TOSSICOLOGIA-6

GENOTOSSICITA’

JeanJeanJeanJean----FranFranFranFranççççois DESAPHY ois DESAPHY ois DESAPHY ois DESAPHY

Farmacologia e Tossicologia, 2015 Farmacologia e Tossicologia, 2015 Farmacologia e Tossicologia, 2015 Farmacologia e Tossicologia, 2015

Genotossicità

•La genotossicità considera gli eventi che danneggiano il DNA

•Il danno genotossico può essere essenzialmente di 4 tipi:

• distruzione del DNA

• mutazioni geniche indotte da mutageni

• mutazioni cromosomiche indotte da clastogeni

• alterazioni epigenetiche (metilazione del DNA, ecc…)

•Gli agenti genotossici possono essere:

• diretti

• indiretti

•Il danno genotossico può condurre:

• alla morte cellulare (apoptosi o necrosi)

• al cancro (neoplasia)

• a difetti congeniti

• a malattie ereditarie

2008© J.F. DESAPHY

Watson & Crick, 1953

Ossatura di zuccheri:

Catena di desossiribosio con legami fosfodiestere

DNA

guanina citosina

adenina timina

PURINE PIRIMIDINE

2008© J.F. DESAPHY

trascrizione

traduzioneribosomi

proteine

NUCLEO

CITOSOL

membrana

plasmaticamembrana

nucleare

La sintesi proteica

Codice genetico

2008© J.F. DESAPHY

Mutazioni geniche: meccanismi

•Sostituzione di una coppia di basi

•Modificazioni spontanee

•Incorporazione di analoghi delle basi

•Modificazione chimica

•Delezione o inserzione di una o più basi

•Modificazioni spontanee

•Agenti intercalanti

•Radiazioni UV

2008© J.F. DESAPHY

Mutazioni puntiformi

sinonimo

non-sinonimo, missenso

nonsenso

readthrough

Mutazioni nella parte

codificante

del gene

Mutazioni nella parte

regolatrice

del gene

2011© J.F. DESAPHY

promotore

Trascrizione

non

controllata

Niente

Trascrizione

Sequenza

regolatrice

Delezione

della sequenza

regolatrice

Delezione del

promotore

N

CH CH

O

C

H2

CH2

O

O

Transizione: sostituzione purina/purina (A/G) o pirimidina/pirimidina (C/T)

Transversione: purina/pirimidina e vv

R1448C: sostituzione di una arginina con una cisteina in posizione 1448

N

CH CH

O

C

H2

CH2

C

H2

CH2

NH2

Mutazioni missenso

2008© J.F. DESAPHY

mRNA

5’-GAG-3’

5’-AAG-3’

Proteina

acido glutammico

lisina

mutazione traduzione

funzione alterata o persa

mutazione

errore di

replicazione

replicazione

replicazione

replicazione

Mutazioni puntiformi spontanee

Accuratezza della replicazione

selezione accurata del nucleotide da parte della DNA polimerasi

capacità di riparazione immediata della DNA polimerasi (attività esonucleasi 3’-5’)

DNA polimerasi

Lettura di verifica

L’ultimo nucleotide è appaiato correttamente

Vince la polimerasi

L’ultimo nucleotide è sbagliato

Vince l’esonucleasi

Selezione del nucleotide

2008© J.F. DESAPHY

Rischio di errore su base chimica: 5-10%

Mutazioni puntiformi indotte

nucleotide

alteratomutazione

mutazione

mutazione

replicazione

replicazione

replicazione

2008© J.F. DESAPHY

2008© J.F. DESAPHY

Mutazioni puntiformi: incorporazione di analoghi

5-bromouracile5-bromouracile

chetonico

5-bromouracile

enolicoadenina guanina

inserzione del

5-bromouracile

tautomerismo

cheto-enolico

tautomerismo inverso

mutazione

A-T G-C

Purine o pirimidine con una struttura analoga alle basi classiche

esempi

5-bromouracile: tautomerismo cheto-enolico (A>G)

Aminopurine: tautomerismo ammino-immino (T>C)

transizione

2008© J.F. DESAPHY

Mutazioni puntiformi: deaminazione

Le basi C, G, A sono deaminate dall’azione di alcuni composti chimici

Esempi di sostanze in grado di “de-aminare”:

Acido nitroso sulle basi A, C, G

Sodio bisulfite sulla base C

Guanina Xantina blocca la replicazione

Adenina Ipoxantina T>C

Citosina Uracile G>A

adenina ipoxantina

HNO2

N N

O

NH2

citosina

timina

deossiribosio

N N

O

Odeossiribosio

deossiribosio

deossiribosio

A-T G-C

transizione

2008© J.F. DESAPHY

guanina

desossiribosio

N N

NN

O

N

H

H

H

citosina

timina

desossiribosio

N N

N

N

H

H

H

O

CH3

N

O6-metilguanina

agente alchilante

G-C A-TDopo replicazione, sarà avvenuta la transizione:

Base posizione effetto

guanina N7 delezione

O6 transizione

timina O4 transizione

Adenina N3 blocco della sintesi

2008© J.F. DESAPHY

Mutazioni puntiformi: alchilazione

Mutazioni puntiformi: coniugazione

Coniugazioni con metaboliti degli idrocarburi policiclici aromatici

O O

OH

OH

OH

O

benzopirene 7,8-epossido BP7,8-diidrodiol BP

7,8 diidrodiol-9,10-epossido BP

P450P450

epossidrolasi

guanina

deossiribosio

N N

NN

O

N

H

H

H

citosina

deossiribosio

adenina

N N

N

NH

HN

O

IPA

guanina coniugata

Legame covalente

in posizione N2

G-C T-A

transversione

2008© J.F. DESAPHY

Esempi di reattivi elettrofiliEsempi di reattivi elettrofiliEsempi di reattivi elettrofiliEsempi di reattivi elettrofili

C+ RR

H

Ioni carbonio

N+ HR

Ioni nitrenio

C°RR

R

Radicali liberi

N+N

R

Ioni diazonio

OR

R

EpossiN+ C

H2

CH2

R

R

Ioni aziridinio

amine aromatiche

acetamidi

nitrocomposti

aloalcani

nitrosocomposti

idrazine simmetriche IPA

aflatossine

alcheni

Mostarde azotate

2008© J.F. DESAPHY

Frame-shift mutationsL’addizione o la rimozione di basi ha degli effetti più drastici che la

mutazione puntiforme, poiché la lettura del codice genetico viene alterato

in tutte le triplette che seguono la mutazione.

delezione di una citosina

2008© J.F. DESAPHY

Frame-shift mutations: agenti intercalanti

Molecole piane che possono intercalarsi tra le coppie di basi nella doppia elica

Agente

intercalante

Esempi

Acridine: anti-batterico

Proflavina: composto sperimentale

Bromuro di etidio: composto sperimentale

distorsione dell’elica

Inserzioni e/o delezioni

Bromuro

di etidio

proflavina acridine

2008© J.F. DESAPHY

Frame-shift mutations: radiazioni UV

frequenza: di dimerizzazione: T-T > CT > TC > CC

dimero ciclobutileUVB, 280-320 nm

delezioneDNA riparato

DNA alteratoblocco

della

replicazione

processi

di

riparazione

2008© J.F. DESAPHY

fotoprodotto 6-4

Cromosomi

cariotipo umano

Maschile: 44 autosomi + XY

Femminile: 44 autosomi + XX

2008© J.F. DESAPHY

metafase

2 metri

Eterocromatina: zona non-trascritta

Eucromatina: geni

Divisioni cellulari

fase G1

(2n)

fase G2

(4n)

metafase

anafase

(2n)

apparato

mitotico

cromatidi

duplicazione del

DNA

citodieresi

fase S

MitosiDivisione delle cellule somatiche

2008© J.F. DESAPHY

MeiosiDivisione delle cellule germinali

(2n)

fase G2

(4n)

profase 1

(4n)

metafase

anafase

telofase

(n)

Crossing-over

Scambi di

materiale

genetico

gameti

paterne

materne

mutazioni cromosomiche

traslocazioni

reciproche

inserzioni

Le anomalie numeriche (mutazioni genomiche) sono dovute a anomalie

strutturali o mancata disgiunzione durante l’anafase.

Le anomalie strutturali (aberrazioni cromosomiche) sono dovute a rotture,

delezioni, scambi, e riarrangiamenti del materiale cromosomico.

2008© J.F. DESAPHY

Intero

cariotipo

singolo

cromosoma

principali

aberrazioni

cromosomiche

2008© J.F. DESAPHY

Agenti Agenti clastogeniclastogeni

ABERRAZIONI STRUTTURALI

•Radiazioni ionizzanti durante la fase G1 (aberrazioni di tipo cromosomico)

durante le fase S e G2 (aberrazioni di tipo cromatidico)

•Clastogeni chimici aberrazioni cromatidiche, qualsiasi la fase

ABERRAZIONI NUMERICHE

•Aberrazioni strutturali

•Inibitori del fuso colchicina (blocca la polimerizzazione della tubulina)

vincristina, taxolo

•Agenti in grado di alterare i seguenti eventi:

•Divisione del centromero nella meiosi I

•Accoppiamento di cromosomi analoghi nella profase I

•Disgiunzione dei cromosomi nella anafase I e II2008© J.F. DESAPHY

Classificazione delle mutazioni•In base alla tipologia:

• cromosomiche

• geniche

•In base all’origine:

• spontanee (errori di replicazione e crossing-over)

• indotte da mutageni o clastogeni

•In base alla sede:

• germinali (si verificano nei gameti e possono essere trasmesse alla prole)

• somatiche (non vengono trasmesse)

•In base all’effetto funzionale:

• letali (100 % di morti prima di raggiungere l’età riproduttivo)

• subletali (50% degli individui raggiunge l’età riproduttivo)

• condizionali (il fenotipo mutante è espresso solo in determinate condizioni)

• neutre (senza nessun effetto)

• silenti (polimorfismi)

• vantaggiose (favoriscono l’adattamento ambientale)

• svantaggiose (riducono l’adattamento ambientali o inducono patologie)

2008© J.F. DESAPHY

Conseguenze del danno genetico

se avviene nelle cellule somatiche:

• morte cellulare

• mosaicismo

• oncogenesi (attivazione di proto-oncogeni e/o inibizione di oncosoppressori)

se avviene nelle cellule germinali, alterazioni del pool genico:

• aborti spontanei

• difetti congeniti

• malattie cromosomiche (sindrome di Down: trisomia 21)

• malattie mendeliane (mutazioni in un singolo gene)

• autosomiche (beta talassemia)

• legate all’X (distrofia di Duchenne)

• malattie non-mendeliane (espansione di sequenze nucleotidiche)

(distrofia miotonica)

• malattie mitocondriali (encefalomiopatia mitocondriale)

• malattie multifattoriali (diabete tipo 2, ipertensione, ecc...)

2008© J.F. DESAPHY

Cellula normale Cellula iniziativa

attivazione proto-oncogeni

inattivazione oncosoppressori

INIZIAZIONE

Lesione preneoplasticaespansione

clonale

selettiva

PROMOZIONE

Tumore clinicamente rilevabilemetastasi

Tumore maligno

PROGRESSIONE

INQUINANTI CHIMICI

AGENTI INFETTIVI

IRRADIAZIONI

MUTAZIONI EREDITATE

ONCOGENESI

2008© J.F. DESAPHY

Fattori che influiscono sul danno genetico

•Concentrazione dell’agente tossico nell’ambiente

•Ingresso e distribuzione nell’organismo

•Capacità metabolizzante dei tessuti a contatto

•attivazione metabolica

•detossificazione

•Reattività dell’agente tossico o suoi metaboliti col DNA

•Capacità della cellula di riparare il danno

•Opportunità di espressione del danno

•Capacità di riparazione del danno (sistemi di riparazione del DNA)

•Abilità del tessuto di riconoscere e distruggere le cellule mutanti

2008© J.F. DESAPHY

FINE