28
Cas d’application de l’outil Métatranscriptomique pour l’optimisation des procédés industriels de méthanisation Sébastien LACROIX 1 , Grégory MARANDAT 1,3 , Thierry ARNAUD 2 , Théodore BOUCHEZ 3 , Anne-Sophie LEPEUPLE 1 1 VEOLIA Recherche et Innovation Chemin de la Digue, 78600 MAISONS-LAFFITTE - France - [email protected] 2 VEOLIA - Direction Technique & Performance - 1 rue Battista Pirelli, 94410 SAINT-MAURICE - France - [email protected] 3 IRSTEA UR HBAN 1 Rue Pierre-Gilles de Gennes, 92761 ANTONY France RECHERCHE & INNOVATION

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Cas d’application de l’outil

Métatranscriptomique pour l’optimisation

des procédés industriels de méthanisation

Sébastien LACROIX1, Grégory MARANDAT1,3, Thierry ARNAUD2, Théodore BOUCHEZ3, Anne-Sophie LEPEUPLE1

1 VEOLIA Recherche et Innovation – Chemin de la Digue, 78600 MAISONS-LAFFITTE - France -

[email protected] 2 VEOLIA - Direction Technique & Performance - 1 rue Battista Pirelli, 94410 SAINT-MAURICE - France -

[email protected] 3IRSTEA – UR HBAN – 1 Rue Pierre-Gilles de Gennes, 92761 ANTONY – France

RECHERCHE & INNOVATION

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La Méta quoi ???

RECHERCHE & INNOVATION

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Quelques définitions…

4

• Méta = Qui vient après

• Métagénomique = Etude du contenu génétique d’un environnement complexe

Image du potentiel métabolique d’une population microbienne complexe

• Métatranscriptomique = Etude de l’ensemble des informations génétiques exprimées au sein d’un environnement complexe

Image de l’ensemble des fonctions métaboliques exprimées par une population microbienne complexe

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Biologie Moléculaire classique vs Méta

5

Approche classique (qPCR, RT-qPCR, DGGE): détection d’une espèce, ou groupe d’espèce, ou d’une fonction métabolique précise.

• Détection et quantification uniquement des microorganismes recherchées et connus.

• Implique une connaissance, des microorganismes recherchés, de leur génome ou au moins de gènes cibles.

5

Approche « Méta »: Description de l’ensemble de la population microbienne présente au sein de l’échantillon,

• - D’un point de vue taxonomique (Métagénomique)

• - D’un point de vue fonctionnel (Métatranscriptomique)

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Principe de l’approche Méta

6

Basées sur l’utilisation de séquenceur d’ADN à haut débit

2 approches différentes:

• Métagénomique: analyse de l’ensemble des génomes présents dans un échantillons.

Fournie une vision quasi exhaustive des populations microbiennes présentes au sein d’un échantillon.

• Métatranscriptomique: analyse de l’ensemble des « transcrits ».

Identification des activités métaboliques exprimées par l’ensemble des microorganismes d’un échantillons.

Thèse CIFRE de Grégory Marandat (IRSTEA d’Antony).

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Acteurs Moléculaires de la cellule

7

Dogme centrale de la biologie moléculaire

7

Support de l’information génétique

(identification, ensemble des activité métaboliques

potentielles)

Intermédiaire entre information génétique et activité métabolique

Support de l’activité métabolique

(assurent l’ensemble des fonction cellulaires)

Métagénomique Métatranscriptomique

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Workflow pour analyses “Méta”

8

Extraction de l’ADN/ARN

Réaction de séquençage

Analyse des séquences (Bioinformatique)

Résultats

Analyses Bioinformatiques: comparaison des séquences obtenues avec séquences présentes dans des bases de données, et analyses statistiques.

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Types de résultats fournis par l’approche Méta

9

Métagénomique:

• Proportion des différentes populations microbiennes dans l’échantillon analysé. Ex: % de méthanogènes, d’acétogènes, etc…

• Liste des activités et voies métaboliques potentiellement exprimées dans l’échantillon

Ex: X% de bactéries capables de dégrader la cellulose dans l’échantillon, Y% de capable d’accumuler du Phosphate, etc…

Métatranscriptomique: • Identification les fonctions enzymatiques et voies métaboliques exprimées

• Différence de niveau d’expression entre deux échantillons/conditions

• Identification des microorganismes impliqués dans l’expression des voies métaboliques d’intérêt.

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Exemples de visualisation des résultats

10 10

• Analyse Taxonomique et visualisation

• Analyse Fonctionnelle

KEGG

mapper

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Caractérisation de la flore

microbienne

d’un digesteur UASB

psychrophile

Cas d’application N°1

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Digesteur de type UASB

Volume = 2,3 m3; Hauteur = 5m

Effluent : boues de station d’épuration

Température de fonctionnement 17°C

TSH = 12h, TSB = 20 j

Production moyenne CH4 = 0,21 m3/j

Caractéristiques des effluents entrants et sortants:

Description du digesteur étudié

12

Paramètre mesuré Effluent entrant Effluent sortant

TSS (mg.l-1) 456 141

DCO totale (mg.l-1) 845 342

DCO soluble (mg.l-1) 137 65

Sulfates mg.l-1) 84 36

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Caractérisation de la biomasse présente dans le réacteur

Caractérisation d’une biomasse anaérobie fonctionnant à faible

température

Dynamique des population lors d’une période de fonctionnement

stable après phase de démarrage.

Prélèvements d’échantillons à 2 mois d’écart.

Analyse Métagénomique (ADN) et Métatranscriptomique (ARN)

Objectifs

13 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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AnalyseTaxonomique: qui est là?

Population très stable au cours du temps.

Méthanogènes représentent 18% (T1) à 22% (T2) de la population microbienne totale.

90% des bactéries appartiennent à 4 phylum (Beta et Deltaproteobacteria,, Firmicute et Bacteroidetes)

14 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Focus sur les Méthanogènes

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Population Méthanogènes principalement composée de Methanomicrobiales et de Methanosarcinales.

Augmentation des Méthanogènes entre T1 et T2 principalement due à une prolifération des Methanosarcinales.

Methanobacteriales apparaissent comme peu présentent mais particulièrement actives (ARN)

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Analyse fonctionnelle: Quelles sont les activités

exprimées?

3 (T1) et 5 (T2) millions des séquences obtenues correspondent à des activités métaboliques.

Principales voies métaboliques détectées: Méthanogénèse (36%)

Biosynthèse des protéines Repliement des protéines Transfert d’électrons ATP synthase … autres activités de base

Métabolisme de l’azote (0,65%) Métabolisme du soufre (0,55%)

16

>50%

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Focus sur le métabolisme du méthane

17

37 des 50 enzymes de la méthanogénèse identifiées. Prédominance de la voie hydrogénotrophe sur la voie acétoclaste Détection de 6 enzymes spécifiques de cette voie.

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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L’approche Métatranscriptomique a permis de :

Décrire de façon très précise et complète la biomasse d’un digesteur

anaérobie fonctionnant à basse température (17°C)

Mettre en évidence que cette biomasse est proche de celle décrite

classiquement dans une installation mésophile

De définir que, dans ces conditions de fonctionnement, la voie

hydrogénotrophe était prédominante sur la voie acétoclaste.

Conclusions

18 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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o Caractérisation de la biomasse au sein du digesteur

o Evaluation d’une technique de Microaération pour diminuer la

concentration en H2S

Cas d’application N°2: Digesteur de type EGSB traitant

des effluents papetiers

19

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EGSB de 5m3

Alimentation: effluent papetier

Charge volumique = 5 kg DCO/m3/j

Système d’injection d’air sur la boucle

de recirculation (débit réglable)

Objectif:

Validation de la méthode de

microaération pour contrôler la

production de H2S

Contexte de l’étude

Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Conditions expérimentales

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Périodes Début Fin Débit d’air

m3/jour

H2SO4

addition

1. Contrôle #1 18-Oct-2012 5-Nov-2012 0 non

1. Contrôle #2 6-Nov-2012 21-Jan-2013 0 oui

1. Aération #1 22-Jan-2013 29-Jan-2013 1.37 oui

1. Contrôle #3 2-Fev-2013 25-Fev-2013 0 non

1. Aération #2 26-Fev-2013 19-Mar-2013 0.72 non

1. Aération #3 22-Avr-2013 14-Mai-2013 2.04 non

1. Aération #4 15-Mai-2013 23-Mai-2013 3.40 non

Analyses Méta réalisées tout au long du suivi.

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Population globale très stable au

cours du temps: Pas de modification de population induite

ni par microaération, ni par l’ajout de

H2SO4

Analyses taxonomiques: Qui est là?

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Bactéries

Mehanolinea

Methanobacterium Methanosaeta

Population microbienne composée à 70% de Méthanogènes, dont 50% de Methanosaeta Prédominance de la voie acétoclaste Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Détection des voies métaboliques du méthane, du soufre et de l’azote

principalement.

Très peu de variations du niveau d’expression de ces différentes voies au

cours du suivi. Pas d’impact significatif de la microaération et de l’ajout de H2SO4

Une différence majeure: variation de l’expression d’une enzyme (1.8.99.1)

induisant la formation de H2S via réduction d’ions sulfites Absence d’expression avant ajout H2SO4

Expression forte après ajout de H2SO4

Inhibition de l’expression après mise en place de la microaération

Analyse fonctionnelle

23 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Analyse fonctionnelle: Métabolisme du Méthane

24 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Description complète et précise de la biomasse au sein du

réacteur.

Corrélation entre:

les analyse Méta: Inhibition de l’enzyme 1.8.99.1 du synthèse du H2S

les données du suivi physico-chimique: Diminution de la concentration en H2S

dans le biogaz

Mise en évidence de la raison métabolique provoquant une

diminution de la production de H2S lors de la mise en place de la

microaération

Conclusions

25 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Conclusions générales

RECHERCHE & INNOVATION

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L’approche Méta offre un outil très puissant basé sur une technologie de

pointe (NGS).

Cette approche permet de décrire avec précision un écosystème

microbien aussi complexe que celui d’un digesteur anaérobie (d’un point

de vue taxonomique et fonctionnel).

Présente avant tout un intérêt scientifique: description et compréhension

de ces écosystèmes complexes.

Montre également que l’approche Méta peut déjà être un outil efficace

d’aide à la décision pour l’optimisation d’installations à l’échelle

industrielle.

Conclusions

27 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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• A court-termes:

• Explorer, caractériser et comprendre les dynamiques des communautés

microbiennes complexes.

• Identifier des profils taxonomiques et fonctionnels caractéristiques, lors de

régimes perturbés et productifs des bioprocédés.

• A moyen-termes:

• Faire le lien entre le design des procédés, les paramètres opératoires, les

performances mesurées et la biomasse active.

• Fournir un outil d’aide à la décision pour la conduite et le design des procédés.

A long termes:

• Repousser les limites de fonctionnement des installations, même dans des

conditions défavorables (ex : faible température),

• Générer de nouvelles hypothèses fondamentales et potentiellement identifier de

nouveaux biocatalyseurs environnementaux ou nouvelles voies métaboliques,

industriellement utilisables.

Perspectives d’application

28 Application de l’outil Méta/ JIM 2014 / 05 Novembre 2014

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Merci de votre attention

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