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DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A
ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM PARA LA DETECCIÓN DE ESCOPOLAMINA Y CONFIRMACIÓN
DE BENZODIACEPINAS EN MUESTRAS DE ORINA
Servicio de Bioquímica Clínica Laboratorio de Medicina Hospital Universitario Central de Asturias
Eduardo Martínez Morillo, Paula Lafuente Ganuza, Belén Prieto García, Francisco V. Álvarez Menéndez
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
CG-MS/MS Hospital Universitario Central de Asturias 2
Introducción
La escopolamina (burundanga) es un alcaloide tropánico obtenido de plantas solanáceas (estramonio)
A dosis ↑: efectos en el SNC Dolor de cabeza Desorientación, mareo Agitación, alucinaciones Delirio y confusión.
La escopolamina ha sido asociada a casos de abusos sexuales por sumisión química
Disponer de un método de referencia que permita identificar su presencia en casos sospechosos de intoxicación puede ser de utilidad
Pueden presentar falsos positivos (por sertralina, AINES, etc)
Indicaciones en medicina: Prevención de la cinetosis Premedicación en anestesia Espasmos del tracto gastrointestinal
Los inmunoensayos son los métodos de cribado habitualmente usados para la detección de benzodiacepinas en orina en casos de intoxicaciones, o para la monitorización de pacientes psiquiátricos
Los métodos de referencia pueden ser necesarios para confirmar los resultados positivos
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Desarrollar dos métodos de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS) para la detección de escopolamina y para la confirmación de benzodiacepinas en muestras
de orina.
Objetivo
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Material y Métodos
Se inyectan 2 µL de muestra en el GC-MS/MS
Escopolamina
Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple
cuadrupolo (Scion TQ, Bruker)
Columna capilar Rxi®-5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas
Extracción sólido-líquido cartuchos Bond Elut Certify, Agilent
- Lavado del cartucho con agua, ácido acético 1M y metanol - Elución con 2 mL de diclorometano-isopropanol-amoniaco (78/20/2)
Evaporación del disolvente en corriente de nitrógeno
+50 µL BSTFA-TMCS 1% (agente derivatizante)
Incubación a 70ºC durante 20 min
+150 µL de acetato de etilo
2 mL de orina con escopolamina (Sigma-Aldrich) + 100 µL de PI (Proadifen, 100 µg/mL) + 1 mL de tampón fosfato (0.1M, pH=6).
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Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple
cuadrupolo (Scion TQ, Bruker)
Material y Métodos
Incubación 1 mL orina 3 horas a 65ºC con β-glucuronidasa
Se inyectan 2 µL de muestra en el GC-MS/MS
Extracción sólido-líquido cartuchos Bond Elut Certify, Agilent
- Lavado del cartucho con agua, tampón acetato (pH=4.0) y metanol - Elución con 2 mL de metanol-amoniaco (98/2)
Evaporación del disolvente
+50 µL BSTFA-TMCS 1% (agente derivatizante)
Incubación a 70ºC durante 20 min
+150 µL de acetato de etilo
Benzodiacepinas
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Columna capilar Rxi®-5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas
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Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple
cuadrupolo (Scion TQ, Bruker)
Material y Métodos
1. Full Scan Identificación de compuestos en librería NIST MS Search 2.0
y selección de los iones precursores más característicos
2. Product Ion Selección de fragmentos y energías de colisión (EC)
3. MRM
Selección de las 4-5 transiciones más intensas y específicas
Optimización del método en tres pasos Análisis de muestras en modo:
Columna capilar Rxi®-5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas
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Resultados y discusión
Gradiente de temperaturas (ºC) del horno para la separación de la escopolamina
Espectro de masas obtenido para una solución patrón de
escopolamina 10 µg/ml (A) y comparación con el espectro disponible en la
librería NIST MS Search 2.0 (B)
Tª del inyector: 250ºC Gas portador: He a flujo constante: 1 ml/min Tiempo total de análisis: 35 min (tabla 1)
Análisis de escopolamina en modo MRM (polaridad positiva)
Tiempo de retención Proadifen (PI): 21.52 min Tiempo de retención Escopolamina: 22.11 min
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Resultados y discusión
Fragmentos con mayor intensidad: iones 154, 138, 120 y 94
Patrón de fragmentación del ión 375 (Precursor)
Análisis en modo “product ion” y selección de fragmentos iónicos para ser filtrados en el tercer cuadrupolo
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Resultados y discusión
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Transiciones utilizadas para la identificación de la escopolamina y del proadifen
Transiciones e intensidades relativas del método MRM
Evaluación de sensibilidad. Pico cromatográfico en 6 muestras de orina con 0, 150, 300, 500, 1000 y 2000 ng/ml de escopolamina
La escopolamina fue detectada en todas las muestras salvo en la primera (blanco de muestra)
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Resultados y discusión
Características del método MRM para benzodiacepinas:
Calibradores Preciset DAT Plus I, Cobas®, Roche Material de control LiquichekTM Qualitative Urine
Toxicology (Bio-Rad)
Se confirmó que este método es capaz de identificar nordiazepam (≥150 ng/mL) y oxazepam (≥300 ng/mL) a concentraciones ≤ los puntos de corte utilizados en
los métodos de cribado CG-MS/MS
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Conclusión
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La CG-MS/MS es una metodología que proporciona mejores prestaciones analíticas que la tradicional GC-MS
El análisis en modo “MRM” es más específico que el análisis en modo “SIM” y más
sensible que el análisis en modo “Full Scan”
Es una metodología de referencia de alto rendimiento para la confirmación de benzodiacepinas e identificación de escopolamina en muestras de orina
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