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Desarrollo de OGMs:
Biotecnología moderna y nuevas aplicaciones
Dra. Laura Esther Tovar Castillo.
Directora Técnica de Información y Fomento a la Investigación.
Secretaría Ejecutiva – CIBIOGEM.
CONACYT
Organismo Genéticamente Modificado:
Cualquier organismo vivo que ha adquirido unacombinación genética novedosa, generada através del uso específico de técnicas de labiotecnología moderna.
Cultivos GM
(LBOGMs Artículo 3, fracción XXI)
Según el Convenio sobre Diversidad Biológica:
Biotecnología puede definirse como "toda aplicación tecnológica que
utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para lacreación o modificación de productos o procesos para usos específicos".
Industria Alimentaria
Medicina y Farmacéutica
Aplicaciones Diagnósticas
Biotecnología Ambiental
Tratamiento de aguas y biorremediación
BiocombustiblesBiofertilizantes
Agrobiotecnología
Mejora de cultivos y selección de
nuevas variedades.
Ingeniería Genética
Aprovechando el conocimiento
en Biología Molecular.
BIOTECNOLOGÍA
(CBD, 1992)
19801960 1970 1990 2000 20101950
1961Mejoramiento genético
Norman Borlaug
[Premio Nobel 1970]
1953 Estructura del ADNWatson-Crick
Wilkinson-Franklin
1976-77 Secuencia ADNSanger/Maxam-Gilbert
1982Vacunas Recombinantes
1978 Interacción Agrobacterium-PlantaSchell-Van Montagu
2002 Salmón de rápido crecimiento
1980 Ratones GM
1985Cerdos GM
1988Maíz resistente a plagas
1994Jitomate FlavrSavr
Aprobado por FDA
1999 Arroz vitaminado
1996 Algodón y Soya
(Aprobación USDA y FDA)
1995 Papa contra plagas
(Aprobación EPA)
2003 GlowFish
1985-86 Tabaco GM
Primer vegetal transgénico
Desarrollo de la Biotecnología Moderna
1972ADN RecombinanteBoyer-Cohen
BIOTECNOLOGÍA MODERNA
(Protocolo Cartagena, 2000; LBOGMs 3, VI)
Por “biotecnología moderna” se entiende la
aplicación de:a.Técnicas in vitro de ácido nucléico, incluidos el
ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante y la
inyección directa de ácido nucléico en células u orgánulos,
o
b.La fusión de células más allá de la familia
taxonómica,
que superan las barreras fisiológicas naturales
de reproducción o de la recombinación y que
no son técnicas utilizadas en la reproducción y
la selección tradicional.
Ciencias Genómicas e Información
Biológica
Respeto y Sustentabilidad del Medio Ambiente y
la Biodiversidad
Innovación Tecnológica
Acceso y potenciamiento de
la biodiversidad nacional
Biotecnología Agroecológica en el
campo mexicano
Adaptación. Academia Mexicana de Ciencias (2010) http://www.amc.unam.mx/biotecnologia/comite/tendencias.htm
Provisión de AlimentosProductos y/o materias primas para la industria
Desarrollo de nueva industria soportada en tecnología biológica más limpia
Nuevos Bioprocesos y otras aplicaciones con potencial tecnológico
Metagenómica, Caracterización, Biocatálisis
e Ingeniería Celular
ClasificaciónComparaciónDiagnósticoCertificación
• El hombre ha
seleccionado y
modificado a las plantas.
• Más de 10,000 años.
• Fomento del avance de
la Ciencia y Tecnología.
8
¿Reconoces esta raíz?
La influencia de la domesticación
9
A través de la selección
artificial:
“favoreciendo la sobrevivencia
y reproducción de individuos
de una especie con rasgos o
atributos de interés, durante
muchos años”, se han
domesticado numerosas
plantas y animales.
La influencia de la domesticación
Muchas de las variedades agrícolas comestibles más comunes se generaron inicialmente a través de procesos de selección
humana favoreciendo las características deseables:
Variedades Agrícolas
Algunos resultados de años del trabajo de la humanidad...
Selección artificial
“La cruza del mejor con
el mejor esperando lo
mejor”
Ingeniería Genética
Reduce costos e
incrementa
rendimientos
La mutagénesis inducida se utiliza
desde mediados del siglo XX.
• Sustancias químicas o radiaciones.
• Cambios al AZAR.
• Diversas mejoras.
• Aprox. 3088 nuevas variedades
vegetales, 70% área de cultivo.
Cambios semejantes a los que ocurren
naturalmente de manera espontánea.
W. Murcott mandarin (left) and Tango (right).
Photo credit: T. Williams, UC Riverside.
No son considerados
Organismos Genéticamente Modificados (OGMs)
Mutaciones
• Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN)
• Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM)
Producen alteraciones
en la secuencia de
nucleótidos de un gen.
• Pérdidas
• Inserciones
• Sustituciones
La edición de genomas derefiere a un tipo deingeniería genética en elque manipulandirectamente secuencias enel genoma.
A diferencia de las técnicasprevias, esta manipulaciónse dirige a sitiosespecíficos.
1. Endonucleasas Sitio Dirigidas (SDN) y Tecnología deDedos de Zinc2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis (ODM)3. Cisgenesis/Intragenesis4. Metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM)5.Reverse breeding & other "negative segregants“(reproducción inversa y otras segregantes negativas)6. Agro-infiltracion7. Injerto sobre Patrón GM
• Las nucleases de dedos de Zinc son proteínas
quiméricas con un domino de “dedos de Zinc” (reconoce
especificamente 3 pares de bases de la secuencia de
DNA).
•La nucleasa corta la doble hebra de DNA
• Nucleasas de dedos de zinc (ZFN)
• Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN)
• Nucleasas de Secuencias Palindrómicas Repetidas Inversas (CRISPR-Cas)
Nucleasas tipo activadores
de transcripción (TALEN)
Nucleasas tipo
activadores de
transcripción (TALEN)
son proteínas que se
unen al DNA de manera
secuencia- específica y
se transforman “tijeras de
DNA” al unirse a una
nucleasa de dominio
catalítico FokI SDN.
Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR
associated system (CRISPR-Cas9)
Los CRISPR han sido encontrados en el 40% de las
eubacterias y 90% de las arqueas secuenciadas.
Es un “sistema inmune” de las bacterias para
defenderlas del ataque de bacteriófagos
Especificidad del sistema CRISPR / CAS9
El sistema CRISPR se compone de dos partes
1) Un componente protéico CAS9 con actividad de nucleasa
2) Un RNA guía que brinda especificidad al sistema
USO DE CRISPR / CAS9
Al igual que en los sistemas anteriores la edición con CRISPR puede emplearse para generar mutaciones puntuales, deleciones o inserciones cortas
• Uso de oligonucleotidos, los cuales
comparten homología con la secunecia blanco
(target) con excepción de los nucleotidos que
serán modificados.
• Oligonucleotidos “target” con secuencia
homologa en el genoma
• Crea uno o más pares de base de mismatch
que corresponde a los nucleotidos no
complementarios.
La Cisgénesis es la introducción de genes aislados con
sus promotores nativos de las especies susceptibles
de cruzamiento o de la propia planta de cultivo
En la intragénesis, el ADN insertado puede ser una
combinación nueva de fragmentos de ADN de la
misma especie o de una especie sexualmente
compatible sujeto a recombinación homologa.
Se usa en casos en donde el ADN flanqueante o el
vector no se originan de especies sexualmente
compatibles (Holme et al. 2013).
Cisgenesis/Intragenesis utilisa la misma base
tecnológica que la transgenesis.
Holme et al. 2013. Intragenesis and cisgenesis as alternative to transgenic crop development. Plant
Biotechnology Journal. 1-13
• Inserción de genes que codifican RNAs los cuáles son
homólogos al promotor de las regiones del gen blanco
• La transcripción de los genes dirige al RNAs de doble
cadena, el cual es cortado en pequeños RNAs
• sRNAs inducen la metilación de la región promotora
del gen blanco target lo que lleva al silenciamiento
transcripcional del gen (TGS)
• Los cambios en el patrón de metilación sera heredaro
aún en ausencia del transgene insertado
Es un mecanismo en el que las moléculas
de doble cadena de ARN (dsRNA) regula
la expresión de los genes.
Silenciamiento
siRNAMolécula de RNA de doble
cadena, que tienen un tamaño
de 21-25 nucleótidos
Producida a partir de un
precursor de RNA que puede
variar de tamaño y origen
miRNAMolécula de RNA de doble
cadena, que tienen un
tamaño de 21-25
nucleótidos
Los precursores de
microARN son transcritos a
partir de genes celulares, tal
y como se producen los
RNAm
piRNA
Mediado por
A. Cuando un virus RNA
infecta la célula, el RNAi
destruye el RNA viral,
previniendo la formación
de nuevos virus.
B. La síntesis de muchas proteínas es
controlada por genes que codifican
microRNA. Después del
procesamiento el microRNA evita la
traducción del mRNA a proteína.
C. En la investigación, Ias
moléculas de dsRNA son
diseñadas para activar el
complejo RISC para degradar el
mRNA para un gen específico.
Muchos procesos en la
célula usan RNAi
Reproducción inversa (RB) es una técnica de fitomejoramiento
diseñada para producir directamente líneas parentales para cualquier
planta heterocigótica.
El mejoramiento reverso genera líneas perfectamente
complementarias de parentales homocigotos mediante ingeniería
meiótica.
El método se basa en la reducción de la recombinación genética en el
heterocigoto seleccionado mediante la eliminación del cruzamiento
meiótico. Las esporas femeninas o masculinas obtenidas de tales
plantas contienen combinaciones no recombinantes de los
cromosomas parentales que pueden ser cultivadas in vitro para
generar plantas homocigotas doble haploides (DHS).
A partir de estos DHS, los padres complementarios pueden ser
seleccionados y utilizados para reconstituir el heterocigoto a
perpetuidad.
Dirks et al. 2009
• El transgene que codifíca para una secuencia
de RNAi es liberado en el explante del material
• La planta transgenica se regenera en cultivo de
tejido
• El silenciamiento de genes dirige a la supresión
meiotica
• Las microsporas haploides son producidas de
de flores de plantas transgenicas.
• Las Microsporas son desarrolladas en plantas
diploides homocigas (tecnología de dobles
haploides)
Reproducción con línea inductora transgénica
(“segregantes negativas")
• El transgene codificador de un constructo de
RNAi o una proteína dominante-negativa es
insertado en el genoma de la línea inductora.
• La expresión del transgene permite la inhibición
de la expresión genica o la función de la
proteína.
• El efecto del transgene es usado durante uno o
varios ciclos de reproducción.
• El transgene inductor finalmente es segregado
o eliminado.
REVERSE BREEDING
• El injerto en sí es un método de cultivo clásico en el que dos
plantas con diferentes fenotipos se combinan físicamente
adjuntándose.
• Cuando se toma la parte inferior, el patrón, de una planta
transgénica y la parte superior, el vástago, de una planta
convencional, las hojas resultantes, tallos, semillas y frutos no
llevan el ADN transgénico.
• Como un ejemplo, este método puede ser utilizado para la
expresión de ARN de interferencia (o RdDM) en el patrón; estos
son sistémicamente transportados y puede llevar al
silenciamiento transitorio o heredable de los genes en el
vástago.
• Las semillas resultantes, frutas o descendencia de un vástago
no contienen ADN de origen transgénico, mientras que la
regeneración de brotes adventicios a partir de callos o
portainjerto puede llevar ADN transgénico.
Stegemann y Bock, 2009; Nagel et al, 2010;. Lusser et al., 2011
ADN
ARN
ARNmi
Proteína
Una planta quimérica se produce mediante el
injerto de un vástago no genéticamente
modificado en un patrón modificado
genéticamente.
En consecuencia, los frutos de la planta no
contienen la secuencia de ADN insertada.
El patrón puede ser modificado para mejorar su
capacidad de enraizamiento o resistencia a
las enfermedades transmitidas por el suelo,
resultando en un aumento sustancial en el
rendimiento de los componentes
cosechables.
El patrón también puede ser modificado para
obtener el silenciamiento de genes a través
de la técnica de ARN interferencia (ARNi). En
las plantas injertadas, los ARN pequeños
pueden moverse a través del injerto de modo
que la señal de silenciamiento puede afectar
a la expresión génica en el vástago.
Raíz GM
Injerto No GM
Fuente: Lusser et al 2012
• La expresión transitoria de genes en plantas implica la
expresión de proteínas recombinantes sin necesidad de
transformación del material genético de la planta.
• El ADN recombinante no se inserta en el genoma, sino
que mediante distintos métodos se consigue producir
grandes cantidades de ARN mensajero, que se traduce
a proteínas en el citoplasma de parte de las células de
la planta.
• Una vez que el mensajero es traducido a proteínas la
planta lo degrada, no se transmite a la descendencia.
http://icono.fecyt.es/informesypublicaciones/Documents/2005-
Plantas%20biofactor%C3%ADa_d.pdf
La expresión transitoria de genes generalmente se utiliza para evaluar la
funcionalidad de las construcciones que se usan para transformar plantas de
manera estable, y para evaluar la calidad del producto que se obtiene.
También es posible la expresión transitoria en plastos.
Ventajas de la expresión transitoria
• Expresión rápida y flexible• No está influida por efectos de posición• Puede producirse en plantas adultas, previniendo cualquier
efecto negativo que la proteína recombinante pudiese tener en el desarrollo de la planta
• No es una modificación genética permanente, lo que desde el punto de vista de la seguridad es una ventaja
• Ideal para obtener pequeñas cantidades de proteínas “a medida” en pocas semanas
Agroinfeccion
• Infiltración con
suspención de
Agrobacterium sp.
Conteniendo el gen de
interés insertado en un
vector viral de tamano
completo
• Facilita la
diseminación y
expresión del gen
blanco en la planta
Floral dip
• Transformación
de gametocitos
femeninos
• Se obtienen
semillas GM
(Lusser M, 2012)
(Lusser M, 2012)
(Lusser M, 2012)
Dra. Laura Esther Tovar Castillo
Secretaría Ejecutiva-CIBIOGEM
Tel. 55756878
e-mail: [email protected]
