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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MATERIALES AVANZADOS
DESARROLLO DE UN BIO-RECUBRIMIENTO
MULTIFUNCIONAL “HA-ZrO2-nAg(EN)”
DEPOSITADO MEDIANTE PROYECCIÓN TÉRMICA
POR PLASMA
CHIHUAHUA, CHIH. DIC, 2016
COASESOR:
DR. HUGO A. ESTUPIÑAN DURAN
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE
MEDELLÍN
TESIS:
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIA DE MATERIALES
ASESOR:
DR. VÍCTOR M. OROZCO CARMONA
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MATERIALES
AVANZADOS
PRESENTA:
ING. ROBERTO GÓMEZ BATRES
DEPARTAMENTO DE ESTUDIOS DE POSGRADO
AGRADECIMIENTOS
Principalmente a mis padres Norma Elizabeth Batres Ortiz y Fernando Gómez Portillo, a
mi hermano Fernando Gómez Batres, quienes me han formado y apoyado
incondicionalmente, así como aconsejando en cada una de los etapas de la vida
llenándolos de conocimiento y lecciones de vida.
A mi familia y amigos, por el apoyo y soporte que me han brindado
A mis amigos y compañeros de laboratorio, quienes me han apoyado así como
contribuido en el desarrollo de la investigación.
A mis asesores:
Dr. Víctor Manuel Orozco Carmona, quien estuvo a cargo del desarrollo de la
presente investigación, brindándome su gran apoyo, conocimiento y
orientación.
Dr. Hugo Armando Estupiñan Duran, quien me brindo su apoyo y conocimiento
durante la estancia en el extranjero
Por último darle gracias a Dios quien me ha acompañado y quien me ha concedido la
oportunidad de desarrollar la presente investigación.
RECONOCIMIENTOS
Agradezco al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por brindarme el
apoyo y financiamiento del presente proyecto asi como el apoyo durante la movilidad en
el extranjero.
Agradezco al Centro de Investigacion en Materiales Avanzados (CIMAV) y al personal,
principalmente al laboratorio de corrosión y protección, quienes me abrieron las puertas,
brindaron el conocimiento, formación y permitieron así el desarrollo y conclusión de la
presente investigación.
A la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, Facultad de minas, por abrirme las
puertas y permitirme el desarrollo de la presente investigación.
A la Universidad Industrial de Santander (UIS), en especial al personal del Centro de
Investigación de Enfermedades Tropicales (CINTROP) así como técnicos del área de
microscopia, por prestar sus instalaciones y contribuir con la experimentación biológica
de la presente investigación.
1.1 RESUMEN
En la presente investigación se desarrolló un bio-recubrimiento con propiedades
mecánicas de adherencia superiores a los recubrimientos osteoconductores comerciales
actuales a base de Hidroxiapatita (HA), los valores alcanzados de adherencia fueron
cercanos a los 59 MPa siendo superiores en casi un 200% superiores a los recubrimientos
comerciales , dichas propiedades se mejoraron mediante la integración de nanopartículas
de circonia estabilizada con Itria (nZrO2(YSZ 8% mol)) sobre una matriz de polvo de HA,
adicionalmente mediante la integración de nanopartículas de plata soportadas en una
matriz de extracto de nopal (nAg-EN) se aportó propiedades biocidas al recubrimiento.
Con la finalidad de observar el efecto de las nZrO2 sobre la matriz de HA, se evaluaran
dos concentraciones de HA/nZrO2 (HA89.1%-nZrO2(YSZ 8% mol)9.9%-nAg(EN)1% y HA63.3%-
nZrO2(YSZ 8% mol)29.7%-nAg(EN)1%). Para la homogenización y efecto de dispersión de
fases sobre el recubrimiento, las matrices en polvo fueron sometidas a dos métodos de
homogenización: el primer método consta de una agitación mecánica, cuya finalidad fue
no modificar el tamaño de partícula, simplemente mezclar todos los polvos en
experimentación; el segundo método consistió en un proceso de molienda mecánica, el
cual se pretendió tuviese impacto en la modificación del tamaño de partícula, buscándose
garantizar una mejor distribución de fases. Los recubrimientos fueron caracterizados
físicamente mediante técnicas de Microscopia Electrónica de Barrido (MEB),
Espectroscopia Confocal Raman (ECR), Difracción de Rayos X (DRX), Microscopia de
Fuerza Atómica (MFA), ensayos mecánicos para determinar adherencia y dureza del
recubrimiento, caracterización electroquímica mediante espectroscopia de impedancia
electroquímica (EIS), determinación de la capacidad hidrofílica mediante la medición de
ángulo de contacto y energía superficial, además de ensayos in vitro mediante línea
celular osteosarcoma humano (HOS) para determinar la biocompatibilidad y capacidad
de osteointegración del recubrimiento así como ensayos de citotoxicidad.
i
ÍNDICE
1. AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................................... iv
RESUMEN ........................................................................................................................................ vi
2. HIPÓTESIS .................................................................................................................................... 8
3. JUSTIFICACIÓN............................................................................................................................. 6
4. OBJETIVO ..................................................................................................................................... 6
Objetivos específicos ....................................................................................................................... 6
5. ANTECEDENTES ........................................................................................................................... 1
6. MARCO TEÓRICO. ........................................................................................................................ 9
Tejido Óseo...................................................................................................................................... 9
6.1.1 Composición .............................................................................................................. 11
6.1.2 Estructura Macroscópica del Tejido Óseo ................................................................. 12
6.1.3 Estructura Microscópica del Tejido Óseo .................................................................. 13
6.1.4 Propiedades mecánicas del hueso ............................................................................ 15
Biomateriales ................................................................................................................................ 16
6.1.5 Biomateriales metálicos ............................................................................................ 18
6.1.6 Biocerámicos ............................................................................................................. 20
6.1.7 Biocerámicos osteoconductores ............................................................................... 22
Implantes ....................................................................................................................................... 25
6.1.8 Respuesta biológica de implantes ............................................................................. 25
6.1.9 Fallas de implantes “Aflojamiento aséptico” ............................................................ 26
ii
Artroplastia total de cadera .......................................................................................................... 27
Principales fallas en artroplastia total de cadera .......................................................................... 29
Funcionalización de Superficies en Prótesis. ................................................................................. 30
6.1.10 Recubrimientos por proyección térmica por plasma ................................................ 30
Integración de nAg como recubrimiento antibacterial ............................................................. 32
7. METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 32
Caracterización de polvos precursores. ........................................................................................ 33
7.1.1 Difracción de Rayos X. ............................................................................................... 34
7.1.2 Microscopia electrónica. ........................................................................................... 34
Preparación de Matriz de polvos precursores. ............................................................................. 35
Adición de nAg (EN) ....................................................................................................................... 36
Caracterización de mezcla de polvos ............................................................................................ 37
Preparación de muestras para recubrimiento; Perfil de Anclaje. ................................................. 37
Desarrollo de recubrimientos. ...................................................................................................... 38
Caracterización del recubrimiento ................................................................................................ 38
7.1.3 Análisis mediante difracción de rayos X. ................................................................... 38
7.1.4 Microscopia electrónica de Barrido (MEB) ............................................................... 39
7.1.5 Caracterización sección Transversal MEB ................................................................ 39
7.1.6 Microscopia de fuerza atómica AFM ......................................................................... 40
Ensayos Mecánicos ....................................................................................................................... 40
7.1.7 Micro dureza ............................................................................................................. 40
7.1.8 Nanoindentación ....................................................................................................... 40
7.1.9 Ensayo de adherencia ............................................................................................... 41
iii
Liberación de Iones ....................................................................................................................... 42
Actividad superficial: Adsorción de calcio ..................................................................................... 42
7.1.10 Formación de Apatita ................................................................................................ 42
7.1.11 Espectroscopia de Impedancia Electroquímica (EIS)................................................. 43
7.1.12 Energía superficial y Capacidad Hidrofílica mediante ángulo de contacto ............... 44
Ensayos In-vitro ............................................................................................................................. 44
7.1.13 Morfología celular ..................................................................................................... 45
7.1.14 Adhesión cuantitativa celular. ................................................................................... 47
7.1.15 Citotoxicidad celular. ................................................................................................. 47
7.1.16 Bioactividad, expresión de fosfatasa alcalina (ALP) .................................................. 49
7.1.17 Determinación de la concentración de ALP .............................................................. 49
8. RESULTADOS ............................................................................................................................. 50
Caracterización de polvos ............................................................................................................. 50
8.1.1 Difracción de Rayos X ............................................................................................... 50
8.1.2 Microscopia electrónica ............................................................................................ 51
Caracterización de mezcla de polvos procesados mediante tratamiento de homogenizado ...... 53
8.1.3 DRX ............................................................................................................................ 53
Caracterización de Recubrimientos .............................................................................................. 58
8.1.4 DRX ............................................................................................................................ 58
8.1.5 Microscopia electrónica de barrido .......................................................................... 60
8.1.6 AFM ........................................................................................................................... 73
iv
8.1.7 Ensayos Mecánicos .................................................................................................... 76
8.1.8 Liberación de iones ................................................................................................... 82
8.1.9 Actividad superficial .................................................................................................. 84
Espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) ................................................... 88
8.1.10 Ensayos In-Vitro ......................................................................................................... 94
9. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 100
10. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 103
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estructura jerárquica del tejido óseo ..................................................................... 15
Figura 2 Esquema de Proyección Térmica por Plasma ......................................................... 32
Figura 3 Esquema de etapas de la presente investigación .................................................. 33
Figura 4 Esquema de muestra recubierta para ensayo de adherencia en base a la norma
ASTM C633-01 ...................................................................................................................... 41
Figura 5 Patrones de difracción; a) Circonia estabilizada con Itría (YSZ) b) Hidroxiapatita (HA)
.............................................................................................................................................. 51
Figura 6 Micrografía MEB para caracterización de polvos de HA e histograma obtenido
mediante IMAGEJ [54] .......................................................................................................... 51
Figura 7 Micrografía TEM campo claro e histograma obtenido mediante IMAGE J [54] para
nanopartículas de YSZ........................................................................................................... 52
Figura 8 Análisis EDS para nanopartículas de YSZ ................................................................ 53
Figura 9 Patrones de difracción para diferentes mezclas de polvo HA/nZrO2 .................... 54
Figura 10 Imágenes de MEB-EC en modo BSE; a) y b) polvos HA-ZrO2 homogenizados
mediante molienda mecánica e imágenes c) y d) polvos de HAzrO2 homogenizados
mediante molienda mecánica .............................................................................................. 55
vi
Figura 11 Análisis EDS puntual en diferentes secciones de partículas para polvos sometidos
a agitacion mecánica ............................................................................................................ 56
Figura 12 Análisis EDS puntual en diferentes secciones de partículas para polvos sometidos
a molienda mecánica ............................................................................................................ 57
Figura 13 Patrones de difracción de recubrimientos; a) Recubrimiento 91A, b) 91M, c) 73A
y d) 73M ................................................................................................................................ 59
Figura 14 Micrografías en sección superficial mediante MEB en electrones secundarios para
los diferentes recubrimientos; a) 91A, b) 73A, c)91M y d)73M ........................................... 60
Figura 15 Micrografías en sección superficial mediante MEB en electrones retrodispersados
para los diferentes recubrimientos; a) 91A, b) 73A, c)91M y d)73M ................................... 61
Figura 16 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente al
recubrimiento 91A ................................................................................................................ 62
Figura 17 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente al
recubrimiento 91M............................................................................................................... 63
Figura 18 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente al
recubrimiento 91A ................................................................................................................ 64
Figura 19 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente de
recubrimiento 73M............................................................................................................... 65
vii
Figura 20 Micrografía en sección transversa por electrones retrodispersados mediante MEB
para los recubrimientos; a) y b) recubrimiento 91A a 250X y 1000X respectivamente, c) y d)
Recubrimiento 91M a 250X y 1000X respectivamente ........................................................ 66
Figura 21 Micrografía en sección transversa por electrones retrodispersados mediante MEB
para los recubrimientos; a) y b) recubrimiento 73A a 250X y 1000X respectivamente, c) y d)
Recubrimiento 73M a 250X y 1000X respectivamente ........................................................ 67
Figura 22 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS
correspondiente para recubrimiento 91A ............................................................................ 68
Figura 23 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS
correspondiente para recubrimiento 91M .......................................................................... 69
Figura 24 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS
correspondiente para recubrimiento 73A ............................................................................ 70
Figura 25 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS
correspondiente para recubrimiento 73M .......................................................................... 71
Figura 26 EDS en sección transversal de los recubrimientos; a) 91A, b) 91M, c) 73A y d) 73M
.............................................................................................................................................. 72
Figura 27 Imagen 2D de topografía mediante AFM y valores de rugosidad para las diferentes
zonas de análisis lineal para perfil de rugosidad del recubrimiento HA comercial ............. 73
Figura 28 Imagen 2D de topografía mediante AFM y valores de rugosidad para las diferentes
zonas de análisis lineal para perfil de rugosidad de los recubrimientos; a) 91A y b) 91M .. 74
viii
Figura 29 Imagen 2D de topografía mediante AFM y valores de rugosidad para las diferentes
zonas de análisis lineal para perfil de rugosidad de los recubrimientos; a) 73A y b) 73M .. 75
Figura 30 Sección superficial para los recubrimientos sometidos a ensayo de tracción para
análisis de falla; a) HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M .................................................... 81
Figura 31 Micrografías MEB de recubrimientos sometidos a inmersión en solución SBF para
precipitación de apatita a) HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M ........................................ 85
Figura 32 Imagen de apatita depositada y espectro Raman correspondiente para los
recubrimientos sometidos a inmersión SBF; a) HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e)73M ......... 86
Figura 33 Modelo de Circuito Electrónico para análisis EIS ................................................. 88
Figura 34 Diagrama de Nyquist (a la izquierda) seguida por el diagrama de Bode para
representación del análisis de impedancia electroquímica para el análisis a diferentes
concentraciones de Ca en solución SBF; a) 2.5mM, b) 4.5mM y c) 6.5mM ......................... 90
Figura 35 Imágenes obtenidas para análisis de ángulo de contacto para los recubrimientos;
HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M. .................................................................................. 92
Figura 36 Imágenes obtenidas para análisis de ángulo de contacto para los recubrimientos
sometidos a tratamiento por GD; HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M............................. 93
Figura 37Micrografías para análisis de morfología celular de HOS adheridos en sustrato de
TI6Al4V; a) y b) imágenes a 300X en modo de electrones secundarios y retrodispersados
respectivamente, c) y d) imágenes a 1000X en modo de electrones secundarios y
retrodispersados ................................................................................................................... 95
ix
Figura 38 Micrografías a 500X para análisis de morfología celular de HOS de los
recubrimientos; a) y b) HA en modo de electrones secundarios y retrodispersados
respectivamente, c) y d) 91A en modo de electrones secundarios y retrodispersados
respectivamente, e) y retrodispersados respectivamente, e) y f) 91M en modo de electrones
secundarios y retrodispersados respectivamente, g) y h) ) 73A en modo de electrones
secundarios y retrodispersados respectivamente y i) y j) 73M en modo de electrones
secundarios y retrodispersados respectivamente ............................................................... 96
x
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Propiedades mecánicas del hueso [10],[11] ............................................................ 16
Tabla 2 Biomateriales metálicos y sus principales aplicaciones........................................... 18
Tabla 3 Propiedades mecánicas de Ti6Al4V (ELI) ................................................................. 19
Tabla 4 Composición Química de Ti6Al4V ELI ...................................................................... 19
Tabla 5 Biomateriales cerámicos y aplicaciones .................................................................. 20
Tabla 6 Fases y propiedades mecánicas de circonia ............................................................ 21
Tabla 7 Principales fosfatos de calcio, formula química y relación Ca/p ............................. 23
Tabla 8 Propiedades mecánicas de la Hidroxiapatita ........................................................... 24
Tabla 9 Materiales precursores de recubrimiento ............................................................... 34
Tabla 10 Nomenclatura y composición de cada matriz ...................................................... 35
Tabla 11 Parámetros de Proyección ..................................................................................... 38
Tabla 12 Parámetros para análisis mediante nanoindentación ........................................... 40
Tabla 13 Valores de Rugosidad obtenidos mediante AFM-NC para los diferentes
recubrimientos ..................................................................................................................... 75
xi
Tabla 14 Valores obtenidos mediante análisis de nanoindentación para los diferentes
recubrimientos; Modulo elástico, dureza y Rigidez ............................................................. 78
Tabla 15 Valores obtenidos mediante análisis de falla por ensayo de adherencia mediante
norma ASTM C633-01 ........................................................................................................... 81
Tabla 16 Valores Obtenidos mediante EIS ........................................................................... 91
Tabla 17 Valores obtenidos de análisis de ángulo de contacto ........................................... 94
Tabla 18 Valores de conteo celular para los diferentes recubrimientos ............................. 97
Tabla 19 Valores obtenidos de % de citotoxicidad para los diferentes recubrimientos ...... 98
xii
INDICE DE GRÁFICAS
Grafica 1 Dureza de Recubrimientos .................................................................................... 76
Grafica 2 Valores obtenidos mediante análisis de nanoindentación para los diferentes
recubrimientos; Modulo elástico, dureza y Rigidez ............................................................. 79
Grafica 3 Análisis de liberación de iones Ag para los recubrimientos correspondientes .... 83
Grafica 4 Análisis de liberación de iones Ca para los recubrimientos correspondientes .... 84
1
2. ANTECEDENTES
En la actualidad los defectos óseos por fracturas, osteoporosis y enfermedades, son
problemas que se presentan frecuentemente tanto en pacientes de mediana edad como de
edad avanzada, motivos por los cuales se utilizan distintas técnicas quirúrgicas que
requieren amplia gama de aplicación de biomateriales destinados a la sustitución ósea.
Los implantes estructurales comúnmente utilizados para la sustitución ósea han sido de
naturaleza metálica, algunos de estos destacan los aceros inoxidables grado quirúrgico (316
L), aleaciones de circonio (OXINIUMᵀᴹ) y aleaciones de titanio (Ti6Al4V ELI). Sin embargo,
las principales fallas en este tipo de dispositivos han sido debido a procesos de
encapsulamiento por tejido fibroso, generando un mal anclaje entre prótesis y tejido, y
posteriormente fallar debido a un aflojamiento aséptico.
Dentro de las principales fallas en implantes se encuentra el aflojamiento aséptico, el cual
es una falla de tipo mecánica en la que algunas partículas originadas por desgaste o
inestabilidad química son liberadas hacia el tejido circundante, generando una enfermedad
conocida como osteólisis periprotésica. Dicha enfermedad se presenta por una respuesta
inflamatoria del tejido circundante, seguido de un rechazo del implante y un posiblemente
un recambio de prótesis. Otra de las principales fallas, dentro de las más costosas, está dado
por infecciones periprotésica causadas principalmente por bacterias como; Staphilococus
Aureus, Escherichia Coli y Pseudomona Aureginosa [6], [8] las cuales pueden ser adquiridas
durante el periodo intraoperatorio y postoperatorio. Dicha falla requiere un tratamiento
específico, el cual va desde la posible aplicación de medicamento y antibiótico hasta la
posible amputación de la extremidad afectando principalmente la salud del paciente [9].
2
Dichas fallas generan además un alto impacto económico debido al elevado costo, cifras las
cuales van desde 50,000 hasta más de 100,000 dólares por paciente.
Algunas alternativas empleadas para prevenir el aflojamiento aséptico en prótesis
estructurales son el uso de cementos en base polimérica como el polimetilmetacrilato
(PMMA), sin embargo, estas presentan algunas desventajas, siendo una de estas provocada
por la elevada temperatura alcanzada por la polimerización, la cual, promueven el
necrosamiento del tejido circundante y posteriormente un encapsulamiento, por otra
parte, debido a su naturaleza química el PMMA promueve el crecimiento bacteriano y por
ende conduciendo a una infección periprotésica.
Por otra parte una alternativa para evitar el uso de cementos óseos han sido el desarrollo
de recubrimientos basados en biomateriales cerámicos. Los actuales recubrimientos con
propiedades osteoconductoras disponibles comercialmente, principalmente los
desarrollados en base a HA y otros fosfatos de calcio, han tenido como principal objetivo
evitar el uso de cementos óseos para el anclaje de la prótesis, sin embargo estos presentan
ciertos problemas asociados a la propiedad mecánica de adherencia así como problemas
asociados a una infección periprotésica. Algunas investigaciones han tenido como principal
objetivo desarrollar recubrimientos con propiedades de adherencia superiores a los
recubrimientos actuales, por otra parte otras investigaciones buscan funcionalizar la
superficie del recubrimiento para brindarle propiedades biocidas y atacar el problema
originado por infección periprotésica. De acuerdo a esto algunos antecedentes para esta
investigación se muestran a continuación.
De acuerdo a C.Y. Yang et al. [1], la evaluación de propiedades mecánicas para los
recubrimientos obtenidos por proyección térmica en base a HA sometidos a exposición de
3
fluido corporal simulado presentan bajas propiedades mecánicas debido a la inestabilidad
del recubrimiento. En cuanto a los resultados de adherencia de los recubrimientos
desarrollados por ellos, mostraron valores de 30.98 ± 1.12 MPa con respecto al sustrato,
dichos valores disminuyeron en un rango entre 20% y 33% posterior a la exposición en
medios biológicos, indicando que esta propiedad disminuyó debido a la alta solubilidad de
fases de tetracalcio fosfato (TTCP) y tricalcio fosfato (TCP), las cuales, se presentan en gran
cantidad sobre el recubrimiento debido a la degradación de HA.
K.A. Khor et. al [2] emplean el desarrollo de un bio-recubrimiento por proyección térmica
por plasma en base a HA-YSZ, muestran diferentes relaciones en peso HA/YSZ (10, 30 y
50%P/P), con un tamaño de partícula del orden de las 34 y 30 μm respectivamente. En este
estudio los polvos precursores fueron tratados mediante molienda mecánica en molino
planetario por un tiempo de 3 horas, además fueron utilizados diferentes parámetros de
proyección térmica (600, 800 y 1000 A). Los resultados obtenidos muestran un efecto de
estabilidad térmica para la HA al aumento de la concentración de YSZ sobre la matriz del
recubrimiento en los tres diferentes parámetros de proyección, sin embargo, al aumentar
la corriente se muestra una mayor degradación de fase por parte de la HA así como un
cambio de fase de YSZ tetragonal a fase cubica, además se muestra la presencia de una
nueva fase de CaZrO3. En las imágenes mostradas en base a electrones retro dispersados,
puede observarse la presencia de fracturas sobre el recubrimiento así como aglomeración
de fases para todos los tipos de recubrimientos.
En el estudio realizado por Lei Fu et. al [3] para el desarrollo de un bio-recubrimiento en
base a HA/YSZ al 30% P/P (YSZ 8%mol), muestran la influencia del tamaño de HA (34 μm)
respecto a YSZ (3 μm), así como la influencia de un tratamiento de los polvos precursores
previo a la proyección térmica por plasma, en los cuales utilizan una molienda mecánica
4
mediante molino planetario y una esferoidización de los polvos para posteriormente su
proyección. En los resultados obtenidos muestran una mayor distribución de fases para los
polvos sometidos a una esferoidización así como una mayor adherencia del recubrimiento
hacia el sustrato, debido a esta mayor homogeneidad de fases sobre el recubrimiento
teniendo valores de 43.24 MPa a diferencia de los recubrimientos sometidos únicamente a
molienda mecánica, los cuales presentaron un valor de adherencia de 25.18 MPa.
Michel R. Dayton et al [4]. muestran un análisis de fallas por aflojamiento aséptico para los
diferentes tipos de implantes: cementados, no cementados e implantes recubiertos
mediante HA. De acuerdo a los diversos análisis, se observa una mayor incidencia de falla
por aflojamiento aséptico en los implantes cementados, con un índice de falla de 5 - 20%
para pacientes con revisión a 5 años y, de un 10 - 40% para pacientes en revisión a 10 años,
lo anterior puede ser ocasionado por los diferentes tratamientos para prótesis cementadas.
Por otra parte, las fallas a corto plazo se presentan más comúnmente en las prótesis no
cementadas y finalmente, las prótesis recubiertas mostraron un mayor anclaje debido a la
regeneración ósea.
De acuerdo con D. Marsland et al.[5], un estudio del tipo de fracturas así como el
tratamiento para pacientes con artroplastia total, muestran en pacientes con osteoporosis
o enfermedades relacionadas con el hueso, que el uso de prótesis con recubrimiento
osteoconductor en la sección total del vástago puede llegar a reducir el índice de fractura
del fémur, así como reducir el efecto de desgaste óseo que se presenta frecuentemente en
prótesis no cementadas.
De acuerdo con los estudios realizados por V. Orozco et al.[6], los recubrimientos en base
a polvos de Hidroxiapatita comerciales con un 1% (P/P) de nanopartículas de plata
5
obtenidas mediante una síntesis verde a partir de extracto de nopal, presenta un 99% de
eficiencia antibacterial ante bacterias tales como Staphilococus Aureus, Escherichia Coli y
Pseudomona Aureginosa.
De acuerdo con S. Bose et. al.[7], los recubrimientos desarrollados a base de de
hidroxiapatita (HA), oxido de plata(Ag2O) al 2% (P/P) y oxido de estroncio (SrO) al 1%(P/P),
presentan una alta eficiencia antibacterial ante Pseudomona Aureginosa. Los ensayos in
vitro mostraron una buena actividad celular, principalmente para los recubrimientos de HA-
SrO (1%), sin embargo la actividad citotóxica por parte de los recubrimientos desarrollados
con un contenido de 2% de Ag2O mostraron cierta respuesta citotóxica a nivel celular. La
adherencia alcanzada por parte de los recubrimientos fue alrededor de los 16MPa, la cual
ellos reportan como una adherencia aceptable.
Los estudios in vitro realizados por X. Bai.[8], en recubrimientos de hidroxiapatita
funcionalizada con plata a diferentes concentraciones en peso (P/P), muestran una
tendencia en la que la concentración de Ag en la matriz del recubrimiento está ligada con
la eficiencia antibacterial y respuesta citotóxica celular. Las concentraciones ideales de Ag
para una buena respuesta antibacterial y baja respuesta citotoxicidad van desde 1% a 3%
(P/P).
6
3. JUSTIFICACIÓN
La necesidad de desarrollar un recubrimiento osteointegrador multifuncional que cuente
con propiedades mecánicas superiores a los biorecubrimientos osteointegradores actuales,
los cuales son aplicados en vástagos de prótesis total de cadera y prótesis total de rodilla.
Además mediante la integración de nanopartículas de plata brindar las propiedades
biocidas, las cuales favorecerán en disminuir los casos de aflojamiento aséptico en
pacientes sometidos a cirugía de implante de tipo estructural como una artroplastia total
de cadera (ATC) y artroplastia total de rodilla.
4. OBJETIVO
Desarrollar un bio-recubrimiento osteoconductor multifuncional con propiedades
mecánicas superiores a los actualmente disponibles, lo cual ayudara en la disminución de
problemas ortopédicos asociados a procesos de aflojamiento aséptico, promoviendo la
regeneración de tejido óseo circundante a la prótesis evitando el uso de cementos óseos y
disminuyendo el suministro de fármacos para la prevención de cuadros infecciosos.
4.1 Objetivos específicos
Evaluar el efecto mecánico, de biocompatiblidad, de osteointegración, y
citotoxicidad, que presentan los recubrimientos desarrollados en la presente tesis al
modificar la matriz de HA-nAg mediante la adición de nanopartículas de óxido de
circonio y variando el método de homogenización de los polvos.
Mediante las técnicas específicas evaluar propiedades mecánicas tales como
adherencia, módulo de Young y dureza del recubrimiento.
7
Mediante técnicas específicas corroborar la biocompatibilidad que se tiene en la
superficie del recubrimiento así como la afinidad para promover la mineralización
de la matriz celular.
8
5. HIPÓTESIS
La integración de nanopartículas de óxido de circonio (estabilizado con oxido de
itrio (Y2O3) 8%) a la matriz del recubrimiento osteoconductor en base a HA-nAg
permitirá incrementar propiedades mecánicas tales como dureza y adherencia,
conservando las propiedades de osteconducción y biocidas propias de un
recubrimiento de HA-nAg.
El procesamiento de los polvos en estudio mediante molienda mecánica, permitirá
mejorar la distribución de fases entre HA/YSZ, lo cual promoverá propiedades más
homogéneas sobre el recubrimiento, teniendo un impacto positivo para los
diferentes ensayos a analizar.
9
6. MARCO TEÓRICO.
En esta sección se hablara de algunos conceptos básicos importantes los cuales está
dedicada la presente investigación. De manera introductoria se hablara del tejido óseo, su
clasificación y algunas propiedades las cuales son importantes conocer. En segunda parte
se hablara de los conceptos básicos de biomateriales, clasificación y aplicaciones de dichos
materiales en el desarrollo de implantes estructurales con propiedades osteoconductoras.
Como tercera parte se hablara de conceptos básicos de los implantes así como del métodos
de funcionalización de superficie mediante recubrimientos por proyección térmica
aplicados en la bioingeniería para la regeneración de tejidos.
6.1 Tejido Óseo
El hueso es un tejido conjuntivo especializado, cuya composición, organización y dinámica
química brinda soporte al cuerpo así como intervenir en procesos de homeostasis mineral,
ya que conforma la reserva principal de minerales en el organismo. El tejido óseo está
constituido en su mayor parte por matriz extracelular, sin embargo, es uno de los sistemas
más dinámicos del organismo ya que experimenta fenómenos de crecimiento, modelado,
remodelado y reparación [9].
El tejido óseo se compone de diferentes tipos de células cuya función es primordial para el
desarrollo, crecimiento y regeneración del tejido óseo [9].
Células osteoprogenitoras.- La células osteoprogenitoras o células madre ósea, son células
indiferenciadas. Está es una célula en reposo capaz de sufrir una diferenciación celular,
transformándose en un osteoblasto y secretar matriz ósea, además de los osteoblastos estas
pueden diferenciarse en otros tres tipos: adipositos, condroblastos y fibroblastos. Estas células
10
se encuentran en las superficies externas e internas de los huesos (células del periostio
y células del endostio).
Osteoblastos.- Estas células se encargan de secretan la matriz extracelular del tejido
óseo para su posterior mineralización (transformación de osteoblasto a osteocito).
El principal producto de los osteoblastos maduros es el colágeno de tipo I que
constituye el 90% de las proteínas del hueso. Pero, además, producen otras
proteínas como la osteocalcina y las proteínas Gla matriciales, y glicoproteínas
fosforiladas incluyendo las sialoproteínas I y II, la osteopontina y la osteonectina. Las
principales proteínas con actividad enzimática producidas por los osteoblastos son
la fosfatasa alcalina y la colagenasa.
Osteocitos.- Es la célula ósea madura rodeado de la matriz ósea mineralizada
producto de la diferenciación del osteoblasto, los osteocitos están interconectados
por un sistema de canalículos aunque ya no excretan materiales de la matriz. Los
osteocitos pasan por varias fases de maduración hasta que quedan completamente
rodeados por la matriz y se mantienen en un estado de aparente reposo.
Células de revestimiento óseo.-Estas células su principal función es el transporte de
minerales y nutrientes a las células óseas adyacentes, principalmente osteocitos.
Estas se encuentran en la superficie del tejido óseo que no presenta actividad o
crecimiento activo.
Osteoclastos.- Son las células multinucleadas de mayor tamaño encargadas de la
resorción ósea, las cuales se encuentran principalmente en la superficie del tejido
óseo. Estas células son producto de la fusión de células hematopoyéticas de la
medula ósea. Estas células participan en procesos de crecimiento, reparación y
remodelado óseo.
11
6.1.1 Composición
El tejido está compuesto por una matriz ósea que representa alrededor de un 98% y por
células específicas las cuales corresponden a un 2%. El tejido óseo está conformado por
una fase orgánica y una fase inorgánica [9]
Fase Orgánica
La fase orgánica está constituida principalmente por proteínas colagenas, principalmente
de colágeno tipo I y tipo V (estas últimas en menor proporción); estas representan entre
un 85-90% de la fracción orgánica, las cuales tienen como función darle soporte y resistencia
al tejido ante los esfuerzos de tracción, permitiendo la flexibilidad del tejido.
El resto de la fase orgánica lo conforman proteínas no colagenas, en las cuales se encuentra
las macromoléculas de proteoglicanos, glicoproteínas multiadhesivas, factores de
crecimiento, osteocalcina y fosfatasa alcalina [9]. La fosfatasa alcalina es la enzima hidrolasa
responsable de la retirada de grupos de fosfatos de varias moléculas, como los alcaloides,
los nucleótidos y las proteínas. La fosfatasa alcalina juega un papel importante en procesos
de calcificación de los cartílagos y de los huesos, además interviene en la reabsorción, y
regeneración de los huesos removiendo una capa de fosfato que está presente en la
superficie de estos. Por otra parte la fosfatasa alcalina también tiene un rol importante en
la actividad celular tanto a nivel metabólico como reproductivo como lo es la síntesis de
proteínas, la síntesis del ADN, ya que es capaz de hidrolizar tanto al ADN como al ARN [9]
Fase Inorgánica
La fase inorgánica está conformada principalmente por fosfato cálcico de tipo amorfo y
cristalino, en forma de pequeños cristales de hidroxiapatita mineral, la cual se presenta en
forma de aguja, y estructura hexagonal de 2-7 ƞm de diámetro y de 5-10 ƞm de longitud.
12
Esta fracción tiene una estructura sólida continua, los cristales de hidroxiapatita se
encuentran orientados con su eje paralelo a las fibras de colágeno tipo I.
6.1.2 Estructura Macroscópica del Tejido Óseo
El tejido óseo posee una estructura macroscópica en la cual se encuentra el tejido esponjoso
o trabecular, el cual representa alrededor del 20% del volumen total del hueso, el cual se
encuentra en continuidad con el tejido óseo cortical o compacto, que corresponde
aproximadamente al 80%. Dichas estructuras presentan características propias específicas
[9].
Hueso Esponjoso.- Está conformado por trabéculas óseas ramificadas, que se
orientan de manera paralela a las líneas de fuerza y limitan un sistema de espacios
intercomunicados, ocupados por la médula ósea. El hueso esponjoso se encuentra
en el esqueleto axial, en las epífisis y metáfisis de los huesos largos, y en los huesos
planos, teniendo la capacidad de resistir fuerzas de comprensión y tensión.
Hueso Cortical.- Está constituido por una masa sólida y continua cruzada por una
red de finos conductos longitudinales y transversales, conocidos como canales de
Havers y conductos de Volkmann respectivamente, los cuales alojan vasos
sanguíneos y fibras nerviosas. Predomina en el esqueleto apendicular, conformando
la diáfisis de los huesos que adopta la forma de un cilindro hueco para contener la
médula ósea. Sus características particulares lo hacen resistente a las fuerzas de
flexión, torsión y cizallamiento.
Periostio.- Lo conforma tejido conjuntivo denso, el cual, se encuentra alrededor del
hueso en crecimiento activo. Lo conforma una capa fibrosa superficial y una capa de
células osteoprogenitoras
13
Los huesos del esqueleto presentan diferentes formas y tamaños que se relacionan con su
función específica.
Respecto a su estructura global, el tejido óseo está constituido por diferentes fases sólidas
y líquidas, según su madurez, el tejido óseo se clasifica en fibrilar y laminar [9].
Hueso Fibrilar.- Está considerado como un hueso inmaduro o primitivo y
normalmente se encuentra en los embriones y recién nacidos, en los callos
formados en el período de remodelación después de una fractura y en la región de
la metáfisis de los huesos en crecimiento. Este tipo de huesos tiene fibras gruesas
que no están orientadas uniformemente. Tiene más células por unidad de volumen
que el hueso laminar, su contenido mineral varía y las células están dispersas al azar.
El hecho de que las fibras de colágeno estén desorientadas le confiere a este tipo de
hueso isotropía con respecto a las características mecánicas del tejido.
Hueso laminar.- Se comienza a formar un mes después del nacimiento, por lo que
este tipo de hueso es más maduro que el fibrilar y de hecho se forma a partir del
proceso de remodelación del hueso inmaduro. Al contrario del tipo anterior, en el
hueso laminar, las fibras de colágeno están altamente organizadas y orientadas, lo
cual le confiere propiedades anisotrópicas, es decir, el comportamiento mecánico
de esta clase de hueso varía dependiendo de la orientación de las fuerzas aplicadas,
teniendo la mayor resistencia en dirección paralela al eje longitudinal de las fibras
de colágeno.
6.1.3 Estructura Microscópica del Tejido Óseo
Desde el punto de vista microscópico, el hueso se divide en tres tipos: plexiforme,
haversiano y laminar [9].
Hueso Plexiforme.- Corresponde a un hueso inmaduro que se encuentra en el tejido
óseo esponjoso y cortical de los individuos en crecimiento, por lo que durante la
14
maduración es sustituido gradualmente por hueso. Este tipo de hueso está ausente
en el esqueleto adulto, aunque se puede formar cuando se acelera la producción de
matriz ósea, como ocurre en los callos de fractura y tumores óseos.
Hueso Haversiano.- Se encuentra constituido por un conjunto de láminas
concéntricas, denominadas osteonas o sistemas de Havers, con un diámetro de
alrededor de 200 μm y una longitud de 1-2 cm, poseen un eje neurovascular central,
denominado canal haversiano, que está recubierto por osteoblastos y células
osteoprogenitoras. Las osteonas están conformadas por alrededor de 4-20 láminas
óseas, entre las cuales se localizan los osteocitos. posee una menor resistencia
mecánica y un sistema circulatorio menos eficiente que el del hueso laminar.
Hueso Laminar.- Las trabéculas del hueso esponjoso y los sistemas circunferenciales
del hueso compacto están compuestos por una serie de láminas óseas paralelas
entre sí. Las láminas tienen un espesor que oscila entre 3-7 μm, y están formadas
por fibras de colágeno dispuestas paralelamente unas con otras, aunque presentan
una orientación distinta respecto de las fibras de láminas vecinas. En la interface
entre las láminas óseas se encuentran las cavidades osteocitarias con sus
correspondientes células, cuya nutrición depende de los canalículos existentes en la
matriz ósea, los que permiten el intercambio de moléculas e iones entre los capilares
sanguíneos y los osteocitos.
15
En la figura 1 se muestra la estructura jerárquica del hueso.
6.1.4 Propiedades mecánicas del hueso
El comportamiento mecánico de un material puede ser descrito completamente por un
grupo de propiedades, sin embargo, el comportamiento mecánico de una estructura ósea
entera es mucho más complejo de predecir, ya que es el resultado de las propiedades de
cada uno de sus componentes, de su distribución geométrica en el espacio así como
factores biológicos que pueden influir directamente en las propiedades mismas del hueso.
A grandes rasgos las propiedades mecánicas del hueso dependerán principalmente del tipo
de tejido al cual pertenece, principalmente clasificado como tejido cortical (longitudinal y
transversal) y tejido trabecular o esponjoso. En la tabla 1 se muestran algunas propiedades
mecánicas del hueso para los diferentes tejidos óseos [10-11]
Figura 1 Estructura jerárquica del tejido óseo
16
Tabla 1 Propiedades mecánicas del hueso [10],[11]
Hueso Cortical Hueso Trabecular
Longitudinal Transversal
Módulo de Young (GPa) 17-20 6-13 0.05-0.1
Resistencia a la compresión (MPa) 131-224 106-133 5-10 Resistencia a la tensión (MPa) 78-150 51-56 2-5
6.2
6.3 Biomateriales
El gran avance que ha tenido la ciencia y la tecnología, a impactado en la creación de nuevos
biomateriales con propiedades específicas, además de buscar procesos económicos y
sencillos para su fabricación y obtención [10], [12-15]
En base a diferentes fuentes, podemos definir a los biomateriales como aquellos
dispositivos capaces de interactuar con un tejido biológico sin generar una respuesta
negativa cuyas propiedades marcan una línea estricta para considerarlos como tal [12-15].
Las principales funciones y aplicaciones de estos se encuentra en el reemplazo de
extremidades, nexos, tejidos y órganos. Los biomateriales también son utilizados como
dispositivos para rehabilitación, fines estéticos, almacenamiento de tejidos y como
vehículos de medicamentos [12-14].
Los biomateriales cuentan con propiedades especiales que marcan una línea estricta que
los diferencia ante cualquier material para su uso como tal, dentro estas propiedades se
destacan las siguientes [12-14], [16]:
17
Biocompatibilidad.-Es aquella cualidad de los materiales en generar una respuesta
positiva en el tejido huésped sin generar un rechazo por el medio biológico, además
de no modificar el tejido o promover la muerte celular.
Citotoxicidad nula.- Es el tipo de respuesta que debe tener un biomaterial al entrar
en contacto con el tejido orgánico, no generar una reacción alérgica, toxica o
promover la modificación y muerte celular
Propiedades mecánicas adecuadas.- Los materiales dentro de un cuerpo biológico,
sobre todo los que están destinados al sistema locomotor, son expuestos a grandes
esfuerzos mecánicos, por lo que la selección del material adecuado será primordial
para efectos de la vida útil del biomaterial
o Resistencia a la fatiga aplicada por una tensión
o Elasticidad y rigidez del material para soportar cargas sin deformación
o Elongación del material por tensión
o Alta tenacidad a la fractura para evitar la propagación de grietas y posibles
fracturas por soportar una carga o tensión.
Estabilidad química.- Que sean principalmente inertes, es decir, los que no
presentan alguna reacción con el tejido, deberán soportar el ambiente agresivo del
cuerpo. Los fluidos corporales son ricos en electrolitos los cuales generan un
ambiente agresivo principalmente para los materiales metálicos y poliméricos,
ocasionando una desestabilidad química y por ende una degradación de los
materiales, cambiando la estructura e incluso la biocompatibilidad de los materiales.
Sin embargo, en la actualidad algunos materiales están diseñados para interactuar
con el sistema biológico, por lo que, su estabilidad química implica que solo se lleve
a cabo una reacción especifica.
18
Que sea esterilizable.- Algunas técnicas de esterilización llegan a ser poco adecuadas
en algunos materiales, las cuales incluso llegan a ocasionar una transformación y/o
degradación en su estructura química o cristalina.
Diseño y arquitectura perfecta.- El diseño y modelación del implante debe ser
adecuado, incluso perfecto para que este pueda desempeñar la función del tejido,
articulación o parte del cuerpo el cual sustituirá.
Los biomateriales pueden ser clasificados de acuerdo a su naturaleza u origen, dentro de
esta clasificación podemos encontrar los materiales de tipo: metálico, polimérico,
cerámicos y materiales compuestos [12], [13], [17], [19-22]. La selección entre uno u otro,
dependerá principalmente de sus propiedades específicas.
6.3.1 Biomateriales metálicos
El uso de este tipo de materiales es principalmente de carácter estructural. Los materiales
metálicos presentan propiedades mecánicas superiores a los demás materiales utilizados
en la fabricación de implantes [9],[15],[16], [23], dentro de sus propiedades mecánicas
destaca la resistencia al desgaste, resistencia a la fractura, resistencia a la fatiga, tenacidad
y buena elasticidad, sin embargo una de las principales desventajas de estos, es la
degradación o baja estabilidad química en soluciones ricas en electrolitos. Las aplicaciones
de estos varían dependiendo de las propiedades mecánicas (ver tabla 2).
Tabla 2 Biomateriales metálicos y sus principales aplicaciones
Metal o Aleación Aplicación
Titanio y Aleaciones de Titanio Tornillos ortopédicos, placas o uniones ortopédicas, prótesis dentales, compuestos para articulaciones ortopédicas artificiales (rodilla,
19
cadera, discos, etc.), stents vasculares, coraza para marcapasos.
Acero Inoxidable (316L) Stents vasculares, placas o uniones ortopédicas, prótesis dentales, compuestos para articulaciones ortopédicas artificiales
Oro y Platino Amalgamas, rellenos dentales, prótesis dentales, electrodos para implantes cocleares
Aleación de Cobre-Plata-Estaño Amalgamas dentales. Aleaciones de Cromo-Cobalto Implantes dentales, rellenos, amalgamas.
Titanio
La aleación más utilizada en el diseño de implantes estructurales ha sido por preferencia la
aleación Ti6Al4V (ELI), debido a su gran estabilidad química así como propiedades
mecánicas adecuadas (ver tabla 3) [21].
Tabla 3 Propiedades mecánicas de Ti6Al4V (ELI)
E (GPa) UTS (GPA) Dureza (HRC)
Ti6Al4V (ELI) 114 860 30-35
En la tabla 4 se muestra la composición química de la aleación Ti6Al4V ELI [21].
Tabla 4 Composición Química de Ti6Al4V ELI
Aluminio Vanadio Carbono Hierro Oxigeno Nitrógeno Hidrogeno Titanio
5.5 - 6.5%
3.5 - 4.5%
0.08% <0.25% <0.13 <0.05 <0.012 balance
En artroplastia total de cadera, los implantes a base de esta aleación presentan además de
gran estabilidad, un menor índice de falla debido a la fractura del vástago femoral, principal
falla para las aleaciones de acero inoxidable debido a sus deficientes propiedades
mecánicas. Otra de sus cualidades, ha sido su capacidad de regeneración ósea debido a la
20
interacción entre el tejido óseo y el TiO2 superficial, sin embargo este oxido presenta una
baja estabilidad mecánica, por lo que, cualquier esfuerzo sobre la superficie puede generar
el desprendimiento de la capa pasiva y, generar desde reacciones alérgicas e inflamatorias,
hasta el rechazo de la misma prótesis forzando a un recambio.
6.3.2 Biocerámicos
Se caracterizan por ser compuestos inorgánicos no metálicos. Este tipo de materiales
presentan una gran estabilidad química a diferencia de los materiales metálicos, los cuales
promueve un encapsulamiento de la prótesis por tejido fibroso, la cual conlleva a una de
las principales fallas de dichos materiales metálicos. Una propiedad sobresaliente de alguno
de estos es su capacidad de interaccionar con los tejidos biológicos adyacentes,
principalmente en tejido óseo, favoreciendo en algunos casos la reabsorción y
osteoconducción. La desventaja en estos materiales son sus bajas propiedades mecánicas
al presentar una alta fragilidad [10], [12-14], [20], [24]. Algunos materiales cerámicos y sus
aplicaciones se presentan en la siguiente tabla (ver tabla 5):
Tabla 5 Biomateriales cerámicos y aplicaciones
Cerámico Aplicación
Óxidos de aluminio Compuestos para articulaciones ortopédicas artificiales, implantes
de carga inmediata (implantes dentales), recubrimientos para implantes.
Óxidos de zirconio Implantes dentales y Compuestos para articulaciones ortopédicas
artificiales. Fosfatos de calcio (Hidroxiapatita)
Recubrimiento bioactivo de implantes estructurales y dentales, implantes dentales, injertos para sustitución ósea.
Bio-vidrios Recubrimiento bioactivo en implantes estructurales y dentales,
implantes dentales, implantes para reconstrucción facial, cementos óseos e injertos para sustitución ósea.
21
Biocerámicos inertes: Circonia (ZrO)
La circonia u oxido de circonio es un material del tipo cerámico, que a diferencia de los
otros materiales cerámicos como la alúmina o el óxido de magnesio, presenta una mejor
estabilidad química y biocompatibilidad dentro del tejido huésped [2],[10], [20], [25-28]. Es
un material multifacético además de contar con propiedades mecánicas necesarias para el
desarrollo de prótesis resistentes al desgaste y a la fatiga ocasionado por las cargas cíclicas,
originadas por el movimiento durante las actividades de la vida cotidiana (ver tabla 6 [10]).
Su uso destaca principalmente en el desarrollo y fabricación de implantes dentales y
cabezas femorales para implantes articulares de cadera.
Tabla 6 Fases y propiedades mecánicas de circonia
Fase Temperatura de fase (ºC)
Densidad Resistencia a la flexión
(MPa)
Dureza (HV)
Módulo de Young
(GPa)
Monoclínica 0-1200 5.68 1000 1100-1300 210
Tetragonal 1200-2370 5.86 600-950 1100-1250 200-210
Cubica 2370-2690 6.29 200 1100-1250 200-210
El uso de agentes estabilizantes le permite a la circonia mantenerse en fase tetragonal o
cubica a temperatura ambiente [10], [20]. Las fases más utilizadas en el desarrollo de
biomateriales ha sido la fase cubica o tetragonal, sin embargo, la fase tetragonal
parcialmente estabilizada (3%mol Y2O3) presenta una degradación a fase monoclínica en
ambientes húmedos y temperaturas de 37° C, dicho cambio de fase genera un cambio de
22
volumen en el material (alrededor de un 7%), el cual, llega a fragilizarse ocasionando su
fractura debido a los esfuerzos residuales asociados al cambio de fase. Dentro de los
principales estabilizantes podemos encontrar [10], [20]:
Oxido de Ytrio (Y2O3)
Oxido de Aluminio (Al2O3)
Oxido de Calcio (CaO)
Oxido de Magnesio (MgO)
La proporción y la temperatura son esenciales para la estabilización de una fase, además
cada agente estabilizante le dará propiedades mecánicas características.
6.3.3 Biocerámicos osteoconductores
El estudio para el desarrollo de biomateriales osteoconductores se remonta desde los años
20´s, donde F.H Albee y H. Morrison realizaron estudios para el desarrollo de materiales
para restauración ósea en base a polvos de fosfato tricálcico [29]. En la actualidad existe
una gran cantidad de biocerámicos diseñados principalmente como materiales
osteoconductores, entre los cuales destacan los compuestos basados en fosfatos de calcio,
siendo los más comúnmente utilizados: la hidroxiapatita (HA), los fosfatos tricálcico (α-TCP
y -TCP), el fosfato dicálcico di hidratado (DCPD), el fosfato dicálcico anhidro (DCPA) y el
fosfato tetracálcico (TTCP) [10],[12],[20], [24]. La principal razón de su uso es que presentan
similar composición química al hueso, permitiendo el intercambio de algunos iones cuando
se encuentran en contacto con fluidos biológicos, además estos presentan una excelente
biocompatibilidad, que una vez introducidos en un cuerpo biológico estos favorecen el
23
crecimiento del tejido óseo en la superficie. En la tabla 7, se muestra la relación Ca/P para
los diferentes compuestos en base a fosfatos de calcio.
Tabla 7 Principales fosfatos de calcio, formula química y relación Ca/p
Nombre Abreviatura Formula Química
Relación Ca/P
Hueso Humano -- -- 1.6-1.71
Fosfato Tetracálcico TTCP Ca4O(PO4)2 2.0
Hidroxiapatita HA Ca10(PO4)6(OH)2 1.67
Hidroxiapatita deficiente en calcio DCHA Ca9(PO4)6(OH)2 1.5
Fosfato tricálcico (α y β) TCP Ca3(PO4)2 1.5
Fosfato dicálcico anhidro DCPA CaHPO4 1.0
Fosfato dicálcico dihidratado DCPD CaHPO4*2 H2O 1.0
Factores de bioactividad en biocerámicos osteoconductores
Además de la composición química y estructura, el principal factor de bioactividad para este
tipo de biomateriales es la solubilidad, la cual está fuertemente ligada con sus propiedades
fisicoquímicas. Sin embargo, la cinética de biodegradación/biorreabsorción de estos
materiales de implante no debe ser tan rápida, ya que a una absorción rápida no permitirá
la colonización por osteoblastos, repercutiendo en la estabilidad del implante, su anclaje y
en el crecimiento del hueso.
Hidroxiapatita
24
La hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2] forma parte del grupo de las apatitas, es un
compuesto cerámico el cual ha sido estudiado y utilizado como biomaterial para promover
la regeneración de hueso debido a sus propiedades osteointegradoras [10], [14],[20],[23-
25], [28], [30]. A diferencia de los otros compuestos de fosfatos de calcio como lo son
fosfatos tricálcico (α-TCP y -TCP) y fosfato tetracálcico (TTCP), la HA presenta una relación
Ca/P similar a la del hueso humano (1.60-1.71). Además la HA presenta una baja solubilidad
al estar en contacto con un fluido corporal, por lo que, ha sido utilizado en la ingeniería
médica principalmente para el desarrollo de dispositivos osteointegradores ya sea para
estar presente en una matriz polimérica y cerámica o en forma de recubrimiento para
implantes metálicos, sin embargo, se ha reportado que es un material con propiedades
mecánicas débiles como recubrimiento (ver tabla 8 [3]), por lo que las fallas de estos han
sido debido al desprendimiento o generación de partículas debido al desgaste. La
adherencia de los recubrimientos va ligada principalmente con la técnica de deposición,
siendo la aplicación por proyección térmica por plasma una de las más utilizadas y más
prometedoras, ya que promueve un anclaje superior a diferencia de las otras técnicas de
deposición como sol gel, coprecipitación, deposición mediante plasma electroquímico y
sputtering.
Tabla 8 Propiedades mecánicas de la Hidroxiapatita
Propiedad
Densidad (g/cm3) 3.156
Dureza (HV) 500-800
Resistencia a la tensión(MPa) 40-100
Resistencia a la compresión(MPa) 100-900
Resistencia a la flexión (MPa) 20-80
Módulo de Young (GPa) 70-120
25
6.4 Implantes
Se define como implante a cualquier dispositivo que se encuentra en contacto con el medio
biológico sin generar una respuesta negativa [12],[13].
El uso de implantes en la actualidad ha ido en aumento. Gracias al avance en la ciencia y la
tecnología ha sido posible llegar a suplir órganos o nexos del cuerpo, inclusive algunos
implantes pueden favorecer la regeneración de tejidos, esto se logra gracias a la creación
de andamios sintéticos, que pueden o no contener fases, que ayudan o estimulan el
crecimiento del tejido adyacente.
En la actualidad existen más de 2600 tipos de implantes o aparatos médicos [12], de los
cuales los implantes más comunes a nivel mundial destacan [12], [13]:
Prótesis de válvula de corazón
Implante total de cadera
Implante total de rodilla
Marcapasos
Implantes dentales
Lentes intraoculares
Dispositivos de asistencia ventricular
6.4.1 Respuesta biológica de implantes
La implantación de materiales en el cuerpo genera una serie de reacciones en cadena
debido a la lesión de tejidos durante el proceso de implantación. La respuesta a la lesión
depende de múltiples factores dependiendo al grado de la lesión, la pérdida de las
26
estructuras de la membrana basal, las interacciones del implante-sangre, adsorción de
proteínas, formación de la matriz provisional, la medida o el grado de necrosis celular y la
medida de la respuesta inflamatoria. Estos eventos, a su vez, pueden afectar el grado de
formación de tejido de granulación, la reacción hacia el cuerpo extraño y la fibrosis o
desarrollo de cápsula fibrosa, siendo esta última una de las principales fallas en implantes
por falta de biocompatibilidad [14],[17], [30-32].
La adsorción de proteínas en la superficie del material juega un papel importante en la
respuesta del implante y el medio biológico, dentro de las proteínas que se encuentran en
la respuesta inflamatoria se encuentra la albumina, fibrinógeno, fibronectina y globulina,
las cuales, regulan la respuesta inflamatoria y cicatrización de los tejidos adyacentes [33].
Una mala absorción de proteínas conlleva a un encapsulamiento de la prótesis. Algunos
factores que determinan la adsorción se encuentra; estabilidad química, sitios activos,
rugosidad e hidrofobicidad, siendo estos últimos que juegan un papel importante en la
respuesta debido a la adsorción de proteínas [31]
6.4.2 Fallas de implantes “Aflojamiento aséptico”
Se le conoce como aflojamiento aséptico al rechazo que tiene un implante dentro del
sistema biológico y, es uno de los principales motivos para un procedimiento de revisión o
hasta intervención de reimplante.
Las causas principales por las que ocurre un aflojamiento aséptico son:
Infección periprotésica
Mal anclaje de la prótesis debido a la fibrosis
27
Distribución inadecuada de cargas debido a un mal diseño
Osteólisis periprotésica
Lesiones habituales en el tejido
6.5 Artroplastia total de cadera
La artroplastia total de la cadera ha sido uno de los hitos más importantes de la cirugía
ortopédica, ya que ha tenido grandes avances a lo largo de su historia. En los primeros
intentos de sustituir una cadera lesionada por un elemento artificial fue necesario emplear
una gran variedad de materiales, que fueron desde materiales polimericos como el
metilmetacrilato (MMA), nylon, hasta algunas aleaciones commo el Vitallium, aceros
inoxidables, aleaciones de Cr-Co y las actualmente aleaciones de Ti, algunos teniendo un
mayor o menor éxito [34].
Prótesis Cementadas
A principios de los años 60, Sir John Charnley introdujo a la práctica ortopédica la
artroplastía de cadera de baja fricción con vástagos cementados pulidos. El uso de prótesis
cementadas han tenido como finalidad obtener una mayor adherencia de éstas sobre los
tejidos adyacentes a largo plazo, sin embargo, estudios recientes han demostrado que
estos presentan diversas fallas debido a la naturaleza de estos componentes y propiedades
físicas, los cuales tienden a provocar un aflojamiento aséptico[34] [35].
El cemento óseo consta de dos componentes, un líquido y otro en forma de polvo, las cuales
deben ser mezcladas previas a su uso. Su composición considera cerca de un 88 % del peso
del componente en forma de polvo, siendo constituida por partículas de poli
metilmetacrilato (PMMA) o copolímeros aleatorios, en su mayor parte metilmetacrilato
28
(MMA), junto con una pequeña cantidad de otros monómeros como el estireno; el resto lo
conforman sulfato de bario o de dióxido de zirconio, así como también el peróxido de
benzoilo, que es un iniciador de la polimerización. El componente líquido es el monómero
(MMA), el cual también contiene N-N dimetilptoluidina (DMPT) activador de polimerización
e hidroquinona, la cual, tiene un efecto retardador de la polimerización. Cuando se mezclan
los componentes, se produce una rápida reacción del peróxido de benzoilo (del polvo) con
el DMPT (del líquido). Esta reacción libera radicales benzoilos que promueven la
polimerización de los MMA. Esta polimerización alcanza de 50 a 100 °C entre los 5 y 15
minutos, además de desprender algunos vapores de origen aromático que pudiesen
representar un riesgo citotóxico e incluso cancerígenos [35].
Las temperaturas alcanzadas durante el proceso de polimerización del cemento logran la
desnaturalización de proteínas, las cuales se encuentran cerca de los 50 a 60 °C, así como
también la osteonecrósis, que se encuentran alrededor de los 80 a 100 °C. Lo cual tiene
como resultado la formación de tejido fibroso debido a la cicatrización del tejido adyacente
y encapsulamiento de la prótesis, pudiendo significar el rechazo o aflojamiento aséptico.
Prótesis no cementadas
El uso de prótesis no cementadas ha tenido una mayor aplicación en las últimas décadas
debido a los problemas principales que se tiene con las prótesis no cementadas, este tipo
de prótesis es insertado a presión para evitar un aflojamiento o dislocación, sin embargo,
las principales fallas de estos han sido la osteólisis periprotésica y la fácil fractura del hueso
femoral debido al estrés que sufre durante la inserción de la prótesis [34],[35], [36].
Prótesis recubiertas
29
Debido a los múltiples riesgos asociados a las prótesis cementadas y no cementadas,
surgieron investigaciones y desarrollo de prótesis con recubrimientos que cuenten con
propiedades multifuncionales, dentro de estos recubrimientos utilizados se destaca los de
HA y otros fosfatos de calcio, los cuales, promueven el crecimiento de tejido óseo
circundante a la prótesis para promover un anclaje de esta misma sin la necesidad de uso
de cementos que pudiesen alterar el tejido circundante, sin embargo, debido a las
propiedades mecánicas y químicas de estos recubrimientos ha puesto en discusión su uso
y aplicación [37-39].
6.6 Principales fallas en artroplastia total de cadera
El aflojamiento aséptico relacionado con prótesis articulares e implantes estructurales
como lo son la artroplastia total de cadera (ATC) constituyen actualmente un problema de
salud pública a nivel mundial. Estadísticamente cerca del 60-71% de los pacientes
sometidos a una ATC sufre de un aflojamiento aséptico, en los cuales destacan
principalmente la osteólisis, dislocación e infección periprotésica, siendo este último el peor
de los casos debido a su alto costo y tiempo de recuperación[40], [41].
Los casos de osteolísis periprotésica tienen una incidencia que va de 1 a 46%, la cual, es
causada principalmente por una mala selección de los biomateriales o por la misma
condición del paciente [37] [38]. En artroplastia total de cadera esta falla es común en
implantes cementados y no cementados fabricados principalmente por acero inoxidable,
donde el desgaste del material, sumado con su alta inestabilidad ante fluidos corporales
genera el desprendimiento y acumulación de partículas provocando así la reacción alérgico-
inflamatoria del paciente.
30
Por otra parte, en cuanto a la falla debido a infección, en México se tiene registro que el
8.4% de los pacientes sometidos a una intervención de ATC tiene probabilidad de infección
[23]. Las complicaciones van desde una inflamación hasta el desbridamiento del implante,
en el caso de una infección aguda esta puede ocasionar una necrosis del tejido seguida de
una amputación e incluso la muerte (principalmente en pacientes con edad avanzada). El
impacto económico que generan este tipo de operaciones tienen un costo que va desde los
$50,000.00 hasta más de los $100,000.00 dólares por paciente [14], [38-40].
6.7 Funcionalización de Superficies en Prótesis.
Como se ha mencionado antes, una de las desventajas primarias en materiales metálicos
ha sido su poca biocompatibilidad y baja estabilidad química que muestran ante un medio
biológico. El avance en la tecnología para la funcionalización de superficies mediante la
aplicación de recubrimientos ha permitido el desarrollo de biomateriales multifuncionales,
tales como propiedades antibacteriales e incluso para regeneración de tejido [30],[45-47] .
6.7.1 Recubrimientos por proyección térmica por plasma
Esta técnica apareció a partir de los años 90´s, la técnica consiste en la proyección de
partículas fundidas sobre un sustrato a recubrir [48-49]. El proceso de recubrimiento consta
de cuatro etapas:
1. Formación del plasma.- En esta etapa se genera un arco eléctrico de alta energía
dentro de la cámara de proyección térmica al aplicar una alta corriente y un
diferencial de potencial entre un cátodo de tungsteno y un ánodo de cobre,
adicionalmente se inyecta el gas primario
31
2. Incremento de la temperatura.- La inyección de gases ionizables como lo es el helio
(He) e hidrógeno (H2) tienen la función de incrementar la temperatura en un rango
de 4,000 a 15,000 °C.
3. Inyección y fundición de polvos.- Los polvos son colocados dentro de una cámara
de precalentamiento y son acarreados mediante un gas inerte hacia la cámara de la
pistola de proyección térmica, donde las partículas son fundidas. Las partículas son
aceleradas por una caída de presión en la cámara de la pistola para después ser
proyectadas.
4. Formación de recubrimiento.- Las partículas proyectadas son depositadas en la
superficie del sustrato, la aglomeración de éstas da la formación de un
recubrimiento denso y rugoso. En la figura 2, se muestra el esquema del
funcionamiento en sección transversal del sistema de proyección térmica.
Esta técnica tiene la versatilidad de desarrollar recubrimientos cerámicos, metálicos, e
incluso compositos. A diferencia de otras técnicas la proyección térmica por plasma genera
recubrimientos con una mejor adherencia, así como porosidad o rugosidad lo que puede
ayudar a tener un bajo nivel de desgaste del material, sin embargo una de las desventajas
de esta técnica es la anisotropía del material y el cambio de fase que podría llegar a tener
los materiales debido a las altas temperaturas del sistema.
32
Integración de nAg como recubrimiento antibacterial
La plata y soluciones ricas en iones de plata sirven como agente inhibidor de bacterias. Esta
ha sido utilizada principalmente en aplicaciones médicas debido a su alta eficiencia contra
en una amplia gama de microorganismos (bacterias gram positivas, bacterias gram
negativas, hongos y hasta virus), entre los cuales, destaca su alta eficiencia contra las
bacterias como Staphyloccocus aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa,
Salmonella spp y Serratia spp., las cuales son bacterias comúnmente encontradas en los
tejidos infectados adyacentes a las prótesis [46], [47], [50], [51].
METODOLOGÍA
En el presente trabajo el desarrollo experimental se llevo a cabo en tres diferentes etapas
se muestra en el esquema de la figura 3.
Figura 2 Esquema de Proyección Térmica por Plasma
33
Figura 3 Esquema de etapas de la presente investigación
6.8 Caracterización de polvos precursores.
Con el fin de identificar la fase estructural la cuales presentan, estos fueron caracterizados
mediante las técnicas de difracción de rayos X. Para el análisis de morfología los polvos
Etapa 1
•Caracterizacion de materia Prima
•DRX
•Microscopia electronica
Etapa 2
•Homogenzación de mezcla en polvos; Agitación y Molienda Mecánica
•Caracterizacion
•DRX
•MEB
Etapa 4
•Adición de Nanopartículas de Plata
•Homogenizado y Caracterización
Etapa 3
•Proyeccion de recubrimiento
•Caracterizacion
•Analisis de Fases (Difraccion de rayos X y espectroscopia Raman)
•Microscopia electronica de barrido
•Propiedades Mecanicas
•Liberacion de iones
•Espectroscopía de Impedancia electroquímica
•Angulo de Contacto
•Ensayos In Vitro
34
fueron observados mediante equipos de microscopia electrónica. En la tabla 9 se muestran
los polvos precursores utilizados para el análisis y formación de recubrimientos.
Tabla 9 Materiales precursores de recubrimiento
Material Marca
Hidroxiapatita (HA) CaP Biomaterials, LLC
Circonia Estabilizada (YSZ)
(ZrO2 8%mol Y2O3)
Inframat Advanced Materials
Nanopartículas de plata CIQA, Síntesis Verde
6.8.1 Difracción de Rayos X.
Para la obtención del patrón de difracción de rayos X (DRX) se utilizo una geometría de tipo
Bragg-Brentano, se tomo una muestra de cada uno de los polvos y se monto sobre el porta
muestras del difractometro PANalytical Xpert MPD Phillips. El barrido se llevo a cabo desde
20° hasta 80° en 2θ, a un paso de 0.05° en 2θ por cada 60 segundos. La máscara utilizada
durante el análisis fue de 15 mm. Para el análisis fue requerido el uso del software Match
Crystal Impact (versión 1.11) [49]
6.8.2 Microscopia electrónica.
Mediante microscopia electrónica de barrido de emisión de campo (MEB-EC) Jeol JSM-
7401F JEM-2200FS y microscopia electrónica de transmisión (Jeol JEM-2200FS) se observo
la morfología la cuales presentan las partículas precursoras.
35
Para la preparación de muestra para microscopia electrónica de barrido, las partículas
fueron suspendidas en una solución de alcohol (99.9%) mediante el uso de un ultrasonido
durante 2 min, posterior a esto se realizo una toma de muestra mediante un capilar y fue
depositada una gota de muestra sobre una laminilla de sílice. Las micrografías fueron
tomadas a 5keV a diferentes aumentos
Para la preparación de muestra para microscopia electrónica de transmisión se llevo a cabo
el mismo procedimiento de suspensión de partículas, sin embargo la muestra obtenida por
el capilar fue depositada sobre una rejilla de transmisión con membrana de carbono.
6.9 Preparación de Matriz de polvos precursores.
Para la preparación de la matriz de polvos precursores para los distintos recubrimientos,
estos fueron procesados por dos técnicas: mediante simple agitación o mediante molienda
mecánica (molino EXPEX 8000M), ambas con el fin de obtener una homogeneidad de fases
en el recubrimiento. Para observar el desempeño de cada una de las técnicas de
homogenización, se utilizaron las siguientes relaciones en peso de acuerdo a los diferentes
compuestos. (tabla 10).
Tabla 10 Nomenclatura y composición de cada matriz
Agitación mecánica
Relación % P/P
Nomenclatura Me todo de homogenizacio n HA YSZ nAg
HA - 100 - -
91 A Agitacio n 89.1 9.9 1
91 M Molienda Meca nica 89.1 9.9 1
73 A Agitacio n 69.3 29.7 1
73 M Molienda Meca nica 69.3 29.7 1
36
Los polvos fueron pesados y homogenizados mediante un proceso de agitación constante
a 60 rpm durante una hora para garantizar una homogenización de la mezcla de polvos,
posterior a esto se procedió a la caracterización de dichos polvos.
Molienda Mecánica
Para el procesamiento por molienda mecánica se utilizó un molino de alta energía (EXPEX
8000M), los polvos fueron pesados acorde a la matriz en porciento en peso y se depositaron
en un vial de Nylamid con una relación en peso de bolas 1:2 por total de matriz preparada.
La molienda se realizó por un periodo de 25 min. Fueron utilizado alcohol etílico como
agente de control y sin atmosfera de control. Posterior a esto se procedió a la
caracterización de dichos polvos.
6.10 Adición de nAg (EN)
Posterior a los diferentes métodos de homogenización, a las mezclas les fue adicionada una
relación en 1 %P/P de nAgEN, concentración de Ag que de acuerdo a los estudios realizados
por S. Bose et. al [8] y X. Bai et. al [7], es la concentración ideal para no presentar una
respuesta citotóxica por apoptosis en células de ensayo, posterior a esto se procedió a un
proceso de homogenización por agitación mecánica con una velocidad de rotación de
60rpm por un tiempo de una hora y se procedió a la caracterización (ver apartado de
caracterización de mezcla de polvos)
37
6.11 Caracterización de mezcla de polvos
Con el fin de observar el efecto del tratamiento por homogenización la mezcla de polvos
fueron analizados mediante DRX. Para el análisis se utilizo una geometría de tipo Bragg-
Brentano, se tomo una muestra de cada uno de los polvos y se monto sobre el porta
muestras del difractometro PANalytical Xpert MPD Phillips. El barrido se llevo a cabo desde
20° hasta 80° en 2θ, a un paso de 0.05° en 2θ por cada 60 segundos. La máscara utilizada
durante el análisis fue de 15 mm. Para el análisis fue requerido el uso del software Match
Crystal Impact (versión 1.11) [52]
Mediante microscopia electrónica de barrido de emisión de campo (MEB-EC) Jeol JSM-
7401F JEM-2200FS por electrones retrodispersados se analizo la dispersión de los
compuestos en la matriz. Para la preparación de muestra para microscopia electrónica de
barrido, las partículas fueron suspendidas en una solución de alcohol (99.9%) mediante el
uso de un ultrasonido durante 2 min, posterior a esto se realizo una toma de muestra
mediante un capilar y fue depositada una gota de muestra sobre una laminilla de sílice. Las
micrografías fueron tomadas a 5keV a diferentes aumentos. Para el análisis EDS fue
utilizado un haz de electrones con 25keV.
6.12 Preparación de muestras para recubrimiento; Perfil de Anclaje.
Para la deposición del recubrimiento las muestras fueron sometidas a una preparación
superficial para mejorar el perfil de anclaje. El perfil de anclaje fue realizado mediante un
proceso de granallado superficial mediante partículas de alúmina con un tamaño de
partícula de .5 a 1mm de diámetro. Posterior al proceso de granallado las muestras fueron
sometidas a una limpieza de ultrasonido durante un tiempo total de 30 min en una solución
38
de alcohol con una pureza del 99.9%, la solución fue cambiada cada 10 min con el fin
eliminar cualquier residuo posible de la superficie.
6.13 Desarrollo de recubrimientos.
El desarrollo de los recubrimientos se realizó mediante un equipo de proyección térmica
por plasma marca PRAXAIR THERMAL PLASMA SPRAY SG100. Los parámetros utilizados
para la proyección térmica en la presente investigación se muestran en la tabla 11, que, de
acuerdo al estudio realizado por Orozco V. et. al[6] estos corresponden a los valores
óptimos para la deposición de recubrimientos base HA-nAgEN.
Tabla 11 Parámetros de Proyección
Parámetros
Gas primario (psi) 50 Gas Secundario (psi) 110 Gas de Acarreo (psi) 55
Voltaje (V) 32 Corriente (A) 600
Inyección de polvos (lb/hr) 2
6.14 Caracterización del recubrimiento
6.14.1 Análisis mediante difracción de rayos X.
Las muestras fueron colocadas en un porta muestras, se verifico que la muestra estuviera a
nivel óptimo para satisfacer las condiciones de difracción de acuerdo a la ley de Bragg. Se
utilizó el equipo PANalytical Xpert MPD Phillips. Para los recubrimientos el barrido se realizó
de 20 a 80° en 2θ con una velocidad de paso de 0.05°/seg.
39
6.14.2 Microscopia electrónica de Barrido (MEB)
Para el análisis mediante MEB, las muestras fueron limpiadas mediante un baño ultrasónico
(Branson 2510) en una solución de acetona 99% para eliminar cualquier residuo orgánico
debido a la manipulación de las muestras. Para el análisis se utilizó un MEB de presión
variable (HITACHI SU3500), realizando los siguientes análisis: morfológico mediante imagen
de electrones secundario (SEI) y análisis de dispersión de fases mediante electrones
retrodispersados (BSEI), fue utilizado un haz de 15keV a una presión de 80Pa. Se realizó
además la técnica de mapeo elemental para observar la distribución de elementos sobre el
recubrimiento, así como análisis de espectroscopia de energía dispersiva (EDS), para estas
técnicas fue necesario incrementar la potencia del haz hasta 25keV.
6.14.3 Caracterización sección Transversal MEB
Para la preparación de muestras de análisis en sección transversal del recubrimiento, la
muestra fue seccionada, soportada en sección transversal en baquelita, desbastada y pulida
hasta acabado espejo con alúmina 0.01µm. Las muestras fueron limpiadas mediante baño
ultrasónico (BRANSON 2510) en una solución de acetona 99%, para eliminar contaminantes
orgánicos y residuos producto de la preparación metalografía. Para el análisis de morfología
mediante imagen de electrones secundarios (SEI) y análisis de imagen de dispersión de fases
mediante electrones retrodispersados (BSEI), fue utilizado un haz con una energía de 15keV
a una presión de 80Pa, al igual que el análisis superficial se realizó un mapeo elemental y
análisis EDS incrementando la potencia del haz hasta 25keV.
40
6.14.4 Microscopia de fuerza atómica AFM
Para el análisis topográfico se utilizó el microscopio de fuerza atómica (AFM Park NSX 10)
en modo no contacto, las probetas utilizadas fueron limpiadas previamente mediante baño
ultrasónico, posteriormente fueron colocadas en el porta muestras y se realizó el barrido
de imagen en una sección de 25µm *25µm a una frecuencia de 0.20Hz.
6.15 Ensayos Mecánicos
6.15.1 Micro dureza
El ensayo de micro dureza se realizó mediante un microdurómetro. Para el análisis fueron
utilizadas muestras en corte de sección transversal del recubrimiento. Para el ensayo se
aplicó una carga de 100 g durante un tiempo de 12 segundos, posteriormente se prosiguió
al análisis de huella para la determinación de la dureza Vickers (HV).
6.15.2 Nanoindentación
Para el ensayo se utilizó un nanoindentador Nanoindenter G200. Fueron utilizadas
muestras en corte de sección transversal; el análisis se realizó en base a los parámetros que
se muestran en la tabla 12:
Tabla 12 Parámetros para análisis mediante nanoindentación
Cabezal DCMII
Carga Máxima (mN) 5
Tiempo de carga (seg) 10
Velocidad de deformación (seg-1) 0.05
Coeficiente de Poisson 0.25
41
6.15.3 Ensayo de adherencia
El ensayo de adherencia de los recubrimientos fue realizado en base a la norma ASTM C-
633-01, la cual ayuda a determinar la adherencia total del recubrimiento así como el tipo
de falla que pueden presentar durante el ensayo. Para este ensayo fue necesario el
maquinado de los dados o probetas en base a una aleación de Ti6Al4V. Para la aplicación
del recubrimiento en los dados se siguió la metodología descrita para la preparación
superficial, limpieza y aplicación del recubrimiento (ver apartado de preparación de
muestras para recubrimiento).
Para el ensayo de adherencia fue necesario el armado de las probetas mediante la
aplicación del adhesivo epóxico [Armstron Epoxy Adhesives A12, ARMSTRONG PRODCTS
CO.] sobre la superficie total del dado con recubrimiento, posteriormente fue colocado el
dado superior, una vez armadas las probetas fueron colocadas dentro de una estufa a 97°C
por un tiempo de 1hr para el secado del adhesivo. En la figura 4 se muestra un esquema de
la probeta para el ensayo de adherencia del recubrimiento por tensión uniaxial en base a la
norma ASTM C633-01
ProbetaTi6Al4V ELI
Epóxico
ProbetaTi6Al4V ELI
Recubrimiento
Tensión Uniaxial
Figura 4 Esquema de muestra recubierta para ensayo de adherencia en base a la norma ASTM C633-01
42
Las probetas se evaluaron mecánicamente mediante una maquina universal y se
sometieron al ensayo de tensión, los parámetros ingresados fueron: velocidad de tensión
de 0.030pulg/min, área de la probeta 1”. El blanco estándar de referencia fue probetas con
adhesivo epóxico sin recubrimiento.
6.16 Liberación de Iones
La liberación de iones juega un papel importante en el desarrollo de biomateriales ya que
como ha sido descrito dentro de la literatura, las principales fallas de estos es debido al
efecto citotóxico de iones y a la acumulación de partículas, los cuales son liberados debido
a una inestabilidad química del biomaterial ocasionando un encapsulamiento de la prótesis
hasta una falla debido a una osteólisis periprotésica, lo que conlleva al reemplazo de la
prótesis debido al rechazo del propio implante [22].
Para el ensayo de liberación de iones las probetas recubiertas fueron sometidas a una
inmersión en solución buffer de pH7.4 (marca J.T. Baker) durante tiempos de 1, 6, 12, 24,
168 y 672 horas a una temperatura de 36.5°C. Después del tiempo correspondiente de
exposición, las muestras fueron retiradas de la solución y se analizó la composición química
de dicha solución mediante un equipo de espectroscopia de absorción por plasma (ICP). Los
iones disueltos analizados fueron Ca, Ag, Zr e Y.
6.17 Actividad superficial: Adsorción de calcio
6.17.1 Formación de Apatita
Una de las pruebas preliminares para observar una posible osteoconducción es mediante la
compatibilidad del material para la formación de precipitados de apatita sobre la superficie
43
al contacto con soluciones simuladoras de fluido corporal (SBF). Para determinar esta
actividad las muestras fueron colocadas en inmersión por un periodo de 5 días en la solución
SBF propuesta por Kokubo et, al, [53], a una temperatura de 37°C. Al final de este tiempo
las muestras fueron retiradas y secadas. Las muestras fueron analizadas mediante MEB-PV
(CARL ZEISS EVO MA10) y mediante espectroscopia Raman
El análisis mediante microscopia confocal Raman (HORIBA LABRAM HR EVOLUTION) Los
recubrimientos fueron analizados de manera puntual en diferentes zonas, como fuente de
emisión se utilizo un láser de λ=532 a una potencia de 30 mW y una lente objetiva de 50X,
el barrido de análisis se realizó a partir de 150 a 1300 cm-1.
6.17.2 Espectroscopia de Impedancia Electroquímica (EIS)
El análisis mediante EIS potenciostático fue utilizado para determinar la adsorción de
especies de Ca, las cuales, tienen influencia en la biocompatibilidad por osteoconducción.
Para el análisis de adsorción de Ca mediante EIS potenciostático, se empleó un
potenciostato/galvanostato Interface 1000 GAMRY Instruments. Para el análisis se realizó
un barrido de frecuencia de 0.1 a 1E+6 Hz, se aplicó un potencial de 10 mV y 10 mA de
corriente, el electrolito de análisis utilizado fue una solución simuladora de fluido corporal
(SBF) a tres concentraciones diferentes de Ca (2.5, a.5 y 6.5 mM) con el fin de observar la
influencia de Ca en la solución, así mismo se determinó la adsorción de Ca sobre la superficie
del recubrimiento. El análisis se realizó a una temperatura de 37 °C.
44
6.17.3 Energía superficial y Capacidad Hidrofílica mediante ángulo de contacto
La superficie de los biomateriales juega un papel importante en la respuesta biológica ya
que es la sección del biomaterial que tiene contacto directo con el tejido biológico. En los
biomateriales uno de factores importantes que determina la energía superficial además de
la composición química es la rugosidad del material, la cual juega un papel importante a
nivel celular [31], [46]. La capacidad hidrofílica juega un papel importante en la
regeneración de tejido óseo, ya que la adsorción de proteínas sobre la superficie requiere
que el material tenga propiedades hidrofílicas. La prueba para determinar la actividad
superficial consiste en medir el ángulo de contacto que forma una gota de agua sobre la
superficie. Mientras mayor sea el ángulo de la gota de agua con la superficie, menor será
su energía de superficie y, por lo tanto, menor también su energía de adhesión. Para la
determinación de la capacidad hidrofílica del material se utilizó un medidor de ángulo de
contacto marca RameHart Instruments modelo 200, se utilizó como fluido de análisis agua
destilada.
El tratamiento de Glow Discharge (GD) se realizó bajo los siguientes parámetros: 20 mA por
un tiempo de 300 segundos con polaridad negativa mediante un sputtering (QUORUM
QR150).
6.18 Ensayos In-vitro
Para los ensayos in-vitro fueron utilizadas células de la línea osteosarcoma humano (HOS),
(ATCC –CRL-1534). Durante el manejo y preparación de los medios de cultivo se mantuvo
un ambiente estéril; el material y las muestras utilizadas fueron previamente esterilizados
45
mediante autoclave a 71 °C y 25 psi de presión por un tiempo de 30 min. Las muestras
utilizadas para el ensayo fueron previamente tratadas mediante Glow Discharge.
Para el trabajo con células en los ensayos in-vitro fue necesario un cultivo celular previo,
hasta alcanzar el número de células viables óptimo para su posterior uso. Para su cultivo,
estas fueron mantenidas en cajas de cultivo, se utilizó como caldo de cultivo una solución
RPMI-1640 (Gibco, Brasil) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado (BSA)
(Gibco, USA) para favorecer el crecimiento y reproducción celular, además al caldo de
cultivo se agregó 1% de Penicilina Estreptomicina para evitar alguna contaminación por
microorganismo. Los medios de cultivo se mantuvieron en incubación bajo una atmosfera
de 5% de CO2, 95% de humedad y temperatura de 37°C, el cambio del caldo de cultivo se
hizo aproximadamente a los 3 días en cultivo ó al vire del color de solución RPMI, la cual
cambia de un color violeta a un color amarillo pálido, dicho vire representa la actividad
celular que se tiene en el medio.
Cada vez que las células presentaban un 90% de confluencia celular se realizaba un
subcultivo. Para esto las células fueron desprendidas de la superficie utilizando una solución
de tripsina-EDTA (0.05% Tripsina-0.02% EDTA-4Na-99.93% PBS Thermo-Fisher Scientific),
parte de las células viables fueron trasladadas a cajas nuevas de cultivo hasta alcanzar una
confluencia del 90% para repetir el proceso.
6.18.1 Morfología celular
La adherencia celular así como el crecimiento celular sobre la superficie de biomateriales,
es un indicio de una buena compatibilidad de estos ante el contacto con un cuerpo
biológico. Para el caso de los recubrimientos osteoconductores la adherencia de células
46
óseas sobre la superficie juega un papel importante en el proceso de osteoconducción, ya
que al no existir una afinidad o interacción ante células óseas, se llevan a cabo los procesos
de encapsulamiento de la prótesis por la formación de tejido fibroso en la interfase tejido-
implante, significando esto una posible causa de falla en prótesis debido a una mala
adherencia.
Para la identificación de crecimiento de HOS en la superficie de los recubrimientos mediante
MEB-PV, las muestras fueron esterilizadas previamente mediante autoclave a vapor
durante 30 min. Una vez esterilizadas las muestras fueron retiradas y colocadas en un
campo de trabajo estéril. Las muestras fueron colocadas en una caja de pozos,
posteriormente les fue añadido 2mL de caldo de cultivo RPMI-10% BSA-1% Penicilina
Estreptomicina y se dejó temperar a 36.5°C, una vez alcanzada la temperatura les fue
añadido 3.5x104 células/mL en fase de crecimiento exponencial y se dejó en incubación
bajo condiciones de crecimiento celular en una atmosfera de 5% de CO2, 95% de humedad
y temperatura de 37°C por un periodo de 5 días, el medio fue cambiado al tercer día de
haber iniciado el proceso de incubación celular.
Una vez transcurrido el tiempo total de incubación les fue retirado el medio a las muestras,
para su posterior preparación para análisis mediante MEB.
Para la preparación de muestras para análisis mediante MEB, fue necesario llevar un
procedimiento de lavado mediante solución buffer de fosfato salino (PBS) .1M para
eliminar residuos de solución RPMI; con el fin de preservar las células sobre el
recubrimiento se pasó a un proceso de fijación celular mediante inmersión de la muestra
en una solución de paraformaldehido al 2% durante 30 min, posterior a esto las muestras
fueron lavadas con solución PBS 0.1M y un lavado doble con H2O destilada para eliminar los
47
restos de paraformaldehido. Una vez fijadas las células se realizó una deshidratación de la
matriz celular mediante inmersión en solución de alcohol al 30%, 50%, 70%, 90% y 100%,
comenzando con la menor concentración, hasta lograr una deshidratación completa. Para
contrarrestar el efecto de carga y posible degradación de las células durante el análisis en
el MEB, las muestras fueron recubiertas con oro mediante un sputtering (QUORUM QR150).
6.18.2 Adhesión cuantitativa celular.
La adhesión cuantitativa de células HOS en la superficie de las probetas fue necesario
realizar las siguientes actividades: Las muestras previamente esterilizadas fueron colocadas
en el interior de placas de 12 pozos, posteriormente fue adicionado un medio de cultivo
RPMI-10% BSA-1% Penicilina Estreptomicina, así mismo se adicionaron Células HOS a una
concentración de 2,5 x 104 células/ml, las placas fueron incubadas a 37 °C, 5% de CO2 y 90%
de humedad durante 5 días. Luego de este periodo las células adheridas a las probetas
fueron desprendidas con Tripsina-EDTA y retomadas con PBS pH 7,4. Las células se
centrifugaron por 5 minutos a 2500 rpm, el pellet obtenido fue resuspendido usando el
colorante vital eosina amarilla para posteriormente ser contadas en cámara de Neubauer.
Como muestras de control fueron probetas de Ti sin tratamiento.
6.18.3 Citotoxicidad celular.
La citotoxicidad celular es definida como una alteración de las funciones celulares básicas
causadas por un agente citotóxico, cuya interacción conlleva a que se produzca un daño
celular irreversible el cual puede ser detectado. Dentro de la literatura para evaluación de
citotoxicidad en células se encuentra el ensayo de reducción del MTT (Bromuro de 3(4,5
dimetil-2-tiazoil)-2,5- difeniltetrazólico) a nitroazul de tetrazolio (NBT) ó Formazan. El MTT
es captado por las células viables y reducidas a Formazan por la acción enzimática de la
succínicodeshidrogenasa mitocondrial, el formazan producido queda retenido en las
48
células, para su cuantificación debe ser liberado mediante la solubilización de las células. La
capacidad de las células para reducir al MTT constituye un indicador de la integridad de las
mitocondrias y su actividad funcional, la cual es interpretada como una medida de la
viabilidad celular, esto muestra una relación directa en citotoxicidad celular al compuesto
que se evalúa. Dicha reacción es cuantificada mediante un método colorimétrico, ya que se
produce como consecuencia de la reacción un cambio de coloración del amarillo al azul
Para el ensayo de citoxicidad mediante reducción de MTT, los recubrimientos fueron
colocados en inmersión en un medio de caldo de cultivo RPMI-10% BSA-1% Penicilina
durante un periodo de 15 días, dicho tiempo tiene como objetivo la posible liberación de
partículas que pudieran tener un comportamiento citotóxico ante las células HOS,
posteriormente, el medio de inmersión ó sobrenadante fue retirado y mantenido en
incubación. Fueron colocadas en placas de 96 pozos diluciones seriadas: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16
de cada uno de los sobrenadantes previamente incubados, se agregó una concentración de
2,5 x 10 4 células/mL en fase de crecimiento exponencial, además se adiciono 20𝜇L de
reactivo MTT, posteriormente fueron incubadas a condiciones de crecimiento celular
durante 72 horas. La viabilidad celular fue medida mediante la prueba colorimétrica de
reducción del MTT a Formazan, en la cual, las mitocondrias de las células viables son
capaces de reducir el MTT a cristales coloreados insolubles de formazan, los que
posteriormente son solubilizados por acción del dimetilsulfoxido (DMSO). La medida de la
densidad óptica (DO) fue determinada por espectrofotometría a 580 nm usando un lector
de microplacas Multiskan.
El porcentaje de citotoxicidad fue calculado mediante:
49
% de citotoxicidad = 100 ∗(DO grupo control − DO grupo tratado)
DO Grupo control
6.18.4 Bioactividad, expresión de fosfatasa alcalina (ALP)
Para la determinación cuantitativa de ALP en células HOS, las muestras fueron colocadas en
placas de 12 pozos, donde se le adiciono un caldo de cultivo RPMI-10% BSA-1% Penicilina,
adicionalmente fue agregada una concentración de 30.000 células/ml. Las muestras fueron
incubadas durante 9 días a 37 °C, 5% de CO2 y 90% de humedad con el fin de lograr una
concentración detectable de ALP. Se realizó un cambio de cultivo cada tercer día. Al final
del periodo de incubación el medio fue retirado y conservado a -20°C para medición de ALP.
Las células adheridas en la superficie de las probetas fueron desprendidas con Tripsina-
EDTA y retomadas con PBS pH 7,4, luego fueron centrifugadas 5 minutos a 2500 rpm, el
pellet celular obtenido fue lisado con una solución de Triton X-100 al 5%. El lisado fue
conservado a -20°C hasta la medición de ALP. Como control, células fueron cultivadas sobre
una probeta de Ti no modificada y sobre pozos sin probetas
6.18.5 Determinación de la concentración de ALP
La ALP presente en el medio de cultivo y en el lisado celular fue determinada por
espectrofotometría siguiendo la técnica descrita en el kit de BioSystems para determinación
de fosfatasa alcalina, el cual consiste en: 20 µl de muestra fue mezclada con 1 ml de reactivo
de trabajo, el cual, previamente fue preparado por la mezcla de 4 ml de reactivo A por 1 ml
de reactivo B del kit. La lectura fue realizada en un espectrofotómetro (Multiscan go,
Thermo scientific) a 405 nm, se registró la absorbencia inicial y lecturas cada minuto
durante 3 minutos y, se calculó el incremento de absorbencia por minuto promedio
50
(ΔA/min). La concentración de ALP en las muestras fue calculada a partir de la siguiente
fórmula general.
ΔA/ min×Vt × 106
ε × l × Vs= U/L
Donde, el coeficiente de absorción molar (ε) del 4-nitrofenol a 405 nm es 18.450, el paso de
luz (l) es 1 cm, el volumen total de reacción (Vt) es 1.02, el volumen de muestra (Vs) es
0.02ml, y 1 U/L equivale a 0.0166 μkat/L.
7. RESULTADOS
7.1 Caracterización de polvos
7.1.1 Difracción de Rayos X
En la figura 5, se muestran los patrones de difracción de rayos X para la hidroxiapatita y
nanopartículas de circonia, el análisis de fases se realizó mediante el software MATCH
Crystal Impact [52]. El patrón a) corresponde al oxido de circonio, el cual, presenta una
estructura cúbica debido a la estabilización mediante el óxido de itrio (carta cristalográfica
00-082-1246), el patrón b) nos muestra el patrón característico de una hidroxiapatita con
estructura hexagonal (carta cristalográfica 00-086-1199). Se puede observar que tanto para
la circonia y la HA presentan una sola fase cristalina.
51
Figura 5 Patrones de difracción; a) Circonia estabilizada con Itría (YSZ) b) Hidroxiapatita (HA)
7.1.2 Microscopia electrónica
En la figura 6, se muestra las micrografías de las partículas de hidroxiapatita obtenidas
mediante MEB por electrones secundarios a diferentes aumentos, las cuales presentan una
morfología en forma esférica con un tamaño de partícula que oscila entre 46.3 ± 13.6 µm.
Figura 6 Micrografía MEB para caracterización de polvos de HA e histograma obtenido mediante IMAGEJ [54]
20 30 40 50 60 70 80
a)
b)
Inte
nsid
ad (
U.
Arb
.)
2
5 .0 kV X 200 SE 100µm 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
5
10
15
20
25
30
Fre
cu
en
cia
m
52
Por microscopia electrónica de transmisión se observaron las nanopartículas de ZrO2. En la
figura , se observan las imágenes en campo claro y campo oscuro, en estas se puede
observar nanopartículas con una morfología tipo esférica que oscila en el tamaño de los
16.6 ± 4.4 nm.
Figura 7 Micrografía TEM campo claro e histograma obtenido mediante IMAGE J [54] para nanopartículas de YSZ
El análisis EDS como se muestra en la figura 8, muestra la composición elemental de las
nanopartículas de circonia, se puede observar la presencia de Y, elemento proveniente de
la itria (Y2O3), O y Zr, adicionalmente la presencia de carbono está asociada a la membrana
de la celda de transmisión.
50 ƞm
10 15 20 25 30 35
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Fre
cuencia
m
Spectrum C O Y Zr
Spectrum 1 34.33 21.56 8.25 35.86
53
7.2 Caracterización de mezcla de polvos procesados mediante tratamiento de
homogenizado
7.2.1 DRX
En la figura 9, se muestra los patrones de difracción e indexación de cada fase para cada
una de las mezclas de polvos; el análisis de fases se realizó mediante el software MATCH
Crystal Impact [52]. Se puede observar que la hidroxiapatita (carta cristalográfica 00-086-
1199) y circonia (carta cristalográfica 00-081-1551) no presentaron alguna degradación de
fase debido a la alta energía durante el proceso de molienda mecánica. Por otra parte, se
puede observarse una pequeña señal debido a las nanopartículas de plata (carta
cristalográfica MATCH 00-087-0719), así como algunas regiones donde se observa
amorficidad debido a la carga orgánica que presenta el extracto de nopal. Para ambos
métodos se puede observarse un incremento notable en la región cercana a los 30° en 2θ,
lo cual indica el aumento de concentración de YSZ sobre la matriz de los polvos.
Figura 8 Análisis EDS para nanopartículas de YSZ
54
Figura 9 Patrones de difracción para diferentes mezclas de polvo HA/nZrO2
Las imágenes de la figura 10, fueron obtenidas mediante MEB-EC en modo de electrones
retrodispersados, donde se muestra la mezcla de polvos de HA-nZrO2 homogenizados
mediante las técnicas de agitación (imagen a) y b)), presentan un encapsulamiento debido
a la aglomeración de nZrO2 alrededor de las partículas de HA; mientras que los polvos
procesados mediante la técnica de molienda (imagen c) y d)), presentan una dispersión de
las partículas de nZrO2 en la cual las partículas de HA no presentan ese encapsulamiento
total (ver figura 8).
26 28 30 32 34 36
20 30 40 50 60 70 80
a)
b)
c)
2
Inte
nsid
ad
(U
. A
rb)
d)
HA
YSZ
Ag
36 38 40 42 44
55
Figura 10 Imágenes de MEB-EC en modo BSE; a) y b) polvos HA-ZrO2 homogenizados mediante molienda mecánica e imágenes c) y d) polvos de HAzrO2 homogenizados mediante molienda mecánica
En la figura 11, se muestra los análisis EDS en diferentes zonas de los polvos procesados
mediante agitación mecánica, se puede observar que en el análisis superficial únicamente
se presenta Zr, Y y O, lo que confiere que las nanopartículas de YSZ presentan un efecto de
encapsulamiento sobre las partículas de HA; en cuanto a los polvos sometidos mediante
molienda mecánica, como se muestra en la figura 12, se identifican partículas de HA con
un menor índice de encapsulamiento por parte de las nanopartículas de YSZ, lo cual indica
que un tratamiento de molienda mecánica ayuda a tener una mejor dispersión, evitando el
encapsulamiento de las partículas de HA por las nanopartículas de YSZ.
56
Element Weight % Atomic %
O K 18.64 48.88
SiK 13.14 19.63
Y L 8.56 4.04
ZrL 59.66 27.44
Element Weight % Atomic %
O K 20.46 52.51
SiK 11.43 16.72
Y L 9.43 4.36
ZrL 58.68 26.42
Figura 11 Análisis EDS puntual en diferentes secciones de partículas para polvos sometidos a agitacion mecánica
57
Element Weight % Atomic %
C K 2.67 6.05
O K 36.18 61.49
SiK 2.54 2.45
Y L 3.68 1.13
P K 7.91 6.95
ZrL 26.22 7.82
CaK 20.80 14.11
Element Weight % Atomic %
C K 0.86 1.82
O K 32.85 52.09
SiK 1.49 1.34
P K 20.09 16.46
CaK 44.70 28.29
Figura 12 Análisis EDS puntual en diferentes secciones de partículas para polvos sometidos a molienda mecánica
58
7.3 Caracterización de Recubrimientos
7.3.1 DRX
En la figura 13, se muestran un análisis comparativo de los patrones obtenidos para cada
uno de los recubrimientos sometidos a los diferentes tratamientos de homogenización y los
polvos iniciales. En los patrones obtenidos se puede observar el efecto de recristalización
en la estructura cristalina de la circonia, donde muestran un cambio en las intensidades y
grosor de los picos, dicho fenómeno se puede apreciar principalmente a una distancia de
30° en 2θ, señal representativa del plano (1 1 1) en la que ocurre una disminución del grosor
así como un incremento en la intensidad debido a que esta pasa de una estructura
nanométrica a un conjunto de aglomerados con tamaño micrométrico, además de esto, se
puede observar la presencia de una textura en las fases del recubrimiento debido a un
reordenamiento cristalino para los diferentes planos cristalográficos, esta textura se debe
a la deformación de los granos del material producto de la proyección térmica por plasma.
Por otra parte, la identificación de fases realizada mediante el software MATCH Crystal
Impact [52], se puede observar una degradación de la HA en fosfato de tetracálcico (TTCP)
y a fosfato tricálcico (TTC) (patrones de referencia correspondientes 00-025-1137 fase
monoclínica y 00-086-1585 fase rombohedral respectivamente), lo cual se presenta debido
a la degradación térmica provocada durante el proceso de proyección por plasma; de
acuerdo a C.J. Liao et. al., la temperatura durante el proceso de proyección supera los 1200
°C, temperatura en la cual comienza la degradación de la HA a TTCP y TCP.
59
Figura 13 Patrones de difracción de recubrimientos; a) Recubrimiento 91A, b) 91M, c) 73A y d) 73M
a)
b)
c)
d)
60
7.3.2 Microscopia electrónica de barrido
Sección superficial
En la figura 14, se puede observar las micrografías superficiales mediante MEB-PV en modo
de electrones secundarios de los recubrimientos desarrollados en la presente tesis, los
recubrimientos 91M y 73M (polvos procesados mediante molienda mecánica) presentan
una rugosidad considerable a diferencia de los recubrimientos 91A y 73A (polvos
procesados mediante agitación). Para ambos recubrimientos puede observarse un aumento
en la rugosidad del recubrimiento al amentar el contenido de YSZ.
Figura 14 Micrografías en sección superficial mediante MEB en electrones secundarios para los diferentes recubrimientos; a) 91A, b) 73A, c)91M y d)73M
En la figura 15, se muestran las micrografías obtenidas mediante MEB-PV en modo de
electrones retrodispersados de los de los recubrimientos desarrollados en la presente tesis,
donde puede observarse para los recubrimientos 91A y 73A presentan un efecto de
a) b)
d)c)
f)
61
aglomeración, esto debido al efecto de encapsulamiento antes mencionado de las
partículas de HA por las nanopartículas de YSZ, dicha aglomeración puede ser apreciable en
la micrografías a) y b) de la figura 15, en la cual se muestran como las regiones en color
blanco. Además a diferencia de los recubrimientos sometidos a molienda mecánica, puede
observarse que para se presenta un mayor indicio de fracturas sobre el recubrimiento. Por
otra parte, los recubrimientos 91M y 73M los cuales fueron homogenizados mediante
molienda mecánica puede observarse una mejor distribución de fases sobre la superficie,
en la cual no se observan aglomerados de la fase de YSZ, esto puede observarse en las
micrografías c) y d), donde la fase de YSZ, en tonalidad blanca se observa prácticamente
distribuida de manera uniforme sobre el recubrimiento. En las figuras 16 a 19 se muestran
el análisis de distribución elemental mediante mapeo, en las que se muestran la micrografía
tomada por electrones retrodispersados así como las micrografías correspondientes a la
distribución elemental de los recubrimientos.
Figura 15 Micrografías en sección superficial mediante MEB en electrones retrodispersados para los diferentes recubrimientos; a) 91A, b) 73A, c)91M y d)73M
a) b)
d)c)
62
Figura 16 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente al recubrimiento 91A
63
Figura 17 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente al recubrimiento 91M
64
Figura 18 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente al recubrimiento 91A
65
Figura 19 Análisis de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente de recubrimiento 73M
66
Sección Transversal
En las figuras 20 y 21, se muestra las micrografías en sección transversal mediante MEB-PV
en modo de electrones retrodispersados. En la figuras **se puede observar la influencia
positiva que se tiene mediante un tratamiento de homogenización por molienda mecánica,
ya que, para el caso de los recubrimientos 91A y 73A, se muestra mayor cantidad de
fracturas las cuales van desde la superficie del recubrimiento hasta el sustrato, además de
presentar fallas en la interface del recubrimiento y sustrato, dando indicios de una mala
adherencia. Al igual que el análisis superficial mediante MEB por electrones
retrodispersados en sección superficial, se puede observar que los recubrimientos
desarrollados mediante polvos con un tratamiento por molienda mecánica presenta una
mayor dispersión de la fase de YSZ, lo cual además ayuda a disminuir los defectos sobre el
recubrimiento.
Figura 20 Micrografía en sección transversa por electrones retrodispersados mediante MEB para los recubrimientos; a) y b) recubrimiento 91A a 250X y 1000X respectivamente, c) y d) Recubrimiento 91M a 250X y 1000X respectivamente
a) b)
d)c)
67
Figura 21 Micrografía en sección transversa por electrones retrodispersados mediante MEB para los recubrimientos; a) y b) recubrimiento 73A a 250X y 1000X respectivamente, c) y d) Recubrimiento 73M a 250X y 1000X respectivamente
En las figuras 22 a 25 se muestran el análisis de distribución elemental mediante mapeo.
Donde se puede observar, que los recubrimientos 91M y 73M ( homogenizados mediante
molienda mecánica) mantienen una buena distribución de YSZ mientras que los
recubrimientos homogenizados mediante agitación presentan aglomeración de las fases de
ZrO2.
En la figura 26, se observan las micrografías tomadas en sección transversal así como su
análisis EDS, las cuales, muestran un aumento en el relación Ca/P > 2, lo cual, puede ser
debido a la degradación de la HA a TTCP e HA a TCP, esto asociado a la proyección térmica
de los polvos.
a) b)
d)c)
68
a) b)
c)
e)
d)
f)
h) g)
Figura 22 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente para recubrimiento 91A
69
Figura 23 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente para recubrimiento 91M
70
Figura 24 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente para recubrimiento 73A
71
Figura 25 Análisis en sección transversal de distribución elemental por mapeo y análisis EDS correspondiente para recubrimiento 73M
72
Figura 26 EDS en sección transversal de los recubrimientos; a) 91A, b) 91M, c) 73A y d) 73M
a)
b)
d)
c)
73
7.3.3 AFM
En las figuras 27 a 29, se muestra las diferentes micrografías obtenidas mediante AFM en
modo no contacto, así como los valores de rugosidad en el área total y perfiles obtenidos
mediante el análisis en línea de las regiones marcadas sobre la imagen. De acuerdo a la
tabla ** en base a las dos relaciones en concentración de YSZ sobre la matriz del
recubrimiento se puede observar un aumento en la rugosidad de los recubrimientos
conforme aumenta la concentración de YSZ, esto debido al aumento de carga de partículas
nanométricas en la matriz. Así mismo, en relación a los métodos de homogenización, se
puede observar que los recubrimientos sometidos a molienda mecánica presentan una
mayor rugosidad superficial debido al efecto de la disminución de partícula en la matriz en
polvo propiciado por dicho tratamiento, de tal manera como se muestra en la tabla 13, los
recubrimientos 73M seguido por 91M muestran los mayores índices de rugosidad cuyos
valores alcanzados fueron de 0.985 ± 0.13 y 0.911 ± 0.24 respectivamente.
Figura 27 Imagen 2D de topografía mediante AFM y valores de rugosidad para las diferentes zonas de análisis lineal para perfil de rugosidad del recubrimiento HA comercial
74
a) b)
Figura 28 Imagen 2D de topografía mediante AFM y valores de rugosidad para las diferentes zonas de análisis lineal para perfil de rugosidad de los recubrimientos; a) 91A y b) 91M
75
Tabla 13 Valores de Rugosidad obtenidos mediante AFM-NC para los diferentes recubrimientos
Valores de Rugosidad
Muestra Ra(µm) Rq(µm) Rz (µm) HA 0.53 ± 0.29 0.63 ± 0.27 2.79 ± 0.42 91A 0.67 ± 0.21 0.85 ± 0.36 3.45 ± 0.23 91M 0.91 ± 0.24 1.10 ± 0.28 4.79 ± 0.35 73A 0.74 ± 0.18 0.90 ± 0.23 3.23 ± 0.27 73M 0.98 ± 0.13 1.28 ± 0.19 5.86 ± 0.37
a) b)
Figura 29 Imagen 2D de topografía mediante AFM y valores de rugosidad para las diferentes zonas de análisis lineal para perfil de rugosidad de los recubrimientos; a) 73A y b) 73M
76
7.3.4 Ensayos Mecánicos
Microdureza
En la gráfica 1, se muestran los resultados obtenidos mediante el ensayo de micro dureza
para cada uno de los recubrimientos. De acuerdo a los resultados, se puede observar que
para ambos métodos de homogenización de polvos, existe un aumento en la dureza del
recubrimiento conforme aumenta la concentración de YSZ en la matriz. Entre ambos
métodos de homogenización se puede observar que para el caso de los recubrimientos
fabricados por polvos sometidos a una homogenización mediante molienda mecánica,
estos presentan una menor dureza del material debido a una mejor distribución de fases,
caso contrario para los recubrimientos homogenizados mediante agitación mecánica, los
cuales presentaron valores mayores de dureza debido a la aglomeración de YSZ, pudiendo
esto significar un grave problema, siendo que esto se reflejaría en una probabilidad de
presentar defectos en la prótesis por desgaste debido a una mayor dureza con respecto al
tejido óseo.
Grafica 1 Dureza de Recubrimientos
Du
reza
HV
(G
Pa)
77
Nanoindentación
De acuerdo al análisis de nanoindentación, se puede observar en la tabla 14, que los
recubrimientos obtenidos en base a polvos por agitación mecánica presentan un módulo
de Young (E) más alto, lo cual se ve reflejado en los valores obtenidos de rigidez, esto
significa al igual que el análisis de microdureza, que los recubrimientos en base a polvos
sometidos a un tratamiento por agitación mecánica presentan una mayor dureza. En
comparación con los resultados publicados por P. K. Zysset et. al [11]., en donde se
presentan resultados de ensayos de nanoindentación realizados en hueso cortical y hueso
esponjoso de un fémur humano, los resultados obtenidos en la presente tesis, muestran
que los ensayos de nanoindentación de los recubrimientos obtenidos mediante una
homogenización de polvos por agitación, presentan un módulo muy superior al módulo que
reportaron P. K. Zysset et. al., lo cual indica, que desde el punto de vista de la aplicación
como biomaterial este podría significar un riesgo, ya que al tener una mayor dureza que el
hueso trabecular, este podría generar un desgaste en el tejido óseo y provocar un fallo por
desgaste. Para el caso de los recubrimientos obtenidos mediante una homogenización de
polvos por molienda mecánica los valores alcanzados son por debajo a los reportados por
P. K. Zysset et. al [11], teniendo como valores de 13.83 ± 1.6 y de 4 ± 0.63 para los
recubrimientos 73M y 91M respectivamente, lo cual indica que este tipo de recubrimientos
pudiese tener un buen desempeño al contacto con el tejido óseo.
78
Tabla 14 Valores obtenidos mediante análisis de nanoindentación para los diferentes recubrimientos; Modulo elástico, dureza y Rigidez
Muestra E (GPa) H (GPa) Rigidez (N/m)
Diáfisis Femoral [11] 19.5 ± 5.4 0.245 a 0.76
--
Hueso trabecular [11] 11.4 ± 5.6 --
91A 170.2 ± 12.29 19.65 ± 3.29 17854.33 ± 483.6
73A 232.47 ± 12.34 27.36 ± 9.16 20286.25 ± 3008
91M 4 ± 0.63 0.06 ± 0.021 8830.66 ± 505.3
73M 13.83 ± 1.6 0.85 ± 0.1 8623.66 ± 1531
Adherencia
En base a los resultados obtenidos en el ensayo a tensión, se puede observar que la adición
de nZrO2 así como un aumento en la concentración de nZrO2 en la matriz del recubrimiento
tiene un efecto positivo respecto a la propiedad de adherencia del recubrimiento con
respecto al sustrato(ver gráfica 2), presentando una mayor adherencia antes de la falla; por
otra parte, se observa que los recubrimientos sometidos a una homogenización mediante
molienda mecánica presentan una mayor adherencia respecto a los recubrimientos
homogenización mediante agitación mecánica. Por otra parte los valores obtenidos para los
recubrimientos 91M y 73M muestran una adherencia superior a los valores reportados por
C. Y. Yang et. al y por L. Fu et. al. para el caso de C.Y. Yang valores alcanzados de 30.8 MPa
para un recubrimiento de HA comercial, y en el caso de L. Fu et. al, con valores cercanos a
45 MPa un recubrimiento base HA/YSZ con 30%(P/P) de YSZ, ambos depositados mediante
la técnica de proyección térmica por plasma.
79
Grafica 2 Valores obtenidos mediante análisis de nanoindentación para los diferentes recubrimientos; Modulo elástico, dureza y Rigidez
De acuerdo a la norma ASTM C633, se puede observar en la tabla 15 y en las figura 30, que
los recubrimientos sometidos a una homogenización mediante molienda mecánica
presentan un mayor desempeño en adherencia con respecto a los homogenizados
mediante agitación alcanzando valores de 51.40 ± 2.06 y 58.52 ± 7.74 para los
recubrimientos 91M y 73M respectivamente. De acuerdo al análisis de falla en los
recubrimientos, para el caso de los recubrimientos sometidos a una homogenización
mediante agitación mecánica, el aumento en el porcentaje de nZrO2 favorece en una falla
del tipo adherente hacia el epóxico alcanzando valores del 84% de este tipo de falla,
presentando una baja adherencia hacia el sustrato, lo cual puede ser debido a la mala
dispersión de fases en el recubrimiento. Para el caso de los recubrimientos fabricados en
base a polvos sometidos a una homogenización mediante molienda mecánica, los
recubrimientos con una mayor concentración de nZrO2 presentan en mayor proporción una
falla del tipo cohesiva, alcanzando valores del 86% , lo cual, indica que el recubrimiento
0
10
20
30
40
50
60
70
80A
dh
ere
nci
a (
MP
a)
Velocidad de Tensión 0.03 lb/min
80
presenta una buena adherencia hacia al sustrato. Las imágenes de la figura 28, muestran el
análisis de falla de los diferentes tipos de recubrimientos sometidos al ensayo de tensión.
Puede observarse las diferentes zonas donde los recubrimientos presentan las fallas de tipo
cohesiva y de tipo adherente. Se puede observar en la figura 28 inciso c) y e), que el
comportamiento es positivo para los recubrimientos 91M y 73M respectivamente, ya que
se observa en mayor proporción una falla del tipo cohesiva (58 y 86% respectivamente),
mientras que los recubrimientos 91A y 73A (incisos b y d respectivamente) existe una mayor
proporción de recubrimiento con falla del tipo adherente (53 y 84% respectivamente),
donde incluso, se puede observar el sustrato desnudo producto de una mala adherencia del
recubrimiento hacia el sustrato.
81
Tabla 15 Valores obtenidos mediante análisis de falla por ensayo de adherencia mediante norma ASTM C633-01
Tipo de Falla
Recubrimiento Adherencia (MPa) Cohesivo (%) Adherente (%)
Epóxico 69.38 ± 0.73 - -
HA 18.72 ± 1.78 23.33 ± 12.68 77.66 ± 12.68
91A 20.13 ± 2.14 46.66 ± 6.94 53.33 ± 6.94
91M 51.40 ± 2.06 58.33 ± 5.79 41.66 ± 5.79
73A 35.61 ± 6.92 15.33 ± 6.54 84.66 ± 6.54
73M 58.52 ± 7.74 86.33 ± 2.64 13.66 ± 2.64
a)
d) e)
b) c)
Figura 30 Sección superficial para los recubrimientos sometidos a ensayo de tracción para análisis de falla; a) HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M
82
7.3.5 Liberación de iones
Mediante la cuantificación elemental por espectroscopia de absorción atómica por plasma
(AA-ICP) de los sobrenadantes obtenidos mediante la inmersión de muestras a diferentes
tiempos de exposición, no se observó lecturas de absorbancia de Zr e Y, sin embargo, para
los elementos de Ca y Ag se tuvo una lectura en el orden de % y ppm respectivamente.
De acuerdo al análisis elemental de Ag en la solución PBS mediante AA-ICP, como se
muestra en la gráfica 3, los recubrimientos 73A presentaron una mayor liberación de iones
Ag, alcanzando el valor umbral posterior a 168 horas de inmersión (aproximadamente 8
ppm), manteniendo dicho valor umbral el resto del tiempo (720 horas). Los recubrimientos
91A, 91M y 73M presentaron una misma tendencia en los valores de Ag liberada tanto en
tiempos iniciales como prolongados, teniendo como concentración máxima liberada a un
tiempo de 24 horas para así después mantener una concentración constante
(aproximadamente entre 4 y 5 ppm).
83
Grafica 3 Análisis de liberación de iones Ag para los recubrimientos correspondientes
Para el caso de la liberación de Ca en solución PBS, como se muestra en la gráfica 4, se pudo
observar que para los recubrimientos 73A y 73M, los cuales presentan una mayor
concentración de circonia en la matriz del recubrimiento, se tuvo una liberación constante
de iones Ca durante el periodo de 720 horas de evaluación, alcanzando un valor entre 10 y
12 %; para los recubrimientos 91A y 91M se pudo observar que para un tiempo de 168
horas se alcanzó una concentración umbral de Ca liberado (8 y 12 % respectivamente),
posteriormente a este tiempo se presentó una disminución constante en la liberaciones de
iones de Ca detectado en la solución, producto de la adsorción superficial de Ca del
recubrimiento, lo que indica, una actividad de afinidad por el Ca en solución por dichos
recubrimientos.
0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo hrs.
Ag liberada
73A
73M
91A
91M
84
Grafica 4 Análisis de liberación de iones Ca para los recubrimientos correspondientes
7.3.6 Actividad superficial
Adsorción de Calcio
De acuerdo a la metodología propuesta por Kokubo et al [53], el tiempo para la formación
de apatita varía entre los 5 a 30 días, en la presente tesis mediante las pruebas de inmersión
en solución SBF durante 5 días, en la figura 31 se pueden observar las micrografías
obtenidas mediante MEB-PV, en las cuales, se observa la tendencia a la formación de
cristales cristales de apatita para cada uno de los recubrimientos, los cuales mediante un
análisis de espectroscopia puntual por Raman, se observa que dichos cristales
correspondiente a la apatita en cada uno de los diferentes tipos de recubrimientos (ver
figura 32).
0
2
4
6
8
10
12
14
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (h)
Ca Liberado
73A
73M
91A
91M
85
Figura 31 Micrografías MEB de recubrimientos sometidos a inmersión en solución SBF para precipitación de apatita a) HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M
Apatita
Apatita Apatita
Apatita
Apatita
a)
b) c)
d) e)
86
Figura 32 Imagen de apatita depositada y espectro Raman correspondiente para los recubrimientos sometidos a inmersión SBF; a) HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e)73M
4µm
4µm200 400 600 800 1000 1200
Raman Shift (cm-1)
Apatita
Inte
nsid
ad
(U
. A
rb)
Cristal
200 400 600 800 1000 1200
Apatita
Inte
nsid
ad (
U.A
rb.)
Raman Shift (cm-1)
Cristal
a)
b)
87
Continuación de Figura 32
4µm
4µm
4µm200 400 600 800 1000 1200
Inte
nsid
ad
(U
. A
rb)
Raman Shift (cm-1)
Apatita
Cristal
200 400 600 800 1000 1200
Raman Shift (cm-1)
ApatitaIn
tensid
ad (
U.
Arb
)
Cristal
200 400 600 800 1000 1200
Inte
nsid
ad (
U.
Arb
.)
Apatita
Raman Shift (cm-1)
Cristal
d)
c)
e)
88
Espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS)
La técnica de EIS fue empleada para medir los procesos de adsorción de Ca+2, las mediciones
fueron realizadas con diez puntos por década a un barrido desde 0.1 a 1 MHz, estos
parámetros permite obtener las respuestas de interés en la zona de altas frecuencias, zona
en donde se llevan a cabo los procesos de transferencia de masa y cargas iónicas, como lo
son la formación de capas en la superficie del material.
El circuito de ajuste para el proceso electroquímico obtenido se muestra en la figura 33.
La primera parte nos describe un proceso capacitivo y resistivo debido a la adsorción de Ca
en la superficie, el cual, muestra un comportamiento independiente a los demás procesos
de interacción recubrimiento-electrolito. La segunda fase del circuito nos muestra un
proceso que describe dos fenómenos en los cuales existe una continuidad eléctrica, por lo
que, las respuestas están solapadas mostrando una tendencia a una línea recta a 45°.
Donde Rsbf, Rads, Rsbf/rec y Rrec/sust son la resistividad propia de la solución, la
resistividad debida a la adsorción de calcio, la resistividad en la interfase de solución-
recubrimiento y la resistividad debida a la interacción del recubrimiento mismo hacia el
sustrato respectivamente, a su vez cada proceso va acompañado de una capacitancia de
fase de doble capa electroquímica debido a la transferencia de carga propiciada por la
adsorción de especies así como la transferencia de carga debido a las diferentes fases.
Rsbf CPEads
Rads
CPEsbf/rec
Rsbf/rec CPErec/sust
Rrec/sust
Element Freedom Value Error Error %
Rsbf Fixed(X) 131,2 N/A N/A
CPEads-T Fixed(X) 1,8793E-05 N/A N/A
CPEads-P Fixed(X) 0,88639 N/A N/A
Rads Fixed(X) 48,58 N/A N/A
CPEsbf/rec-T Fixed(X) 1,4072E-05 N/A N/A
CPEsbf/rec-P Fixed(X) 0,31968 N/A N/A
Rsbf/rec Fixed(X) 717,8 N/A N/A
CPErec/sust-T Fixed(X) 7,7858E-06 N/A N/A
CPErec/sust-P Fixed(X) 0,686 N/A N/A
Rrec/sust Free(+) 3,8567E19 1E20 259,29
Chi-Squared: 5,0034E-06
Weighted Sum of Squares: 0,0001451
Data File: ~Clipboard
Circuit Model File: G:\electroquimica\mod roberto.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0,1 - 100000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
Figura 33 Modelo de Circuito Electrónico para análisis EIS
89
En la figura 34, se muestra los diferentes diagramas obtenidos por el análisis de
espectroscopia de impedancia electroquímica, diagrama de Nyquist y diagrama de Bode
respectivamente para cada uno de los recubrimientos; de manera general se puede
observar que los recubrimientos presentan un comportamiento altamente capacitivo en la
región de bajas frecuencias, en el diagrama de Nyquist esto se puede observar en la región
de bajas frecuencias presentando una línea recta con tendencia a 45°, mientras que en el
diagrama de Bode esto se puede observar con ángulos de fase superiores a 40 grados. Por
otra parte, se puede observar en la zona de altas frecuencias un comportamiento
mayormente resistivo, esto se puede observar en la formación de semicírculos, los cuales,
corresponden a la región de la absorción de Ca y la interacción de la solución
SBF/recubrimiento, a su vez se puede observar una depresión para estos semicírculos
producto de la rugosidad con la que cuentan los recubrimientos. En la tabla 16, se muestran
los resultados obtenidos del análisis por modelo de ajuste del circuito equivalente para cada
uno de los recubrimientos, observándose, que la variación en la concentración de calcio
tiene una tendencia al aumento en la resistividad debido a la adsorción de Ca en la solución
SBF.
A bajas concentraciones de Ca (2.5mM), el recubrimiento de HA presenta una mayor
adsorción de Ca, lo que corresponde de manera similar a los resultados obtenidos mediante
la precipitación de apatita por inmersión en solución SBF, sin embargo, el comportamiento
no fue igual al obtenido para el recubrimiento 73M, en el cual, presentó una baja
resistividad debido a la adsorción de Ca.
90
Figura 34 Diagrama de Nyquist (a la izquierda) seguida por el diagrama de Bode para representación del análisis de impedancia electroquímica para el análisis a diferentes concentraciones de Ca en solución SBF; a) 2.5mM, b) 4.5mM y c) 6.5mM
91
Tabla 16 Valores Obtenidos mediante EIS
92
Ángulo de contacto
En la figura 35, se observan las imágenes obtenidas en el ensayo de gota para la medición
del ángulo de contacto para los recubrimientos sin tratamiento superficial por descarga
intensa por plasma (Glow Discharged, GD). Se puede observar que el incremento en el
ángulo de contacto está ligado principalmente con la rugosidad del material, por una parte
se puede observar que los recubrimientos de HA presentan ángulos de contacto más bajos
(de acuerdo con la tabla17), dicho ángulo se ve afectado conforme aumenta la
concentración de YSZ en la matriz de los recubrimientos, que de acuerdo al análisis por AFM
la rugosidad aumenta conforme aumenta la concentración de YSZ en la matriz. Por otra
parte se puede observar que para los recubrimientos 91M y 73M se presenta una mayor
ángulo de contacto debido a una mayor rugosidad con respecto a los recubrimientos 91A y
73A, lo cual, es generada por la disminución del tamaño de partícula producto del
tratamiento de molienda mecánica.
Figura 35 Imágenes obtenidas para análisis de ángulo de contacto para los recubrimientos; HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M.
93
En la figura 36 se observan las imágenes obtenidas en el ensayo de ángulo de contacto para
los recubrimientos sometidos al tratamiento por descarga intensa por plasma, donde se
observa una disminución en las propiedades de hidrofobicidad del material tendiendo a un
comportamiento hidrofílico, el cual de acuerdo a J. I. Rosales [31] tenga efectos positivos
en la adherencia celular sobre la superficie del material.
Figura 36 Imágenes obtenidas para análisis de ángulo de contacto para los recubrimientos sometidos a tratamiento por
GD; HA, b) 91A, c) 91M, d) 73A y e) 73M
En la Tabla 17 se muestran los valores de energía superficial obtenidas a partir de la
medición del ángulo de contacto θc, dicha energía fue calculada de acuerdo a la ecuación
de Young-Dupre.
∆WSLV = 𝛾(1 + cosθc)
Donde 𝛾 es la tensión superficial del líquido de análisis, para fines de esta investigación fue
utilizado como liquido de análisis agua de osmosis inversa con un valor de tensión
superficial de 72.75 mJ/m2. Mediante este análisis, se puede observar que los
recubrimientos obtenidos mediante polvos sometidos a una homogenización por agitación
mecánica presentan una mejor respuesta hidrofílica, teniendo valores de energía de
adhesión mayores que a sus recubrimientos homólogos en concentración obtenidos por
polvos con tratamiento de molienda mecánica (57.73 ± 7.03 y 35.28± 7.03 para los
94
recubrimientos 91A y 73A). Por otra parte se puede observar el aumento en la energía de
adhesión debida al tratamiento por GD para los diferentes tipos de recubrimiento, dicho
tratamiento logra generar una respuesta similar para ambos recubrimientos sin importar la
rugosidad.
Tabla 17 Valores obtenidos de análisis de ángulo de contacto
Sin Tratamiento GD Con Tratamiento GD Ángulo de
Contacto (°) Energía Adhesión
(mJ/m^2) Ángulo de
Contacto (°) Energía
adhesión HA 99.2 ± 6.04 61.16 ± 7.59 27.21 ± 1.08 137.46 ± 0.59 91A 102.04 ± 5.61 57.73 ± 7.03 40.32 ± 1.46 124.36 ± 1.18 91M 127.10 ± 6.40 29.14 ± 6.31 44.78 ± 1.98 124.36 ± 1.73 73A 121.30 ± 7.62 35.28 ± 8.14 51.08 ± 1.48 118.43 ± 1.47 73M 141.70 ± 5.09 15.892 ± 4.11 53.72 ± 2.014 115.79 ± 2.05
7.3.7 Ensayos In-Vitro
Morfología celular
En las figura 37 y 38, se muestran las imágenes obtenidas mediante MEB-PV para el sustrato
sin modificación y los diversos recubrimientos expuestos al medio RPMI-1% Penicilina-
Estreptomicina y carga celular, en las cuales, se puede observar una serie de células
adheridas en la superficie, indicando la compatibilidad y afinidad de la células sobre los
recubrimientos desarrollados en la presente tesis. En la figura 38, se puede observar ensayo
similar únicamente sobre el sustrato de Ti6Al4V ELI (sin recubrimiento), donde las células
adheridas presentan un estiramiento de la membrana celular, la cual es una morfología
típica que presentan las células al adherirse sobre la superficie del material con, las células
adheridas sobre la superficie del Ti6Al4V ELI presentaron un tamaño aproximado de los 20
a35 µm.
95
En la figura 38 se puede observar que mediante imagen por electrones secundarios y
retrodispersados, tanto para los recubrimientos sometidos a molienda mecánica como
simple agitación, la adherencia celular se ve afectada principalmente por la rugosidad
superficial presente en los recubrimientos, observándose una adherencia restringida
debido a la topografía superficial presente de estos recubrimientos presentando un tamaño
celular entre los 15 a 25µm.
Figura 37Micrografías para análisis de morfología celular de HOS adheridos en sustrato de TI6Al4V; a) y b) imágenes a 300X en modo de electrones secundarios y retrodispersados respectivamente, c) y d) imágenes a 1000X en modo de electrones secundarios y retrodispersados
96
a)
e)
d)
g)
f)
c)
b)
h)
Figura 38 Micrografías a 500X para análisis de morfología celular de HOS de los recubrimientos; a) y b) HA en modo de electrones secundarios y retrodispersados respectivamente, c) y d) 91A en modo de electrones secundarios y retrodispersados respectivamente, e) y retrodispersados respectivamente, e) y f) 91M en modo de electrones secundarios y retrodispersados respectivamente, g) y h) ) 73A en modo de electrones secundarios y retrodispersados respectivamente y i) y j) 73M en modo de electrones secundarios y retrodispersados respectivamente
97
Adhesión cuantitativa celular.
En la tabla 18, se muestran los resultados obtenidos por el conteo celular de las muestras
sometidas a una exposición de carga celular, el conteo es obtenido mediante cámara
Neubauer, en los cuales, se muestran que las probetas en general permiten la adhesión de
un número cuantificable de células HOS. En la mayoría de los casos, las probetas con
recubrimiento mostraron una mayor cantidad de células adheridas con relación a la probeta
control (Ti6Al4V). Las probetas con mayor conteo celular fueron 91M y 91A obtuvieron
valores de 28.0 y 23.5 x104 células/probeta respectivamente.
Tabla 18 Valores de conteo celular para los diferentes recubrimientos
Código de Muestra N° de células/probeta (x10^4)
Ti 2.5
HA 12 91A 23.5 91M 28 73A 18.5 73M 14.5
Citotoxicidad.
i) j)
Continuación figura 38
98
En la tabla 19, se muestra los resultados obtenidos mediante el ensayo de citotoxicidad, en
la cual, se puede observar una baja citotoxicidad por parte de los recubrimientos. Para el
cálculo de la concentración citotóxica 90 y concentración citotóxica 50, ninguna de las
diluciones evaluadas de los sobrenadantes de probetas incubadas con medio RPMI, alcanzó
un porcentaje de toxicidad cercano al 50% en células HOS, por lo que de acuerdo a este
ensayo, los recubrimientos no presentan una respuesta citotóxica considerable, se puede
observar que en los sobrenadantes de las probetas 73M y 91A, se presentó los valores más
altos de toxicidad con valores de 37.4 y 25.1 respectivamente, a la mayor concentración
evaluada 1/2. Por otra parte mediante este ensayo se concluye que la una concentración
utilizada en la presente investigación del 1% de Ag (%P/P) no muestra una respuesta
citotóxica considerable, resultados los cuales muestran una similitud con los obtenidos por
S. Bose [7] y X. Bai [8] a mismas concentraciones.
Tabla 19 Valores obtenidos de % de citotoxicidad para los diferentes recubrimientos
No Código % de citotoxicidad (DS) CC50 (µg/mL±DE)
CC90 (µg/mL±DS) Dilución
1/2 1/4 1/8 1/16
1 Ti 3,8±8,8 0,9±6,2 0,0 0,0 ND ND 2 HA 0,0 0,0 0,0 0,0 ND ND 3 73M 37,4±1,8 9,3±2,3 0,0 0,0 ND ND 4 73A 3,0±3,7 0,0 0,0 0,0 ND ND 5 91A 25,1±4,0 3,2±5,7 2,4±5,5 0,0 ND ND 6 91M 18,2±13,3 0,0 0,0 0,0 ND ND
99
Bioactividad, expresión de fosfatasa alcalina (ALP)
En la gráfica 5, se muestra la actividad celular en relación a la concentración de ALP total
cuantificada para las células HOS adheridas y, los sobrenadantes correspondientes en cada
uno de las probetas sometidas al ensayo. Se puede observar que los recubrimientos HA y
91A mostraron una mayor actividad celular relacionada con la concentración de ALP total,
los cuales, presentaron valores de 44.7 y 28.8 U/L de ALP respectivamente. Estos valores
registrados fueron superiores a los valores obtenidos para los controles con 1.4 y 27.6 U/L
para la probeta de Ti6Al4V sin modificar y para el pozo control respectivamente. Por otra
parte, se puede observar que la mayoría de las muestras tuvieron un comportamiento
similar al del pozo control a excepción del recubrimiento 73A, el cual, mostro la menor
actividad relacionada con ALP.
Gráfica 1 Valores de concentración mediante expresión de ALP para los diferentes recubrimientos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Controlcelular
TiAlV 73A 73M 91A 91M HA
Co
nce
ntr
ació
n d
e A
LP (
U/L
)
100
8. CONCLUSIONES
Mediante el análisis por DRX para los polvos se pudo observar, que un tratamiento por
molienda mecánica no influye en la degradación de fases o posible reacción entre HA y YSZ
durante el tratamiento, sin embargo mediante esta mismo análisis se pudo observar que
para los recubrimientos se observa una degradación de HA a TTCP y TCP, la cual es debida
a las altas temperaturas alcanzadas durante el proceso de recubrimiento por proyección
térmica por plasma.
De acuerdo al análisis entre ambos métodos de homogenización se puede observar que
mediante el tratamiento de molienda mecánica previo a la proyección térmica ayuda a
mejorar la dispersión de los compuestos, eliminando un comportamiento de
encapsulamiento de las partículas de HA por las nanopartículas de YSZ, evitando la
aglomeración YSZ sobre el recubrimiento así como una disminución de las fallas presentes
en los recubrimientos.
En base a los resultados obtenidos mediante los ensayos mecánicos puede observarse que
los recubrimientos sometidos a una molienda mecánica presentan un mejor desempeño
en cuanto a propiedades mecánicas como dureza y modulo elástico, siendo el
recubrimiento 91M el cual presento valores cercanos a los obtenidos por P. K. Zysset para
el hueso cortical y hueso esponjoso de fémur humano.
Se puede observar en cuanto a la concentración de YSZ, se tiene un comportamiento similar
a los resultados obtenidos por L. Fu et al, el aumento de la concentración promueve un
aumento de las propiedades mecánicas evaluadas en la presente investigación, sin embargo
101
debido a la aplicación, el recubrimiento 91M siendo el que presenta los valores más acordes
en cuanto a propiedades mecánicas.
En cuanto a los recubrimientos sometidos a una homogenización por molienda mecánica
se puede observar que este tratamiento influye de manera positiva en cuanto a las
propiedades de adherencia hacia el recubrimiento así como a las propiedades mecánicas
de acuerdo a su aplicación como biomaterial, los cuales alcanzaron valores superiores a los
recubrimientos tanto HA comercial como sus homólogos en concentración sometidos a una
homogenización por simple agitación, a su vez dichos valores superiores a los obtenidos por
para las diferentes relaciones de HA
Mediante el tratamiento de GD se pudo observar un cambio significativo en los materiales
pudiendo pasar de un comportamiento hidrofóbico a un comportamiento hidrofílico. Por
otra parte se puede confirmar de acuerdo a J.I Rosales la estrecha relación que presenta la
capacidad hidrofílica con respecto a la rugosidad del material.
En base a los ensayos In-vitro se confirmo un crecimiento celular así como su actividad
sobre la superficie, lo cual indica que el material tiene propiedades de osteoconducción.
Por otra parte se descarta una posible respuesta citotóxica por parte de los recubrimientos
al no alcanzar CC50 para las diferentes diluciones, por lo que la YSZ así como las nAg
presentes en la matriz no altera algún efecto en esta propiedad. Así mismo mediante el
ensayo MTT realizado en la presente investigación se puede confirmar que, de acuerdo a S.
Bose et. al y X. Bai, la concentración de 1% de Ag en la matriz es la ideal para no generar
una respuesta citotóxica debida a la apoptosis.
102
Mediante el análisis de adsorción de Ca por EIS y el análisis de inmersión en solución
simulada de fluido corporal de acuerdo a la metodología planteada por T. Kokubo et. al, se
puede observar la afinidad presentes en los recubrimiento para promover una
osteointegración debido a la adsorción de Ca sobre la superficie.
Por último englobando los resultados obtenidos en la presente investigación se tiene que
el recubrimiento 91M, el cual obtenido mediante un tratamiento de homogenización
mediante molienda mecánica de alta energía y cuya relación %P/P fue de
HA89.1YSZ8.9nAg(EN)1, presento el mejor desempeño tanto en propiedades mecánicas, así
como de respuesta celular y afinidad a la osteoconducción, las cuales son ideales acorde a
la aplicación como un bio-recubrimiento osteoconductor para vástago de implante de
cadera.
103
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