DEFENSAS ANTIOXIDANTESDEFENSAS ANTIOXIDANTES

EN PLATHELMINTOSEN PLATHELMINTOS

Curso de Biología Parasitaria2013

PLATHELMINTOS PLATHELMINTOS

- Organismos multicelulares

- Hábitat variados: - intestino- vasos sanguíneos- órganos linfáticos- varios

- Ciclos de vida complejos: - varios estadios de desarrollo- migración tisular

PREVALENCIA GLOBAL DE INFECCIÓN POR HELMINTOS HUMANOS

Parásito Estimación

Helmintos intestinales 1/3 población mundial

Esquistosomas 200-300 millones

Parásitos filariales >150 millones

DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN

ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y DEL NITRÓGENO

DAÑO CELULARDAÑO CELULAR

Daños en el DNADaños en el DNA

Ribosilación deRibosilación depoly ADPpoly ADP

Alteración de laAlteración de laexpresión genéticaexpresión genética

Ruptura de ATPRuptura de ATPy NAD(P)(H)y NAD(P)(H)

Bases de schiffBases de schiff

AGEsAGEs(Advanced glycation (Advanced glycation

end products)end products)

LipoperoxidaciónLipoperoxidación

DañosDaños en las en las

membranasmembranas

Oxidación de grupos tiolesOxidación de grupos tiolesFormación de grupos Formación de grupos carboniloscarbonilos

Daños a los sistemas Daños a los sistemas transportadores ionicostransportadores ionicos

Inestabilidad para Inestabilidad para mantener gradientes mantener gradientes

iónicos normalesiónicos normales

Activación/Desactivación de Activación/Desactivación de varios sistemas enzimáticosvarios sistemas enzimáticos

BLANCOS DE LAS EROs

LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS

Si los EROs no son neutralizados o sus efectos reparados puede

producirse la muerte del organismo

Por lo tanto todos los organismos aeróbicos han desarrollado sistemas

antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para prevenir o reparar el

daño oxidativo.

ALTAS CONCENTRACIONES

DE EROs

ESTRÉSOXIDATIVO

DAÑO OXIDATIVO

● SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)

MECANISMOS ENZIMÁTICOS

● CATALASA

● GLUTATIÓN-S-TRANSFERASA (GST)

● SISTEMA GLUTATIÓN

NADPH

NADP+

GlutatiónGlutatiónreductasareductasa

GlutarredoxinaGlutarredoxina

red red

ox ox

Blancos

red

ox

GlutatiónGlutatión

red

ox

redox Glutatión Glutatión peroxidasaperoxidasa

MECANISMOS ENZIMÁTICOS

● SISTEMA TIORREDOXINA

NADPH

NADP+

Tiorredoxina Tiorredoxina reductasareductasa TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox ox

red

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

ox

DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN

● El estadio adulto de S. mansoni es más resistentes al ataque oxidativo generado

in vitro.

Nare et al. Experimental parasitology (1990) 70:389-397.

ESTUDIOS DE RESISTENCIA AL ATAQUE OXIDATIVO

NIVELES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES

Nare et al., 1990. Experimental parasitology, 70:389-397.

Mei and LoVerde. Experimental Parasitology (1997) 86:69-78.

● La mayor resistencia del estadio adulto al ataque oxidativo se correlaciona con niveles altos de enzimas antioxidantes.

● Se inmunolocalizaron en el tegumento y en el aparatato digestivo

Mei and LoVerde. Experimental Parasitology (1997) 86:69-78.

LOCALIZACIÓN DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES

Experimentos realizados con juveniles de F. hepatica incubados en conjunto con schistosómulas vuelven resistentes a estas últimas frente al ataque oxidativo generado

ESTUDIOS REALIZADOS CON F. hepatica

Piedrafita et al. Parasite Immunology (2000), 22: 287-295.

LOS PARÁSITOS ESTÁN MUY BIEN ADAPTADOS

AL ESTRÉS OXIDATIVO

- alta expresión de enzimas antioxidantes

- alta concentración de estas enzimas en la interfase huésped-parásito:

- Productos de excreción/secreciones

- Superficie de los parásitos

- (CuZn)SOD: formas citosólica y secretadas

- MnSOD

- GPx

- Grx

- GST

- Sistema Tiorredoxina

ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS

DIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOSDIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOS

SCHISTOSOMA MANSONI

A. Anti-GST26 tratados con GFP dsRNA.B. Anti-GST26 tratados GST26 dsRNA.C. Anti-Prx1/2 tratados con GFP dsRNA.D. Anti-Prx1/2 tratados con Prx1/2 dsRNA

50uM H2O2

Mourao et at. PLOS Neglected Tropical Diseases (2009), 3:1-9.

● Las enzimas antioxidantes prometen ser buenos blancos para vacunas mediante: - Inmunización con enzimas purificadas - Diseño de drogas que inhiban selectivamente estas enzimas

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

● Los niveles de enzimas antioxidantes en plathelmintos se correlacionan positivamente con la capacidad de supervivencia frente a los EROs generados por el huésped.

● Los niveles de enzimas antioxidantes son regulados a lo largo del ciclo de desarrollo del parásito y se encuentran influenciados por: - Hábitat parasitado - Metabolismo energético en los diferentes estadios - Presión inmunológica

● Las distintas clases de helmintos presentan diferentes tipos y niveles de expresión enzimática.

SISTEMAS LIGADOS Trx-GSH EN PLATHELMINTOS

TPX GPX

SOD

SISTEMA GLUTATIÓN

NADPH

NADP+

GlutatiónGlutatiónreductasareductasa

GlutarredoxinaGlutarredoxina

red red

ox ox

Blancos

red

ox

GlutatiónGlutatión

red

ox

redox Glutatión Glutatión peroxidasaperoxidasa

SISTEMA TIORREDOXINA

NADPH

NADP+

Tiorredoxina Tiorredoxina reductasareductasa TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox ox

red

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

ox

ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR

TR CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG

Grx CPYC GSH

dominio Grx

dominioTR

CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUGTGR CPYC GSH

GR CVNVGC FAD NADPH región interfase

66 kDa

PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA

10 mM GSH

PM 1 2 3 4 5 6 7 8

45 kDa36 kDa

29 kDa24 kDa

66 kDa

PM 9 10

66 kDa

45 kDa

36 kDa

TR

Fasciola 1 ----------------------------------------MAPIPDDTS-----------SmanTGR 1 -----------------------------------------MPPADGTS-----------EgraTGR 1 -------------MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV---------

Fasciola 9 ---------SWVKKTINSSAVLLFSKS--------RCPYCRAVKQIFNDDKVNHAVIELD

SmanTGR 8 ---------QWLRKTVDSAAVILFSKT--------TCPYCKKVKDVLAEAKIKHATIELDEgraTGR 38 ---------EKLRNKINNAAVLVFAKS--------FCPYCKKVMERFNNLKIPFGYLDLD

Fasciola 53 KRPDGAKIQQVLSQISGISTVPQVFVRGEFVGDSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTYDYDLSmanTGR 52 QLSNGSAIQKCLASFSKIETVPQMFVRGKFIG DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKYDYDLEgraTGR 82 LKKNGSDYQKMLQEITGRTTVPQVFFRGEFIG GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKYDYDM

Fasciola 292 V VGASYVALECAGFLTRFGF DTTVMVRSIFLRGFDQQMADMIGEYMKEHGTKFVRSCVPTSmanTGR 291 VIGASYVALECAGFLASLGG DVTVMVRSILLRGFDQQMAEKVGDYMENHGVKFAKLCVPDEgraTGR 318 CVGASYVSLECAGFLSSIGC DVTVMVRSIFLRGFDQQMAGLISDYIAKYGVKFVRPCVPT

Fasciola 584 TKD -ASAKVTACUGSmanTGR 584 TKK -VSPIVSGCU GEgraTGR 610 TKS

SGSGSG-ASATVTGCUG

SmanTGR 111 IVIGGGSGGLAAGKEAAKYGAKTAVLDY VEPTPIGTTWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAGLEgraTGR 140 VIIGGGSGGLALAKESAKSG AKVALLDFVVPTPMGTTWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL

Fasciola 112 VVIGGGSGGLAASKEAARFGAKTAVFDFVVPTPQDTTRGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA

Grx

sitio de unión al FAD centro redox

sitio de unión al NADPH

selenocisteína

TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA

Tiorredoxina Tiorredoxina glutatión reductasaglutatión reductasa

TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox

NADPH NADP+

Blancos

red

ox

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

oxdominioTR

dominioGrx

- La enzima purificada posee actividad TR, GR y Grx

La fusión de dominios codificada en el gen de la TGR hace posible que la enzima sea capaz de transferir electrones a los blancos de ambos sistemas

- Todas estas actividades son inhibidas con sales de oro

ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR

Tiorredoxina Tiorredoxina glutatión reductasaglutatión reductasa

TiorredoxinaTiorredoxina

red red

ox ox

NADPH NADP+

Blancos

red

ox

Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos

red

oxdominioTR

dominioGrx

¿Hay TGR en los compartimientos

mitocondrial y citosólico?

Mic Mit Cit Nuc Tot

66 kDa

Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR

Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?

EN OTROS PLATHELMINTOS

Taenia crassiceps:

Seguimiento de una actividad GR y TR resultaron en la purificación de una TGR

(Rendon et al. 2004)

Schistosoma mansoni:

Auranofin inhibe las actividades GR y TR en extractos de parásitos

(Alger and Williams, 2003)

S. mansoni S. Japonicum

cTGR 38* 18*

mtTGR 4 2

GR 0 0

TR 0 0

cGrx 0 0

mtGrx 8* 0

cTrx1 6 26

cTrx2 2 1

mtTrx 15 3

cTPx1 12 29

cTPx2 30 20

mtTPx 16 10

cGPx 39 20

secGPx 10 1

- Resultados similares se encontraron en E. granulosus y E. multilocularis

. Ausencia de GR y TR

. Presencia de Trx y TPx mitocondrial y citosolica

En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR

ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica

- 100 μg FhTGR- PBS

1º inmunización

- 100 μg FhTGR- PBS

2º inmunización

- 50 metacercarias

semana 0 semana 4 semana 6

Desafío

semana 18

Sacrificio

Schistosoma mansoni

Auranofin: En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente.

Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito.

Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

Tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásitos encontrados.

Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

Echinococcus granulosus

A- Control B- 12h C- 30h

Bonilla et al. The journal of biological chemistry, (2008) 283:17898-17907.

Fasciola hepatica

Ross et al. Plos One (2012) 7:1-12.

NEJ de F. hepatica incubados con 20 mM de diferentes drogas inhibidoras de TGR durante 48 h. A. 2 (oxadiazole N-oxide), B. 1(oxadiazole N-oxide), C. 4 (oxadiazole N-oxide), D. 61(quinoxaline), E. 50 (thiadiazole), F. control.