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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA
Departamento de Nutrición y Bromatología I (Nutrición)
TESIS DOCTORAL
Desarrollo de una nueva generación de alimentos para el control de peso y prevención de la obesidad
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Luciana Alina Gheorghe Rosu
Directoras
Fátima Pérez de Heredia Ligia Esperanza Díaz Prieto Ascensión Marcos Sánchez
Madrid, 2018
© Luciana Alina Gheorghe Rosu, 2017
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Nutrición y Bromatología I. Nutrición
TESIS DOCTORAL
Desarrollo de una nueva generación de alimentos para el control de peso
y prevención de la obesidad
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Luciana Alina Gheorghe Rosu
DIRECTORAS
Doctora Fátima Pérez de Heredia
Doctora Ligia Esperanza Díaz Prieto
Profesora Ascensión Marcos
Madrid, 2017
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
Departamento de Nutrición y Bromatología I. Nutrición
Desarrollo de una nueva generación de alimentos para el control de peso y prevención de la obesidad
Memoria presentada por Luciana Alina Gheorghe Rosu para optar al grado de doctor
por la Universidad Complutense de Madrid
Bajo la dirección de:
Doctora Fátima Pérez de Heredia (Liverpool John Moores University)
Doctora Ligia Esperanza Díaz Prieto (ICTAN-CSIC)
Profesora Ascensión Marcos (ICTAN-CSIC)
Madrid, 2017
Doctora Fátima Pérez de Heredia (Escuela de Ciencias Naturales y Psicología,
Liverpool John Moores University, Liverpool, Reino Unido),doctora Ligia Esperanza
Díaz y profesora Ascensión Marcos (Grupo de Inmunonutrición, Departamento de
Metabolismo y Nutrición,Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentosy Nutrición
(ICTAN), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid, España)
CERTIFICAN
Que la presente memoria titulada: “Desarrollo de una nueva generación de alimentos
para el control de peso y prevención de la obesidad”, cuya autora es Alina Luciana
Gheorghe Rosu para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Instituto de
Ciencia y Tecnología de los Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) bajo su dirección, y
que hallándose concluida, autorizan su presentación para que pueda ser juzgada por
el tribunal correspondiente.
Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos elpresente certificado en
Madrid a 30 de marzo de 2017.
Fátima Pérez de Heredia Ligia Esperanza Díaz Prieto
Ascensión Marcos
Desarrollo de una nueva generación de alimentos para el control de peso
y prevención de la obesidad
Tesis doctoral presentada por:
Luciana Alina Gheorghe Rosu
Para optar al grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid
Vº Bueno de las directoras:
Fdo. Dra. Fátima Pereza de Heredia Fdo. Dra. Ligia Esperanza Díaz
Prieto
Fdo. Prof. Ascensión Marcos Sánchez
Vº Bueno del órgano responsable
Fdo. Dra.Rosa Maria Ortega
La presente memoria ha sido realizada en el Departamento de Metabolismo y
Nutrición del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos y Nutrición, Consejo
Superior de Investigaciones Científicas (ICTAN-CSIC).
El trabajo fue apoyado por el Programa CENIT (Consorcios Estratégicos Nacionales
de Investigación Técnica) y BTSA-Applied Biotechnologies SL, el Ministerio de
Economía y Competitividad (MICINN, BFU2011-3036), el RETICEF (RD12 /
0043/0018) y FIS (PI15 / 01787) del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) -FEDER de la
Unión Europea y del Estudio PRONAOS (CDTI 20081114).
AGRADECIMIENTOS
A lo largo del desarrollo de esta tesis he recibido mucha ayuda de gente que me ha brindado
sus conocimientos y por ello, quiero destacar a las personas que, por su especial colaboración
en este trabajo, merecen mi más profundo agradecimiento.
A mis tres directoras: Ascensión, por brindarme la oportunidad de llevar a cabo este proyecto y
por ayudarme tanto. Lo que principalmente me ha aportado estos años ha sido un ejemplo de
honestidad, y valores. Quiero agradecer especialmente y de todo el corazon a Fátima todo lo
que me ha enseñado durante este tiempo. Gracias por inculcarme la importancia de desarrollar
la tesis doctoral, y por apoyarme en todo momento. A Ligia Esperanza, trabajadora, alegre y
aplicada le doy las gracias porque me ayudó y me escuchó todo el tiempo.
Me gustaría agradecerle a la persona que se ha convertido en mi buena amiga Noemí, que me
haya ayudado en todo y me ha dado un grandísimo cariño, apoyo constante, calidez y
cercanía.
Quisiera también dar las gracias a la profesora Mónica de la Fuente y a Caroline por la
amabilidad con la que me han ayudado con parte de mi tesis. No quiero olvidarme a Belén y
Laura por todo el apoyo en el análisis estadístico y por estar siempre dispuestas a ayudarme.
Por último, y no por ello, menos importante a mi familia. El desarrollo de esta tesis ha supuesto
para mí un gran esfuerzo, pero puedo decir que ahora mismo siento que ha merecido la pena y
estoy muy orgullosa de ello.
10
INDICE
INDICE DE TABLAS ............................................................................................................................. 13 INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................... 14 ABREVIATURAS ................................................................................................................................... 15 RESUMEN ........................................................................................................................................... 19 ABSTRACT ........................................................................................................................................... 24
I. INTRODUCCION ................................................................................................................................ 29
1. EPIDEMIOLOGIA DE LA OBESIDAD ...................................................................................................... 29
1.1 Definición, diagnóstico y clasificación de la obesidad .................................................................................... 29 1.2. Prevalencia de la obesidad en el mundo y en España ................................................................................... 32
1.2.1. Prevalencia en adultos ......................................................................................................................... 32 1.2.2. Prevalencia infanto-juvenil .................................................................................................................. 33
1.3. Factores de riesgo .......................................................................................................................................... 35 1.3.1. Modelos de obesidad por dieta ........................................................................................................... 38
2. COMPLICACIONES ASOCIADAS A LA OBESIDAD .................................................................................. 40
2.1. Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) ...................................................................................................................... 40 2.2. Enfermedades cardiovasculares .................................................................................................................... 41 2.3. Hipertensión arterial ...................................................................................................................................... 42 2.4. Dislipemias ..................................................................................................................................................... 44 2.5. Otras comorbilidades asociadas a obesidad ................................................................................................. 45
-Cáncer ...................................................................................................................................................... 45 -Enfermedades respiratorias .................................................................................................................... 45 -Enfermedades del hígado ........................................................................................................................ 45 -Aparato locomotor .................................................................................................................................. 46 -Síndrome del ovario poliquístico ............................................................................................................. 46 -Problemas mentales ................................................................................................................................ 46
3. OBESIDAD, SISTEMA INMUNE Y ESTRÉS OXIDATIVO .......................................................................... 47
3.1. Papel del tejido adiposo en la inflamación asociada a la obesidad ............................................................... 47 3.2. El tejido adiposo como órgano secretor ........................................................................................................ 50
3.2.1. Leptina ................................................................................................................................................. 51 3.2.2. Adiponectina........................................................................................................................................ 52 3.2.3. Resistina ............................................................................................................................................... 53
3.3. Origen de la inflamación en la obesidad. Biomarcadores del estado inflamatorio ....................................... 54 3.4. Obesidad y estrés oxidativo (EO) ................................................................................................................... 59
4.ÁCIDOS GRASOS .................................................................................................................................. 62
4.1. Clasificación de los ácidos grasos y generalidades ........................................................................................ 62 -Ácidos grasos saturados .......................................................................................................................... 62 -Ácidos grasos monoinsaturados .............................................................................................................. 63 -Ácidos grasos poliinsaturados ................................................................................................................. 63
4.2. Papel de los ácidos grasos en la obesidad y enfermedades asociadas .......................................................... 64 4.2.1. Efecto de los ácidos grasos saturados ................................................................................................. 64 4.2.2. Efecto de los ácidos grasos monoinsaturados ..................................................................................... 65 4.2.3. Efecto de los ácidos grasos poliinsaturados ........................................................................................ 68 4.2.4. Recomendaciones ................................................................................................................................ 73
5. EL PROYECTO PRONAOS ..................................................................................................................... 74
II. OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 76
III. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................................... 78
1. ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................................. 78
1.1. Animales de experimentación utilizados ....................................................................................................... 78
11
1.2. Diseño experimental y dietas ......................................................................................................................... 78 2. DETERMINACIONES FISIOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS ........................................................................... 81
2.1. Análisis de grasa corporal por resonancia magnética nuclear ...................................................................... 81 2.2. Determinación de la tensión arterial ............................................................................................................. 83 2.3. Determinaciones de glucosa, colesterol y triglicéridos en sangre ................................................................. 84 2.4. Valoración plasmática de niveles de hormonas, moléculas pro-inflamatorias y de riesgo cardiovascular ...................................................................................................................................................... 85
3. DETERMINACIONES INMUNOLÓGICAS .............................................................................................. 87
3.1. Análisis de subpoblaciones de linfocitos ........................................................................................................ 87 3.1.1. Subpoblaciones linfocitarias en sangre................................................................................................ 87 3.1.2. Subpoblaciones linfocitarias en bazo ................................................................................................... 87
3.2. Análisis de producción de citoquinas por linfocitos de sangre periférica ...................................................... 88 3.3. Determinaciones en tejido adiposo ............................................................................................................... 88
3.3.1. Aislamiento de los adipocitos .............................................................................................................. 88 3.3.2. Cultivo de adipocitos ........................................................................................................................... 89
4. VALORACIÓN DEL ESTADO REDOX CELULAR ...................................................................................... 91
4.1. Niveles de glutatión reducido y glutatión oxidado ........................................................................................ 91 4.2. Determinación del nivel de peroxidación lipídica-malondialdehído .............................................................. 92 4.3. Actividad xantina oxidasa .............................................................................................................................. 93
5. ESTUDIO DE FUNCIONES INMUNITARIAS ........................................................................................... 94
5.1. Movilidad inducida o quimiotaxis .................................................................................................................. 95 5.2. Estudio de la actividad citotóxica natural killer de los leucocitos .................................................................. 96 5.3. Capacidad proliferativa de los linfocitos ........................................................................................................ 98
6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO...................................................................................................................... 100
IV. RESULTADOS ................................................................................................................................ 103
1. VALORACIÓN DE INGESTA DIETÉTICA Y EVOLUCIÓN DEL PESO ........................................................ 103
2. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LA GRASA CORPORAL Y VISCERAL Y EN EL PESO DE ÓRGANOS 106
3. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS .................. 109
4. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS...................................... 114
5. EFECTOS DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS VALORES DE ADIPOQUINAS, CITOQUINAS Y HORMONAS
............................................................................................................................................................. 115
5.1. En tejido adiposo en cultivo ......................................................................................................................... 115 5.2. Citoquinas .................................................................................................................................................... 117 5.3. Hormonas plasmáticas ................................................................................................................................ 118
6. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS MARCADORES DE SALUD CARDIOVASCULAR .................... 119
7. EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE ESTRÉS OXIDATIVO Y FUNCIÓN EN CÉLULAS INMUNITARIAS
............................................................................................................................................................. 120
7. 1. Efecto de los tratamientos sobre los parámetros de estrés oxidativo ........................................................ 120 7.1.1. Niveles de compuestos oxidantes y defensas antioxidantes ............................................................. 120 7.1.2. Peroxidación lipídica .......................................................................................................................... 120 7.1.3. Actividad xantina oxidasa .................................................................................................................. 121
7.2. Efecto de los tratamientos sobre parámetros de la función inmune ........................................................... 122 7.2.1. Índice de quimiotaxis de los linfocitos del bazo ................................................................................ 122 7.2.2. Actividad citotóxica de los leucocitos del bazo .................................................................................. 123 7.2.3. Capacidad proliferativa de los linfocitos del bazo en respuesta a mitógenos ................................... 123
V. DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 126
1. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE LA INGESTA, EL PESO Y LA GRASA CORPORALES, Y EL PESO DE
ÓRGANOS INTERNOS ........................................................................................................................... 126
2. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS .................. 130
12
3. EFECTOS DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS VALORES DE ADIPOQUINAS, CITOQUINAS Y HORMONAS
............................................................................................................................................................. 135
4. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE LOS PARÁMETROS DE ESTRÉS OXIDATIVO ......................... 143
5. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS ...................................... 147
VI. CONCLUSIONES............................................................................................................................. 153
VII. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................................. 155
ANEXOS .......................................................................................................................................... 254
ANEXO 1: Mujico JR, Baccan GC, Gheorghe A, Díaz LE, Marcos A (2013). Changes in gut microbiota due to
supplemented fatty acids in diet-induced obese mice. British Journal of Nutrition.110:711-20. ............... 255
ANEXO 2: Gheorghe A, Pérez de Heredia F, Hunsche C, Redondo N, Díaz LE, Hernández O, et al. (2017).
Oxidative stress and immunosenescence in spleen of obese mice can be reversed by 2-hydroxyoleic acid.
Exp Physiol. Online. ..................................................................................................................................... 266
13
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de grado de obesidad de acuerdo al IMC (Sociedad Española para el Estudio
de la Obesidad (SEEDO)………………………………………………………………………………………31
Tabla 2. Contenido de macronutrientes y micronutrientes de energía de las dietas experimentales
utilizadas…………………………………………………………………………………………………………81
Tabla 3. Ingesta de dieta durante las fases de inducción de la obesidad (8 semanas) y de
suplementación con ácido 2-hidroxioléico (DO-HO) u omega 3 (DO-N3) (6
semanas)…………………………………………………………………………………………………..…...104
Tabla 4. Peso corporal medio en gramos al principio y al final del estudio………………….……..…..105
Tabla 5. Pesos medios de los órganos internos…………………………………………………………...109
Tabla 6. Parámetros fisiológicos y bioquímicos después de 8 semanas con dieta estándar o dieta
obesogénica……………………………………………………………………………………………………110
Tabla 7. Concentraciones de colesterol total en sangre………………………………………………….113
Tabla 8. Porcentajes de las poblaciones de linfocitos circulantes en sangre y bazo………………….115
Tabla 9. Secreción de adipoquinas y citoquinas en tejido adiposo en cultivo, en condiciones basal
y de estimulaciónconLPS…………………………………………………………………………….….......117
Tabla 10. Niveles de secreción de citoquinas por células sanguíneas
cultivadas…………………………………………………………………………………………...…….…….118
Tabla 11. Niveles plasmáticos de hormonas………………………………………………………….……119
Tabla 12. Niveles plasmáticos de marcadores cardiovasculares.....…………..………………………..120
Tabla 13. Concentraciones de glutatión reducido y oxidado en el bazo de los
ratones……………………………………………………………………………………..…………...………121
14
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tipos de obesidad: A) ginoide; B) androi…...……………………………..…….….….... 31
Figura 2. Prevalencia de sobrepeso y obesidad en el mundo………………………...………..... 32
Figura 3. Mecanismo de aparición de HTA en obesidad……………………………...…………... 44
Figura 4. Tejido adiposo blanco (A) y tejido adiposo marrón (B)……………….......................... 47
Figura 5. Localización del tejido adiposo pardo en el adulto.……………………........................ 48
Figura 6. Contribución de los distintos tipos celulares a la inflamación del tejido adiposo........ 59
Figura 7. Daños oxidativos involucrados en enfermedades crónicas………..…..………........... 61
Figura 8. Resonancia magnética nuclear…………………………………..………............…..….. 82
Figura 9. Medidor de presión no invasivo…………...………...…………..................................... 83
Figura 10.Medidor ACCUTREND ROCHE………………………………………...….…………..... 84
Figura 11. Estructura química del gluation………………………………………………………….. 91
Figura 12. Evolución del peso de los ratones durante 27 semanas.……….................…..……. 105
Figura 13. Imagen obtenida por RMN a las 27 semanas de edad.……………………….……… 106
Figura 14. Peso de los depósitos de grasa visceral (g) 27 semanas de edad...……...….…...... 107
Figura 15. Niveles de glucosa en sangre después de 2 semanas de suplementación...……… 110
Figura 16. Niveles de triglicéridos en sangre tras 2 semanas de suplementación...…….......... 111
Figura 17. Concentraciones de triglicéridos en sangre tras 1 mes de suplementación….......... 111
Figura 18. Tensión sistólica tras 1 mes de suplementación...…………………..….….…....……. 113
Figura 19. Tensión diastólica tras 1 mes de suplementación...…………………………….…….. 113
Figura 20. Niveles de malondialdehído (nmol/mg de proteína) en homogeneizados de bazo………………………………………………………………………………………………………
121
Figura 21. Actividad xantina oxidasa (mU XO/mg proteína) en leucocitos esplénicos aislados…………………………………………………………………………………………………..
121
Figura 22. Índice de quimiotaxis (IC) en linfocitos del bazo...…………...………………….…..... 122
Figura 23. Actividad natural killer (% lisis) de linfocitos del bazo…………………..………..…… 123
Figura 24. Proliferación de linfocitos del bazo en respuesta almitógeno ConA….………..…….
124
Figura 25. Proliferación de linfocitos del bazo en respuesta al mitógeno LPS...……….….…… 124
15
ABREVIATURAS
AA: Ácido araquidónico
AG: Ácidos grasos
AGI: Ácidos grasos insaturados
AGS: Ácidos grasos saturados
AGMI: Ácidos grasos monoinsaturados
AGPI: Ácidos grasos poliinsaturados
AL: Ácido linoleico
ALA: Ácido α-linolénico
ApoA1: Apolipoproteína A-1
ApoE: Apolipoproteína E
AR: Artritis reumatoide
CC: Circunferencia de cintura
ConA: Concanavalina A
cHDL: Colesterol ligado a lipoproteínas de alta densidad
cLDL: Colesterol ligado a lipoproteínas de baja densidad
DE: Desviación estándar
DHA: Ácido docosahexaenoico
DM2: Diabetes mellitus tipo 2
DT: Dieta de transición
ECV: Enfermedad cardiovascular
EO: Estrés oxidativo
EPA: Ácido eicosapentaenoico
GIP: Polipéptido inhibidor gástrico
GSH: Glutatión reducido
GSSG: Glutatión oxidado
HOMA: Índice de resistencia a insulina
HTA: Hipertensión arterial
HVI: Hipertrofia ventricular izquierda
16
ICAM-1: Molécula de adhesión intercelular 1
IC: Indice de quimiotaxis
ICC: Índice cintura-cadera
IL: Interleuquina
IMC: Índice de masa corporal
LPS: Lipopolisacárido
MCP-1: Proteína quimioatrayente de macrófagos 1
MDA: Malondialdehído
MGLU: Modelo Lineal General Univariante
MMP-9: Matrixmetallopeptidasa 9
NK: Células naturalmente asesinas
OMS: Organización Mundial de la Salud
ON: Óxido Nítrico
PAI-1: Inhibidor del activador del plasminógeno1
PCR: Proteína C reactiva
PP: Péptido pancreático
RI: Resistencia a la insulina
PYY: Péptido YY
RL: Radicales libres
RMN: Resonancia magnética nuclear
ROS: Especies reactivas de oxígeno
sE-selectina: selectina E
TAB: Tejido adiposo blanco
TAM: Tejido adiposo marrón
TAS: Tejido adiposo subcutáneo
TAV: Tejido adiposo visceral
TG: Triglicéridos
TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa
VCAM-1: Molécula de adhesión vascular 1
17
VLDL: Lipoproteína de muy baja densidad
XO: Xantina oxidasa
RESUMEN
19
RESUMEN
La prevalencia mundial de sobrepeso y obesidad ha aumentado dramáticamente en las últimas
décadas, alcanzando el nivel de epidemia. Esta condición se asocia a su vez con una amplia
gama de factores de riesgo metabólico, como resistencia a la insulina, valores altos de
triglicéridos y glucosa en sangre, o hipertensión arterial, características todas ellas típicas del
síndrome metabólico, y que promueven un incremento del riesgo de enfermedad
cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2, entre otras enfermedades.
Además, el exceso de adiposidad se caracteriza por una inflamación crónica de bajo grado con
desequilibrio en las adipoquinas del tejido adiposo, en particular en la secreción de leptina y
adiponectina, y en consecuencia en sus valores circulantes. La obesidad también se asocia
con el estrés oxidativo (EO) cuando se mantiene durante largo tiempo, y puede estar mediada
por una disminución de las defensas antioxidantes y/o una mayor formación de oxidantes.
En las últimas décadas también se ha experimentado un aumento del consumo de alimentos
procesados, y este cambio sin duda ha contribuido a la mayor incidencia de sobrepeso y
obesidad. En este sentido, las grasas alimenticias constituyen un factor principal en el
desarrollo de la obesidad y las alteraciones asociadas, y posiblemente también en su
prevención y/o tratamiento.
La dieta mediterránea se ha propuesto como una opción saludable para la prevención de la
obesidad. Se caracteriza por un alto consumo de aceite de oliva, rico en ácidos grasos
monoinsaturados (AGMI), y depescados grasos, principal fuente de ácidos grasos poli-
insaturados (AGPI) n-3, como los ácidos eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA).
Estos ácidos grasos de la dieta son capaces de influir sobre una serie de parámetros
relacionados con la homeostasis energética, como la masa del tejido adiposo, el metabolismo
lipídico, la termogénesis y la ingesta alimentaria. Por otra parte, la dieta mediterránea se ha
relacionado con tasas más bajas de inflamación y oxidación en la obesidad.
20
Este patrón dietético parece ser capaz de modular la respuesta inmune y de ejercer
propiedades anti-inflamatorias y antioxidantes. Esto puede deberse en gran parte a su alto
contenido en AGMI y AGPI n-3, que han mostrado a su vez acciones inmunomoduladoras.
Los objetivos del presente estudio han sido: investigarlos efectos de la administración de una
dieta obesogénica en ratones ICR-CD1® sobre la evolución del peso corporal, la acumulación
de grasa, y marcadores de salud metabólica y cardiovascular, estrés oxidativo y funciones
inmunitarias; y evaluar la efectividad de dos suplementos de ácidos grasos, uno con ácido 2-
hidroxioléico y otro con n-3 AGPI (EPA+DHA) en la reversión o prevención de los posibles
efectos ligados a la dieta obesogénica.
Para ello, ratones hembras ICR-CD1® (8 semanas de edad, n=24) recibieron una dieta
obesogénica progresiva (22% de grasa durante 4 semanas y 60% de grasa durante 14
semanas). Después de 6 semanas con la dieta al 60%, los ratones se dividieron en tres grupos
(n=8/grupo): dieta obesogénica sin suplementación (grupo DO), suplementación con 2-
hidroxioléico, compuesto sintético derivado del ácido oleico (1500 mg/kg dieta; grupo DO-HO),
y suplementación con AGPI n-3 (EPA + DHA, 3000 mg/kg dieta; grupo DO-N3). Otros ocho
ratones fueron alimentados con dieta estándar durante toda la duración del estudio (grupo
control).
Durante el experimento, se registraron la ingesta de alimento y el peso corporal, la grasa
corporal total (por resonancia magnética nuclear), la tensión arterial y parámetros bioquímicos
(triglicéridos, glucosa, insulina y colesterol en sangre). Al final del experimento, se analizó el
peso de órganos internos (cerebro, hígado, corazón y bazo) y de la grasa visceral, así como
una serie de biomarcadores inflamatorios y cardiovasculares circulantes (leptina, adiponectina,
PYY, PP, GIP, sE-selectina, sCAM-1, sICAM, PAI-1, MMP-9, fibrinógeno, Apo-A1, Apo-E).
Además, se midió la secreción de adipoquinas y citoquinas en adipocitos aislados en cultivo
(leptina, adiponectina, resistina, IL-6, TNF-α, MCP-1, PAI-1), en condiciones basales y
estimuladas por el lipopolisacárido de Escherichiacoli (LPS).
21
También se analizó el estado de estrés oxidativo de los animales, mediante la evaluación de
las siguientes variables en los bazos: niveles de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG),
relación GSH/GSSG, actividad xantina oxidasa (XO) yperoxidación lipídica.
Finalmente, se estudió una serie de parámetros inmunológicos, como las proporciones de
linfocitos circulantes (CD335+, CD19+, CD45CD3+, CD3CD4+, CD3CD8+, y los cocientes
CD4+/CD8+ y CD45CD3+/CD19+) y en bazo (CD19+, CD45CD3+, y cociente
CD45CD3+/CD19+), la secreción de citoquinas (IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10) en células
sanguíneas aisladas en cultivo, así como diversas funciones leucocitarias en bazo: quimiotaxis
linfocítica, actividad natural killer (NK) y proliferación de linfocitos inducida por mitógenos
(concanavalina A [ConA] y LPS).
Los resultados mostraron que los animales alimentados con la dieta obesogénica comenzaron
a ganar significativamente más peso que los controles después de cinco semanas de
tratamiento. Además, presentaron mayor acumulación de grasa corporal total y visceral, peso
de hígado y corazón, concentraciones plasmáticas de leptina y triglicéridos y tensión diastólica,
así como una menor secreción de adiponectina, resistina y MCP-1 en adipocitos aislados,
comparados con los controles. También se observó una tendencia a valores más altos de sE-
selectina, sVCAM, y fibrinógeno. Todo ello indica un mayor riesgo de síndrome metabólico en
los animales obesos.
La suplementación con el ácido 2-hidroxioléico condujo a una disminución progresiva del peso
corporal, que se acompañó de una reducción dela grasa corporal total y visceral, las
concentraciones plasmáticas de leptina, triglicéridos y glucosa, y los valores de tensión arterial,
y restauró parcialmente la secreción de adiponectina, resistina y MCP-1. La administración de
AGPI n-3 no mostró ningún efecto sobre el peso corporal de los ratones; sin embargo, redujo
parcialmente la acumulación de grasa corporal y los triglicéridos, y restauró en parte la
secreción de adiponectina y resistina.
22
Finalmente, no se observaron cambios en las concentraciones circulantes de citoquinas y otras
moléculas inflamatorias, en la secreción de citoquinas por leucocitos circulantes en cultivo, ni
en las proporciones de las subpoblaciones linfocitarias en sangre o en bazo debidos a la dieta
obesogénica. Sin embargo, la inducción temprana de obesidad condujo a un mayor estrés
oxidativo ya cambios en la función leucocitaria en bazo, sugiriendo inmunosenescencia
prematura en este órgano.
Los animales obesos presentaron mayores niveles de GSSG, GSSG/GSH, peroxidación
lipídica, actividad XO y quimiotaxis de los linfocitos, así como una menor actividad NK y
proliferación linfocítica en respuesta a ConA que los controles.
El ácido 2-hidroxioléico invirtió total o parcialmente la mayor parte de los cambios (peso
corporal, contenido de grasa, niveles de GSSG, GSH/GSSG, peroxidación lipídica, quimiotaxis
y proliferación), mientras que los AGPI n-3 invirtieron el aumento en la actividad XO.
En resumen, la inducción temprana de obesidad dietética condujo a la aparición de síndrome
metabólico, un aumento del estrés oxidativo y al deterioro de la función leucocitaria en ratones.
La suplementación con 2-hidroxioléico, y en menor medida con AGPI n-3, fue capaz de revertir
algunos de estos efectos deletéreos, especialmente la acumulación de grasa corporal, el estrés
oxidativo y la actividad leucocitaria en el bazo.
Este es el primer estudio que muestra efectos beneficiosos del ácido 2-hidroxioléico sobre las
alteraciones immunológicas relacionadas con la obesidad. Nuestros hallazgos apoyan un
vínculo entre la obesidad y la inmunosenescencia y sugieren una potencial herramienta
terapéutica frente al desarrollo de la obesidad y alteraciones asociadas, tales como
hipertensión, estrés oxidativo y disfunción inmunológica.
ABSTRACT
24
ABSTRACT
The worldwide prevalence of overweight and obesity has increased dramatically in the past
decades, reaching epidemic levels. This condition is associated with a wide range of metabolic
risk factors, such as insulin resistance, high triglyceride levels, glucose and blood pressure, all
typical characteristics of the metabolic syndrome, which promote increased risks of
cardiovascular disease and type-2 diabetes mellitus, among other diseases.
In addition, an excess of adiposity is characterized by chronic low-grade inflammation with an
imbalance in the adipokines from adipose tissue, particularly in leptin and adiponectin secretion,
and in consequence in their circulating levels. Obesity is also associated with oxidative stress
when maintained for a long time, and it can be mediated by either a decrease in antioxidant
defences and/or increased formation of oxidants.
In recent decades, there has also been an increase in the consumption of processed foods that
has contributed to the higher rates of overweight and obesity. In this sense, dietary fats are a
major factor in the development of obesity, and possibly in its prevention and treatment as well.
The Mediterranean diet has been proposed as a healthy option for the prevention of obesity,
and it is characterized by a high consumption of olive oil, rich in monounsaturated fatty acids
(MUFA), and of fatty fish, the main source of n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA), such as
eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids.
These dietary fatty acids are capable of influencing a number of parameters related to energy
homeostasis, such as adipose tissue mass, lipid metabolism, and thermogenesis and food
intake. The Mediterranean diet has also been linked to lower rates of obesity inflammation and
oxidation. This dietary pattern has been reported to modulate the immune response and to exert
anti-inflammatory and antioxidant properties. This may be in great part due to its high content in
MUFA and n-3 PUFA fatty acids, which have shown immunomodulatory actions.
25
The objectives of the present study were to investigate the effects of feeding ICR-CD1® mice
an obesogenic diet on the evolution of body weight, body fat accumulation, and biomarkers of
metabolic and cardiovascular health, oxidative stress and immune function; and to assess the
effectiveness of two supplements with fatty acids, one with 2-hydroxioleic acid, and the other
one with n-3 PUFA (EPA+DHA) in preventing or reversing the potential detrimental effects
linked to the obesogenic diet.
For this purpose, female ICR-CD1® mice (8 weeks of age, n=24) received a progressive
obesogenic diet (22% fat for 4 weeks and 60% fat for another 14 weeks). Six weeks into the
60% fat diet, mice were divided into three groups (n=8/group): obesogenic diet without
supplementation (DO group), supplementation with 2-hydroxyoleic acid, a synthetic derivative of
oleic acid (1500 mg/kg diet, DO-HO group), and supplementation with n-3 PUFA (EPA + DHA,
3000 mg/kg diet, group DO-N3). Eight other mice were fed a standard rodent diet for the entire
duration of the study (control group).
During the experiment, food intake and body weight were monitored, and total body fat was
measured by nuclear magnetic resonance. Blood pressure and biochemical parameters
(triglycerides, glucose, insulin and cholesterol) were also measured. At the end of the
experiment, the weight of internal organs (brain, liver, heart and spleen) and visceral fat depots
were measured.
Circulating inflammatory and cardiovascular biomarkers (leptin, adiponectin, PYY, PP, GIP, sE-
selectin, sCAM-1, sICAM, PAI-1, MMP-9, fibrinogen, Apo-A1, and Apo-E) were analysed. The
secretion of leptin, adiponectin, resistin, IL-6, TNF-α, MCP-1 and PAI-1 was studied, in basal
conditions and after stimulation with Escherichia coli’s lipopolysaccharide (LPS).
The animals’ oxidative stress was also analysed, by evaluating the following variables in the
spleens: reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione, GSH/GSSG ratio, xanthine oxidase
(XO) activity and lipid peroxidation.
26
Finally, a group of immune parameters was studied, such as the proportion of lymphocyte
subpopulations in blood (CD335+, CD19+, CD45CD3+, CD3CD4+, CD3CD8+, and CD4+/CD8+
and CD45CD3+/CD19+ ratios) and spleen (CD19+, CD45CD3+, and CD45CD3+/CD19+ ratio),
secretion of cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10) by blood cells in vitro, and leukocyte functions
in the spleen: lymphocyte chemotaxis, natural killer (NK) activity and proliferation of
lymphocytes induced by mitogens (concanavalin A [ConA] and LPS).
Results showed that the animals fed the obesogenic diet started gaining significantly more
weight than the controls after five weeks of high-fat feeding. They also presented increased total
body and visceral fat, heavier hearts and livers, higher blood leptin and triglyceride
concentrations, and higher diastolic blood pressure, and decreased secretion of adiponectin,
resistin and MCP-1 from adipocytes, compared to controls. There was also a trend towards
higher values of sE-selectin, sVCAM, and fibrinogen in the DO versus the control group. These
findings indicate increased risk of metabolic syndrome in the obese animals.
Supplementation with 2-hydroxioleic acid led to a progressive decrease in body weight, together
with a reduction in total body and visceral fat, plasma levels of leptin, triglycerides and glucose,
and blood pressure. It also restored partially the secretion of adiponectin, resistin and MCP-1
from adipocytes. Supplementation with n-3 PUFA did not affect the animals’ body weight; butit
resulted in changes in body fat, triglycerides levels, and adiponectin and leptin secretion,
although they were less pronounced than those observed with 2-hydroxioleic acid.
Finally, no changes were observed in the concentrations of cytokines and other inflammation-
related molecules, in the secretion of cytokines by blood cells in vitro, or in the lymphocyte
subpopulations in blood or spleen due to the obesogenic diet. However, dietary obesity led to
increased oxidative stress and changes in leukocyte function in spleen, suggesting premature
immunosenescence.
27
Obese animals had higher levels of GSSG, GSSG/GSH, lipid peroxidation, XO activity and
lymphocyte chemotaxis, and lower NK activity and lymphocyte proliferation in response to ConA
than controls. Supplementation with 2-hydroxyoleic acid totally or partially reversed most of the
changes (body weight, fat content, GSSG, GSH/GSSG levels, lipid peroxidation, chemotaxis
and proliferation), while n-3 PUFAs reversed the increase in XO activity.
In summary, early induction of dietary obesity led to the onset of metabolic syndrome, oxidative
stress and the deterioration of leukocyte function in mice. Supplementation with 2-hydroxyoleic,
and to a lesser extent with n-3 PUFA, was able to reverse some of these deleterious effects,
especially body fat accumulation, oxidative stress and spleen immune function.
This is the first study to show the beneficial effects of 2-hydroxyoleic acid on obesity-related
immune disorders. Our findings support a link between obesity and immunosenescence and
suggest a potential therapeutic tool for obesity-related alterations, such as hypertension,
oxidative stress and immune dysfunction.
INTRODUCCIÓN
29
I. INTRODUCCION
1. EPIDEMIOLOGIA DE LA OBESIDAD
1.1 Definición, diagnóstico y clasificación de la obesidad
Presente desde la antigüedad, la obesidad en principio se consideraba un problema estético
(con excepción de la obesidad mórbida, que siempre ha sido considerada una patología). En
2004, sin embargo, se reconoció como la epidemia del siglo XXI, afectando a las personas
independientemente de edad, género, etnia y nacionalidad (Arteaga 2012; Brito y col., 2012).
La obesidad “es hoy en día una condición que cabalga entre los límites de lo médico-
nutricional, lo psicológico y lo socio-cultural¨ (Medina y col., 2014). Según la Organización
Mundial de la Salud (OMS), la obesidad se puede definir como una enfermedad de etiología
multifactorial de curso crónico no transmisible caracterizada por una acumulación anormal de
los depósitos grasos del organismo que puede ser perjudicial para la salud (OMS 2015).
La manera ideal para el diagnóstico de la obesidad es la determinación de la grasa
corporal real. Cuando esto no es posible, el índice de masa corporal (IMC) o índice de Quetelet
es el parámetro más aceptado para definir clínicamente la obesidad, y se calcula como la
relación entre el peso en kilogramos y el cuadrado de la talla en metros (kg/m2); esta fórmula
fue descrita por el matemático belga Adolphe Quetelet en el siglo XIX, siendo válido para
ambos sexos y para adultos de todas las edades (Sánchez-Castillo y col., 2004; OMS 2015).
La OMS considera que un individuo está obeso cuando el IMC es igual o superior a 30
kg/m² (Tabla 1), que es el punto de corte a partir del cual aumenta la mortalidad, según
diversos estudios epidemiológicos (Salas-Salvado y col., 2007). Este índice no es un buen
indicador de adiposidad en ancianos, o en deportistas, pero es el que se emplea en la mayoría
de estudios epidemiológicos y el recomendado para su uso clínico por diversas sociedades
médicas y organizaciones internacionales de salud, dada su capacidad de reflejar la adiposidad
en la mayoría de la población (Salas-Salvado y col., 2007).
La clasificación de la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (SEEDO)
introduce ligeras modificaciones a la clasificación de la OMS (Tabla 1) subdividiendo la
categoría de sobrepeso en dos subcategorías y distingue un grado de obesidad tipo 4 para los
pacientes con IMC superior a 50 kg/m2 (Arrizabalaga y col., 2004).
30
Tabla 1. Clasificación de grado de obesidad de acuerdo al IMC
Clasificación IMC (kg/m2)
Normopeso 18,5 – 24,9
Exceso de peso > 25
Sobrepeso grado I 25 – 26,9
Sobrepeso grado II 27- 29,9
Obesidad grado I o moderada 30 – 34,9
Obesidad grado II o severa 35 – 39,9
Obesidad grado III o mórbida > 40
Obesidad grado IV o mórbida > 50
Fuente: Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (SEEDO), 2000; Arrizabalaga y
col., 2004
El riesgo para la salud está relacionado con la distribución de la grasa, y por ello en la década
de los 40Vague la clasificó en dos tipos: ginoide y androide (Figura 1) (Salas-Salvadó y col.,
2007; Montero 2010).
En la obesidad de tipo ginoide, la grasa se acumula preferentemente en la parte inferior
del cuerpo y presenta complicaciones mecánicas relacionadas con las extremidades inferiores
(Salas-Salvadó y col., 2007).
La obesidad de tipo androide se caracteriza por el exceso de grasa en la región
superior del cuerpo (cara, cuello, tronco y abdomen) y se asocia con un mayor riesgo de
hiperinsulinemia, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), dislipemias, hipertensión arterial (HTA) y
riesgo de mortalidad en general (Salas-Salvadó y col., 2007; Montero 2010). Finalmente, la
obesidad de distribución homogénea se caracteriza por un exceso de grasa corporal sin que
esta predomine en ninguna área anatómica concreta (Salas-Salvadó y col., 2007).
31
Figura 1. Tipos de obesidad: A) ginoide; B) androide. Fuente: Gil-Campos y col., 2014
Se puede obtener una estimación clínica a partir de medidas antropométricas, como la
circunferencia de cintura (CC) que junto con el IMC es una de las medidas antropométricas
más utilizadas para valorar la obesidad central, y permite evaluar el riesgo cardiovascular
asociado a la obesidad abdominal (Ness-Abramof y Apovian, 2008; Lisbona y col., 2013).
En niños y adolescentes es difícil diagnosticar la obesidad por los cambios que se
producen durante el crecimiento en el acúmulo de grasa y en las relaciones de los diferentes
parámetros antropométricos (Colomer 2005). Para el diagnóstico de obesidad central en niños
y adolescentes, se emplean curvas de percentiles de la CC ajustadas por edad y género
estableciéndose al respecto diferentes puntos de corte para el diagnóstico de obesidad central;
los más empleados corresponden a los percentiles 90 y 98 (Chacín y col., 2009).
A B
32
1.2. Prevalencia de la obesidad en el mundo y en España
1.2.1. Prevalencia en adultos
La obesidad hoy en día tiene alcance mundial (Figura 2), y aunque las estimaciones de su
incidencia no están disponibles para todos los países, y los datos disponibles no siempre son
precisos, se estima que se ha multiplicado por más de dos entre 1980 y 2014 (Lisboa y col.,
2013). En 2014, el 39% de las personas adultas en el mundo (más de 1900 millones) tenían
sobrepeso, y el 13% (600 millones) eran obesas (OMS 2015). En Europa, los últimos datos
disponibles corresponden a 2010, cuando la obesidad afectaba a 150 millones de adultos, un
20% de la población; de continuar este ritmo, en el año 2040 la totalidad de la población
europea tendría sobrepeso (Martín-Calvo y col., 2013; Varela-Moreiras y col., 2013).
Figura 2. Prevalencia de sobrepeso y obesidad en el mundo 2014. Fuente:
OMS.http://apps.who.int/bmi/index.jsp
Male
Female
33
Este fenómeno también está presente en la población española; en España la obesidad
aumentó del 7 al 17% en los últimos 25 años, siendo las zonas geográficas más afectadas
Canarias, Andalucía y el Noreste (Quiles y col., 2008; Lisbona y col., 2013). En España el
45,5% de los hombres y el 29,9% de las mujeres tienen sobrepeso, mientras que el 17,3% de
los hombres y el 14,7% de las mujeres presentan obesidad, y se estima que para el año 2030
la población obesa masculina aumentará hasta el 33% y la femenina hasta el 37% (Rodríguez
y col., 2002; Costa-Font y Gil, 2005; Lisbona y col., 2013).
1.2.2. Prevalencia infanto-juvenil
El incremento explosivo de la obesidad en niños y adolescentes es un problema de salud en
todo el mundo, provocando alarma social (Romero-Velarde y Vásquez-Garibay, 2008; Han y
col., 2010). En los países en desarrollo hay cerca de 35 millones de niños con sobrepeso,
mientras que en los países desarrollados esa cifra es de 8 millones (Brito-Núñez y Alcázar,
2011). En el año 2010, la prevalencia de sobrepeso y obesidad infantil fue superior al 40% en
Norte América y en regiones del Mediterráneo oriental, 38% en Europa, 27% en la región
occidental del Pacífico y 22% en el sudeste de Asia (Han y col., 2010).
Según los datos del NHANES en los EEUU en 2007-2008, la obesidad alcanzó una
prevalencia del 9,5% en niños y niñas 0-2 años de edad, mientras que la prevalencia para los
niños de 2-19 años de edad fue de 16,9% en ambos sexos (Flegal y col., 2010). En otro estudio
en niños nacidos en el 2001, se mostró que, a los nueve meses de edad, aproximadamente un
tercio ya tenía sobrepeso u obesidad (Moss y Yeaton, 2011).
América Latina también ha experimentado el incremento de obesidad infantil. Por ejemplo, en
México, los resultados de la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición de 2006 mostraron que la
prevalencia de sobrepeso y obesidad era del 26% para niños entre los 5 y 11 años de edad, y
alcanzaba el 32% en adolescentes (Olaiz-Fernández y col., 2006). En Perú, entre 2007-2010,
con una muestra de 3669 niños menores de cinco años, se encontró una prevalencia de
sobrepeso y obesidad del 6,9% (Pajuelo-Ramirez y col., 2011).
34
La obesidad infantil también tiene alta presencia en Europa, donde uno de cada cuatro niños
tiene sobrepeso o es obeso (Fernández y Díaz-Campo, 2014). En España los estudios de
sobrepeso y obesidad infanto-juvenil son relativamente recientes y la prevalencia varía según
el lugar y el momento en el que se han realizado los estudios (Lasarte-Velillas y col., 2015). Un
estudio llevado a cabo en 18 países europeos señaló que la prevalencia de sobrepeso en niños
de 4 años de edad en España era del 32,3%, la mayor de toda Europa (Cattaneo y col., 2010).
España es el segundo país de la Unión Europea, detrás de Malta, con mayor porcentaje de
niños obesos con sobrepeso entre los 7 y los 11 años (Lisbona y col., 2013).
Según los últimos datos disponibles, el 21,1% de los niños españoles tienen sobrepeso
y el 8,2% presenta obesidad, con lo que casi uno de cada tres niños de entre 3 y 12 años tiene
exceso de peso (Lisbona y col., 2013; Fernández y Díaz-Campo, 2014). Según el estudio
ALADINO 2013, la prevalencia de sobrepeso es del 24,6% (24,2% en niños y 24,9% en niñas),
y la de obesidad del 18,4% (21,4% en niños y 15,5% en niñas) (Estudio Aladino, 2013).
Diversos estudios para distintos rangos de edad presentan cifras de sobrepeso y obesidad
infanto-juvenil que oscilan entre el 25% y el 35%e incluso el 45% (Serra-Majem y col., 2006;
Villagrán Pérez y col., 2010; Sánchez-Cruz y col., 2013; Estudio Aladino, 2013).
Estos estudios sitúan a España entre los países de la Unión Europea con mayor
porcentaje de población infantil con obesidad. Se estima que aproximadamente el 40% de los
niños obesos y el 70% de los adolescentes obesos llegarán a ser adultos obesos, y tendrán
mayor riesgo de padecer enfermedades crónicas, lo que conlleva una disminución de la calidad
de vida y un mayor gasto sanitario (Reinehr y col., 2006).
35
1.3. Factores de riesgo
La obesidad es una enfermedad compleja y multifactorial, que resulta de la interacción de
factores genéticos, conductuales y ambientales (Coyote-Estrada 2009).
El papel de la genética como factor de riesgo para el desarrollo de obesidad es
innegable, demostrándose en numerosos estudios que la predisposición a la obesidad y a sus
condiciones asociadas es más parecida entre individuos genéticamente relacionados que en
aquellos no relacionados (Loos y Bouchard 2003; Martín-Calvo y col., 2013). Si ambos padres
son obesos, el riesgo de obesidad para los hijos será del 69 al 80%; cuando solo uno es obeso
será 41-50%, y si ninguno de los dos es obeso el riesgo será solo del 9% (Sánchez y col.,
2010).
Se calcula que del 40 al 70% de las variaciones relacionadas con los fenotipos de
obesidad en humanos se deben a factores hereditarios (Willer y col., 2009). En la actualidad se
estima que hay más de 450 genes, marcadores y regiones cromosómicas relacionados con los
fenotipos de la obesidad humana (Varela-Moreiras y col., 2013). Ejemplos de estos genes son:
el gen que codifica la propiomelanocortina, relacionado con obesidad severa (Ochoa y col.,
2004), el gen del receptor de melanocortina-4, o el gen asociado a la masa grasa y obesidad
común (Ochoa y col., 2007) entre otros ejemplos.
Aunque está claro que el componente genético es importante, el rápido incremento de
la incidencia de la obesidad se debe sobre todo a factores ambientales, principalmente a los
cambios de hábitos, ya que los cambios genéticos no pueden producirse en tan corto tiempo
(Barrió y col., 2005). Entre los factores conductuales que han contribuido a la aparición de esta
pandemia destacan los dietéticos, como por ejemplo el bajo consumo de frutas y verduras,
comer fuera de casa (suele implicar comidas con más grasa saturada), un mayor consumo de
bebidas azucaradas, el incremento en los tamaños de las raciones, o cocinar de forma poco
saludable (Nielsen y col., 2002; St-Onge y col., 2003; Smiciklas-Wright y col., 2003; Aranceta y
col., 2005).
36
Tradicionalmente, la dieta en España era muy rica en hidratos de carbono, verdura, frutas y
aceite de oliva; sin embargo, la industria alimentaria ha modificado la dieta de la sociedad
actual, favoreciendo la ingesta de dietas ricas en grasas saturadas y azúcares (García-Brenes
2010; Varela-Moreiras y col., 2013; Martín-Calvo y col., 2013). En niños y jóvenes, la obesidad
está asociada al aumento del número de comidas al día, al consumo de refrescos y snacks (la
mayoría de ellos de alto contenido en grasa, azúcares y sal, y densos en energía), y a la
publicidad; en este sentido las industrias audiovisual y publicitaria tienen el poder tanto de
promover como de evitar la promoción de alimentos poco saludables (Blissett y Bennett, 2013;
Gómez-Miranda y col., 2013; Reisch y col., 2013; Sánchez y col., 2014).
El estudio EnKid, realizado entre 1998 y 2000, puso de manifiesto la mala calidad de la
dieta en niños y adolescentes españoles, señalando que un 20% de ellos necesitaba cambios
importantes en su dieta (Leis y Tojo, 2011). La Fundación Española de Nutrición observó que el
consumo de carne y sus derivados fue superior al recomendado, mientras que el consumo de
cereales, verduras, hortalizas, frutas y leguminosas se encontraba por debajo de los niveles
deseados; los grupos que se ajustaron más a las recomendaciones fueron los de la leche y
derivados, pescados y huevos (Fundación Española de la Nutrición 2011). Por otra parte, el
consumo excesivo de zumos de frutas (> 350 mL/d) en niños en edad preescolar favorece el
desarrollo de obesidad (Jahns y col., 2001), y se ha comprobado que la ingestión diaria de
450 kcal procedentes de bebidas azucaradas a base de frutas puede producir un aumento
significativo del IMC (Malik y col., 2010).
Se ha demostrado en estudios realizados en población infantil norteamericana que
aquellos niños que ingieren frutas y verduras tienen menor riesgo de presentar obesidad
(Lorson y col., 2009). Sin embargo, otra investigación realizada en niños y adolescentes
americanos encontró que aquellos cuya ingesta de fruta procedía en su mayoría de variedades
con alto contenido energético, y/o de zumos, tenían mayor riesgo de presentar sobrepeso y
obesidad (Hendy y col., 2007). También en la población preescolar canadiense se ha visto una
asociación entre el consumo de bebidas gaseosas o refrescos de fruta y el exceso de peso
(Dubois y col., 2007).
37
En Argentina, un estudio con niños en edad escolar encontró una asociación entre el consumo
de bebidas azucaradas y exceso de peso y por ello, se ha recomendado restringir en este país
su consumo, con el objetivo de reducir el riesgo de aumento de peso (OMS 2003; Nissinen y
col., 2009).
La dieta occidental también tiene la desventaja de presentar un alto contenido de
ácidos grasos saturados (AGS), que predominan en carnes, derivados lácteos y repostería,
asociados con un mayor riesgo de obesidad, hipótesis que ha sido comprobada en estudios
con animales de experimentación (Priego y col., 2008; García-Brenes, 2010). En un estudio
realizado en adolescentes españoles sobre composición de la dieta y su relación con el IMC,
se observó que los adolescentes que presentaban obesidad seguían una dieta con un perfil
calórico más desequilibrado, con mayor proporción de energía procedente de grasas y
proteínas, que los sujetos normopeso (Ortega y col., 1995). Sin embargo, hay estudios que no
han encontrado asociación alguna entre los macronutrientes de la dieta y la obesidad (Atkin y
Davies, 2000; Magarey y col., 2001; Elliott y col., 2011).
Aunque los lípidos han sido los nutrientes más estudiados en relación con la obesidad,
también una elevada ingesta de proteínas de origen animal podría estar relacionada con el
riesgo de obesidad en niños (Rolland-Cachera 1995). Se ha encontrado en estudios en ratas
que podía incrementarse el porcentaje de grasa corporal aumentando la proporción de
proteínas en la dieta (Kim y col., 1991), y dos estudios observacionales realizados en niños han
observadoque el IMC a lo largo de la infancia se relacionaba con la ingesta de proteínas a los
dos años de edad, pero no con la de lípidos o de hidratos de carbono (Rolland-Cachera 1995,
Scaglioni y col., 2000).
Otras investigaciones en niños sugieren que un aporte insuficiente de calcio se asocia
con mayor adiposidad, y también se constata un peor estatus de vitamina D en niños con
sobrepeso y obesidad, y viceversa, un peor control de peso se asocia a la deficiencia en esta
vitamina (Navia y col., 2010; Rodríguez‐Rodríguez y col., 2010; 2011). Una mala nutrición
puede originar modificaciones epigenéticas que podrían incrementar el riesgo de sufrir
enfermedades metabólicas (Fermín y col., 2013).
38
Se ha demostrado también que las dietas ricas en grasa y azúcar, así como la obesidad, se
asocian con cambios en los patrones de metilación del ADN (Lomba y col., 2010). Las
personas obesas tienen un patrón de marcas epigenéticas diferente del de los individuos no
obesos (Feinberg y col., 2010). Hay estudios que muestran que la posibilidad de desarrollar
obesidad no sólo depende de la ingesta, el gasto energético y la secuencia genética del
individuo, sino también de la herencia epigenética, de influencias nutricionales y de estilo de
vida que tiene lugar durante el período fetal o ya en la etapa adulta, y que modifican las marcas
epigenéticas pudiendo afectar a la expresión de los genes (Fermin y Martínez, 2013).
También la suplementación con diversos micronutrientes dietéticos, los ácidos grasos de
cadena corta y varios compuestos de origen vegetal han sido asociados con los cambios
epigenéticos (Campión y col., 2010). La edad escolar y la adolescencia son unas etapas
determinantes de la salud del adulto, y por ello todos los niños y adolescentes tienen que tener
acceso a alimentos adecuados, con el fin de alcanzar un crecimiento óptimo desde el punto de
vista físico, cognitivo, emocional y social (Aranceta y col, 2005).
1.3.1. Modelos de obesidad por dieta
Para el estudio de diferentes bases fisiológicas y genéticas se han usado diferentes modelos
animales (principalmente roedores) basados en modificaciones que pueden ir desde
mutaciones monogénicas que aparecen de forma espontánea en una colonia, mutaciones
aleatorias provocadas mediante el uso de mutágenos o exposición a radiación para alterar o
sobre-expresar un gen específico, modelos animales obtenidos mediante cría selectiva para
obtener cepas de roedores que difieren en su grado de acumulación grasa, y estudios de otras
especies que incluyen primates y perros (Speakman y col., 2008).
Los modelos animales nos han permitido obtener información para conocer desde la
respuesta a dietas altas en grasa y azúcares (Holemans y col., 2004), efectos de la restricción
calórica sobre el IMC, efectos ambientales, o estrés oxidativo (EO) entre otros (Park y col.,
2012; Garg y col., 2013). Así mismo, existe gran interés en la comprensión del papel de la
dinámica de la evolución del peso durante el ciclo de la vida, especialmente en la predicción de
la incidencia de la morbilidad y mortalidad (Speakman y col., 2008).
39
La alimentación con dietas ricas en grasa está muy utilizada en investigación para inducir
obesidad dietética (Buettner y col., 2007).
Las ratas y los ratones son los modelos de obesidad que se usan para la administración de
dietas ricas en grasa (Matarese y La Cava, 2005). Diferentes estudios muestran cómo ratones
de la cepa C57BL/6 alimentados con una dieta alta en grasa desarrollaron obesidad (Ikemoto y
col., 1996; Van Heeky col., 1997; Shore 2007).
En uno de los estudios, estos ratones tras 51 días de ingestión con la dieta alta en
grasa (45% de la energía total), incrementaron su peso corporal un 25% más que los animales
alimentados únicamente con una dieta donde solo el 10% de las calorías derivaban de grasa
(Van Heek y col., 1997). También ratones ICR-CD1 alimentados con una dieta rica en grasa
(60%) desarrollaron obesidad (Hunsche y col., 2015). Los modelos animales obtenidos a partir
de una dieta alta en grasa podrían ser parecidos a los mecanismos que conducen a la
obesidad en humanos (De la Fuente y De Castro 2012). Estos modelos animales son difíciles
de obtener por dieta hipercalórica, debido a que los roedores presentan un gran control de la
ingesta y además no incrementa la ingesta de manera incontrolable, como ocurre en humanos
(De la Fuente y De Castro 2012).
40
2. COMPLICACIONES ASOCIADAS A LA OBESIDAD
Ya en la antigüedad se reconocía el efecto negativo de la obesidad en la supervivencia de las
personas, provocando la aparición de múltiples problemas de salud (Ezquerra y col., 2008;
Brito y col., 2012). Garrow y Warwick en 1977 señalaron que “la obesidad es lo suficientemente
común como para constituir uno de los problemas médicos y de salud pública de nuestro
tiempo” (Garrow y Warwick 1977; Medina y col., 2014).
La obesidad aumenta el riesgo para múltiples complicaciones, entre las que destacan
enfermedades importantes como la enfermedad cardiovascular (ECV),la hipertensión arterial, la
diabetes mellitus, dislipemias, alteraciones del sistema respiratorio, o diversos tipos de cáncer
(Carmenate y col., 2007; Cabrerizo y col., 2008; Varela-Moreiras y col., 2013). A esto hay que
sumar trastornos de la imagen corporal, dificultad en las relaciones personales, o problemas
cotidianos básicos vinculados al sueño, los viajes, el tamaño de los asientos y camas, etc.;
trastornos que implican, además de una peor calidad de vida del individuo, un elevado coste
personal, social y sanitario (Arteaga 2012; Varela-Moreiras y col., 2013). Además, lo más
preocupante es que se ha observado que estas comorbilidades asociadas a la obesidad se
presentan no solo en el adulto, sino también en la infancia y la adolescencia (Serra Majem y
col., 2003; Schwimmer y col., 2003; Barrió y col., 2005).
2.1. Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2)
La DM2 se caracteriza por niveles elevados de glucosa en plasma con alteración en el
metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas, como resultado de un defecto en la
secreción de insulina, en la acción de la insulina o en ambas (Chen y col., 2011). La DM2 se
asocia estrechamente con la obesidad, que favorece su aparición y desarrollo en ambos sexos
y con consecuencias negativas, porque las personas afectadas por DM2 tienen mayor riesgo
de sufrir un infarto de miocardio y/o un accidente vascular encefálico (Rubio y col., 2007;
Cabrerizo y col., 2008; Durán y col., 2012). Sin embargo, hay que tener en cuenta que la DM2
se puede evitar o retardar modificando simplemente los hábitos de alimentación (Klein y col.,
2004).
41
Los mecanismos implicados en el desarrollo de DM2 en individuos obesos susceptibles no son
bien conocidos (Cabrerizo y col., 2008), pero se acepta que el exceso de tejido adiposo en el
paciente obeso puede producir un estado de resistencia a la acción de la insulina (RI), con la
consecuente hiperglicemia (Stumvoll y col., 2005; Cabrerizo y col., 2008). Tanto la duración de
la obesidad como la distribución de la grasa corporal se asocian con la DM2. Un perímetro de
cintura mayor de 102 cm en varones se acompaña de un incremento de 3 veces y media en la
incidencia de diabetes en un plazo de 5 años, tras corregir la influencia del IMC (Cabrerizo y
col., 2008). En un meta-análisis, se observó que el riesgo relativo de desarrollar DM2 fue de
hasta tres veces mayor en aquellas personas con sobrepeso y de siete veces más en
pacientes obesos (Abdullah y col., 2010). En otro estudio la cantidad de grasa abdominal
predijo la incidencia de DM2, independientemente de la adiposidad corporal total (Boyko y col.,
2000).
También la incidencia de DM2 en niños y adolescentes ha aumentado debido al
incremento de la obesidad (Kaufman 2002; Barrio y col, 2005). Como ejemplo, basta mencionar
que en un estudio realizado en EEUU en el que se incluían 439 niños y adolescentes obesos,
se encontró que un 3,2% de los participantes con sobrepeso, un 14,4% de los moderadamente
obesos y un 19,9% de los severamente obesos eran intolerantes a la glucosa y de estos, 8
sujetos (9,8%) desarrollaron DM2 a los 2 años de seguimiento (Weiss y col., 2004).
2.2. Enfermedades cardiovasculares
Las ECV son la primera causa de muerte en el mundo y la obesidad constituye uno de los
principales factores de riesgo para su desarrollo (Arteaga 2012). El papel de la obesidad como
principal factor de riesgo en el desarrollo de la enfermedad coronaria es indudable, provocando
debilidad del corazón e insuficiencia cardíaca congestiva, fibrilación auricular, arritmias
ventriculares y muerte súbita (Bray 2004a; Russell y Allen, 2008). El miocardio es mayor en el
sujeto obeso, ya que la excesiva masa de tejido adiposo requiere un aumento en la
vascularización, por lo que se necesita un mayor volumen sanguíneo circulante (López y
González-García, 2001).
42
La obesidad central además puede afectar a las grandes arterias, favoreciendo el desarrollo de
infarto y anginas, ya que aumentan el volumen de sangre total y el gasto cardiaco, y la
sobrecarga cardiaca es mayor (Brito y col., 2012). Además, no hay que olvidar que la
aterosclerosis, una enfermedad inflamatoria de la capa interna arterial, puede estar ocasionada
por la obesidad, la DM2 y la HTA (Contreras-Leal y Santiago-García, 2011).
2.3. Hipertensión arterial
La HTA se define como la elevación crónica de la tensión arterial por encima de 140 mmHg
para la presión sistólica, y/o de 90 mmHg para la presión diastólica (Sacks y Campos, 2010).
La presión sistólica es la fuerza con la que la sangre sale del corazón en cada latido, y la
diastólica es la ejercida en la pared de las arterias por la sangre que se encuentra en ellas
durante el intervalo entre dos latidos del corazón (Bastidas y col., 2011).
La HTA se asocia con un mayor riesgo de accidente cerebrovascular, infarto de
miocardio, insuficiencia cardíaca, insuficiencia renal, y el deterioro cognitivo. La HTA mantenida
en el tiempo genera hipertrofia ventricular izquierda y esta a su vez afecta a la función
ventricular, aumenta el consumo de oxígeno miocárdico y produce arritmias cardíacas que
pueden llegar a producir muerte súbita (Chobanian y col., 2003; Anter y col., 2009) en todos los
grupos de edad, desde los cuarenta hasta los ochenta años (Duarte y Rubio, 2005).
Aproximadamente, el 70% de los casos nuevos de HTA pueden ser atribuidos a la
obesidad o al aumento de peso, asociación apoyada por numerosos estudios (Faloia y col.,
2000; Gondim y col., 2006; Arteaga 2012). El riesgo de HTA aumenta progresivamente al
aumentar el IMC y es reversible con la pérdida de peso (Luengo Fernández y col., 2005). Esta
asociación ha sido observada en Intersalt, un estudio transversal realizado en 52 poblaciones
diferentes de todo el mundo, o en el estudio Framingham, que atribuía el 70% de la variabilidad
de la HTA en los hombres y el 61% en las mujeres a la obesidad (Kannel y col., 1993; Dyer y
col., 1994). En adultos, un incremento de 2,4kg/m2 en el IMC da como resultado un mayor
riesgo de desarrollar HTA (Ávila y col., 2010).
43
La distribución de la grasa corporal parece tener un efecto importante sobre el riesgo de HTA
porque personas con obesidad abdominal o central tienen un riesgo mayor de desarrollar HTA
(Day 2007; Genique y col., 2010).
Esto se observó en un estudio en población adulta de EEUU donde el riesgo de HTA
era tres veces superior en pacientes con obesidad abdominal (Okosun y col., 1999).
La HTA en obesidad se produce debido, entre otras causas, a una disminución en la
producción de óxido nítrico (ON), un potente vasodilatador de las arterias que interviene en la
regulación del tono vascular, inhibición de la agregación y adhesión plaquetaria y de la
proliferación de células musculares (Fhigashi y col., 2001; Raij 2006).
Otra hipótesis recaería sobre una situación de resistencia insulínica (RI) localizada
básicamente a nivel del músculo estriado, que condicionaría hipertrofia vascular vía receptor a
y un aumento de la conversión de fibras musculares hacia tipo 2b, las cuales muestran un
mayor nivel de RI, perpetuándose así el daño sobre las resistencias periféricas. El aumento de
la actividad simpática es un mecanismo de inicio y mantenimiento de la presión arterial y, en
combinación con la RI, podría estar relacionado con los mecanismos de retención de Na
(Figura 3) (López de Fez y col., 2004).
En la infancia un conjunto de factores parece contribuir a la HTA relacionada con la
obesidad, incluyendo: la sobreactividad del sistema nervioso simpático, la RI (Sinaiko y col.,
2002) y anomalías en las estructuras vasculares (Barrió y col., 2005). A su vez, la RI y la
hiperactividad simpática podrían estar en relación con los mecanismos a través de los cuales
se origina la retención de sodio, característica de la HTA (Figura 3) (López de Fez y col., 2004;
Sugerman 2005).
44
Figura 3. Mecanismo de aparición de HTA en obesidad. Fuente: López de Fez y col., 2004
2.4. Dislipemias
La alteración metabólica más deletérea de la obesidad es la dislipemia, que se define como la
alteración de los valores de lípidos en sangre, caracterizada por triglicéridos (TG) elevados,
niveles bajos de cHDL y/o un incremento de partículas LDL pequeñas y densas, lo que
constituye un factor de riesgo cardiovascular (Contreras-Leal y Santiago-García, 2011). En
condiciones de obesidad, aumentan los niveles de VLDL en el plasma, debido a una
sobreproducción hepática y a la disminución de su eliminación por el hígado, a causa de la
reducción en la actividad de la lipoproteína lipasa (Yu y Ginsberg 2005; Semenkovich 2006).
Los niveles de colesterol son más elevados en individuos con obesidad visceral. Los niveles
bajos de cHDL (< 35 mg/ dl en varones y < 45 mg/dl en mujeres) también se relacionan con un
mayor IMC (Cabrerizo y col., 2008). Del mismo modo, en la adolescencia se ha evidenciado
una fuerte asociación entre el aumento en la incidencia de obesidad ydislipemias (Kohen-
Avramoglu y col., 2003).
45
2.5. Otras comorbilidades asociadas a obesidad
-Cáncer
La obesidad se ha asociado con los principales tipos de cáncer, como colon, endometrio, o
mama. El cáncer de colon se ha atribuido a factores ambientales y de estilo de vida, incluyendo
la obesidad y el sobrepeso.
Hay una estrecha relación entre la CC en hombres y el riesgo de cáncer de colon y grandes
adenomas (Giovannucci y col., 1995). Con respecto al cáncer de endometrio, existe una
relación con el aumento de peso o del IMC (Calle y col., 2003).
-Enfermedades respiratorias
La obesidad provoca alteraciones importantes en el sistema respiratorio (Shebjami 1998) y una
de estas alteraciones es el síndrome de apnea obstructiva del sueño, frecuente en pacientes
con obesidad extrema, debido a que la misma favorece la obstrucción de la vía respiratoria
superior durante el sueño (López y González-García 2001). El 50% de los niños con obesidad
sufre apnea del sueño y asma y en casos extremos, puede aparecer el síndrome de Pickwick,
que se caracteriza por hipoventilación alveolar, retención de dióxido de carbono y somnolencia
(Field 2008).
En obesidad se observa también con frecuencia el síndrome de hipoventilación pulmonar y los
síntomas más comunes son la insuficiencia respiratoria, la falta de oxígeno, la hipercapnia
(aumento del CO2) y la hipertensión pulmonar; además, la mayoría de estos pacientes
presentan apnea obstructiva del sueño (Poulain y col., 2006).
-Enfermedades del hígado
La esteatosis hepática no alcohólica, la esteatohepatitis y la cirrosis hepática están también
relacionadas con la obesidad. La grasa anormal acumulada en exceso libera una gran cantidad
de ácidos grasos a la sangre, y la llegada masiva de estos ácidos al hígado por la vena porta
incrementa la síntesis de TG en este órgano y conduce a su almacenamiento en exceso, con la
aparición del hígado graso, que es tan frecuente en personas obesas (Bray 2004b).
46
-Aparato locomotor
La obesidad y el sobrepeso incrementan el riesgo de osteoartritis, especialmente de la cadera y
en segundo lugar de la rodilla, deteriorando la calidad de vida, en mayor grado en la mujer que
en el varón (Felson y col., 1988). Durante la infancia, el exceso de peso constituye una
sobrecarga para el aparato locomotor, siendo frecuente encontrar en los niños obesos algunos
trastornos ortopédicos (Contreras y col., 2013).
-Síndrome del ovario poliquístico
El síndrome del ovario poliquístico y la obesidad también se asocian; aproximadamente un
50% de las mujeres con este síndrome presentan sobrepeso u obesidad (Diamanti-Kandarakis
y Bergiele 2001).
-Problemas mentales
La obesidad está relacionada así mismo con la salud mental, donde el IMC predice el
desarrollo de demencia, sobre todo en mujeres (Luengo Fernández y col., 2005). La obesidad
aumenta el riesgo de ictus isquémico y puede asociarse con disfunción del sistema nervioso
autónomo (Luengo Fernández y col., 2005).
47
3. OBESIDAD, SISTEMA INMUNE Y ESTRÉS OXIDATIVO
3.1. Papel del tejido adiposo en la inflamación asociada a la obesidad
La grasa es un componente del cuerpo humano ampliamente distribuido que se acumula en
forma de tejido adiposo, considerado un órgano con función endocrina (Valenzuela 2004;
Marcano y col., 2006; Waki y Tontonoz, 2007). El tejido adiposo es muy heterogéneo, tanto al
nivel de composición celular como en su disposición anatómica (Minteer y col., 2013). En el
órgano adiposo hay dos tipos de tejidos diferentes, el marrón (TAM) y el blanco (TAB) (Figura
4),que presentan diferencias en cuanto a su morfología, distribución, expresión génica y
función (Gómez-Hernández y col., 2013).
Figura 4. Tejido adiposo blanco (A) y tejido adiposo marrón (B). Fuente: Montalvo 2010
Los adipocitos marrones comparten precursor con los miocitos (células musculares) y los
blancos lo hacen con el sistema inmune (Poglio y col., 2010; Saely y col., 2010). El equilibrio
entre TAB y TAM se puede modificar en función de diferentes factores como el frío, el calor, la
obesidad y la edad (Moreno y Martínez, 2002).
A B
48
En animales de experimentación, el porcentaje relativo de adipocitos marrones y blancos
depende de la cepa animal, la edad, el sexo, las condiciones ambientales y la dieta (Himms-
Hagen y col., 2000).
Descrito por primera vez por Galés en 1670, el TAM es predominante en el humano
recién nacido y en roedores, pero los adultos humanos conservan algunos depósitos (en las
regiones cervical, supraclavicular, paravertebral, mediastinal, paraórtica y suprarrenal; Figura 5)
(Farmer 2006; Marcano y col., 2006). Es un tejido metabólicamente activo, implicado en la
termogénesis (oxidación de lípidos para producir calor) y en la activación simpática del sistema
nervioso, está dotado de capilares y numerosas terminaciones nerviosas simpáticas (Pérez
Miguelsanz y col., 2010; Vega 2010; Gómez-Hernández y col., 2013). Se caracteriza por
adipocitos poligonales y grandes con un gran núcleo central, amplio citoplasma y mitocondrias
muy numerosas, redondeadas, con crestas muy juntas y bien desarrolladas (Figura 4B). Estas
mitocondrias contienen citocromos que les confieren ese color oscuro característico. En el
citoplasma se encuentran dispersas varias gotas de ácidos grasos de distinto tamaño (Mattson
2010; Pérez Miguelsanz y col., 2010; Vega 2010).
Figura 5. Localización del tejido adiposo pardo en el adulto. Fuente: Pérez Miguelsanz y col.,
2010
49
La formación del TAB empieza antes del nacimiento y su desarrollo es un proceso continuo a lo
largo de la vida, llegando a ser el tejido más abundante del organismo humano adulto y el
mayor reservorio energético (alrededor de 200.000-300.000 kcal en el adulto no obeso)
(Moreno y Martínez 2002; Marcano y col., 2006; Manzur y col., 2010; Vega 2010). Este tejido
tiene la capacidad de acumular grasa cuando el aporte energético es excesivo, y de movilizarla
cuando el organismo requiere energía (González y col., 2002).
Está altamente vascularizado, a tal punto que muchos adipocitos se encuentran en
contacto directo con uno o más capilares y estos permiten la entrada y salida activa de
metabolitos, péptidos y factores no peptídicos, fundamentales en la regulación de la
diferenciación y el crecimiento celular (Cinti 2006). Su principal función es controlar la ingesta
de energía y la distribución de la misma a otros tejidos en los períodos catabólicos (Moreno y
Martínez 2002).
El TAB (Figura 4A) está compuesto por muchos tipos celulares, entre ellos, los
adipocitos, que constituyen en torno al 60-70% del total de células, y una fracción estromal-
vascular formada por las células precursoras de adipocitos (los preadipocitos), vasos
sanguíneos, terminaciones nerviosas y macrófagos tisulares y linfocitos (Cinti 2006). Los
adipocitos son células secretoras endocrinas, que ejercen además una potente actividad
fagocítica y bactericida, y se mantienen unidos por un tejido conectivo laxo vascularizado
(Wood y col., 2009; Vega 2010). Tienen su origen a partir de células precursoras o
preadipocitos, las cuales, bajo el estímulo de numerosas hormonas, citoquinas, factores de
crecimiento y nutrientes, inician un proceso de diferenciación morfológica y funcional hasta
convertirse en adipocitos maduros, lo que se conoce como adipogénesis, proceso que está
presente durante toda la vida (Valenzuela 2004).
Los adipocitos aparecen con una gran vacuola o espacio vacío en posición central que
corresponde a una única y gran gota de ácidos grasos (Pérez y col., 2010). Tienen pocas
mitocondrias, un retículo endoplasmático rugoso y liso de baja densidad membranosa y un
complejo de Golgi de pequeño tamaño (Mattson 2010). Tiene una forma variable, aunque
clásicamente es esférica, y su tamaño puede variar considerablemente de 20 a 200
micrómetros de diámetro.
50
Para almacenar lípidos, es capaz de aumentar su diámetro hasta 20 veces (Vega 2010). La
expansión del tejido adiposo se debe principalmente a hipertrofia de las células ya presentes
(aumento del tamaño celular) (Wong y col., 2004; Marcano y col., 2006; Vögler y col., 2008).
El TAB se diferencia en el tejido adiposo subcutáneo (TAS), que representa el 80% de la grasa
corporal total y que es más susceptible de aumentar en grosor en casos de obesidad (Pérez y
col., 2010), y el tejido adiposo visceral (TAV), que representa el 20% del total de grasa corporal
en el hombre y aproximadamente el 6% en la mujer (Valenzuela 2004; Barrera y col. 2008). El
TAV es reconocido como el principal depósito de grasa asociado al aumento en el riesgo de
padecer enfermedades metabólicas (Doelle 2004). Está constituido por adipocitos de un
tamaño más reducido, con menor capacidad de almacenamiento, es más vascularizado, y tiene
mayor inervación simpática (Cannon y Nedergaard 2004).
El TAV y el TAS difieren en la producción de moléculas bioactivas, en la actividad de
varios receptores y en los procesos enzimáticos involucrados con el metabolismo lipídico
(Weyer y col., 2000; Bray 2004a). El TAV muestra mayor actividad metabólica que la que se
observa en el TAS y su incremento aumenta la HTA (Tan y col., 2004; Bays y col., 2006). Esto
es posible que se deba al efecto del TAV sobre varios factores del adipocito como lo son las
citoquinas inflamatorias, interleuquina 6 (IL-6), y el factor de necrosis tumoral (TNF-α), los
cuales se encuentran involucrados con la disfunción endotelial (Tan y col., 2004; Bays y col.,
2006). El TAV expresa mayor cantidad de adiponectina, IL-6, inhibidor del activador del
plasminógeno 1 (PAI-1) (una proteína que se sintetiza en las células endoteliales y en los
adipocitos) y TNF-α que el TAS, mientras que la leptina se expresa en mayor concentración en
el TAS (Bays y col., 2006).
3.2. El tejido adiposo como órgano secretor
Desde los años 90 se sabe que el tejido adiposo es un órgano de gran actividad endocrina y
vascularizado, asegurando así la circulación sistémica de los péptidos que produce y, sobre
todo, tiene un potencial de crecimiento casi ilimitado a cualquier edad (Argente y col., 2006). No
sólo los adipocitos, sino también el resto de componentes celulares sintetizan y liberan a los
torrentes circulatorios diferentes péptidos, denominados adipoquinas, que actúan sobre el
51
hipotálamo y que participan muy activamente en la modulación de la inflamación crónica de
bajo grado que acompaña a la obesidad (Argente y col., 2006; Gómez-Ambrosi y col., 2008). El
tejido adiposo responde al exceso nutricional alterando la producción de adipoquinas (Trayhurn
2005).
3.2.1. Leptina
La leptina fue descubierta en 1994, primero en modelos animales y después en humanos
(Zhang y col., 1994). Es una hormona peptídica que contiene 167 aminoácidos, secretada por
los adipocitos (Malacara 2004; Pérez 2007), pero también está producida en otros tejidos como
la placenta, glándula mamaria, estómago, músculo, cerebro, ovario y tejido linfoide (Pérez
2007; Park y Ahima 2015). Circula en la sangre y actúa en el sistema nervioso central,
regulando la ingesta y el gasto energético (Friedman 2011; Friedman y Mantzoros 2015). Tanto
su expresión como su secreción están altamente correlacionadas con el IMC, el aumento de la
grasa visceral y el tamaño del adipocito, pero su interpretación varía con el sexo, la edad y las
comidas (Blanco y col., 2000; Barrios y col., 2010).
Las concentraciones circulantes de leptina aumentan ante la presencia de TNF-α e IL-6
(Lago y col., 2007). El TNF-α estimula la expresión de la leptina y ésta a su vez retroalimenta la
producción de TNF-α y éste a su vez promuevela producción de IL-6, que es una citoquina
reguladora de adiponectina, produciendo un aumento en las citoquinas pros inflamatorias y un
descenso en las antiinflamatorias (Almanza-Pérez y col. 2008).
En modelos animales se ha observado que cuando se tiene una dieta alta en grasa se
presenta hiperleptinemia, que indica resistencia a la leptina, lo que provoca mayor consumo de
alimento y desarrollo de obesidad (Wang y col., 2005a). La resistencia a la leptina es uno de
los factores causantes de complicaciones cardiovasculares en la obesidad (Sánchez Muñoz y
col., 2005). En las personas delgadas, cerca del 50% de la leptina está unida a proteínas,
mientras que en las personas obesas la mayoría se encuentra en su forma libre (Fantuzzi y
Faggioni 2000).
52
El receptor de la leptina (Ob-R) fue identificado en el hipotálamo y en regiones cerebrales
adyacentes, pero también está presente en diferentes órganos como el páncreas, el músculo
esquelético, el estómago, el intestino, el hígado, los riñones, las glándulas adrenales y el
corazón. También se expresa en órganos reproductores y en tejidos inmunocompetentes como
el bazo, el timo y los nódulos linfáticos (Frühbeck 2001). Esta hormona actúa como puente
entre el sistema neuroendocrino y el inmunitario, regula el eje hipotalámico-pituitario-adrenal, y
participa en la maduración del sistema reproductivo (Fantuzzi y Faggioni, 2000). Varios
estudios han implicado a la leptina en la patogénesis de trastornos inflamatorios autoinmunes
como la diabetes tipo 1, la artritis reumatoide, la osteoartritis y la inflamación intestinal (Otero y
col., 2004).
3.2.2. Adiponectina
La adiponectina es una hormona de 244 aminoácidos, y una de las adipoquinas más
abundantemente secretadas por el adipocito y específica del tejido adiposo (Mendivil y Sierra,
2004). Se descubrió al mismo tiempo que la leptina, pero su papel en la protección contra la
obesidad se conoció más tarde (Matsuzawa 2006). La adiponectina actúa a través de dos
receptores diferentes: el receptor adipoR1, que se expresa especialmente en el músculo y el
adipoR2, que se expresa primordialmente en hígado (Yamauchi y col., 2003; Mendivil y Sierra
2004). A la adiponectina se le han atribuido funciones anti-diabéticas, anti-hipertensivas y anti-
inflamatorias (Guzik y col., 2006; Brochu-Gaudreau y col., 2010).
La hipoadiponectinemia se relaciona con resistencia a la insulina, mientras que el
incremento en sus concentraciones atenúa dicho proceso (Yamauchi y col., 2001; Maeda y
col., 2002). En la obesidad, la enfermedad coronaria y la DM2, los niveles de adiponectina son
bajos y aumentan con la pérdida de peso (Oh y col., 2007; Bełtowski y col., 2008; Shibata y
col., 2012). Induce la producción de mediadores anti-inflamatorios como la IL-10, suprime la
activación de células citotóxicas NK mediada por IL-2 y también, in vitro, los macrófagos
incubados con adiponectina tienen menor capacidad fagocítica (Guzik y col., 2006).
53
El mecanismo por el cual se produce descenso de adiponectina en obesidad es desconocido,
pero una explicación podría ser el aumento de la actividad del sistema nervioso simpático
(López de Fez y col., 2004).
3.2.3. Resistina
La resistina es una hormona polipeptídica de 12,5 KDa formada por 114 aminoácidos en
ratones y por 108 aminoácidos en humanos (Steppan y col., 2001; Gnacinska y col., 2009). La
proteína humana presenta un 59% de homología con la del ratón (Savage y col.,
2001).Secretada por el tejido adiposo en los ratones y por los macrófagos, monocitos, células
del tejido adiposo, bazo y médula ósea en los humanos, la resistina se asocia a la obesidad en
modelos murinos, y en el ser humano ejerce un efecto fundamentalmente pro-inflamatorio
(Steppan y col., 2001; Patel y col., 2003; Gharibeh y col, 2010). Sus niveles se encuentran
aumentados en los ratones obesos y diabéticos y en adolescentes obesos (Vendrell y col.,
2004; Bokarewa y col., 2005; Makni y col., 2013). Su nombre se debe a que se observó que
contribuía a la aparición de resistencia a la insulina en ratones con exceso de tejido adiposo
(Steppan y col., 2001).
La resistina podría ser el puente entre la obesidad y el desarrollo de la resistencia a la
insulina, aunque esta función, por ahora, está solo probada en ratones (Li y col., 2009). Los
ratones con niveles elevados de resistina muestran alteración del metabolismo de la glucosa y
resistencia a la insulina a nivel hepático y muscular (Satoh ycol., 2004; Rangwala y col., 2004),
mientras que la administración de un anticuerpo anti-resistina a ratones con obesidad inducida
por la dieta, mejora los niveles sanguíneos de glucosa e insulina (Chen y Nyomba, 2003). Se
ha asociado la concentración plasmática de resistina humana con DM2, obesidad,
hiperinsulinemia, dislipemia e HTA (Chen y col., 2009; Asano y col., 2010). A la resistina se la
puede considerar factor de riesgo cardiovascular porque puede inducir significativamente la
expresión de la molécula de adhesión intracelular-1 (ICAM-1) y de la molécula de adhesión
vascular-1 (VCAM-1) en las células endoteliales (Lau y col., 2005).
54
3.3. Origen de la inflamación en la obesidad. Biomarcadores del estado inflamatorio
El proceso inflamatorio crónico y de bajo grado que se genera en la obesidad induce
alteraciones en la respuesta inmunitaria, entre ellas, niveles plasmáticos elevados de TNF-α,
IL-6, resistina y proteína quimioatrayente de macrófagos (MCP-1) (Medzhitov 2008; Calder y
col., 2011). La inflamaciónes un proceso de carácter protector y cuyo objetivo es defender al
organismode la lesión celular iniciada por microorganismos, toxinas, o alérgenos, así como de
las consecuencias de la misma, pero sin embargo, algunos estudios han sugerido que podría
ser una posible causa de la obesidad (Moreno-Aliaga y col., 2005). Las alteraciones
inmunológicas inducidas por la obesidad son un factor importante para promover el desarrollo
de otras enfermedades asociadas, como DM2, RI, HTA y dislipemias (Berg y Scherer, 2005;
Flores-García y col., 2010).
Se ha demostrado en estudios en modelos animales y en humanos que, durante el
desarrollo de la obesidad, la expansión del tejido adiposo genera un estado de hipoxia que ha
sido demostrada en estudios con microelectrodos de O2, mostrando valores de 48 mmHg de
presión parcial en tejido adiposo de ratones delgados y de 15 mmHg para ratones obesos
(Reyes 2012; Izaola y col., 2015).
El tejido adiposo se expande en un periodo breve de tiempo y llega un momento en que
la vasculatura es insuficiente para mantener la normoxia, provocando que algunos adipocitos
se vuelvan hipóxicos y esto produce una respuesta inflamatoria que incrementa el flujo de
sangre y estimula la angiogenesis (Surmi y Hasty, 2008; Wood y col., 2009; Trayhurn 2013).
Esta escasez de oxigeno provoca la muerte celular de los adipocitos más periféricos, que se
traduce en un aumento de la reacción inflamatoria (Izaola y col., 2015). Se ha considerado la
hipoxia que experimentan los adipocitos un factor clave en la inducción de esta respuesta
inflamatoria, que conduce a la desregulación de adipoquinas secretadas por los adipocitos
(Wood y col. 2009; Trayhurn 2013).
La infiltración por macrófagoses otro de los procesos que tienen lugar en la inflamación
(Gómez-Ambrosi y col., 2008; Vega 2010). Los macrófagos reconocen de alguna manera el
incremento en la masa grasa como un invasor, que tiene que ser neutralizado (Sonnenberg y
col., 2004).
55
En condiciones de obesidad, el número de macrófagos residentes de tejido adiposo aumenta
significativamente pudiendo llegar a constituir más del 40% del total de la población celular que
conforma este tejido (Escobedo y col., 2010). Esta acumulación de macrófagos tiene efecto
sobre la fisiología de los adipocitos y las células preadiposas, generando una comunicación
intercelular que hace que el tejido adiposo tenga un funcionamiento patológico (Reyes 2010).
La comunicación entre los adipocitos y los macrófagos está asociada a un incremento de rutas
de señalización inflamatorias que provocan un aumento de citoquinas pro-inflamatorias
(Cancello y Clément 2006).
Los macrófagos del tejido adiposo se clasifican en macrófagos M1 (macrófagos
activados clásicamente), que producen citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α e IL-6, y
los macrófagos M2 (macrófagos activados alternativamente), que secretan citoquinas anti-
inflamatorias como IL-4, IL-10 e IL-13 (Guzmán-Flores y López-Briones, 2012). En el estado de
obesidad hay una transformación de un estado anti-inflamatorio M2 a una forma M1 más pro-
inflamatoria (Lumeng y col., 2008).
El tejido adiposo en la obesidad presenta una infiltración masiva de macrófagos M1
secundaria al incremento de la secreción de la proteína quimioatrayente de macrófagos (MCP-
1) que juega un papel crucial en la respuesta inflamatoria en obesidad (Zeyda y col., 2007;
Lumeng y col., 2008; Prieur y col., 2011). Los niveles en el tejido adiposo y circulantes de MCP-
1 están elevados en la obesidad, lo que sugiere que MCP-1 podría contribuir a las alteraciones
metabólicas asociadas a la obesidad (Figura 6) (Takahashi y col., 2003; Sartipy y Loskutoff,
2003; Bruun y col., 2005).
A su vez, los macrófagos infiltrados son responsables de la secreción de más del 50%
del TNF-α desde el tejido adiposo (Izaola y col., 2015). El TNF-α es una citoquina que participa
en la inflamación sistémica, es un inhibidor del apetito y también está producida por otras
células como linfocitos, células endoteliales, fibroblastos, células neuronales y adipocitos
(Romanatto y col., 2007). La concentración circulante de TNF-α aumenta con la obesidad
(Figura 6), y estudios in vitro han demostrado que el tejido adiposo visceral produce más TNF-α
que la grasa subcutánea (Wellen y Hotamisligil 2005).
56
La pérdida de peso en obesos reduce los niveles séricos de TNF-α (Young y Zechner 2013).
Además, el TNF-α se ha asociado con patologías como la HTA y las dislipemias (Cottam y col.,
2004). Al aumentar el TNF-α, se estimula la producción de IL-6, que estimula a su vez la
producción de proteínas de fase aguda en el hígado, entre las que se encuentran el fibrinógeno
(Trayhurn y Wood, 2004). También estimula la expresión de ICAM-1, la MCP-1, y VCAM-1 en
las células endoteliales, aumentando la disfunción vascular (Maury y Brichard, 2010). Esta
citoquina también inhibe la conversión de los preadipocitos a adipocitos maduros (Makki y col.,
2013).
Las concentraciones circulantes de IL-6 están altamente relacionadas con el porcentaje
de grasa corporal (Figura 6) (Trayhurn y Wood 2004; Pérez 2007) y sus altos niveles pueden
además predecir el desarrollo de DM2 (Pradhan y col., 2001), así como un mayor riesgo a
desarrollar arteriosclerosis (Marcos-Gómez y col., 2008). La IL-6 reduce la capacidad de la
insulina para suprimir la producción hepática de glucosa y reduce la captación de glucosa
inducida por la insulina en el músculo esquelético (Kim y col., 2004). Por otro lado, sin
embargo, animales de experimentación con déficit de IL-6 desarrollan obesidad asociada con
incremento de glucosa y lípidos. Además, se han descrito efectos centrales para la IL-6, tras su
inyección intracerebro-ventricular, previniendo la obesidad mediante un incremento del gasto
energético (Wallenius y col., 2002). Otros estudios han implicado a la IL-6 con la HTA
(Furumoto y col., 2002). Se puede tratar de un mecanismo relacionado con la angiotensina II
(expresada y producida en los adipocitos), que es una molécula de gran poder vasoconstrictor,
así como con la inducción de la síntesis de fibrinógeno (Takano y col., 2000).
El fibrinógeno (proteína de la coagulación) es un factor importante de riesgo
cardiovascular y sus niveles en sangre se han correlacionado positivamente con el IMC, la CC
y el porcentaje de grasa corporal, y al igual que otras moléculas descritas anteriormente
disminuye con la bajada de peso (Kerr y col., 2001, Thorand y col., 2006). Se ha observado
que niveles elevados de fibrinógeno en pacientes obesos originan un mayor riesgo de sufrir
complicaciones tromboembólicas y favorecen el desarrollo de aterosclerosis al infiltrar la pared
57
muscular de una arteria con disfunción endotelial, estimulando la proliferación de células
musculares lisas y la captación de la fracción LDL unida al colesterol por los macrófagos
(Koenig 2003).
Otro biomarcador relevante en obesidad es el PAI-1. El aumento de sus niveles tiene
correlación con la insulinemia, la hipertrigliceridemia y el IMC, e igualmente se relaciona con
enfermedades asociadas a la obesidad como DM2, HTA, estados pro-inflamatorios y trastornos
cardiovasculares (Dandona y col., 2004, Alessi y Juhan-Vague 2006; Darvall y col., 2007; Zulet
y col., 2007; Dimitrijevic-Sreckovic y col., 2007). Corroborando la relación con el IMC, González
Hita en el año 2000 describió la disminución de las concentraciones sanguíneas de PAI-1 en
sangre asociada a la reducción de peso por pérdida de masa grasa (González Hita y col.,
2002). Igualmente se ha observado que la sobreexpresión del ARNm del PAI-1 en el TAB
disminuye la hipertrofia en ratones sometidos a una dieta alta en grasa. Esta observación
sugiere que, en la obesidad, el aumento en la secreción del PAI-1 por el TAB ejerce un efecto
protector contra el crecimiento excesivo del mismo (Sánchez y col., 2005). Entre los factores
que estimulan la producción del PAI-1 por los adipocitos se incluyen el TNF-α y la leptina
(Wellen y Hotamisligil 2005).
El incremento del IMC se asocia con una activación endotelial sistémica temprana en
individuos con obesidad, relacionada con concentraciones elevadas en plasma de las
moléculas de adhesión celular, entre ellas la E-selectina, la VCAM-1 o la ICAM-1, y todas ellas
y de manera individual se correlacionan con el estado inflamatorio en obesidad y con
enfermedades asociadas a la obesidad (Figura 6) (Kvasnicka y col., 2001; Ito y col., 2002;
Desideri y col., 2005; Carrizo y col., 2008).
La E-selectina es una glicoproteína que se expresa exclusivamente en las células
endoteliales activadas, en respuesta a citoquinas inflamatorias, permitiendo la adhesión y
migración de macrófagos y leucocitos al endotelio activado (Roldan y col., 2003).
58
En niveles elevados muestra una perturbación endotelial y podría constituirse en un marcador
temprano del estado inflamatorio vascular subclínico (Hartge y col., 2007; Velarde y col., 2010).
La E-selectina se encuentra elevada en adultos con obesidad, dislipemias, HTA y DM2
disminuyendo tras el descenso de peso corporal (Figura 6) (Elhadd y col., 2004; Desideri y col.,
2005; Carrizo y col., 2008; Trøseid y col., 2005).
La VCAM-1 está incrementada en procesos infecciosos, inflamatorios, autoinmunes y
estados hipertensivos no compensados; también se ha observado un aumento en niños obesos
y además, se correlaciona positivamente con la IL-6 y TG y negativamente con el cHDL en
adultos obesos (Figura 6) (Desideri y col., 2005).
ICAM-1 es la molécula de adhesión a células vasculares con un papel crítico en
muchos procesos inflamatorios (Wang y col., 2005; Galkina y Ley, 2007). Su elevación en
sujetos obesos (Figura 6) podría ser debida a un aumento en la expresión de esta proteína por
los adipocitos (Weyer y col., 2002). Otros autores relacionan sus niveles elevados en la
obesidad con el TNF-α y la RI, la DM2 y trastornos cardiovasculares (Straczkowski y col., 2002;
Weyer y col., 2002). La ICAM-1 se ha correlacionado positivamente con la obesidad central y la
trigliceridemia e inversamente con los niveles del cHDL (Calabresi y col., 2002; Ito y col., 2002).
59
Figura 6. Contribución de los distintos tipos celulares a la inflamación del tejido
adiposo.Fuente: Gómez-Hernández y col., 2013
3.4. Obesidad y estrés oxidativo (EO)
Las células expuestas a diversas fuentes oxidantes sufren un desequilibrio entre la generación
de especies pro-oxidantes y su eliminación por parte de los mecanismos de defensa
antioxidantes, provocando el proceso de EO. Este desequilibrio provoca una alteración del
estado redox celular (balance entre el estado oxidado y el reducido), así como una excesiva
producción de moléculas conocidas como radicales libres (RL), responsables del deterioro
progresivo de los distintos órganos y sistemas, y que pueden ser definidos como moléculas o
átomos que contienen uno o más electrones desapareados en su última capa u orbital
electrónico (Vincent y col., 2007; De Tursi Ríspoli y col., 2013; Rowínski y col., 2013).
60
La existencia de estos electrones desapareados les hace ser inestables y les confiere una alta
reactividad, reaccionando con biomoléculas como los lípidos y proteínas, ya que tienden
rápidamente a ganar o ceder un electrón para conseguir así una conformación estable, lo que
explicaría el que actúen como agentes oxidantes al causar la oxidación de dichas moléculas
(Rowínski y col., 2013).
Existen evidencias sobre el papel del EO en la aparición y evolución de enfermedades
relacionadas con el mismo (Figura 7) (De la Fuente y Miquel 2009). Es poco lo que se conoce
acerca de la relación de la obesidad con el EO, pero se ha demostrado que provoca una
disminución de la capacidad antioxidante total debido a la presencia de EO por efecto de la
oxidación de lípidos de membrana celular, siendo este proceso un factor de riesgo que
incrementa considerablemente la aparición de ciertas patologías metabólicas (Vincent y Taylor
2006; Yang 2006; Blair 2008; Csiszar y col., 2008). La obesidad crea condiciones que pueden
generar una perturbación en el estado redox del organismo (Thannickal yFanburg, 2000;
Martin-Gallan y col., 2004; Furukawa y col., 2004).
La relación que existe entre la obesidad y el EO puede deberse a la hiperglucemia, la
hipoxia, la inflamación crónica asociada a la obesidad y a una menor defensa antioxidante
(Furukawa y col., 2004; Bondia-Pons y col., 2012). La hiperglucemia estimula la generación de
especies reactivas de oxígeno en los adipocitos, con lo cual se incrementa la producción de
citoquinas pro-inflamatorias (Lin y col., 2005). Otro posible mecanismo puede ser la hipoxia, ya
que el excesivo crecimiento del tejido adiposo durante el desarrollo de la obesidad produciría
un proceso inflamatorio crónico (Vincent y col., 2007; Wood y col., 2009). El EO y la inflamación
se encuentran estrechamente relacionados, puesto que el exceso de RL puede inducir la
respuesta inflamatoria, y más aún, los RL en sí mismos son efectores de la inflamación (Vida y
col., 2014). El EO es responsable de la degeneración celular, debido a que los RL pueden
reaccionar químicamente con proteínas y lípidos produciendo un daño celular irreversible que
puede llevar al daño del tejido y eventualmente a la muerte celular (Donaldson y col., 1996;
Turrens 2003). Por otra parte, el EO produce un aumento de la expresión de citoquinas pro-
inflamatorias y disminución de la expresión de citoquinas anti-inflamatorias en los tejidos
(Suzuki y col., 2003; Katsuki y col., 2006).
61
Otro factor que provoca la aparición de EO son las sustancias antioxidantes. Las defensas
antioxidantes de naturalezas no enzimáticas endógenas están constituidas principalmente por
compuestos con grupos tioles, entre los que se encuentran el glutatión reducido (GSH), que al
mantener el equilibrio con su forma oxidada (GSSG) mantiene el balance redox celular
mediante la relación GSSG/GSH. En las células sanas, aproximadamente un 90% del glutatión
total está en la forma reducida y un 10% existe en la forma oxidada, y un aumento de la
proporción entre GSSG y GSH se considera un buen indicativo del grado de EO (Stadtman
2004; Pastore y col., 2003). Por otra parte, los antioxidantes obtenidos a través de la dieta
pueden prevenir o frenar la generación excesiva de RI, evitando que se produzca EO y la
aparición de enfermedades producidas por su efecto (Uttara 2009).
Figura 7. Daños oxidativos involucrados en enfermedades crónicas. Fuente: Barbosa y col.,
2008
La superación de los sistemas pro-oxidantes por los antioxidantes favorece la instauración del
estrés oxidativo, caracterizado por la producción exacerbada de radicales libres (RL) y
especies reactivas (no radicales) de oxígeno (ERO) o de óxido de nitrógeno (ERON) (Salas-
Salvado y col., 2008).
62
4.ÁCIDOS GRASOS
4.1. Clasificación de los ácidos grasos y generalidades
En el organismo, la mayoría de las grasas están compuestas por monoglicéridos, diglicéridos y
TG. A su vez, estos están constituidos por una molécula de glicerol a la que se unen 1, 2 o 3
ácidos grasos (AG), que a su vez están formados por una cadena hidrocarbonada,
generalmente lineal, de longitud variable, con un grupo carboxilo (−COOH) en un extremo y un
grupo metilo (−CH3) en el extremo opuesto, que son los que les confieren las propiedades
físico-químicas a las grasas (Nasiff-Hadad y Meriño-Ibarra 2003).
El organismo humano sintetiza numerosos AG denominados no esenciales, mientras
que otros, llamados esenciales, deben incorporarse a través de la dieta, ya que el ser humano
no los sintetiza; estos incluyen los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) como el α-linolénico
(18:3 n-3, ALA), el cual es la base de la cascada metabólica de la serie n-3 (Kris-Etherton y
col., 2003; Harris 2005; Yngve 2009) y ácido linoleico (18:2 n-6 AL) de la familian-6 (Fernández
2010).
La esencialidad de los ácidos grasos fue descubierta por George y Mildred Burr en 1929,
quienes observaron que la alimentación de ratas con una dieta carente totalmente de grasas
producía enfermedades de piel incluso la muerte (Burr y Burr, 1949).
Los AG se clasifican en función del número de dobles enlaces en: AGS, que no
contienen ningún doble enlace; ácidos grasos monoinsaturados (AGMI), que contienen un
doble enlace, y AGPI, que contienen dos o más dobles enlaces (Rodríguez-Cruz y col., 2005).
Los dobles enlaces en la estructura de un ácido graso cambian sus propiedades químicas y
físicas. Así, por ejemplo, mientras que un AGS puede ser un sólido a temperatura ambiente, los
AGMI o AGPI de igual número de carbonos será generalmenten un líquido (Valenzuela y col.,
1999a).
-Ácidos grasos saturados
Los AGS sólo tienen enlaces simples entre los átomos de carbono, y dada su estructura son
sustancias extremadamente estables desde el punto de vista químico (Torrejón y Uauy, 2011).
63
Según la longitud de su cadena se clasifican en cuatro subgrupos: cadena corta (3-7 C),
cadena media (8-13 C), cadena larga (14-20 C) o muy larga (> 21 C) (Torrejón y Uauy, 2011).
Algunos AGS son comunes en la dieta, como el butírico (C4:0, presente en la mantequilla), el
láurico (C12:0, presente en la leche materna, el aceite de coco y el aceite de palma), el
mirístico (C14:0, que se encuentra en la leche de vaca y los productos lácteos), el palmítico
(C16:0, presente en el aceite de palma y en la carne) y el esteárico (C18:0, abundante en la
carne y en la grasa de cacao). Aparte de las fuentes de alimentación, se sabe que el cuerpo es
capaz de sintetizar AGS (Carrillo y col., 2011; Torrejón y Uauy, 2011).
Los AGI se caracterizan por una cadena hidrocarbonada con al menos un doble enlace,
y se clasifican en tres subgrupos según la longitud de su cadena: AGI de cadena corta (19 o
menos C), cadena larga (20-24 C) y cadena muy larga (25 o más C) (López y Macaya, 2006).
-Ácidos grasos monoinsaturados
Por definición, los AGMI contienen un solo doble enlace, cuya ubicación varía, pero está con
frecuencia situado en el carbono 9 de la cadena hidrocarbonada. Su longitud puede variar de
10 a 32 átomos de carbono, pero la gran mayoría existe como un ácido graso de 18 carbonos,
el ácido oleico, que contiene un doble enlace en el carbono 9 (C18:1, n-9) (Ros y col., 2015).
Los AGMI están presentes en muchos alimentos, incluyendo algunas frutas, frutos
secos, aceites de semillas, carnes y productos lácteos, pero el aceite de oliva contiene entre un
72-79% de ácido oleico (Mataix y col., 2006; Carrillo y col., 2011). El ser humano puede
sintetizar AGMI, y, por tanto, estos no se requieren de forma imprescindible en la dieta (Benatti
y col., 2004).
-Ácidos grasos poliinsaturados
Los AGPI son ácidos grasos que contienen en su molécula de 2 a 6 dobles enlaces,
habitualmente separados entre sí por un grupo metileno (-CH2-). Se agrupan según el carbono
en el que se sitúa el primer enlace doble. Si el primer enlace doble se encuentra en el carbono
3, nos referiremos a estos AG como AGPI n-3 o n-3 (Sprecher 1992).
64
El ALA es el padre de los AGPI n-3 y tiene tres dobles enlaces en las posiciones 3, 6 y 9 de su
cadena, y puede ser a su vez desaturado y alargado para formar series de AGPIn-3
(Rodríguez-Cruz y col., 2005; Mesa y col., 2007). A partir del ALA se obtienen los ácidos de
cadena larga (≥20 C) eicosapentaenoico (EPA; 20:5, n-3) y docosahexaenoico (DHA; 22:6, n-
3), que son abundantes en pescados grasos y en aceites de pescado como por ejemplo el
atún, el jurel y el salmón (Valenzuela y col., 2011).
El EPA se asocia con la prevención de las enfermedades cardiovasculares y puede convertirse
también en otro ácido graso n-3 de cadena larga, el ácido docosapentanoico (DPA; 22:5 n-3),
que luego puede elongarse y oxidarse formándose el DHA, que es el de más relevancia
biológica en la salud mental, por su mayor predominio en el cerebro de los humanos y otros
mamíferos (López y Macaya, 2006; Mesa y col., 2007; Valenzuela y col., 2014).
4.2. Papel de los ácidos grasos en la obesidad y enfermedades asociadas
4.2.1. Efecto de los ácidos grasos saturados
Estudios realizados en roedores muestran que ingestas elevadas de dietas ricas en grasas
saturadas tanto de origen animal como vegetal conducen a sobrepeso y obesidad, y otros
estudios muestran que también incrementan el riesgo de ECV (Priego y col., 2008; Mozaffarian
y col., 2009; Socarrás y Bolet, 2010). Existen diferencias en los efectos de los distintos tipos de
AGS de cadena larga sobre el perfil lipídico, pero no está claro si los efectos particulares de los
distintos tipos de AGS sobre el perfil lipídico se traducen en diferencias en el riesgo de ECV
(Mensink y col., 2003; FAO 2010; Hunter y col., 2010).
La ingesta de dietas ricas en AGS de cadena larga eleva la lipemia posprandial,
mientras que dietas ricas en AGS de cadena corta y media no producen cambios sustanciales
en ella (Sanders 2003). Los ácidos láurico, mirístico y palmítico se han asociado con un
aumento de los valores de colesterol total y de cLDL, mientras que el ácido esteárico no causa
ningún efecto en los niveles de colesterol (Kris-Etherton y Yu, 1997). Los AGS disminuyen la
expresión génica de la proteína del receptor de cLDL a nivel hepático, lo que lleva al aumento
de las cLDL circulantes y de los TG (Matthan y col., 2004; Korani y col., 2012).
65
Otros estudios realizados en animales han observado que dietas ricas en AGS empeoraron la
sensibilidad a la insulina (Storlien y col., 1991), y estudios epidemiológicos observacionales
mostraron una posible relación entre mortalidad por enfermedad coronaria y el consumo de
AGS en la alimentación (Kromhout 1989). También un estudio en babuinos ha comprobado que
una dieta rica en AGS puede incrementar la expresión de VCAM-1 y E-selectina de sus
membranas (Shi y col., 2005).
Dietas con elevado consumo de grasas saturadas e hidratos de carbono refinados pueden
producir disfunción endotelial, además de reducir la vasodilatación dependiente del endotelio, e
incrementar los valores de marcadores inflamatorios (PCR, IL-6, IL-8, TNF-α), y aumentan así
el EO (Esposito y Giugliano2006).
Finalmente, los ácidos mirístico y palmítico parecen incrementar el riesgo de cáncer de próstata
y su evolución, pero los datos no son suficientes para determinar la existencia de una relación
(Kurahashi y col., 2008; Strom y col., 2008).
4.2.2. Efecto de los ácidos grasos monoinsaturados
En estudios experimentales se han demostrado muchos posibles efectos positivos de la ingesta
de AGMI, especialmente en el sistema cardiovascular y el sistema inmune (Mente y col., 2009;
Kastorini y col., 2011; Martínez-González y Bes-Rastrollo 2006). La dieta mediterránea,
caracterizada por el uso de aceite de oliva como grasa culinaria principal, elevado consumo de
frutas, verduras, legumbres, cereales no refinados, bajo consumo de carnes y lácteos, ingesta
moderada de vino y pescado se ha relacionado con tasas más bajas de obesidad
(Trichopoulou y col., 2003; Schröder y col., 2004).
Hay datos de que el consumo de dietas ricas en AGMI no engordan en el contexto de
dietas controladas (Ros 2003), en programas de reducción de peso (Shai y col., 2008), e
incluso con dietas ad libitum (Sabaté 2003) en comparación con otro tipo de dietas. Vogler y
colaboradores evaluaron las acciones de los AGMI en el peso corporal de ratas, y se
encontraron que el ácido oleico podría conducir a una reducción en la masa de tejido adiposo.
66
En el mismo estudio, los autores demostraron que el ácido 2-hidroxioléico, un derivado sintético
del ácido oleico, promovió una disminución drástica del peso corporal de las ratas tratadas
(Vögler y col., 2008).
En el pasado, los AGMI se consideraban neutros en cuanto a su efecto sobre las
lipoproteínas plasmáticas, pero se ha sugerido en distintos estudios que podrían ser
beneficiosos en la prevención de las ECV (Massaro y De Caterina, 2002). El consumo de
aceite de oliva se ha relacionado con la reducción del cLDL, de los TG, del cociente colesterol
total: cHDL, y con un aumento del cHDL (Mensink y col., 2003; Martínez-González y Bes-
Rastrollo 2006; Guillén y col., 2009).
Cuando disminuyen los AGS en la dieta y simultáneamente se incrementan los AGI, deja de
producirse el efecto inhibidor de la actividad de los receptores de cLDL que produce la grasa
saturada y, por tanto, mejora la captación de esta lipoproteína (Dietschy 1998). Los AGMI
producen un cambio muy poco pronunciado en cHDL (Gardner y Kraemer, 1995), aunque en
otros estudios se ha observado que no hay cambio en los niveles de cHDL (Delplanque y col.,
1991; Mata y col., 1992; Thomsen y col., 2003).
Los AGMI, debido a su estructura química, son mucho más estables y menos
susceptibles a la peroxidación lipídica, y probablemente también disminuyen el riesgo
trombogénico y la agregabilidad plaquetaria (Mancini y Rubba, 2000). En un estudio de casos y
controles se observó que el consumo elevado de aceite de oliva (54 g/d) se asocia a una
reducción relativa del 74% del riesgo de sufrir un primer infarto de miocardio (Fernández-Jarne
y col., 2002).
Una dieta rica en AGMI puede reducir significativamente la tensión arterial sistólica y diastólica
(Schwingshackl y col., 2011). Pacientes con una dieta suplementada con aceite de oliva
pudieron reducir su medicación antihipertensiva (Ferrara y col., 2000). En otro estudio, se
encontró una disminución en la tensión arterial sistólica y diastólica en el grupo que consumía
aceite de oliva, pero no en el grupo que consumía aceite de girasol (Ruiz-Gutiérrez y col.,
1996). Se ha observado en modelos animales que el ácido oleico tiene un efecto hipotensor
ligado a su incorporación en membranas celulares y la regulación de la señalización celular
(Terés y col., 2008).
67
La ingesta elevada de AGMI puede modificar los fosfolípidos de membrana (Corrocher y col.,
1992), lo que a su vez conduce a una menor presión arterial (Ruiz-Gutierrez y col., 1996).
El aceite de oliva puede favorecer el control de la glucemia en la diabetes. El estudio
PREDIMED ha demostrado que el consumo de aceite de oliva virgen reduce un 40% el riesgo
de desarrollar DM2 (Salas-Salvadó y col., 2014).
Por otra parte, una dieta rica en AGMI provoca cambios beneficiosos en la glucemia en ayunas
y en la tolerancia a la glucosa (Louheranta y col., 2002). En pacientes con DM2 una dieta
predominante en AGMI llevó a una reducción de la resistencia insulínica y una restauración de
la vasodilatación endotelio-dependiente (Ryan y col., 2000). Los sujetos con DM2 pueden tener
un buen control sobre sus parámetros lipídicos cuando presentan una elevada ingesta de AGMI
(Korani y col., 2012).
En cambio, en estudios prospectivos la ingesta de AGMI ha tenido un efecto neutro sobre el
riesgo de DM2 (Gillingham y col., 2011). No existe ningún estudio epidemiológico amplio hasta
la fecha que haya analizado la asociación entre el consumo específico de aceite de oliva como
elemento independiente y el riesgo de DM2 (Marí-Sanchis y col., 2011).
Recientemente se ha constatado una reducción en la actividad inflamatoria de determinadas
enfermedades tras la administración de aceite de oliva (Bueno 2011; Lucas y col., 2011). La
producción de IL-6 por fibroblastos humanos en cultivo es menor en presencia de ácido oleico,
sugiriendo que tiene un papel relevante en la prevención de las enfermedades inflamatorias
(Darlington y Stone 2001). La administración en humanos de una dieta que contiene aceite de
oliva no afecta a la proliferación de leucocitos estimulada por mitógenos, mientras que en
animales sí se ha evidenciado una inhibición de este parámetro (Puertollano y col., 2010).
Los resultados experimentales llevados a cabo en células NK procedentes de humanos que
han ingerido una dieta que contiene aceite de oliva han demostrado una reducción de la
actividad NK después de dos meses de ingesta con esta dieta (Yaqoob 2002).
La relación del consumo de aceite de oliva y el cáncer es poco conocida; no obstante,
se ha encontrado en estudios realizados en países mediterráneos que el consumo de aceite de
oliva está relacionado con una reducción significativa de entre el 14 y el 34% en el riesgo de
cáncer de mama (Granados y col., 2006).
68
El acido 2-hidroxioléico es una molécula análoga al ácido oleico, cuya síntesis ha sido descrita
con anterioridad (Adam y col., 1998). Ha sido utilizada en la industria cosmética como
emulsionante para preparaciones de productos cosméticos (Escribá 2003). Esta molécula fue
diseñada por el grupo de Investigación de Biomedicina Molecular y Celular de la UIB dirigido
por el doctor Pablo Escribá (Escribá 2003).
El acido 2-hidroxioléico ha demostrado ser un buen agente antitumoral ehipotensor, además de
tener potencial en los tratamientos de reducción del peso corporal; estos efectos se deben
principalmente a su acción como agente regulador de señales asociadas a proteínas G (Alonso
y col., 2006; Alemany y col., 2007); por tanto, podráser utilizado en un futuropara fabricar
medicamentos destinados al tratamiento del cáncer, enfermedades cardiovasculares y la
obesidad.
4.2.3. Efecto de los ácidos grasos poliinsaturados
La atención sobre los AGPI n-3 se ha incrementado por sus efectos positivos sobre la
respuesta inmunológica, el cáncer, las ECV y en el equilibrio del peso corporal (Rodrigo y col.,
2008; González-Acevedo y col., 2013).Este efecto positivo de los AGPI n-3 se ha demostrado
en diferentes modelos (celulares y animales), así como también en estudios epidemiológicos y
clínicos (Browning y col., 2007; Newens y col., 2011).
Los AGPI n-3 pueden frenar el aumento de peso y reducir la grasa corporal en
roedores, especialmente la grasa visceral (Buckley y Howe 2010). El efecto anti-obesidad de
los AGPI involucra también la regulación de la leptina y la adiponectina (Ohashi y col., 2004;
Ahn y col., 2006). También la suplementación con AGPI n-3 aumenta la pérdida de peso en
mujeres obesas (Kunesova y col., 2006). En hombres jóvenes con sobrepeso, se ha
demostrado que los AGPI n-3 producen una mayor pérdida de peso que en el grupo control
después de 4 semanas, pero no se han visto efectos sobre la distribución de la grasa y las
medidas antropométricas (Thorsdottir y col., 2007). Por el contrario, en otro estudio no se
observó ningún cambio significativo en la composición corporal en pacientes con dieta
suplementada con AGPI n-3 (Titos y Clària, 2013).
69
Los resultados de los estudios epidemiológicos y de intervención indican que el consumo de
AGPI n-3 puede afectar positivamente a la salud cardiovascular (Mozaffarian y col., 2013; Li y
col., 2013). En un metaanálisis se concluyó que el consumo de 20 g/d de pescado reducía el
riesgo de muerte por cardiopatía isquémica en un 7% (Sekikawa y col., 2008). También el
consumo dos veces por semana de pescado graso disminuyóla mortalidad total un 29% en dos
años, con una reducción del 33% de muerte por ECV (Chiuve y col., 2012). Los datos
obtenidos en la población japonesa, que tiene una dieta rica en pescado, demuestran una
menor incidencia de infarto de miocardio, otras enfermedades isquémicas cardiacas y
ateroesclerosis (Kinjo y col., 1999). Se ha descrito que los AGPI n-3 reducen las
concentraciones de moléculas quimioatrayentes/quimioatractores y factores de crecimiento, y
la producción de moléculas de adhesión, lo que puede favorecer una reducción en la migración
de leucocitos y células de músculo liso vascular en la capa íntima de la pared vascular y
retrasar el proceso ateroesclerótico (Wallace y col., 1995; Miles y col., 2001).
Los efectos positivos de los AGPI n-3 en relación a las ECV al principio se centraron en el
contenido de EPA, aunque después se asociaron estos efectos también al DHA (Haag 2003;
Singhal y col., 2013).
De hecho, se ha observado que el DHA disminuye significativamente la expresión de ICAM-1,
VCAM-1 y E-selectina en humanos (De Caterina y Libby, 1996; Valenzuela y col., 2011;
Kromhout y col., 2012). También se ha demostrado que la suplementación con 4 g/d de AGPI
n-3 reduce los valores de fibrinógeno (Knapp 1997). En cuanto al mecanismo de acción,
intervendrían los lípidos reguladores que se forman a partir de los AGPI, como los
tromboxanos, que pueden afectar a la formación de trombos (Linder 1991).
La reducción de los TG generada por el consumo de AGPI n-3 es uno de los efectos
evidentes tanto en humanos como en animales (Manerba y col., 2010; Dessì y col., 2013). Se
ha observado que el consumo de cantidades considerables de pescado puede disminuir los
niveles de TG en sujetos sanos y en hiperlipidémicos (Visioli y col., 2000). Más recientemente,
se ha encontrado que una ingesta de 3-4 g/d de EPA+DHA es capaz de reducir las cifras de
TG entre un 25 y un 35% (Ros y col., 2015).
70
Con respecto al efecto de los AGPI n-3 sobre el colesterol total, un estudio realizado en
humanos demostró que la suplementación con 4g/d de EPA+DHA permite reducir los niveles
plasmáticos de cVLDL e incrementar los niveles de cHDL (Woodman y col., 2002). Los efectos
de los AGPI n-3 en pacientes hipertensos han sido estudiados en varios ensayos clínicos y su
consumo tiene un discreto efecto antihipertensivo (Kriketos y col., 2001; Holmy col., 2001;
Geleijnse y col., 2002). Se ha demostrado que una ingesta de 3-4g/d de EPA+DHA reduce
tanto la tensión sistólica como la diastólica (Kriketos y col., 2001; Holm y col., 2001).
La reducción de los TG, el aumento del cHDL y la reducción de la inflamación vascular
favorecela disminución en la tensión arterial (Leaf y col., 2005). Existen evidencias de que los
AGPI n-3 pueden estimular la producción endotelial de ON que reduce la tensión arterial y la
activación endotelial (Carrero y col., 2005; Adkins y Kelley, 2010).
El efecto que los AGPI n-3 producen sobre la glucemia (Nasiff-Hadad y Meriño-Ibarra
2003) se ha evaluado en diabéticos en múltiples investigaciones. Tanto la cantidad como el tipo
de grasa consumido pueden modificar el metabolismo de la glucosa y la insulina (Louheranta y
col., 2002). Se ha señalado que la ingesta de AGPI disminuye el riesgo de padecer DM2 a
través de diferentes mecanismos, incluida la protección de las células beta pancreáticas del
daño causado por el aumento de RL producidos durante la diabetes (Salmerón y col., 2001;
Suresh y Das 2003). Los estudios epidemiológicos realizados en esquimales han mostrado una
menor prevalencia de DM2 en este grupo poblacional debido a su alto consumo habitual de
AGPI n-3, que es alrededor de 14 g/d (Feskens y Kromhout 1993). No obstante, en otros
estudios no se han encontrado efectos del consumo de los AGPI sobre la DM2 (Woodman y
col., 2002); sin embargo, aún existe controversia con respecto a los efectos beneficiosos de los
AGPI en la DM2 (Rodríguez-Cruz y col., 2005).
Los resultados del efecto de los AGPI n-3 sobre el sistema inmune han sido
contradictorios (Yaqoob 2003). El efecto puede variar dependiendo de las dosis utilizadas y de
la duración de la suplementación (Mesa y col., 2007). La causa del efecto antiinflamatorio de
los AGPI n-3 es, probablemente, la propia estructura de estas moléculas. Diferentes
investigaciones han llegado a la conclusión de que un doble enlace es el mínimo necesario,
pero suficiente, para que los AGPI n-3 inhiban la actividad inflamatoria del endotelio (De
71
Caterina y col., 1998). También se ha demostrado que la actividad anti-inflamatoria de los AGPI
n-3 está relacionada con la presencia o ausencia de dobles enlaces en su molécula másque
con el tipo de insaturación (De Caterina y col., 1998). No obstante, todavía quedan muchas
preguntas sobre los mecanismos involucrados en el efecto antiinflamatorio de los AGPI n-3
(Lopez y Macaya 2006). Algunos estudios muestran que la proliferación de los linfocitos se ve
reducida en respuesta a niveles relativamente altos de AGPI n-3 (Calder y col., 2002).
La suplementación con 4,9 g/d de DHA durante 4 semanas previene la activación de algunos
parámetros de linfocitos T en humanos sanos, efecto que no se observó cuando los individuos
fueron suplementados con EPA (Kew y col., 2004). La proliferación de linfocitos B y T, aislados
del bazo, estimulada por los mitógenos ConA y LPS es notablemente menor en animales de
laboratorio alimentados con aceite de pescado comparado con dietas basadas en manteca de
cerdo, aceite de maíz, coco, azafrán o linaza (Alexander y Smythe, 1988).
Además, se ha demostrado que los AGPI n-3 afectan considerablemente a la actividad de las
células NK; así, una inyección intravenosa de EPA en sujetos sanos anula la respuesta de las
mismas durante 24 horas (Jeffery y col., 1996).
Se ha demostrado en diversos estudios ciertos efectos beneficiosos del aceite de
pescado en la enfermedad inflamatoria intestinal y la artritis reumatoide, así como una menor
incidencia de enfermedades inflamatorias intestinales en poblaciones japonesas y esquimales,
debido a la ingesta de los AGPI n-3 procedentes del pescado (Mesa y col., 2007). Los efectos
beneficiosos de los AGPI n-3 también se han demostrado en modelos animales con
enfermedad inflamatoria intestinal (Calder 2009a). Estos aceites de pescado incorporan el n-3
en la mucosa intestinal de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (Calder 2009b).
La artritis reumatoide se caracteriza por una marcada inflamación y destrucción progresiva de
las articulaciones, donde las citoquinas liberadas por linfocitos T activos tienen un papel
importante en los procesos inflamatorios asociados a esta enfermedad (Uchiyama y col., 2010;
Parameswaran and Patial, 2010). Varios estudios realizados en humanos y animales han
demostrado que la suplementación con AGPI n-3 reduce significativamente los niveles séricos
de IL-1, IL-2, IL-6 e IL-8, así como del TNF-α (Scott y col., 2010; Caughey y col., 2010;
72
Bahadori y col., 2010), mejorando los síntomas de estas dos patologías (enfermedad
inflamatoria intestinal y la artritis reumatoide).
También se están estudiando los efectos beneficiosos de los AGPI n-3 en el desarrollo
del cáncer, que es un área de gran interés. Se ha observado en estudios en ratones y en
cultivos celulares que las dietas que contienen EPA+DHA retrasan tanto el crecimiento como la
metástasis de los tumores en células mamarias (Peet 2004; Cavazos y col., 2011).
En un estudio en ratas con cáncer de colon, se demostró que los AGPI n-3 bloquean la
formación de tumores, mediante el aumento de la diferenciación celular y la apoptosis en las
primeras etapas de formación del tumor, aunque las evidencias en humanos no son tan claras
(Yam y col., 2001; Sala-Vila y Calder 2011; Gerber 2012). Una ingesta relativamente elevada
de AGPI n-3 podría inhibir, al menos en parte, los procesos apoptóticos en las células
tumorales, impidiendo su crecimiento (Hardman 2004). El TNF-α tiene un rol importante en el
desarrollo de caquexia en pacientes con cáncer y la suplementación dietaría con EPA+DHA
puede reducir su producción y sus efectos (Szymanski y col., 2010; Lima-Salgado y col., 2011),
pero no se conocen exactamente los mecanismos bioquímicos por los cuales los AGPI n-3
inhiben el desarrollo celular en algunos tumores (Rodríguez-Cruz y col., 2005).
También se ha observado un efecto neuroprotector de los AGPI n-3 en estudios in vitro
realizados en humanos, en animales y en modelos celulares (Lauritzen y col., 2000;
Mozaffarian y col., 2003; Högyes y col., 2003). In vitro, los AGPI n-3 han demostrado ser
capaces de prevenir la acumulación neuronal de calcio, bloqueando una señal que puede
desencadenar una cascada de eventos celulares que provoca lesión y apoptosis neuronal (Lim
y col., 2005). Durante el desarrollo fetal e infantil, los AGPI n-3 tienen un papel fundamental en
el desarrollo del cerebro, el sistema nervioso, la retina y el crecimiento (Cetin y Koletzko 2008;
Helland y col., 2008). En un estudio realizado en ratas alimentadas con una dieta pobre en
DHA, se observaron trastornos de aprendizaje y de la función cognitiva, efectos que revierten al
suplementar con este AGPI n-3 (Wu y col., 2004). Además, se ha asociado la ingesta frecuente
de pescado a una reducción del riesgo de depresión. Así, en un estudio llevado a cabo en 23
países, el consumo de pescado mostró una correlación negativa con las tasas de depresión
posparto (Bodnar y Wisner 2005).
73
4.2.4. Recomendaciones
Se desconoce el nivel seguro de ingesta de AGS y en qué concentración son necesarios para
conservar una buena salud, debido a sus múltiples orígenes (Torrejón y Uauy 2011).
La mayoría de recomendaciones nacionales e internacionales fijan el 10% de la
energía total como límite superior para el consumo de AGS en la población general (FAO 2010;
Aranceta y Pérez-Rodrigo 2012; Perk y col., 2012), mientras que la American Heart Association
recomienda un consumo total de AGS <7% de la energía de la dieta (Heart Association
Nutrition 2009). En Europa, diversas organizaciones han realizado unas recomendaciones de
ingesta de AGMI que oscilan entre un 10 y un 20% de la energía total de la dieta (Ros y col.,
2015). La ingesta deseable de AGMI para la población española es de un 20 a 25 % de la
energía diaria (45-55 g/d) y la fuente principal debe ser el aceite de oliva virgen (Ros y col.,
2015). En cuanto a los AGPI n-3, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación
y la Agricultura (FAO) y la OMS recomiendan un consumo óptimo de 0,3 a 0,4g/d de EPA y
DHA (Metcalf y col., 2003).
74
5. EL PROYECTO PRONAOS
PRONAOS (“Desarrollo de una nueva generación de alimentos para el control del peso y
prevención de la obesidad”), fue uno de los 14 grandes proyectos de investigación industrial
estratégica aprobados en 2008, en la cuarta convocatoria del Programa CENIT (Consorcios
Estratégicos Nacionales en Investigación Técnica). El proyecto PRONAOS está dirigido a la
investigación de los factores genéticos, moleculares y nutricionales que regulan los sistemas de
control de peso corporal, para desarrollar una nueva generación de alimentos dirigidos al
control de peso y a la prevención de la obesidad.
Los objetivos generales del proyecto PRONAOS eran los siguientes:
1. La identificación de nuevos marcadores genéticos y moleculares implicados en los
sistemas de regulación del peso corporal en humanos.
2. El descubrimiento de nuevos ingredientes que actúen sobre los sistemas de control de
peso.
3. El desarrollo de nuevas formulaciones de alimentos y nuevos procesos tecnológicos.
4. La implantación de nuevas estrategias para la prevención de la obesidad a través de la
alimentación.
OBJETIVOS
76
II. OBJETIVOS
Objetivos generales del presente trabajo
El objetivo global de esta tesis doctoral fue valorar los efectos de la administración de una dieta
obesogénicaen ratones hembra ICR-CD1®, y si la administración de dos suplementos de
ácidos grasos, uno con ácido 2-hidroxioléico y otro con n-3 AGPI (EPA+DHA), era capaz de
contrarrestar dichos efectos.
Para ello, se plantearonlos siguientesobjetivos específicos:
1. Estudiarel efecto de la dieta obesogénica sobre la evolución del peso corporal desde la
adolescencia hasta la edad adulta, y sobre la acumulación de grasa corporal en los ratones.
2. Analizar el impacto de la dieta obesogénica sobre diversos marcadores de salud metabólica
y cardiovascular.
3. Evaluar el impacto de la dieta obesogénicaen el estado funcional del bazo, mediante el
análisis de marcadores de estrés oxidativo y de una serie de funciones inmunitarias.
4. Estudiar el efecto de la suplementación con ácido 2-hidroxioléico en ratones ICR-CD1®
alimentados con la dieta obesogénica, sobre los parámetros fisiológicos, bioquímicos e
inmunológicos de interés.
5. Estudiar el efecto de la suplementación con los AGPI n-3 en ratones ICR-CD1® alimentados
con la dieta obesogénica, sobre los parámetros fisiológicos, bioquímicos e inmunológicos de
interés.
4. Este diseño experimental permite evaluar el posible efecto protector que los AGPI n-3
marinos y el ácido 2-hidroxioléico pueden ejercer sobre las funciones inmunitarias (quimiotaxis,
actividad “Natural Killer”, capacidad proliferativa de linfocitos) y parámetros de estrés oxidativo
(glutatión antioxidante, glutatión oxidado, niveles de malondialdehído y la actividad de XO) y
determinar si estos dos tipos de ácidos grasos pueden ejercer un efecto beneficioso sobre la
obesidad.
MATERIAL Y MÉTODOS
78
III. MATERIAL Y MÉTODOS
1. ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL
1.1. Animales de experimentación utilizados
Treinta y dos ratones hembras de la cepa ICR-CD1® de 8 semanas de edad fueron
proporcionados por Harlan Interfauna Ibérica, y mantenidos en el animalario del departamento
de Fisiología Animal de la Universidad Complutense durante la totalidad del experimento. ICR-
CD1® es una cepa de ratón no consanguínea y ampliamente utilizada, caracterizada por
animales robustos y de temperamento dócil.
Los ratones fueron marcados para su seguimiento individualizado mediante muescas
en las orejas, y se mantuvieron en un máximo de 8 animales por jaula, bajo fotoperiodos de
12/12 horas (luz/oscuridad), humedad relativa entre el 50-60%, temperatura media de 22ºC ±1
y ventilación adecuada. Los animales pasaron un período de adaptación a las condiciones del
animalario de cinco semanas previo al experimento.
1.2. Diseño experimental y dietas
El modelo animal utilizado es un modelo de obesidad inducida por una dieta progresivamente
rica en lípidos, empezando con una dieta de transición (DT) (Tabla 2) con un 22% de la energía
procedente de grasa, durante cuatro semanas que fue parte del periodo de adaptación,
seguida de una dieta con un 60% de grasa del total de las calorías, la dieta obesogénica (DO),
durante las restantes 14 semanas de experimentación (Tabla 2).
Ocho animales constituyeron el grupo control, siendo alimentados con una dieta de
mantenimiento estándar (Dieta 2014, Harlan Ibérica) durante todo el experimento (Tabla 2). Los
24 ratones restantes recibieron la dieta obesogénica (DO). Tras 8 semanas, un tercio de los
animales pasó a recibir la dieta al 60% de grasa suplementada con ácido 2-hidroxioléico
(1500mg/kg de dieta/d) durante seis semanas más (grupo DO-HO, n=8); otro tercio recibió la
dieta al 60% de grasa suplementada con una mezcla de AGPIn-3 (EPA + DHA; 3000mg/kg de
dieta/d) (grupo DO-N3, n=8); el tercio restante continuó con la dieta obesogénica hasta el final
de las 14 semanas experimentales (grupo DO, n=8).
79
La ingesta dietética se registró dos veces por semana, controlando el peso del alimento
proporcionado y lo que quedaba sin comer, y teniendo en cuenta derrames de la dieta.
Se realizó el registro de la evolución del peso de los animales dos veces por semana, durante
todo el estudio, con una balanza BOECO (Hamburgo, Alemania, máx. 610 g; d=0,01g).
Al finalizar el periodo experimental, todos los animales fueron sacrificados por decapitación con
tijeras y pinzas, sin anestesia y a primera hora de la mañana (8,00 h), en la fase oscura de su
ciclo vital, de acuerdo con las directrices del Real Decreto 1201/2005, Convenio Europeo para
la Protección de Animales Vertebrados y Otros Propósitos Científicos, denominado Convenio
123 (BOE nº 256 de 25/10/1990). Después del sacrificio se procedió a la extracción de sangre y
órganos, que se realizó tras la apertura total del abdomen. Se extrajeron bazo, hígado,
corazón, tejido adiposo visceral y cerebro, se pesaron y se depositaron en tubos estériles con
medio PBS (solución salina tamponada de fosfatos).
80
Tabla 2.Contenido de macronutrientes y micronutrientes de energía de las dietas
experimentales utilizadas.
Composición de las dietas CONTROL DT DO
Macronutrientes (% peso) Hidratos de carbono 48 44,9 27,3
Proteína 14,3 19 23,5
Grasa 4 9 34,3
Fibra* 18 12,1 6,6
Densidad de energía (kJ/g) 12,1 13,8 21,4
Energía de los hidratos de carbono (%) 67 55 21,4
Energía de la proteína (%) 20 23 18,3
Energía de la grasa (%) 13 22 60,3
Minerales (por kg de dieta) Calcio (g) 7 9 7,9
Fósforo (g) 6 7 4,8
Potasio (g) 6 4 4,9
Cloruro (g) 3 4 2,2
Sodio (g) 1 1 1,4
Magnesio (g) 2 2 0,706
Hierro (mg) 175 200 50
Zinc (mg) 70 60 48,8
Manganeso (mg) 100 80 14,5
Cobre (mg) 15 15 8,2
Yodo (mg) 6 6 0,28
Selenio (mg) 0,23 0,23 0,21
Vitaminas (por kg de dieta) A (IU) 6,00 15,00 8,40
D3 (IU) 600 1,500 2,100
E (IU) 120 110 158
K (mg) 20 50 1,6
B1 (mg) 12 17 11,2
B2 (mg) 6 15 12,6
B3(mg) 54 75 63
B6 (mg) 10 18 12,1
B5(mg) 17 33 30,8
Biotina (mg) 0,26 0,4 0,42
Folato (mg) 2 4 4,2
B12 (μg) 30 80 50
Colina (g) 1,03 1,2 1,4 Los valores mencionados se calculan de acuerdo con la información de hojas de datos del fabricante.
*Fracción de detergente neutro para las dietas control y DT, y contenido de celulosa para la DO. Dieta
control: Harlan Laboratories Teklad-Global EE.UU. 2014; TD: dieta de transición, Harlan 2019; DO: dieta
obesogénica, Harlan TD.06414.
81
2. DETERMINACIONES FISIOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS
2.1. Análisis de grasa corporal por resonancia magnética nuclear
La resonancia magnética (RM), también conocida como resonancia magnética nuclear o RMN)
es un fenómeno físico basado en las propiedades magnéticas que poseen los núcleos
atómicos.
Los análisis de imagen de RNM se llevaron a cabo en 3 animales de cada grupo al final
de las 14 semanas de experimentación en un espectrómetro BIOSPEC BMT 47/40 de 4.7
Teslas (Bruker, Ettlingen, Alemania) (Figura 8), equipado con una sonda. Los ratones se
anestesiaron usando una mezcla de oxígeno e isoflurano y se colocaron en posición prona
dentro de una sonda de volumen de radiofrecuencia de 7 cm, que se usó como emisor y
receptor.
Se utilizó un sensor neumático para controlar la respiración del animal durante el
tiempo de análisis. Para cada animal se adquirieron dos series de imágenes. La primera serie
consistió en imágenes sin saturación de ninguna señal en las que se observa tanto la señal del
agua como la de la grasa. Esta serie se usó para calcular el volumen total del animal. En la
segunda serie se realizó una saturación de la señal del agua mediante un pulso selectivo a la
frecuencia de dicha señal, por lo que en la imagen sólo se observa la señal procedente de la
grasa. Esta serie se usó para calcular el volumen total de la grasa de cada animal. En ambos
casos se adquirieron los mismos cortes coronales y en número suficiente para cubrir el
volumen completo del animal.
Los parámetros de adquisición de ambos análisis fueron: tiempo de repetición (TR) =
700 min tiempo de eco (TE) = 10 min; campo de visión o field of view (FOV) = 5,5 x 11 cm2;
anchura del corte = 1 mm; tamaño de la matriz = 128 x 256 puntos. Las imágenes se
transfirieron a un PC para su procesado mediante el programa ImageJ (NIH, USA).
En aquellas imágenes en las que en el fondo de la imagen aparecía algún artefacto que
aumentase la intensidad de la señal, por ejemplo, debido a la respiración del animal, se eliminó
dicho artefacto igualando su intensidad a la del fondo de la imagen. En ambos casos, para
calcular el volumen total y el volumen de la grasa, se utilizó el programa ImageJ para ajustar el
umbral.
82
Una vez encontrado el umbral que permite segmentar en cada caso el volumen del animal
completo o la grasa, se usó la utilidad Analyze Particles de ImageJ para medir el número de
píxeles que ocupaba cada uno de los volúmenes. En el caso del cálculo del volumen total fue
necesario activar la opción Include Hole. Esto permite incluir las zonas no segmentadas, que
no poseen señal suficiente para ello, pero que están rodeadas por zonas que sí están
segmentadas, como por ejemplo ocurre con los pulmones.
El número total de píxeles segmentados en cada corte se sumó para dar el número
total de píxeles del volumen buscado. Este número de píxeles se multiplicó por el volumen de
cada píxel (0,42 x0, 42 x1 mm3) para dar el volumen total del animal o el volumen total de la
grasa.
Figura 8. Resonancia magnética nuclear. Fuente: www.ucm.es/rmn/bruker-biospec-47-40.
83
2.2. Determinación de la tensión arterial
En todos los grupos de ratones se realizaron medidas de tensión arterial con el medidor
PANLAB/HARVARD (Figura 9), método no invasivo que tiene como objetivo evaluar la tensión
arterial en ratones sin el uso de cateterismo invasivo, parecido al fundamento utilizado en
humanos.
Las mediciones se realizaron al finalizar el tratamiento con DO (al final de la octava semana de
experimentación) y tras un mes de suplementación (al final de las 14 semanas de
experimentación con DO-HO y DO-N3).
Los valores de la tensión sistólica y de la presión diastólica se midieron indirectamente en
venas periféricas gracias a la utilización del manguito y el transductor (Figura 9). En este caso
el manguito se aplicó a la cola. La principal dificultad en esta prueba es conseguir que el animal
esté lo suficientemente tranquilo y estable para la medición, por lo que es importante dedicar
tiempo a habituar el animal, con el fin de conseguir la estabilidad de señal de pulso necesaria
para la obtención de datos fiables.
Los animales tenían que tener controlada la temperatura corporal (30 a 35°C) y la
vasodilatación a través del calentador automático, para lograr unas condiciones de
estabilización de temperatura y vasodilatación en el animal.
Figura 9.A, medidor de presión no invasivo. PANLAB/HARVARD; B, calentador; C, transductor;
D, manguito.Fuente: http://novalabcientifica.com.
B A
C
D
A
B
84
2.3. Determinaciones de glucosa, colesterol y triglicéridos en sangre
Las determinaciones bioquímicas de glucosa, colesterol y triglicéridos fueron realizadas:1) al
final de la octava semana de experimentación; 2) tras 2 semanas de suplementación con DO-
HO y DO-N3 (semana 10); y 3) al final de las 14 semanas de experimentación.
Se realizaron en sangre extraída de la cola de los ratones, y fueron cuantificadas con el
medidor Accutrend Roche Accu-Chek (ACCUTREND, COBAS, SAFE-T-PRO y
SOFTCLIXRoche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Alemania) (Figura 10) mediante tiras
reactivas.
Este medidor funciona mediante colorimetría. El área de aplicación de la tira reactiva está retro-
iluminada por un LED (diodo emisor de luz). Antes de que se realice la medición en sí, se
determina el comportamiento de reflexión de la tira reactiva por medio de la luz reflejada desde
el área de aplicación (blanco). El componente que se desea determinar en la muestra aplicada
en la tira reactiva experimenta una reacción enzimática y se forma un colorante; la cantidad de
colores proporciona la concentración de la sustancia que se desea determinar.
Después de alcanzar el tiempo de reacción, se mide la intensidad del color retro iluminando en
el área de aplicación con el LED. La intensidad de la luz reflejada se mide con un detector
(fotometría de reflectancia). El valor medido se determina a partir de la intensidad de señal de
la luz reflejada, teniendo en cuenta también el valor del blanco previamente medido y la lectura
de la información específica del lote (tira de codificación).
Figura 10. Medidor ACCUTREND ROCHE. Fuente: http://www.comedan.com/producto-idp-
201.html
85
2.4. Valoración plasmática de niveles de hormonas, moléculas pro-inflamatorias y de
riesgo cardiovascular
Una vez sacrificados los animales a las 14 semanas, se obtuvieron muestras de sangre
periférica en tubos heparinizados. Las muestras de plasma se consiguieron mediante la
centrifugación (centrífuga 32R HETTICH ZENTRIFUGEN) de la sangre total heparinizada
durante 15 minutos a 1000 g, y a continuación fueron mantenidas a -80ºC en congeladores
(LIEBHERR) hasta el momento de su análisis (según protocolo de Díaz 2006).
Posteriormente, las muestras fueron analizadas mediante citometría de flujo utilizando
tecnología LUMINEX. En este ensayo, los anticuerpos específicos para cada molécula están
anclados a la superficie de microesferas de poliestireno. El espectro de emisión de cada una de
estas microesferas es único, lo que posibilita la identificación simultánea de todas ellas y por
tanto, de varias moléculas de interés, en la misma muestra. Las microesferas están marcadas
con dos fluoróforos, de forma que se establece un cocientede ambos distinto en cada una de
ellas; así tendremos la primera de las microesferas con un 100% del primer fluoróforo y 0% del
segundo, la 2ª microesfera con 99% del primer fluoróforo y un 1% del segundo, la 3ª con un
98% del primer fluoróforo y un 2% del segundo, y así sucesivamente hasta completar 100
microesferas perfectamente identificables dentro del mismo tubo de reacción.
Posteriormente, las microesferas son obligadas a pasar por una corriente de flujo. Cada una de
ellas es clasificada de acuerdo al cocientede su marcaje fluorescente interno. Además de esto,
el sistema Lúminex 100TM
IS v.1.7 escanea cada una de las microesferas para determinar la
presencia o ausencia de otro fluoróforo, el cual se habrá unido o no a los anticuerpos anclados
en la superficie de las microesferas, detectando así la presencia de la molécula de interés.
Se utilizaron paneles específicos Multiplex para el análisis de las siguientes variables:
adiponectina, insulina, leptina, PYY, GIP y PP, fibrinógeno, Apolipoproteina (Apo) ApoA1,
ApoE, PAI-1 total, sE-selectina, MMP-9, s-ICAM-1 y sVCAM-1. El ensayo se realizó de acuerdo
a las instrucciones y protocolos establecidos en el kit comercial de Millipore (Mouse Cytokine
MPXMCYTO-70K Millipore Corporation Billerica, Massachusetts, USA). Las muestras (25 μl) se
depositaron en placas de 96 pocillos, junto con los correspondientes blancos, estándares y
controles de calidad.
86
A los pocillos que contenían las muestras se les añadió 25 μl de Buffer de ensayo (que
contiene 0,08% de azida sódica). También se adicionaron 25 μl de una matriz sérica a los
controles con el fin de alcanzar condicionas similares de concentración de proteínas en los
pocillos de blancos, estándares y controles de calidad. Se añadieron 25 μl de la mezcla de
microesferas asociadas a los anticuerpos específicos para las citoquinas de interés, y la placa
se incubó, en agitación, durante 16-19 horas a 4ºC. Posteriormente, se realizaron dos lavados,
y 25 μl del detector de anticuerpos marcado con biotina se añadió a cada pocillo, y se incubó
durante 2 horas, a temperatura ambiente y en agitación constante. Sin lavar la placa, se
añadieron 25 μl de estreptavidina-ficoeritrina a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos en
agitación, a temperatura ambiente. Por último, se realizaron 2 lavados en la placa y se
añadieron en cada pocillo 150 μl de fluido apropiado para el sistema. Transcurridos cinco
minutos en agitación, se analizó la placa en el luminómetro (Lúminex 100TM IS v.1.7),
aplicando las especificaciones y el protocolo del proveedor. Los resultados se analizaron con
ayuda del software 2.3 de análisis de datos (Luminex 100 TM v 2.3).
87
3. DETERMINACIONES INMUNOLÓGICAS
3.1. Análisis de subpoblaciones de linfocitos
3.1.1. Subpoblaciones linfocitarias en sangre
Una vez sacrificados los animales, se obtuvieron muestras de sangre periférica en un
eppendorf heparinizado para analizar subpoblaciones linfocitarias. El método empleado se
basa en la unión de distintos anticuerpos específicos con su correspondiente determinante
antigénico expresado en la superficie de los linfocitos. Estos anticuerpos llevan unida una
molécula fluorescente, cuya emisión permite su detección, diferenciando así las células que
tienen unido el anticuerpo (positivas) de las que no (negativas) (Díaz 2006).
La sangre se mantuvo a temperatura ambiente por un tiempo no superior a los 30 min.
Las subpoblaciones linfocitarias se determinaron mediante la incubación de la sangre 30 min
en oscuridad con los anticuerpos monoclonales correspondientes a cada subpoblación de
interés, usando controles para cada tipo de fluorescencia: linfocitos T maduros (CD3+),
linfocitos T colaboradores (CD4+), linfocitos T citotóxicos (CD8+), células NK (CD335+), y
linfocitos B (CD19+, CD5+). Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo
(FACSCalibur Flow Cytometer, Becton Dickinson), obteniéndose los porcentajes de los distintos
tipos de linfocitos: FACSCalibur de BECTON DICKINSON puede medir simultáneamente
forward scatter, side scatter y 4 fluorescencias usando dos láseres (un láser de argón de 15
mw, refrigerado por aire, operando a 488 nm y un láser diodo a 635 nm). El análisis de
resultados se realizó con ayuda del software CellQuestPro (BD Biosciences).
3.1.2. Subpoblaciones linfocitarias en bazo
Los bazos fueron disgregados usando el sistema Medimachine, para obtener leucocitos
mononucleares. Los extractos de bazo se lavaron añadiendo suero salino hasta 14mL y se
centrifugó 7 min a 1000 rpm. El precipitado obtenido se resuspendió y se ajustó a un volumen
de 2 mL. A este volumen se le agregaron 5mL de una solución de cloruro amónico (NH4Cl) al
0,85%, y se dejó actuar 10 min a temperatura ambiente.
88
Después se volvió a centrifugar y se le añadió suero salino hasta un volumen final de 15 mL, y
se centrifugó una vez más a 1000 rpm durante 7 min. Después se eliminó el sobrenadante, y
tras resuspender el precipitado se le añadió suero salino hasta un volumen de 5mL.
Al finalizar el procedimiento de purificación de los linfocitos de bazo se estableció su número
por mL, realizando un recuento en una cámara de Neubauer (BLAU BRAND). Se hizo una
última centrifugación como las anteriores y se ajustó el volumen a 1x106 células por mL.
Después se marcaron las células con los anticuerpos monoclonales, siguiendo protocolo
descrito en el apartado anterior. Al igual que con la sangre, las suspensiones celulares de bazo
fueron analizadas mediante citometría de flujo (FACSCalibur, BECTON DICKINSON).
3.2. Análisis de producción de citoquinas por linfocitos de sangre periférica
La determinación de la producción de citoquinas fue realizada en alícuotas de sangre de 300
μl. Para la estimulación de los linfocitos se utilizó el mitógeno LPS a 1,5 µg/mL de
concentración, y posteriormente se valoraron los niveles de citoquinas en el sobrenadante
mediante citometría de flujo (Luminex 100 TM v 2.3), con anticuerpos específicos para IL-6, IL-
1β y TNF-α (Multiplex, Millipore), tal y como se ha descrito en la sección 2.4 de este capítulo.
3.3. Determinaciones en tejido adiposo
3.3.1. Aislamiento de los adipocitos
Inmediatamente tras el sacrificio de los animales, se procedió a la extirpación del tejido graso.
El aislamiento de los adipocitos se realizó en condiciones de esterilidad bajo campana de
seguridad biológica de flujo laminar. El tejido adiposo extraído se colocó sobre una placa de
Petri en tampón HEPES-fosfato atemperado a 37ºC. El aislamiento de los adipocitos a partir del
tejido se realizó según el protocolo de Rodbell (1964) con ligeras modificaciones (Lorente-
Cebrián y col., 2006). De esta forma, una vez pesado el tejido, se troceó con tijeras durante 90
segundos. Seguidamente, se incubó este tejido parcialmente digerido con una solución de
colagenasa tipo I (Worthington Biochemical Corporation Vassar Ave., Lakewood): 1,25 mg/mL
por 0,5 g de tejido durante 30 min a 37ºC y con agitación constante.
89
Transcurrido este tiempo, se neutralizó la acción de la colagenasa mediante la adición de
tampón HEPES-fosfato (24 mL) e inmediatamente se procedió a la filtración del tejido. Para
esto último, se utilizaron membranas de nylon de 400 µm de tamaño de poro previamente
esterilizadas, para retener el tejido no digerido y obtener los adipocitos aislados.
A continuación, se realizaron dos lavados con HEPES-fosfato con el fin de eliminar restos de
colagenasa, y se centrifugó la suspensión durante 6 min a 500 x g. Tras la centrifugación, se
obtenía en la parte superior la suspensión celular de adipocitos y en la fase inferior, los restos
de y otros tipos celulares como pre-adipocitos y células sanguíneas.
Esta fase inferior se eliminó utilizando cánulas metálicas revestidas de un aislamiento
de goma (para evitar la lisis de los adipocitos en contacto con el metal) y acopladas a jeringas.
Después, se realizó un último lavado utilizando medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM, Gibco®) suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) al 1% [SFBHeat Inactivated,
Biowhittaker (DE14-801FH)] y se procedió de nuevo a centrifugación en las mismas
condiciones. Tras retirar de nuevo el infra nadante, se volvió a añadir DMEM hasta 12-14 mL y
los adipocitos aislados se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 durante 30-40 min en incubador
termostatizado con atmósfera de CO2 regulable (KOWELL y HERAEUS).
3.3.2. Cultivo de adipocitos
Transcurridos los 30-40 min de incubación, se retiró la fase inferior hasta obtener una relación
volumétrica 2:1 de células/medio, que se mezclaron hasta obtener una suspensión celular
homogénea. Seguidamente, los adipocitos se cultivaron en placas de 6 pocillos en una matriz
de colágeno.
Para ello, se añadieron 500 µl de la solución de colágeno preparada con anterioridad
sobre cada pocillo y sobre esta, 150 µl de la suspensión celular de adipocitos. La matriz de
colágeno con los adipocitos se extendió cuidadosamente sobre la superficie del pocillo girando
y agitando cuidadosamente hasta obtener una distribución homogénea de las células sobre la
capa de colágeno.
90
A continuación, las placas se incubaron durante 40-50 min (37ºC y 5% CO2) para que se
produjera la solidificación de la capa de colágeno, en la que quedaban atrapados los
adipocitos, favoreciendo así unas condiciones de cultivo más parecidas a la situación fisiológica
de los adipocitos en el tejido adiposo, en comparación a ser estos cultivados en suspensión.
A continuación, se añadió a cada pocillo 2 mL de DMEM, y se realizó la estimulación con
mitógeno LPS (1,5 µg/mL), dejando pocillos sin estimular como control del estímulo. Después
de 48 horas de incubación en estufa a 37ºC y atmósfera húmeda al 0,5% de CO2, el
sobrenadante de las células en cultivo fue recogido y almacenado a -80ºC hasta el momento de
realizar las determinaciones. La cuantificación de adipoquinas en sobrenadante se llevó a cabo
usando citometría de flujo, tal y como se realizó para la determinación de citoquinas en sangre,
mediante el uso de Multiplex de Millipore específicos para IL-6, TNF-α, MCP1, adiponectina,
leptina, PAI-1 y resistina.
91
4. VALORACIÓN DEL ESTADO REDOX CELULAR
4.1. Niveles de glutatión reducido y glutatión oxidado
El glutatión es el antioxidante más potente en el organismo, gracias a la acción reductora del
grupo tiol de su cisteína (Figura 11).
Figura 11. Estructura química del glutatión. Fuente:www.coenzima.com
La valoración de los niveles de GSSG y GSH se determinó en el bazo utilizando el método
fluorométrico de Hissin y Hilf 1976. El método se basa en la reacción de una sonda de
fluorescencia, o-ftaldialdehído (OPT), con GSH a pH 8 y con GSSG a pH 12, lo que genera un
derivado de fluorescencia.
Para ello, las muestras de bazo se homogeneizaron (50 mg/mL) en tampón de fosfato
de sodio-EDTA (0,1 M, pH 8) y las proteínas se precipitaron añadiendo 5 μl de ácido perclórico
al 60%. Entonces, las muestras de bazo homogeneizado se centrifugaron a 9500 g durante
diez minutos a 40C y los sobrenadantes se mantuvieron en hielo para la medición de los niveles
de GSH y GSSG.
Para la determinación de los niveles de GSH, 10 μl del sobrenadante, 190 μl de tampón
de fosfato-EDTA de sodio y 20 μl de solución de OPT (1 mg/mL en metanol (MERCK)) fueron
añadidos a una microplaca de 96 pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 15
minutos. La fluorescencia se determinó en un lector de microplacas usando excitación a 350
nm de detección y emisión a 420 nm. Para la determinación de los niveles de GSSG, se
añadieron 10 μl del sobrenadante y 4 μl de N-etilmaleimida (NEM) (0,04 M) a una microplaca
de 96 pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
92
Después, se añadieron 186 μl de hidróxido de sodio (NaOH) (0,1 N) con 20 μl de solución de
OPT a cada pocillo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos, la
fluorescencia se midió como se ha descrito previamente para la determinación de GSH. Los
resultados se analizaron con curvas estándar para GSH y GSSG y se expresaron comomg de
proteína/nmol. La concentración de proteína de las muestras se midió siguiendo el protocolo
del kit de ensayo de proteínas bicinconínico (Sigma-Aldrich, Madrid, España). Entonces, para
cada muestra de bazo se calculó la relación GSSG/GSH.
4.2. Determinación del nivel de peroxidación lipídica-malondialdehído
La estimación de los niveles de malondialdehído (MDA) se evaluó colorimétricamente con el kit
comercial (Biovision, Mountain View, CA, USA). El MDA es un buen indicador de peroxidación
lipídica o daño oxidativo a lípidos debido a que es uno de los productos liberados por la
interacción de ROS y/o radicales libres con las membranas celulares. Este kit comercial mide la
reacción del MDA con el ácido tiobarbitúrico (TBA) y la formación del aducto MDA-TBA.
En un primer paso se preparó el buffer de lisis compuesto por butilhidroxitolueno (BHT)
a una concentración 1mM, cuya función es prevenir la autooxidación de la muestra impidiendo
la obtención de valores de MDA anormalmente altos, en tampón fosfato 50 mM y pH 7.4.
Las muestras de bazo (a partir de muestras previamente almacenadas a -80ºC) se
homogeneizaron (10 mg) en 300 μl de tampón de lisis MDA con 3 μl BHT (X100). Tras la
homogeneización se centrifugaron las muestras a 3.200 g durante 30 minutos y a 4ºC. Se
utilizó un homogeneizador eléctrico a un número bajo de revoluciones (aproximadamente 300
rpm). La homogeneización se llevó a cabo en cámara fría (a una temperatura de 4ºC) y la
muestra se mantuvo en hielo en todo momento. Se recogieron los sobrenadantes, de los
cuales se tomaron 200 µL y se les adicionó 600 µL de TBA al igual que a las concentraciones
utilizadas para la recta patrón. Posteriormente y en oscuridad, se incubaron todas las muestras
durante una hora a 95ºC en un baño de agua caliente. Pasada la hora, las muestras se
enfriaron en hielo durante 10 minutos y se añadieron 300 µL de butanol 90% a cada muestra,
se vortearon y se centrifugaron a 1.700 g durante 15 minutos a 4ºC.
93
Se obtuvo la fase orgánica de cada muestra, de la cual se cargaron 200 µL en una placa negra
de fondo plano de 96 pocillos y negra para proceder a la lectura espectrofotométrica del aducto
MDA-TBA a 532 nm usando un lector de placas Fluorestar Optima (BMG LabTech Biomedal,
Spain). Los resultados se analizaron con curva estándar MDA a diferentes concentraciones y
se expresaron como nmol/mg de proteína.
4.3. Actividad xantina oxidasa
La valoración de la actividad de esta enzima se llevó a cabo en homogenizados de bazo
obtenidos a partir de muestras previamente almacenadas a -80ºC.
El homogeneizado se realizó en tampón fosfato 50 mM a pH 7,4 y todas las muestras
de tejido se ajustaron a una concentración de 50 mg/mL. A continuación, se centrifugaron a
14.000 rpm durante 30 minutos y a una temperatura de 4ºC. En los sobrenadantes obtenidos
de esta centrifugación se llevó a cabo el análisis de la actividad de la enzima xantina oxidasa
mediante un ensayo fluorimétrico, utilizando el kit comercial “Amplex Red Xanthine/ Xanthine
Oxidase Assay Kit” (Molecular Probes). Fue necesario diluir la muestra 1/2.
El kit se basa en la capacidad de la enzima XO de producir el radical libre anión
superóxido (O2•-), como consecuencia de su actividad normal en la ruta de catabolismo de las
purinas, dando lugar como productos de esta reacción a xantina en un primer paso y ácido
úrico en el paso final. Cuando se añade la mezcla de reacción, el anión superóxido producido
por la XO se degrada espontáneamente, dando lugar a la aparición de peróxido de hidrógeno
(H2O2).
Este, a su vez, en presencia de peroxidasa de rábano, reacciona estequiométricamente
con el reactivo Amplex Red y genera así un compuesto de oxidación fluorescente, la resofurina,
cuya fluorescencia se mide en un lector de placas en un rango de excitación de 530 nm y
emisión de 595 nm. Para el análisis del bazo se realizaron curvas patrón con xantina a
diferentes concentraciones. A partir de estas curvas se obtuvieron las expresiones de los
niveles de actividad de la enzima. Los resultados se expresaron en miliunidades de actividad
enzimática por miligramo de tejido (mU XO/mg tejido).
94
5. ESTUDIO DE FUNCIONES INMUNITARIAS
El bazo se dividió en dos partes, una mitad se utilizó en fresco para el estudio de la
funcionalidad inmunitaria y la otra se congeló a -80ºC con objeto de emplearla en el estudio del
estado de estrés oxidativo. El procesamiento de la parte de bazo utilizada en fresco se realizó
como se describe a continuación: el primer paso consistió en macerar el órgano en tampón
buffer fosfato salino (PBS) estéril, solución salina tamponada de fosfatos, con la siguiente
composición por litro de disolución: cloruro sódico 123,2 mM (NaCl, PANREAC), fosfato
disódico 10,84 mM (Na2HPO4, PANREAC), fosfato monopotásico 3,23 mM (KH2PO4,
PANREAC) y agua ultrapura Milli-Q®. Seguidamente, se llevó a cabo un aislamiento mediante
gradiente de densidad, para extraer los leucocitos mononucleares separadamente de otros
tipos celulares, principalmente del elevado número de hematíes presentes en el macerado.
Para ello, se depositó el macerado en un tubo de vidrio estéril que contenía 3 mL de
Histopaque de densidad 1,077 g/mL (medio separador de las células sanguíneas). Se
centrifugó durante 20 minutos a 2500 rpm y, con ayuda de una pipeta Pasteur estéril, se
recogió el halo de leucocitos mononucleares. Dicho halo se depositó en otro tubo de vidrio con
PBS estéril, y se realizó un lavado de diez minutos a 1500 rpm (este paso puede realizarse
varias veces, en función del número de lavados que se consideren necesarios). Finalmente, se
decantó el sobrenadante y se resuspendió el pellet celular en 800 µl de medio PBS estéril.
El recuento del número de células vivas por mL se realizó empleando un
hemocitómetro de Neubauer y un microscopio óptico de contraste de fase. La viabilidad de los
leucocitos extraídos en fresco del bazo se analizó con el método de exclusión del colorante
vital azul tripán (SIGMA-ALDRICH). Este colorante, diluido previamente al 0,4% en medio PBS
estéril, se añadió a la suspensión celular en un volumen 1:1 y a continuación se llevó a cabo el
recuento de células muertas (aquellas que aparecían teñidas de azul) y vivas (aquellas que no
aparecían teñidas) en el hemocitómetro. Solo se emplearon en los estudios aquellas muestras
cuya viabilidad fue superior al 95%.
95
5.1. Movilidad inducida o quimiotaxis
Esta técnica se llevó a cabo de acuerdo con la modificación de la técnica original descrita por
Boyden en 1962 (De la Fuente y col., 2000), y que se basa en la capacidad que poseen los
leucocitos para desplazarse hacia un gradiente químico generado desde el foco infeccioso, el
cual experimentalmente puede reproducirse empleando el péptido formulado f-Met-Leu-Phe
(fMLP) procedente de la pared bacteriana de E.coli (Schuber y Müller 1989).
El método consiste en la utilización de cámaras con dos compartimentos (de 9 mm de
diámetro interno y 13 mm de diámetro externo) separados por un filtro de nitrocelulosa de
3 mm de poro. Una vez ajustada la suspensión linfoide a 1x106
células/mL, se depositaron
300 mL en el compartimento superior de la cámara. En el compartimento inferior se
depositaron alícuotas de 400 mL del agente quimioatrayente fMLP a una concentración de 10-
8M. Una vez cargadas, las cámaras se incubaron durante 3 horas en una estufa a una
temperatura de 37ºC, con un aporte de 5% de CO2y con humedad a saturación. Pasado ese
tiempo, se recuperaron los filtros, que fueron fijados y teñidos según los siguientes pasos:
1. Metanol al 50% 5 minutos
2. Etanol al 75% 5 minutos
3. Agua Destilada 2 minutos
4. Eosina-Azul de Metileno 15 minutos
5. Agua destilada 2 minutos
Después del último paso de lavado con agua destilada, los filtros se colocaron sobre un
portaobjetos y se llevó a cabo el recuento del número de linfocitos presentes. Para el recuento
se empleó un microscopio óptico (objetivo 100x), realizando en cada filtro 4 barridos de 5 mm
cada uno (de modo que se recorre aproximadamente la tercera parte del filtro). El valor
obtenido en el recuento representa el “índice de quimiotaxis”. En todos los experimentos se
realizaron los ensayos por duplicado.
96
5.2. Estudio de la actividad citotóxica natural killer de los leucocitos
Este ensayo consiste en la valoración de la capacidad citotóxica natural que, frente a células
tumorales, poseen los leucocitos de las muestras. Para ello se utilizaron como células diana las
de la línea YAC-1 de linfoma murino inducido por el virus de Moloney. Dicha línea celular fue
mantenida hasta su utilización a -80ºC en condiciones de esterilidad y en alícuotas de 2x106
células/mL de medio completo (RPMI 1640 con 1% de gentamicina, 0,1 mg/mL, y
suplementado con 10% de suero fetal de ternera descomplementado) y 10% de dimetil
sulfóxido (DMSO) como agente crioprotector.
Un par de semanas antes de realizar el ensayo se descongeló un vial de células YAC-1
y se transfirió todo el volumen de células tumorales a un tubo de plástico estéril. A continuación
se realizó un lavado (1500 rpm, cinco minutos) para eliminar el DMSO. Tras la centrifugación
se eliminó el sobrenadante, se añadió más medio completo y se llevó a cabo un segundo
lavado (1500 rpm, diez minutos). De nuevo se decantó el sobrenadante, y el pellet de células
tumorales se resuspendió en medio completo fresco (compuesto por medio RPMI con rojo fenol
con glutamina, enriquecido con un 10% de suero fetal bovino descomplementado y
suplementado con un 1% de gentamicina). Finalmente, se transfirió todo el volumen a un tubo
falcón estéril y se mantuvoen condiciones de esterilidad en un incubador (a 37ºC y con 5% de
CO2), para permitir el crecimiento de la línea tumoral y obtener de este modo un número de
células suficiente en el momento en que se fuera a comenzar el ensayo. El medio completo se
renovó cada 48 horas. En todo momento se controló la evolución del cultivo de las células del
linfoma con la ayuda del microscopio invertido para detectar cualquier tipo de contaminación
microbiológica que pudiera producirse.
El ensayo se realizó mediante un kit comercial colorimétrico para valorar citotoxicidad
(Cytotox 96. PROMEGA), siguiendo la metodología previamente descrita por Ferrández y col.,
(1999),cuyo fundamento consiste en valorar la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa
(LDH) liberada al sobrenadante por parte de las células lisadas.
Para ello, en el momento del ensayo, se transfirió todo el volumen del frasco donde
habían crecido las células de nuevo a un tubo estéril, se realizó un lavado (1500 rpm, diez
minutos) y se decantó el sobrenadante.
97
El pellet se re suspendió en 1 mL de RPMI sin rojo fenol (un medio que no tiene color, y que es
el que se emplea en el ensayo de la actividad natural killer). A continuación se llevó a cabo el
recuento celular y se ajustó una alícuota a la concentración de 100.000 células/mL,
concentración que se necesitan las células tumorales para el ensayo de la actividad natural
killer de las muestras. Las células efectoras (leucocitos de bazo) se ajustaron a 106 células/mL
en RPMI sin rojo fenol, para obtener así una relación de 10:1 (10 células efectoras: 1 célula
diana).
Una vez ajustadas las suspensiones, se dispensaron 100 µl de la suspensión de
células efectoras en placas de 96 pocillos con fondo en “U”, a los que se añadieron 100 µl de la
suspensión de células diana. Además se incluyeron pocillos en los que únicamente se
adicionaron células diana, con objeto de cuantificar la lisis espontánea y total de las mismas.
Del mismo modo, se incluyeron otros pocillos que contenían únicamente células efectoras, para
obtener así su lisis espontánea. Estos pocillos se completaron con 100 µl de medio RPMI sin
rojo fenol. Las placas se centrifugaron a 1250 rpm (250g) durante cinco minutos para favorecer
los contactos celulares y se incubaron durante 3 horas y 15 minutos a 37º C de temperatura y
5% de CO2.
Después de estas horas se añadieron 20 l de solución de lisis (HCl) en los pocillos
destinados a cuantificar la lisis total de las células diana. Tras 45 minutos, se volvieron a
centrifugar las placas en las mismas condiciones anteriores y se recogieron 50 l de los
sobrenadantes de todos los pocillos, que se transfirieron a una placa de 96 pocillos con fondo
plano, que permite la posterior medida en el lector de placas.
A continuación, a cada pocillo se añadieron 50 l de una mezcla de sustratos de la
enzima lactato deshidrogenasa (lactato, diaforasa y NAD+) y se incubó la placa durante 30
minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Pasado ese tiempo, se paró la reacción
añadiendo a los pocillos 50 l de una solución de parada y se midió la absorbancia a 490 nm,
lo cual nos proporcionó la actividad de la LDH en los sobrenadantes.
Finalmente, se calculó el porcentaje de lisis con ayuda de la siguiente fórmula:
(Lisis problema – Lisis espontánea céls. efectoras – Lisis espontánea céls diana) % Lisis =
(Lisis total – Lisis espontánea céls. diana)
X 100
98
Siendo:
- Lisis problema: media de las absorbancias obtenidas en los pocillos donde se incuban células
efectoras junto con células diana.
- Lisis espontánea: media de las absorbancias obtenidas en los pocillos sembrados solo con
células diana o con células efectoras.
- Lisis total: media de las absorbancias obtenidas en los pocillos que contenían células diana, a
los que se añadieron 20 l de solución de lisis (HCl).
En cada experimento se realizaron los ensayos por triplicado, utilizándose en la ecuación el
valor medio de las absorbancias obtenidas para cada tipo de lisis.
5.3. Capacidad proliferativa de los linfocitos
La actividad más característica de los linfocitos es su capacidad de respuesta proliferativa a
antígenos o mitógenos y para estudiarla se empleó el test de transformación linfoblástica (TTL)
en respuesta a los mitógenos ConA y LPS, siguiendo la metodología descrita por del Rio,
Hernandez y col., (1994) (De la Fuente y col., 2004). Este ensayo analiza in vitro la respuesta
proliferativa frente a mitógenos que reproduce la que tiene lugar in vivo frente a antígenos. Su
fundamento reside en la capacidad que poseen los linfocitos maduros para, en condiciones
adecuadas, transformarse en células con capacidad de división o linfoblastos. Estos sintetizan
ADN para su división, por lo que si se añade un precursor de la síntesis marcado
radiactivamente (timidina marcada con tritio, en este caso) puede cuantificarse el crecimiento.
Para el estudio de la respuesta proliferativa en linfocitos de bazo, se sembraron 106
células/mL en medio completo, en alícuotas de 200 l, en placas de cultivo de 96 pocillos con
fondo plano. En los pocillos destinados a determinar la respuesta proliferativa de los linfocitos,
se adicionaron 20 l del mitógeno. Se utilizaron 3 concentraciones diferentes de los mitógenos
para la estimulación de los linfocitos, que fueron las siguientes: 1, 3 y 5 g/mL en cada pocillo,
tanto para ConA como para LPS.
En los pocillos para la valoración de la proliferación espontánea, se añadieron 20 l de
medio completo, sin mitógeno. Las placas se incubaron durante 48 horas, a una temperatura
de 37º C, en una atmósfera al 5% de CO2 y una humedad de saturación.
99
Transcurrido ese tiempo, se observó al microscopio óptico invertido la aparición de blastos. En
todo momento se trabajó en condiciones de esterilidad y después se añadieron en cada pocillo
5 l de timidina tritiada (0,5 Ci/pocillo) y se renovó el medio completo adicionando 100 l de
medio fresco.La incubación se prolongó durante 24 horas más, tras las que se recolectaron las
células de cada pocillo en filtros con un recolector de células semiautomático, lavando los
pocillos tres veces con agua ultrapura. Los filtros se dejaron secar y se colocaron a
continuación en viales que contenían 5 mL de líquido de centelleo. La timidina incorporada por
los linfocitos se midió en un contador de centelleo líquido, del que se obtuvieron las cuentas
por minuto (cpm) de cada filtro.
En todos los experimentos se realizaron los ensayos por triplicado, utilizándose el valor
promedio de cada triplicado para la obtención de los datos. Los resultados se expresan como la
media aritmética de cpm en cada triplicado y también mediante el porcentaje de estimulación
(en el que el valor de 100% corresponde a las cuentas por minuto de los pocillos en los que se
ha valorado la proliferación espontánea).
100
6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El programa estadístico empleado para llevar a cabo los análisis fue el IBM SPSS Statistics
Versión 23 (SPSS versión 23).
La normalidad de las variables objeto de estudio (peso, parámetros bioquímicos y del
sistema inmunitario) se confirmó mediante los testsde Kolmogorov-Smirnov, Shapiro-Wilk y la
homogeneidad de las varianzas entre los grupos se analizó utilizando el test de Levene.
Para el peso, que es una variable de especial interés, ya que recoge de manera directa
el efecto de los tratamientos, se realizó un estudio descriptivo más amplio. Los pesos de
partida de los distintos grupos se compararon mediante un análisis ANOVA. Se estudió
también la evolución del peso, realizando un análisis de regresión lineal curvilínea, para
conocer el modelo al que mejor se ajustaba el peso en cada uno de los grupos y su variación a
lo largo de todo el experimento. El análisis estadístico de los datos obtenidos se realizó
mediante el análisis de la varianza (ANOVA) de una vía (para estudiar el efecto de la dieta).
Se realizaron también las comparaciones por grupos dos a dos, mediante la prueba “t”
de Student para muestras independientes en las variables de bioquímica y tensión después de
las 8 semanas de tratamiento obesogénico.
Para las variables que presentaban una distribución normal [grasa visceral, peso
cerebro y bazo,medidas bioquímicas y tensión arterial sistólica y diastólica,parámetros
inmunológicos en sangre y bazo, adipoquinas basales y tras estimulación con LPS,
hormonas,marcadores cardiovasculares,quimiotaxis, actividad NK, linfoproliferación con ConA y
LPS, actividad XO, MDA], se utilizó ANOVA de una vía con corrección post-test de Bonferroni o
Tamhane para comparar los valores medios entre los cuatro grupos. Para evaluar el efecto del
tratamiento en aquellas variables dependientes en las que se ha podido confirmar la
normalidad de la distribución, se ha realizado un Modelo Lineal General Univariante (MLGU).
Debido al tamaño muestral con el que trabajamos y para no quedarnos sin grados de
libertad en los contrastes, los MLGU se realizan considerando tanto cuatro niveles del factor
como tres niveles, excluyendo el grupo control. Dichos MLGU van a ser de dos tipos, en el
primero se incluyen la variable dependiente (VD) y el factor (modelos ANOVA) y en el segundo
añade la covariable (modelos ANCOVA).
101
Para las variables que presentan una distribución no normal peso hígado, peso corazón, la
variable CD19CD5+ en bazo, resistina (pg/μg proteína), PAI-1 (pg/μg proteína) tras
estimulación con LPS, TNF-α (pg/μg proteína) tras estimulación con LPS, MCP-1 (pg/μg
proteína), citoquinas, GSH, GSSG y GSSG/GSH se utilizaron pruebas no paramétricas (Kruskal
Wallis y U-Mann Whitney) para comparar las medias de los cuatro grupos. Se consideró que
existía significación estadística si el valor de la probabilidad de significación (p) era menor de
0,05.
RESULTADOS
103
IV. RESULTADOS
1. VALORACIÓN DE INGESTA DIETÉTICA Y EVOLUCIÓN DEL PESO
La Tabla 3 muestra la evolución de la ingesta de dieta sólida de cada uno de los grupos a lo
largo de la inducción de la obesidad (14-21 semanas de edad) y durante la suplementación
(22-27 semanas de edad). En líneas generales, los tres grupos de ratones hembras DO (DO,
DO-HO y DO-N3) alimentados con la dieta obesogénica, a pesar de que tuvieron una menor
ingesta de alimentos, mostraron valores significativamente más altos de calorías consumidas
que los animales alimentados con la dieta estándar.
Tabla 3. Ingesta de dieta durante las fases de inducción de la obesidad (8 semanas) y de
suplementación con ácido 2-hidroxioléico (DO-HO) y n-3 (DO-N3) (6 semanas).
C
(n=8)
DO
(n=8)
DO-HO
(n=8)
DO-N3
(n=8)
Inducción
(14-21sem edad)
g/ratón/d 4,2 (0,6) 2,8 (0,4) *** 3,2 (0.8) *** 2,8 (0.4) ***
kcal/ ratón/d 12,0 (1,7) 14,0 (1,9) 16,0 (4,0) *** 14,0 (2,2)
Suplementación
(22-27sem edad)
g/ratón/d 4,0 (0,7) 3,2 (0,8) * 3,0 (0,5) ** 3,1 (0,6) *
kcal/ratón/d 11,5 (1,9) 17,0 (4,4) *** 15,3 (2,9) * 16,3 (3,2) **
Los valores se presentan como media (DE) de los datos obtenidos semanalmente durante el período
indicado. ***P<0,001; **P<0,01; *P<0,05 con respecto a los valores de los ratones del grupo control. C:
grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3:
grupo con DO + AGPI n-3, analizado mediante ANOVA con corrección post-hoc Dunnett.
La evolución del peso se registró mediante el seguimiento controlado del aumento ponderal
individual y por grupo. En la Tabla 4 se muestran los valores del peso inicial y final de cada
grupo experimental, mientras que la Figura 12 muestra la evolución ponderal semanal. El peso
inicial de los animales fue homogéneo, sin presentar diferencias significativas entre los 4
grupos. Los grupos alimentados con DO incrementaron su peso, obteniéndose diferencias
significativas a partir de la semana 14 con respecto del grupo control.
104
Los animales alimentados con la dieta obesogénica comenzaron a ganar significativamente
más peso que los controles después de cinco semanas de alimentación con alto contenido en
grasa (P=0,036).
Se encontró que la suplementación con ácido 2-hidroxioléico dio lugar a una disminución
progresiva de peso corporal, llegando a presentar diferencias significativas con el grupo control
a partir de la semana 23 (P=0,009) y esta situación no se dio en los otros dos grupos de
tratamiento (DO y DO-N3). La suplementación con AGPI n-3 no mostró ningún efecto sobre el
peso corporal de los ratones (Figura 12). En consecuencia, los valores del peso final reflejaron
diferencias significativas entre los 4 grupos (P=0,005). El grupo DO ganó más peso que los
controles (P=0,042), mientras que el grupo DO-HO experimentó una disminución del peso
frente al grupo control (P=0,046) y al grupo DO (P=0,009) (Tabla 4 y Figura 12).
Tabla 4. Peso corporal medio en gramos al principio y al final del estudio.
Edadratones (semanas)
n C n DO n DO-HO n DO-N3 P
9 8 26,77 (1,41) 8 28,10(1,57) 8 26,17(2,01) 8 26,42 (1,35) NS
27 8 34,09(3,44)a 7 50,82(11,31)
b 7 28,43(3,49)
c 7 48,17 (11,67)
abc 0,005
NS: no significativo.C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-
hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Los resultados se presentan como media (DE).Letras
distintas indican diferencias significativas, P<0,05, analizado mediante el test ANOVA con corrección post-
hoc de Tamhane.
105
Figura 12. Evolución del peso de los ratones durante 27 semanas con dieta estándar
(control) o dieta obesogénica (DO□), seguidas de suplementación con ácido 2-hidroxioléico
(DO-HO∆) y omega 3 (DO-N3▲). Las flechas indican los puntos en que el peso de los grupos
DO empieza a ser significativamente mayor que el del control, y que el peso del grupo DO-HO
empieza a ser significativamente menor que los otros grupos DO.
En el análisis de la evolución del peso, los grupos control, DO y DO-N3 mostraron un ajuste
lineal (R2 de 0,417, 0,56 y 0,49, respectivamente; P<0,001 en todos los casos), mientras que el
grupo DO-HO se ajustó mejor al modelo cuadrático (R2=0,65, P<0,001). Estas evoluciones se
aprecian en la Figura 12.
Mediciones
106
2. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LA GRASA CORPORAL Y VISCERAL Y EN EL
PESO DE ÓRGANOS
Los resultados de la distribución de la grasa corporal se observan en la imagen de RMN
(Figura13). Dado que esta prueba suponía un considerable estrés para los animales y por
tanto, comprometía su continuidad en el experimento, se realizó únicamente en tres animales
de cada grupo. Este tamaño muestral tan bajo solo nos permitió realizar un estudio meramente
descriptivo; no obstante, consideramos que los resultados obtenidos son lo suficientemente
elocuentes como para ser valorados.
La imagen de RMN mostró un volumen total de grasa corporal (área gris refringente) en
los ratones del grupo DO casi cuatro veces mayor que en los ratones del grupo control. Se
observa un área de depósito graso marcado en la zona abdominal y periovárica. Los ratones
suplementados con AGMI n-3 presentaron valores intermedios de grasa corporal, teniendo los
del grupo suplementado con ácido 2-hidroxioléico valores más próximos a los del grupo control
(Figura 13).
Figura 13. Imagen obtenida por RMN a las 27 semanas de edad. Las cifras representan el
volumen medio de grasa corporal total (mm3). C: grupo control; DO-HO + ácido 2-hidroxioléico;
DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3.
C DO DO-HO DO-N3
7734 mm3 30289 mm
3 9866 mm
3 18600 mm
3
107
El peso total de la grasa visceral extraída a los ratones post-sacrificio fue evaluado,
encontrando valores marcadamente superiores en el grupo de ratones DO-N3 frente al grupo
control (P=0,039). Estas diferencias se aprecian en el gráfico (Figura 14). Para esta variable, el
modelo indica un efecto significativo del factor “grupo” (P=0,001).
Figura 14. Peso de los depósitos de grasa visceral (g) de los ratones a las 27 semanas de
edad (n=8 animales por grupo). C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO:
grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Letras distintas
indican diferencias significativas, P<0,05, analizado mediante ANOVA y post-hoc de Tamhane.
En la Tabla 5 se recogen los datos del estudio de los órganos (hígado, corazón, cerebro y
bazo) tras el sacrificio a las 27 semanas.
Se observó que el factor grupo tenía un efecto marginalmente significativo sobre el
peso del hígado (P=0,050) y significativo sobre el del corazón (P=0,027). Con respecto al peso
hepático, se encontraron valores más altos en los grupos DO y DO-N3 frente al control
(P=0,015 y P=0,020, respectivamente, según el análisis post-hoc). En el caso del peso del
corazón, este fue mayor en el grupo DO que en los grupos control (P=0,026) y DO-HO
(P=0,011). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas ni en cerebro ni en
bazo (Tabla 5).
a
ab
ab
b
108
Tabla 5. Pesos medios de los órganos internos.
Peso (g) C
(n=8)
DO
(n=7)
DO-HO
(n=7)
DO-N3
(n=7) P
Hígado 1,43 (1,29-1,66)a 1,83 (1,70-1,90)
b 1,72 (1,28-2,23)
ab 1,85 (1,62-2,38)
b 0,050
Corazón 0,16 (0,14-0,18)a 0,19 (0,18-0,20)
b 0,14 (0,12-0,18)
a 0,18 (0,15-0,21)
ab 0,027
Cerebro 0,49 (0,03) 0,48 (0,04) 0,49 (0,18) 0,49 (0,03) NS
Bazo 0,12 (0,02) 0,19 (0,07) 0,16 (0,14) 0,20 (0,09) NS
NS: no significativo; C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-
hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Los resultados se presentan como media (DE) o
mediana (Q1-Q3), según corresponda a la naturaleza estadística de las variables. Letras distintas indican
diferencias significativas entre grupos, tras análisis mediante ANOVA con post-hoc de Tamhane (variables
normales) o con el test de Kruskal-Wallis (variables no normales); P<0,05.
109
3. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS Y
FISIOLÓGICOS
Tras recibir la dieta obesogénica durante 8 semanas, únicamente se observaron diferencias
estadísticas entre el grupo control y los 3 grupos con DO en los niveles de triglicéridos y en la
tensión diastólica (P=0,004 en ambos casos; Tabla 6).
Tabla 6. Parámetros fisiológicos y bioquímicos después de 8 semanas con dieta estándar o
dieta obesogénica.
Mediciones C (n=8) DO (n=21) P
Glucosa (mg/dL) 99,88 (26,51) 105,23 (24,17) NS
Triglicéridos (mg/mL) 96,38 (10,43) 133,18 (31,84)* 0,004
Colesterol (mg/dL) 176,88 (17,64) 175,18 (17,76) NS
Tensiónsistólica (mmHg) 247,00 (38,26) 275,58 (38,13) NS
Tensióndiastólica (mmHg) 181,14 (26,62) 228,74 (35,19)* 0,004
NS: no significativo; C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-
hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Los resultados se presentan como media (DE).
*Diferencias significativas entre grupos, P<0,05, analizado mediante el test de la t de Student.
Tras dos semanas de suplementación con los ácidos grasos 2-hidroxioléico y n-3, el grupo DO-
HO presentó valores más bajos de glucosa que el grupo control (P=0,048) y el grupo DO
(P=0,029) (Figura 15). Este mismo comportamiento se describió tras un mes de
suplementación, aunque sin llegar a ser significativas las diferencias entre los grupos (136,8 ±
27,12 mg/dl en el grupo control; 151,3 ± 27,55 mg/dl en el grupo DO; 131,7± 31,01 mg/dl en el
grupo DO-HO y 144,7 ± 24,02mg/dl en el grupo DO-N3, P=0,056).
110
En relación a los valores de triglicéridos, a las dos semanas había una disminución de los
valores en el grupo DO-HO comparado con el grupo y DO (P=0,018) (Figura 16). Después de
un mes de tratamiento, tanto el grupo DO-HO como el grupo DO-N3 presentaron valores más
bajos que el grupo DO (P=0,045 y P=0,035) (Figura 17). Con respecto a los niveles de
colesterol, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los cuatro grupos
(Tabla 7).
Figura 15. Niveles de glucosa en sangre después de 2 semanas de suplementación. C: grupo
control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-
N3: grupo con DO + AGPI n-3. Letras distintas indican diferencias significativas, P<0,05,
analizado mediante el modelo lineal general univariante con corrección post-hoc de Bonferroni.
a ab
b
ab
111
Figura 16. Niveles de triglicéridos en sangre tras 2 semanas de suplementación. C: grupo
control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-
N3: grupo con DO + AGPI n-3. Letras distintas indican diferencias significativas; P<0,05,
analizado mediante el modelo lineal general univariantecon corrección post-hoc de Bonferroni.
Figura 17. Concentraciones de triglicéridos en sangre tras 1 mes de suplementación. C: grupo
control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-
N3: grupo con DO + AGPI n-3. Letras distintas indican diferencias significativas; P<0,05,
analizado mediante el modelo lineal general univariante con corrección post-hoc de Bonferroni.
ab
a
b ab
a
a
b
b
112
Tabla 7. Concentraciones de colesterol total en sangre.
Colesterol (mg/dl) C
(n=8)
DO
(n=7)
DO-HO
(n=8)
DO-N3
(n=7) P
2 semanas suplementación 167,50 (3,21) 171,14 (3,02) 169,57 (1,90) 162,14 (21,81) NS
1 mes suplementación 152,75 (3,06) 155,86 (2,48) 153,43 (1,72) 154,86 (2,12) NS
C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-
N3: grupo con DO + AGPI n-3. Los resultados se presentan como media ±DE. Análisis mediante el
modelo lineal general univariante.
Por otra parte, se observó que tras un mes de suplementación la tensión sistólica disminuyó en
el grupo DO-HO en comparación con el grupo DO (P=0,011; Figura 18), mientras que la
tensión diastólica fue menor en el grupo DO-HO en comparación con todos los demás
(P=0,007) (Figura 19).
113
Figura 18. Tensión sistólica tras 1 mes de suplementación. C: grupo control; DO: grupo con
dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO +
AGPI n-3. Letras distintas indican diferencias significativas; P<0,05, analizado mediante el
modelo lineal general univariante con post-hoc de Bonferroni.
Figura 19. Tensión diastólica tras 1 mes de suplementación.C: grupo control; DO: grupo con
dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO +
AGPI n-3. Letras distintas indican diferencias significativas P<0,05, analizado mediante el
modelo lineal general univariante con post-hoc de Bonferroni.
ab
a
b
ab
aa
b a
114
4. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS
Una vez sacrificados los animales (27 semanas) se obtuvieron los porcentajes de las siguientes
poblaciones linfocitarias circulantes en sangre: CD45+CD3+, CD3+CD4+ y CD3+CD8+,
correspondientes a linfocitos T, y las subpoblaciones CD335+ y CD19+, correspondientes a
linfocitos B, así como los cocientes CD3+/CD19+ y CD4+/CD8+. En bazo se calcularon los
porcentajes de las poblaciones CD45+CD3+ y CD19+, y el cociente correspondiente. Respecto
a los linfocitos circulantes, se encontró una tendencia a un menor porcentaje de CD19+ en los
grupos DO-HO y DO-N3 en comparación con el grupo control (P=0,090 y P=0,058,
respectivamente); ninguna de las otras poblaciones mostró cambios significativos, ni por efecto
de la dieta obesogénica ni por efecto de la suplementación con ácidos grasos. Tampoco se
observó ningún cambio a nivel esplénico en ninguno de los parámetros analizados (Tabla 8).
Tabla 8. Porcentajes de las poblaciones de linfocitos circulantesensangre y bazo.
C
(n=8)
DO
(n=7)
DO-HO
(n=8)*
DO-N3
(n=7) P
Linfocitos circulantes#
CD335+ 4,02 (1,37) 6,81 (4,25) 4,50 (2,66) 5,31 (2,73) NS
CD19+ 28,67 (11,11)a 25,14 (7,12)
ab 16,23 (8,98)
b 16,67 (7,39)
b 0,023
CD45CD3+ 35,03 (11,60) 30,22 (7,56) 34,51 (15,79) 37,74 (11,98) NS
CD3CD4+ 67,09 (11,00) 62,85 (11,15) 68,15 (9,30) 62,02 (14,21) NS
CD3CD8+ 27,53 (9,35) 28,26 (6,79) 23,80 (7,20) 26,10 (7,52) NS
CD4+/CD8+ 2,74 (1,11) 2,39 (0,87) 3,18 (1,39) 2,60 (1,19) NS
CD45CD3+/CD19+ 1,49 (0,82) 1,36 (0,75) 2,14 (1,58) 2,84 (2,19) NS
Linfocitos en bazo
CD19+ 57,42 (5,40) 54,96 (7,63) 54,62 (10,50) 51,48 (6,91) NS
CD45CD3+ 10,46 (10,17) 21,16 (23,58) 29,19 (21,71) 27,52 (19,79) NS
CD45CD3+/CD19+ 0,14 (0,17) 0,33 (0,39) 0,57 (0,43) 0,51 (0,37) NS
*N = 7 en medidas de bazo. # (%). C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con
DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Los resultados se presentan como media
(DE). Letras distintas indican diferencias significativas, P<0,05; análisis mediante el modelo lineal general
univariante con corrección post-hoc de Bonferroni.
115
5. EFECTOS DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS VALORES DE ADIPOQUINAS,
CITOQUINAS Y HORMONAS
5.1. En tejido adiposo en cultivo
Tras el sacrificio de los animales a las 27 semanas se analizaron los niveles de adiponectina
resistina y leptina producidas por el tejido adiposo in vitro, tanto a nivel basal como estimulado
con LPS. Estos resultados se muestran en la Tabla 9. Los grupos alimentados con la dieta
obesogénica presentaron una menor secreción de adiponectina estimulada por LPS; los niveles
más bajos fueron los del grupo DO, mientras que los grupos DO-HO y DO-N3 mostraron una
recuperación parcial. La misma tendencia se observó para la adiponectina basal.
También la leptina siguió patrones similares de secreción, con valores más altos en el
grupo control que en los otros grupos, aunque sin alcanzar diferencias de significación
estadística.
Los niveles basales de producción de resistina fueron más bajos en el grupo DO con
respecto al grupo control (P=0,005), y la misma tendencia se vio en el grupo DO-N3 (P=0,053).
Tras la estimulación con LPS, los niveles de resistina siguieron siendo significativamente más
bajos en los grupos DO y DO-N3, comparados con el control (P=0,001 y P=0,005,
respectivamente) y más alto en el grupo DO-HO comparado con el grupo DO (P=0,050).
En cuanto a las citoquinas, los tratamientos tuvieron un efecto significativo sobre la
secreción basal de MCP-1 (P=0,035); los valores más bajos correspondieron a los grupos DO y
DO-N3, y el más alto al grupo DO-HO. Las mismas tendencias se encontraron al estudiar las
secreciones de MCP-1 y de PAI-1 estimuladas por LPS, aunque en estos casos no se alcanzó
significación estadística (Tabla 9).
116
Tabla 9. Secreción de adipoquinas y citoquinas en tejido adiposo en cultivo, en condiciones basal y estimulado con LPS.
Basal n C n DO n DO-HO n DO-N3 P
Adiponectina (pg/μgprot) 7 22,37 (12,37) 7 9,73 (7,19) 7 16,64 (11,30) 7 17,70 (18,35) NS
Resistina (pg/μg prot) 7 2,80 (2,49-4,88)a 7 0,89 (0,57-1,95)
b 7 3,33 (0,80-4,37)
ab 7 1,37(1,04-3,00)
ab 0,028
Leptina (pg/μgprot) 7 1,26 (1,20) 7 0,62 (0,33) 7 0,91 (0,82) 7 0,97 (0,66) NS
MCP1(pg/μgprot) 7 4,32 (9,10-8,10) 7 1,05 (0,70-4,38) 6 7,13 (3,42-12,82) 7 0,75 (0,06-1,60) 0,035
TNF-α (pg/μgprot) 6 0,012(0,006-0,015) 4 0,033 (0,012-0,057) 6 0,021 (0,010-0,047) 7 0,009 (0,005-0,020) NS
IL-6 (pg/μgprot) 7 9,51 (10,40) 6 11,97 (10,52) 6 16,53 (13,45) 6 5,72 (5,28) NS
PAI-1 (pg/μgprot) 6 16,32 (13,09) 7 11,97 (10,52 4 16,53 (13,45) 6 5,72 (5,28) NS
LPS
Adiponectina (pg/μgprot) 7 19,28 (9,44)a 7 5,32 (1,95)
b 6 10,97 (6,87)
ab 7 8,26 (4,75)
ab 0,002
Resistina (pg/μgprot) 7 3,40 (2,64-5,80)a 7 0,83 (0,59-1,36)
b 7 1,68 (1,30-2,78)
a 7 0,99 (0,60-1,69)
c 0,002
Leptina (pg/μgprot) 7 1,18 (1,00) 7 0,52 (0,16) 7 0,37 (0,18) 7 0,78 (0,79) NS
MCP1(pg/μgprot) 7 9,43 (10,13) 7 2,34 (1,68) 7 7,29 (5,25) 7 1,54 (1,68) NS
TNF-α (pg/μgprot) 6 0,012(0,005-0,020) 6 0,008(0,003-0,034) 6 0,025(0,012-0,060) 7 0,008(0,004-0,017) NS
IL-6 (pg/μgprot) 7 14,62 (12,12) 7 11,31 (12,54) 7 17,56 (9,35) 7 7,50 (6,17) NS
PAI-1 (pg/μgprot) 6 14,00 (7,64-20,33) 7 5,75 (4,62-7,12) 4 27,19 (16,86-41,59) 6 4,65 (1,89-8,54) NS
C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Los resultados se presentan como media (DE) o mediana (Q1-Q3), según la naturaleza estadística de las variables. Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos, analizadas mediante ANOVA con post-hoc de Tamhane (variables normales) o Kruskall-Wallis (variables no normales), P<0,05.
117
5.2. Citoquinas
No se hallaron diferencias significativas entre los distintos grupos en la secreción de citoquinas
por parte de las células sanguíneas cultivo (Tabla 10).
Tabla 10. Niveles de secreción de citoquinas por células sanguíneas cultivadas.
Citoquinas
(pg/mL)
C
(n=8)
DO
(n=6)
DO-HO
(n=5)
DO-N3
(n=7) P
IL-1β 24,2
(3,10-93,11)
23,9
(3,02-63,06)
42,5
(7,62-63,33)
3,1
(3,10-20,43)
NS
IL-6 181,5
(50,45-691,99)
298,4
(93,16-1009,50)
350,0
(97,29-574,38)
124,5
(24,56-257,57)
NS
TNF-α 49,5
(39,93-187,18)
45,2
(4,19-80,12)
49,6
(34,82-71,78)
16,0
(10,40-36,35)
NS
IL-10 12,0(7,51-29,00) 6,7
(3,10-19,47)
3,1
(3,10-20,86)
16,5
(3,10-31,73)
NS
C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-
N3: grupo con DO + AGPI n-3.Los resultados se presentan como mediana (Q1-Q3). Análisis con test de
Kruskal-Wallis.
118
5.3. Hormonas plasmáticas
Los valores de leptina de los grupos DO y DO-N3 fueron significativamente mayores que los
del grupo control (P=0,002 y P=0,008, respectivamente). También se observa que los valores
del grupo DO-HO son más bajos que el grupo DO (P=0,019). No se encontraron diferencias
significativas en los valores plasmáticos de las demás hormonas estudiadas (Tabla 11).
Tabla 11. Niveles plasmáticos de hormonas.
n C
n DO
n DO-HO
n DO-N3 P
Adiponectina (µg/mL) 4
6,97
(2,13)
4
5,94
(3,39)
4
8,11
(2,49)
5
5,96
(3,18)
NS
Insulina (pg/mL) 8
1,04
(0,91)
7
0,82
(0,43)
7
0,67
(0,41)
7
1,52
(0,70)
NS
Leptina (pg/mL) 8
6,50
(5,18)a
7
28,96
(11,52)b
7
10,68
(7,20)a
7
26,13
(15,50)b
0,001
PYY (pg/mL) 8
32,56
(26,54)
6
88,62
(96,79)
7
45,75
(40,44)
7
85,73
(54,08)
NS
PP (pg/mL) 8
15,80
(13,77)
7
55,57
(59,88)
7
14,84
(12,43)
6
25,24
(24,03)
NS
GIP (pg/mL) 8
32,23
(43,54)
7
18,78
(9,95)
7
58,02
(66,79)
7
43,02
(34,32)
NS
C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO + ácido 2-hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO +
AGPI n-3. Los resultados se presentan como media (DE). Letras distintas indican diferencias
significativas, para P<0,05, analizado mediante el modelo lineal general univariante con post-hoc de
Bonferroni.
119
6. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS MARCADORES DE SALUD
CARDIOVASCULAR
Ninguno de los marcadores cardiovasculares estudiados presentó diferencias estadísticas
entre los grupos experimentales (Tabla 12), aunquese observó una tendencia a valores más
altos de sE-selectina, sVCAM, y fibrinógeno en los grupos alimentados con dieta obesogénica
frente al control.
Tabla 12. Niveles plasmáticos de marcadores cardiovasculares.
Los resultados se presentan como media (DE) o mediana (Q1-Q3), según la naturaleza estadística de las
variables. C: grupo control; DO: grupo con dieta obesogénica; DO-HO: grupo con DO + ácido 2-
hidroxioléico; DO-N3: grupo con DO + AGPI n-3. Análisis mediante el modelo lineal general univariante.
n C
n DO
n DO-HO
n DO-N3
P
sE-Selectina (ng/mL) 7 20,36
(9,27) 6
39,48
(5,84) 7
39,89
(22,42) 7
31,12
(24,30) NS
s-ICAM1 (ng/mL) 8 37,33
(9,87) 7
39,32
(11,68) 6
42,72
(14,96) 6
39,00
(12,93) NS
s-VCAM1 (ng/mL) 8 500,5
(215,4) 7
663,5
(341,6) 6
879,3
(525,3) 6
708,6
(488,2) NS
PAI-1 total (ng/mL) 8 4,43
(2,95) 7
6,02
(3,92) 7
5,46
(2,13) 6
4,64
(2,49) NS
MMP-9 (ng/mL) 8 240,6
(123,2) 7
384,2
(150,3) 6
364,4
(312,4) 7
206,4
(169,2) NS
Fibrinógeno (µg/mL) 6 21,09
(14,28) 4
69,80
(75,04) 5
74,34
(66,38) 5
93,05
(56,03) NS
Apo-A1 (µg/mL) 6 234,4
(50,65) 5
333,5
(109,5) 5
271,9
(30,10) 5
280,5
(89,54) NS
Apo-E (ng/mL) 6 369,4
(137,2) 4
508,5
(147,6) 5
430,8
(62,28) 5
439,4
(112,0) NS
120
7. EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE ESTRÉS OXIDATIVO Y FUNCIÓN EN
CÉLULAS INMUNITARIAS
7. 1. Efecto de los tratamientos sobre los parámetros de estrés oxidativo
7.1.1. Niveles de compuestos oxidantes y defensas antioxidantes
No se encontraron diferencias significativas en los niveles de GSH entre los grupos estudiados
(P=0,518) (Tabla 13). Sin embargo, los niveles de GSSG fueron significativamente mayores en
los grupos DO y DO-N3 que en los grupos control y DO-HO. En consecuencia, la relación
GSSG/GSH fue mayor en el grupo DO que en los grupos control y DO-HO, mientras que
alcanzó un valor intermedio en el grupo DO-N3.
Tabla 13.Concentraciones de glutatión reducido y oxidado en el bazo.
C
(n=6) DO
(n=6) DO-HO (n=6)
DO-N3 (n=6)
P
GSH (nmol/mg) 7,87
(4,64-12,02)
7,45
(6,77-7,76)
8,62
(7,45-9,94)
7,78
(6,03-9,00)
NS
GSSG (nmol/mg) 2,95
a
(2,31-3,34)
5,84 b
(4,76-6,84)
3,97 a
(2,94-5,03)
4,28 b
(3,39-5,67)
0,003
GSSG/GSH 0,38
a
(0,30-0,55)
0,77 b
(0,68-0,97)
0,39 a
(0,31-0,64)
0,49 ab
(0,39-0,49)
0,013
Los resultados se presentan como mediana (Q1-Q3).GSH: glutatión reducido; GSSG: glutatión oxidado.
Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos, analizadas mediante el test Mann-Whitney.
7.1.2. Peroxidación lipídica
La peroxidación lipídica [medida como niveles de malondialdehído (MDA)] también fue
diferente entre los tratamientos (P=0,004). Se observó una bajada significativa de los niveles de
MDA en el bazo del grupo DO-HO en relación al grupo DO (P=0,012). No se observaron
diferencias significativas con la suplementación con AGPI n-3 (Figura 20).
121
7.1.3. Actividad xantina oxidasa
Finalmente, la actividad xantina oxidasa (Figura 21) fue mayor en los ratones DO que en el
grupo control (P=0,032). La suplementación con ácido 2-hidroxioléico revertió parcialmente
este aumento, mientras que el tratamiento con AGPI n-3 lo revertió por completo.
Figura 20. Niveles de malondialdehído (MDA) (nmol/mg de proteína) en homogeneizados de
bazo. Letras distintas indican diferencias significativas, P<0,05, analizado mediante ANOVA
con corrección post-hoc de Tamhane.
Figura 21. Actividad xantina oxidasa (mU XO/mg proteína) en leucocitos esplénicos aislados.
Letras distintas indican diferencias significativas, P<0,05, analizado mediante ANOVA con
corrección post-hocde Bonferroni.
ab
a
b
a
a
b
ab a
122
7.2. Efecto de los tratamientos sobre parámetros de la función inmune
7.2.1. Índice de quimiotaxis de los linfocitos del bazo
Los tratamientos experimentales tuvieron un efecto significativo en el índice de quimiotaxis (IC)
de los linfocitos de bazo (Figura 22). Todos los grupos alimentados con la dieta obesogénica
presentaron valores más altos que el grupo control. Además, la suplementación con ácido
hidroxioléico, pero no con AGPI n-3, consiguió revertir este aumento parcialmente, siendo el IC
significativamente más bajo en el grupo DO-OH que en el DO (P=0,002) (Figura 22).
Figura 22. Índice de quimiotaxis en linfocitos del bazo. Letras distintas indican diferencias
significativas entre grupos, para P<0,05, analizado mediante ANOVA con corrección post-hoc
de Bonferroni.
a
c
b
bc
123
7.2.2. Actividad citotóxica de los leucocitos del bazo
La actividad “natural killer” (expresada como % de lisis de células tumorales) de los leucocitos
del bazo se refleja en la Figura 23. Se puede observar que todos los grupos alimentados con la
dieta alta en grasa mostraron valores significativamente más bajos que el grupo control,
P=0,014 y P=0,019, respectivamente). No hubo diferencias entre el grupo DO y los grupos
tratados con suplementos de ácidos grasos.
Figura 23. Actividad natural killer (% lisis) de linfocitos del bazo. Letras distintas indican
diferencias significativas entre grupos, para P<0,05, analizado mediante ANOVA con corrección
post-hoc de Bonferroni.
7.2.3. Capacidad proliferativa de los linfocitos del bazo en respuesta a mitógenos
En condiciones basales, no se observaron diferencias significativas en linfoproliferación entre
los grupos (grupo control: 1394 ± 550 cpm; grupo DO: 1282 ± 462 cpm; DO-HO:1362 ± 346
cpm; y grupo DO-N3: 1192 ± 361 cpm, P=1,000).
Tras la estimulación con ConA, el grupo DO mostró una proliferación reducida en
comparación con el grupo control (P<0,001). La suplementación con ácido 2-hidroxioléico
revertió completamente esta disminución, mientras que la suplementación con AGPI n-3 lo hizo
parcialmente (Figura 24).
a
b b
b
124
Figura 24. Proliferación de linfocitos del bazo en respuesta al mitógeno ConA. Letras distintas
indican diferencias significativas, P<0,01, analizado mediante ANOVA con corrección post-hoc
de Tamhane.
En respuesta a la estimulación con LPS (Figura 25), la suplementación con DO-HO dio lugar a
niveles significativamente más altos de proliferación en comparación con el grupo DO
(P=0,002) y el grupo control (P<0,001). La suplementación con AGPI n-3, sin embargo, no
afectó a este parámetro inmunológico.
Figura 25.Proliferación de linfocitos del bazo en respuesta al mitógeno LPS. Letras distintas
indican diferencias significativas, P <0,05, analizado mediante ANOVA con corrección post-hoc
de Tamhane.
a
b
a
ab
a a
b
ab
DISCUSIÓN
126
V. DISCUSIÓN
1. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE LA INGESTA, EL PESO Y LA GRASA
CORPORALES, Y EL PESO DE ÓRGANOS INTERNOS
En nuestro estudio, los animales alimentados con la dieta obesogénica ingirieron menos
comida en peso que los controles, y sin embargo presentaron una mayor ganancia de peso y
un mayor volumen de grasa corporal. Otros estudios realizados en roedores con dietas híper-
energéticas alcanzaron niveles ponderales de obesidad en periodos similares o incluso más
cortos que el nuestro (Commerford y col., 2001; Lee y col., 2001; Ferrari y col., 2005). Por tanto
es importante considerar como factores condicionantes el tiempo y la clase de dieta
administrada. Básicamente, todas las especies de roedores a nivel de laboratorio son
propensas a desarrollar perturbaciones metabólicas bajo tal régimen dietético (Sullivan y col.,
1993, Tschop y Heiman, 2001; Llado y col., 2000; Rodriguez y col., 2004).
La explicación más plausible para nuestras observaciones es el aumento de
calorías ingeridas debido a la mayor densidad energética de la dieta (Poppitt y Prentice, 1996;
Golay y Bobbioni, 1997; Rolls 2000). Otros mecanismos implicados en el aumento de la
adiposidad debido al consumo de dietas ricas en grasas son: afinidades alteradas de los
receptores β-adrenérgicos en el tejido adiposo marrón, el corazón y el músculo esquelético
(Matsuo y Suzuki, 1994; Takeuchi y col., 1995); menor actividad de la lipasa sensible a
hormonas (Awad y Zepp, 1979); o un aumento de la expresión de factores de transcripción
como el PPARγ y otros genes implicados en la adipogénesis (Wajchenberg 2000).
Al mismo tiempo hay que tener presente factores como las modificaciones en la
microbiota intestinal que puedan desarrollar los animales sometidos a dietas hipergrasas y que
están asociadas con la aparición de un fenotipo obeso (Cani y Delzenne, 2009; de La Serre y
col., 2010; Mujico y col., 2013). Además, el estado nutricional del huésped puede estar
marcadamente influenciado por la composición y las actividades de la microbiota intestinal, ya
que en pacientes obesos se han observado cambios significativos en la composición de la
microbiota intestinal en comparación con sujetos delgados (Nadal y col., 2009; Santacruz y col.,
2009); por ejemplo, la proporción de Bacteroidetes: Firmicutes parece disminuir en individuos
obesos (Turnbaugh y col., 2006).
127
De hecho, en un estudio previo llevado a cabo en los mismos animales estudiados en la
presente tesis doctoral, también se observó que el consumo de la dieta obesogénica inducía un
aumento en todos los grupos de Firmicutes (el phylumFirmicutes, el géneroLactobacillus y el
grupo ClostridialXIVa), así como el orden Enterobacteriales, aunque la diferencia fue
estadísticamente significativa sólo en este último grupo. Por el contrario, se observó una
tendencia a la baja en el género Bifidobacterium spp. y el phylum Bacteroidetes (Mujico y col.,
2013).
En nuestro estudio se observó una reducción progresiva en el peso corporal en
el grupo DO-HO; sin embargo, el grupo DO-N3 mostró una evolución de peso similar al grupo
DO. A pesar de estas diferencias en la evolución ponderal, la RMN demostró que los ratones
suplementados con AGPI n-3 presentaron valores intermedios de grasa corporal, y que los del
grupo suplementado con ácido 2-hidroxioléico tenían valores más próximos a los del grupo
control. El efecto adelgazante del 2-hidroxioléico no puede explicarse por cambios en la
ingesta, ya que esta no fue diferente entre los grupos DO y DO-HO. Es interesante destacar
que, siguiendo la línea de argumentación del párrafo anterior, la suplementación con 2-
hidroxioléico aumentó notablemente la densidad bacteriana total y restauró las proporciones de
bacterias de los grupos Clostridia lXIVa, Enterobacteriales y Bifidobacterium spp, mientras que
este efecto no tuvo lugar con la suplementación con los AGPI n-3 (Mujico y col., 2013).
La dieta mediterránea y el consumo de aceite de oliva se han relacionado con
tasas más bajas de obesidad (Schröder y col., 2004; Razquin y col., 2009), y hay un gran
número de estudios en animales y humanos que demuestran efectos positivos de la ingesta de
AGMI sobre el peso y la grasa corporales (Rodríguez-Villar y col, 2000; Ros 2003; Sabaté
2003; Paniagua y col., 2007; Shai y col., 2008; Gillingham y col., 2011; Patterson y col, 2014).
Aunque hay controversias (Flint y col., 2003), la evidencia experimental sugiere que los AGMI
tienen un mayor efecto saciante y termogénico que los AGS (Lawton y col., 2000; Soares y col.,
2004; Kien y col., 2005). Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos del ácido 2-hidroxioléico.
Nuestros resultados coinciden con los de Vögler y colaboradores, que señalaron que ratas
normopeso Wistar-Kyoto tratadas con ácido 2-hidroxioléico experimentaron una disminución en
el peso corporal a través de la reducción de la masa grasa (Vögler y col., 2008).
128
Con respecto a los AGPI n-3, a pesar de existir una considerable evidencia sobre sus
potenciales efectos anti-obesidad (Takahashi e Ide 2000; Murase y col., 2002; Wang y
col.,2002; Huang y col., 2004; Thorsdottir y col., 2007; Buckley y Howe, 2010), hay otros
estudios que indican que la suplementación con AGPI n-3 no tiene tal acción (Parrish y col.,
1990; Itoh y col., 2007; Batetta y col., 2009; Du y col., 2015). Los principales factores que
contribuyen a las diferencias entre los estudios podrían estar relacionados con la dosis, fuente
y duración de la suplementación. Debido a que la mayoría de los estudios han tenido una
duración relativamente corta, la magnitud de las mejoras ha sido modesta. Belzung y
colaboradores (1993) demostraron que el efecto protector del aceite de pescado exhibía una
relación dosis-respuesta (Belzung y col., 1993).
Se ha propuesto que el posible efecto anti-obesidad de los AGPI involucra la regulación
del sistema nervioso simpático, así como de la producción de leptina y adiponectina (Ohashi y
col., 2004; Ahn y col., 2006). Además, se ha demostrado que los individuos obesos oxidan peor
los AGPI en comparación con los individuos normopeso, lo que indica que la calidad de la
grasa de la dieta puede ser un factor condicionante en el desarrollo de la obesidad. Parece
existir una relación entre una ingesta excesiva de grasa y una disminución de la capacidad
oxidativa de los AG aunque existen controversias sobre esta teoría (Gil y col., 2005). Otro
posible mecanismo de acción de los AGPI es la inducción de la actividad termogénica del tejido
adiposo (Terpstra y col., 2003). El EPA incrementa la oxidación grasa en hepatocitos y
adipocitos, debido a una mayor actividad de la carnitin-palmitoil-transferasa 1 (CPT1), enzima
limitante en el sistema de oxidación lipídica mitocondrial (Guo y col., 2005). La administración
de DHA en ratas, por su parte, estimula la beta oxidación peroxisomal en el hígado, mediante
el incremento de la actividad de la coenzima oxidasa de ácidos grasos (Totland y col., 2000).
Por otra parte, DHA y EPA inhiben la actividad de la sintetasa de ácidos grasos en hígado y
tejido adiposo, así como la expresión de la estearoil-coenzima A desaturasa, ambas esenciales
en la síntesis de ácidos grasos, a través de la supresión de la proteína de unión al elemento
regulador de estearol (SREBP1) (Nakatani y col., 2003). Además, inhiben la diferenciación de
preadipocitos e incrementan la apoptosis de estas células (Kim y col., 2006).
129
En nuestro estudio, sin embargo, no solo los AGPI n-3 no provocaron una disminución del peso
corporal, sino que a pesar de observarse una reducción de la grasa corporal total con respecto
del grupo DO, los animales del grupo DO-N3 mantuvieron un mayor tamaño de grasa visceral
en comparación con el grupo control. En este sentido, se ha encontraron que una dieta con alto
contenido de AGPI n-3 en ratas limita selectivamente la hipertrofia de los depósitos adiposos
retroperitoneal y epididimal, sin efectos sobre otros depósitos importantes (Belzung y col.,
1993).
En relación a los órganos internos estudiados en el presente trabajo, el peso medio del
hígado de los grupos DO y DO-N3, y el peso medio del corazón del grupo DO fueron
significativamente más grandes que los de los de los grupos control y DO-HO. Hepatomegalia y
cardiomegalia, unidas a los valores más altos de peso corporal y grasa visceral, constituyen
rasgos comunes del síndrome metabólico (Castro-Martínez y col., 2012; Caruana y col., 2000).
Hallazgos similares han sido descritos en animales genéticamente obesos como las ratas
Zuckerfa/fa
, que muestran un aumento de tamaño en el hígado y el corazón (Bray 1977; White y
Martin, 1997; Srinivasan y Ramarao, 2007; de Artiñano y Castro, 2009). Se ha demostrado que
una dieta con alto contenido en AGS incrementa significativamente el peso del hígado en
ratones después de 16 semanas en comparación con otras dietas (aceite de oliva, aceite de
cártamo o linaza, y aceite de pescado) (Patterson y col., 2014). En nuestro estudio, el peso
medio del hígado fue más alto en los grupos DO y DO-N3 que en el control. La hepatomegalia
inducida por la alimentación con aceite de pescado ha sido descrita de forma consistente en
diferentes estudios (Otto y col., 1991; Yaqoob y col., 1995; Rabbani y col., 2001; Nakatani y
col., 2003). Con respecto al corazón, cuya principal fuente de energía son los ácidos grasos
libres circulantes, la ingesta de aceite de oliva ha sido relacionada con una reducción de su
peso en ratas (Jones y col., 1995), coincidiendo con los resultados observados en nuestro
estudio.
130
2. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS Y
FISIOLÓGICOS
El presente trabajo de investigación ha revelado que 8 semanas de administración de la dieta
obesogénica no fueron suficientes para producir alteraciones significativas en los niveles de
glucosa y de colesterol total; en cambio, los niveles de triglicéridos se incrementaron con
respecto al grupo control. Las alteraciones metabólicas que derivan de la obesidad, tales como
hipertrigliceridemia y otras dislipidemias, resistencia a insulina e hipertensión, tienen un gran
impacto en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares y diabetes (Contreras-Leal y
Santiago-García, 2011). La ingesta de grasa saturada ha sido asociada con alteraciones de los
niveles séricos de glucosa (López y col., 2003; Archer y col., 2004) y triglicéridos (Buettner y
col., 2006; Buettner y col., 2007). Igualmente se ha documentado que la hiperinsulinemia
favorece la síntesis de VLDL en el hígado y por lo tanto puede contribuir al incremento de los
triglicéridos (Orchard y col., 1983). Además, diversos estudios han demostrado que los AGS
aumentan de modo significativo el colesterol total y el asociado a lipoproteínas LDL, y
moderadamente el cHDL (Aguilera y col., 2001; Mensink y col., 2003). Hipotéticamente, el
tiempo de administración de la dieta obesogénica en nuestro estudio pudo no ser suficiente
para producir modificaciones significativas a nivel metabólico en nuestro modelo animal.
En relación a la suplementación con 2-hidroxioléico y AGPI n-3, observamos que tras
solo dos semanas de administración, el grupo tratado con 2-hidroxioléico presentó valores más
bajos en los niveles de glucosa en comparación con el grupo DO, e incluso en comparación
con el grupo control, y la misma tendencia se mantuvo tras un mes de tratamiento, aunque sin
llegar a niveles estadísticamente significativos. A este respecto, la ingesta de AGMI se ha
asociado con la disminución de la glucosa en la sangre (Rocca y col., 2001; Esposito y col.,
2004a) y con mejoras del control glucémico (Hussain y col., 2007). Además se ha propuesto
que durante la administración de una dieta rica en AGMI, los ácidos grasos libres son
transportados por el sistema linfático sin estimular la secreción de insulina, y llevados
directamente al tejido adiposo periférico y, por tanto, el pico de la insulina postprandial y la
hiperglucemia se reducen (Paniagua 2016). Otro estudio, en cambio, no encontró efectos
131
significativos sobre la sensibilidad a insulina tras la suplementación con AGMI en ratones de
laboratorio (Tierney y col., 2011).
El tratamiento con AGPI n-3 no influyó sobre los niveles de glucosa en la sangre. Estudios con
períodos más largos de suplementación con AGPI n-3 presentaronefectos beneficiosos sobre
el metabolismo de la glucosa (Nascimento y col., 2010), mientras que otros trabajos han
mostrado un incremento de los niveles de glucosa en sangre tras la ingesta de dosis elevadas
de aceites de pescado (EPA/DHA; 7,5 g/d) (Norday 1996) y ningún cambio significativo con
dosis bajas (4g/d, Malasanos y Stacpoole, 1991; 3,4 g/d, Grundt y col., 1999). Actualmente, el
efecto de EPA y DHA sobre la sensibilidad a la insulina no está bien caracterizado (Griffin y
col., 2006; Gonzalez-Periz y col., 2009; Tierney y col., 2011).
En relación a los valores de triglicéridos, tras las dos primeras semanas de
suplementación se evidenció una disminución de sus niveles en el grupo de animales
suplementado con 2-hidroxioléico. Un meta-análisis y una revisión sistemática recientes sobre
los AGMI en relación con el riesgo cardiovascular concluyeron que la mayoría de estudios
describen una disminución de los valores de triglicéridos (Schwingshackl y Hoffmann, 2012;
Ros y col., 2015). Además hay evidencia de que las dietas enriquecidas con AGMI podrían
mejorar los niveles de triglicéridos plasmáticos en el sobrepeso y la obesidad (Colette y col.,
2003) como en sujetos sanos (Covas y col., 2006). La suplementación con AGPI n-3 también
redujo los niveles de triglicéridos en comparación con el grupo DO. En humanos, la acción
metabólica principal de los AGPI n-3 es la reducción de la concentración de triglicéridos en
plasma (Ramírez-Tortosa y col., 1999), y la literatura científica describe trabajos en los que las
concentraciones plasmáticas de triglicéridos son casi invariablemente reducidas con AGPI n-3
(Phillipson y col., 1985; Sanders y col., 1985; Nestel y col., 1987; Ramírez-Tortosa 1999; Visioli
y col., 2000; Kris-Etherton y col., 2002; Flachs y col., 2009). Además, la reducción de la
hipertrigliceridemia es mayor cuanto mayor sea el nivel basal de triglicéridos (Connor y
Connor1997; Ros y Laguna, 2006; Kromhout 2012), y esto se cumple tanto para dosis bajas de
AGPI n-3administradas durante largo tiempo, como cuando se ofrece una dosis única muy alta
(Svaneborg y col., 1994). Los mecanismos por los cuales los AGPI n-3 reducen la
hipertrigliceridemia son múltiples, incluyendo: la reducción de la síntesis hepática de
132
triglicéridos (Connor y Connor 1997); la estimulación de los factores de transcripción PPAR
(Watanabe y col., 1992; Kaikaus y col., 1993); la reducción de la producción (síntesis y
secreción) de las VLDL y el aumento de su aclaramiento por estimulación de la actividad
lipoprotein-lipasa, en un proceso dependiente de PPAR y compartido en parte con los fibratos
(Kromhout 2012; Ros y Laguna, 2006).
Finalmente, nuestros resultados muestran que la suplementación con 2-hidroxioléico y
AGPI n-3 no influyó sobre los niveles de colesterol en nuestro modelo animal. Desde el informe
de Mattson y Grundy en el año 1985, se han llevado a cabo numerosos estudios de
intervención dietética para probar un efecto diferencial de los AGMI y los AGPI en los lípidos
séricos, y la mayoría de estos estudios no encontraron diferencias significativas en los niveles
de cLDL y cHDL (Wardlaw y col., 1991; Berry y col., 1991; Chan y col., 1991; Valsta y col.,
1992;Wahrburg y col., 1992; Kris-Etherton y col., 1993; Wood y col., 1993; Ginsberg y col.,
1994;Nydahl y col., 1994; Thomsen y col., 2003). Los AGS son el componente dietético que
más aumenta el cLDL en sangre, y se ha descrito que su sustitución por AGMI disminuye el
cLDL sin afectar los niveles de cHDL (Araneta 2003; Hernández 2004), aunque en otros
estudios los AGMI no produjeron cambios en el colesterol plasmático (González y col., 1997).
Ya en los años sesenta, Keys y Hegsted demostraron que el consumo de AGMI no afecta a los
niveles de colesterol total (Keys y col., 1965; Hegsted y col., 1965). Respecto a los AGPI n-3,
varios informes indican que no modifican los niveles de cLDL (Schectman y col., 1996; Harris
1997; Cazzola y col., 2007), o los resultados son inconsistentes (Phillipson y col., 1985;
Sanders y col., 1985; Nestel y col., 1987; Kris-Etherton y col., 2002; Finnegan y col., 2003).
Esto parece depender en partede la dosis empleada (Nestel y col., 1987), y posiblemente
también de la fuente del aceite de pescado y de la relación EPA/DHA. En nuestro estudio
tampoco encontramos cambios con ningún tratamiento en los niveles de ApoA1, considerada
mejor predictor de eventos cardiovasculares que el cLDL y el cHDL (Walldius y col., 2001;
Florvall y col., 2006; Chan y Watts, 2006; Van der Steeg y col., 2008; Sierra-Johnson y col.,
2009;Campana y col., 2014), ni en los de ApoE, que es poco abundante, pero está presente en
todas las lipoproteínas, incluso en las cLDL (Argüeso y col., 2011).
133
Otro de los puntos críticos en las complicaciones asociadas a la obesidad es el desarrollo de
hipertensión; la elevación de la tensión arterial en etapas tempranas de la vida es predictivo de
hipertensión en la edad adulta, y su asociación con el sobrepeso y la obesidad es bien
conocida (Mikhail y col., 1999; Brown y col., 2000).
Entre los factores que contribuyen al desarrollo de hipertensión se cuentan, además de
factores genéticos, mecanismos relativamente bien conocidos, como la resistencia a insulina, el
aumento de la actividad adrenérgica y de las concentraciones de aldosterona, la retención de
sodio y agua, y el incremento del gasto cardíaco, así como una serie de alteraciones de la
función endotelial, especialmente las mediadas por leptina y adiponectina (Vázquez-Carrera
2007; Rector y col., 2008). La leptina participa en la estimulación del sistema nervioso
simpático, lo que aumenta la tensión arterial y por lo tanto contribuye a la hipertensión
relacionada con la obesidad (Carlyle y col., 2002; Rahmouni y col., 2005). Hay evidencia
además de que la leptina puede influir en la homeostasis del fluido salino y el tono vascular
(Hajer y col., 2008). Por otro lado, se han descrito niveles reducidos de adiponectina en una
variedad de condiciones de obesidad y de hipertensión (Kumada y col., 2003; Ouchi y col.,
2003).
En el presente estudio comprobamos la asociación entre la obesidad y la hipertensión.
Los animales del grupo DO presentaron altos valores de tensión diastólica, tal y como se ha
descrito en casos de patologías asociadas a la obesidad humana y en modelos murinos
(Bakery col., 2007; Martínez-Gómez y col., 2010, Martínez-Gómez y col., 2011; Okin y
Medzhitov, 2012). A pesar de que se han identificado muchos detalles sobre el desarrollo y el
mantenimiento de la hipertensión relacionada con la obesidad, todavía no se conoce el impulso
primario para iniciar el proceso patológico, y tampoco se sabe si la obesidad causa
hipertensión o viceversa (Vaneckova y col., 2014).
Los animales tratados con ácido 2-hidroxioléico en nuestro estudio mostraron una
reducción de la presión arterial sistólica y diastólica después de 6 semanas de tratamiento. Se
ha demostraron que la administración oral de ácido 2-hidroxioléico podía promoverla
134
disminución de la presión arterial sistólica en ratas hipertensas, de manera tiempo- y dosis-
dependiente (Alemany y col., 2004).
El ácido 2-hidroxioléico ejerce efectos en diversos mecanismos hipotensores que implican la
regulación, la modificación y el control de las proteínas G, y las vías de señalización celular
cardíaca para promover vaso-relajación (Yang y col., 2005; Terés y col., 2008).
Este efecto hipotensor se ha observado en estudios previos con AGMI (Ruiz-Gutiérrez y col.,
1996; Lahoz y col., 1997; Alonso y Martínez-González, 2004; Estruch y col., 2006; Perona y
col., 2007). A nivel molecular, además de modificar los fosfolípidos de membrana (Pagnan y
col., 1989; Corrocher y col., 1992), el ácido oleico y el aceite de oliva virgen regulan la
señalización asociada a proteínas G in vivo (en seres humanos) y en cultivos celulares (Yang y
col., 2005; Alemany y col., 2007), compartiendo vías de señalización con el ácido 2-
hidroxioléico (Alemany y col., 2004; 2006 y 2007).
La suplementación con AGPI n-3 en nuestro estudio no condujo a una modificación
significativa de la presión arterial. A diferencia de nuestros resultados, en la literatura científica
se ha descrito que un aumento en el consumo de AGPI n-3 puede reducir la tensión sistólica y
diastólica, tanto en sujetos normopeso como en hipertensos (Appel y col., 1993; Morris y col.,
1993). Los AGPI n-3 parecen tener un efecto hipotensor menor, dependiente de dosis y del
grado de hipertensión arterial (Howe 1997). La reducción de los triglicéridos, el aumento del
cHDL, la reducción de la inflamación vascular y la disminución de la agregación plaquetaria
favorecerían dicha disminución del a presión arterial (Leaf y col., 2005). También existen
evidencias de que los AGPI n-3 podrían estimular la producción endotelial de óxido nítrico, que
provoca la relajación de las células del músculo liso, permitiendo la dilatación de los vasos
sanguíneos, que a su vez reduce la presión sanguínea y la activación endotelial (Tagawa y col.,
2000; Din y col., 2004). Solo cantidades elevadas de aceites de pescado (mínimo 3 g/día)
parecen producir un descenso significativo, si bien moderado, de la presión sanguínea (Appel y
col., 1993).
135
3. EFECTOS DE LOS TRATAMIENTOS EN LOS VALORES DE ADIPOQUINAS,
CITOQUINAS Y HORMONAS
La evidencia demuestra que las adipoquinas, además de influir en la regulación del apetito, el
gasto energético y la homeostasis de glucosa y lípidos, proporcionan un vínculo entre la
obesidad y la inflamación (Mora y Pessin, 2002). Los resultados de numerosos estudios en
adipocitos, tejido adiposo y suero han sugerido que las dietas hipergrasas afectan
negativamente los niveles de adiponectina y resistina (Nagao y col., 2003; Fernández-Real y
col., 2005; Flachs y col., 2006; Bueno y col., 2008; Pérez-Echarri y col., 2009; Lorente-Cebrian
y col., 2009; Shirouchi y col., 2010; Catta-Preta y col., 2012; Lefils-Lacourtablais y col., 2013;
von Frankenberg y col., 2014; Tishinsky y col., 2014; Graf y col., 2014). Las dietas ricas en
lípidos promueven un aumento significativo en la concentración de leptina sérica, existiendo
fuerte correlación entre la leptina y el porcentaje de ingesta lipídica (Ahrén y col., 1997; Cooling
y Blundell, 1998; Wang y col., 2005a), mientras que la ingesta de dietas tipo cafetería provocan
bajadas de los niveles de adiponectina (Ribot y col., 2008). También se ha observado que los
niveles de resistina aumentan debido a la utilización de dietas altas en grasa (Van Schothorst y
col., 2009; Lee y col., 2010).
En el presente estudio, los valores de leptina en plasma fueron significativamente más
altos en los animales DO que en los controles, aunque la secreción de leptina por adipocitos
aisladosno mostró diferencias significativas entre los grupos estudiados. La leptina tiene un
papel relevante en la regulación del peso corporal a través de sus efectos centrales sobre el
apetito, y periféricos sobre el gasto energético y la señalización de la insulina (Martí y col.,
1999; Maury y Brichard, 2010), y sus niveles responden directamente a la expansión adiposa
(Paniagua y col., 2016). Se ha descrito tanto en ratas como en humanos, que los adipocitos
hipertrofiados contienen una mayor cantidad de leptina comparados con los adipocitos más
pequeños (Lee y Fried, 2006; Lee y col., 2007). En modelos animales se ha observado que
cuando se tiene una dieta alta en grasa y/o azúcar se presenta hiperleptinemia, generando una
obstrucción funcional de la hormona que recibe el nombre de bloqueo leptinérgico, que culmina
en resistencia a la leptina, mayor consumo de alimento y desarrollo de obesidad (Wang y col.,
2005a; Rosado y col., 2006; Vasselli 2012).
136
Estos hallazgos sugieren que macronutrientes específicos como los carbohidratos (Jenkins y
col., 1997; Weigle y col., 2003; Vasselli, 2012), las grasas (Surwit y col., 1997; Ahrén y col.,
1997; Cooling y Blundell, 1998), pueden estar implicados en la inducción de dicha resistencia
como paso previo al desarrollo de la obesidad.
La suplementacion con 2-hidroxioléico en nuestros animales revirtió el aumento de la
leptina en plasma, como corresponde a la reducción de grasa corporal observada en ese
grupo. Nuestros resultados coinciden con otro estudio, que mostró que la ingesta de 2-
hidroxioléico en ratas delgadas durante 7 días (600 mg/kg cada 12 horas) condujo a una
reducción en los niveles de leptina (Vogler y col., 2008). Así mismo, se ha descrito que una
dieta rica en AGMI disminuye la concentración de esta hormona en comparación con los AGS
(Pieke y col., 2000; Kratz y col., 2002).
Por el contrario, el grupo suplementado con AGPI n-3 tuvo valores plasmáticos más
altos de leptina que losdel grupo control, y similares a los del grupo DO. Otros estudios in vivo
han mostrado que la suplementación con AGPI n-3 da lugar a la disminución de las
concentraciones plasmáticas de leptina en ratas y ratones (Reseland y col., 2001; Ukropec y
col., 2003), y se ha descrito que los AGPI n-3 reducen la señalización de la leptina mediante la
disminución en la expresión del gen de su receptor (Cleary y col., 2004). Los estudios
realizados en animales han proporcionado resultados inconsistentes sobre los efectos de los
AGPI n-3 sobre los niveles plasmáticos de leptina: encontramos tanto disminución (Reseland y
col., 2001; Ukropec y col., 2003), como ausencia de modificación (Flachs y col., 2006), o
incluso aumento (Cha y Jones, 1998; Peyron-Caso y col., 2002). La regulación de la
producción de leptina puede depender de la localización anatómica del tejido; se ha
demostrado que un aumento en la ingesta de los AGPI n-3 reduce la expresión de leptina en el
tejido adiposo epididimal de rata (Reseland y col., 2001), mientras que observaron niveles
reducidos de ARNm del gen de leptina en el tejido retroperitoneal asociados al consumo de
DHA, en comparación con una mezcla de manteca de cerdo y aceite de oliva (Raclot y col.,
1997). Además, los niveles de ARNm se correlacionaron positivamente con el tamaño de las
células de grasa, lo que sugiere un papel de los AGPI n-3 en la regulación del tamaño de las
células grasas y la expresión de leptina.
137
Por otra parte, experimentos in vitro e in vivo han revelado que la acción moduladora delos
AGPI n-3 sobre la secreción de leptina en los adipocitoses dependiente de la etapa de
maduración de los mismos (Prostek y col., 2014). Por lo tanto, la discrepancia entre nuestros
resultados y la literatura podría estar relacionada con las diferencias en los modelos celulares
utilizados (células primarias vs líneas celulares) o en la etapa específica de la adipogénesis en
la cual se miden los efectos de los AGPI n-3 sobre la leptina (Todorcevic y Hodson, 2016).
En nuestro estudio, los animales alimentados con DO no mostraron alteraciones en las
concentraciones plasmáticas de adiponectina, pero sí presentaron niveles más bajos de
secreción en adipocitos aislados que los controles. Resultados similares fueron obtenidos
mientras que otros autores hallaron concentraciones plasmáticas reducidas de adiponectina
tras la ingesta de dietas altas en grasas (Arita y col., 1999; Orio y col., 2003; Hoffstedt y col.,
2004). El mecanismo a través del cual la expansión del tejido adiposo suprime la producción de
adiponectina no se entiende muy bien (Fain y col., 2008), y además se sabe poco sobre la
secreción de adiponectina a partir del tejido adiposo y su papel en la regulación de la cantidad
de adiponectina circulante plasmática (Hoffstedt y col., 2004). Sin embargo, dado que la
obesidad suele estar acompañada de niveles elevados de ácidos grasos circulantes y en
particular de AGS, el efecto negativo de la obesidad sobre la adiponectina puede atribuirse a la
acción directa de los ácidos grasos en los adipocitos (Nguyen y col., 2005; Lavoie y col., 2009;
Kennedy y col., 2009). Es posible que factores distintos de la secreción adiposa, como el
recambio y la degradación, regulen las concentraciones séricas de adiponectina (Hoffstedty
col., 2004). Distintos estudios han descrito niveles más bajos de ARNm de adiponectina en el
tejido adiposo visceral en comparación con el tejido adiposo subcutáneo (Lihn y col., 2004),
mientras que Motoshima y colaboradores (2002) encontraron una mayor liberación de
adiponectina por adipocitos aislados del tejido omental en comparación con los de tejido
adiposo subcutáneo. Por lo tanto, no sólo la cantidad de grasa, sino también su distribución,
son factores que determinan los niveles de adiponectina (Trujillo y Scherer 2005).
138
En nuestro estudio, los niveles plasmáticos de adiponectina tampoco cambiaron con los
suplementos, aunque sí se observó una recuperación parcial de la secreción de adiponectina
estimulada por LPS en el grupo DO-HO, en relación al grupo DO.
Existe evidencia de efectos anti-inflamatorios y cardio-protectores del consumo de AGMI en la
obesidad (van Dijk y col., 2009; Schwingshackl y col., 2011), así como de los efectos positivos
del ácido oleico sobre la expresión del gen de la adiponectina (Hernández-Morante y col.,
2006). La capacidad del ácido oleico para inducirla expresión de adiponectina puede contribuir
a explicar los efectos beneficiosos de las dietas enriquecidas con este ácido en los niveles
plasmáticos humanos de adiponectina (Paniagua y col., 2007; Yeung y col., 2010), aunque
nosotros no observáramos dicha consecuencia. La asociación entre la adiponectina y los AGMI
requiere de más investigación.
Diferentes grupos de investigación han encontrado un aumento de la adiponectina
circulante con suplementos de aceite de pescado en modelos animales (Rossi y col., 2005;
Neschen y col., 2006; Flachs y col., 2006; Saraswathi y col., 2007; Kalupahana y col., 2010). La
suplementación con AGPI n-3 en nuestro estudio coincide con el estudio de Kratz y
colaboradores (2008), quienes no observaron cambios en las concentraciones de adiponectina
entre los sujetos que consumían una dieta enriquecida en AGPI n-3 y los sujetos control. Sin
embargo, y como en el caso del ácido 2-hidroxioléico, sí observamos una recuperación parcial
de la secreción de adiponectina en adipocitos. En esta línea, el estudio de Todoric y
colaboradores (2006) encontró que la expresión de la adiponectina fue restaurada por AGPI n-
3. La inducción de adiponectina en el tejido adiposo de ratones por los AGPI n-3 se ha
asociado con la supresión de la inflamación de bajo grado (Neschen y col., 2006; Rossi y col.,
2005; Flachs y col., 2006), y con un efecto sensibilizador de insulina, posiblemente como
resultado de la activación de la AMPK en diversos tejidos (Yamauchi y col., 2002; Nawrocki y
col., 2006).
Con respecto a la resistina, un estudio reciente señala que sus niveles pueden estar
directamente relacionados con la ingesta de AGS (Cabrera de León y col., 2014), pero no hay
resultados suficientes en la literatura científica para sacar conclusiones más claras.
139
Los datos no son uniformes al respecto sobre la influencia de la ingesta calórica en los niveles
plasmáticos de resistina, aunque lo más aceptado es que la disminución de peso y de la
ingesta calórica se asocian a una disminución de los niveles de resistina (Azuma y col., 2003;
Hansen y col., 2010). En nuestro estudio se observó que la secreción de resistina en el tejido
adiposo era significativamente menor en el grupo DO que en el control, y el mismo efecto ha
sido descrito por otrosautores (Moore y col., 2001; Way y col., 2001; Maebuchi y col., 2003;
Rajala y col., 2004; Ribot y col., 2008). Maebuchi y colaboradores (2003) mostraron que la
resistina en suero era indetectable en ratones obesos, y que la expresión de su ARNm estaba
reducida, al igual que pasa en nuestro estudio. Los niveles de expresión de los ARNm no
siempre se correlacionan con la expresión de las proteínas correspondientes (Rajala y col.,
2004). Explicaciones posibles incluyen diferencias en las modificaciones post-transcripcional y
post-traduccional, que afectan consecuentemente las tasas secretoras de resistina. Además, el
aumento de los niveles séricos puede aumentar las tasas de degradación de los transcritos, o
la iniciación y reclutamiento de inhibidores de la traducción, a través de mecanismos de
retroalimentación negativa. La forma secretada de resistina se considera que tiene propiedades
paracrinas, y esto puede implicar que la mayor parte de la regulación se produzca a nivel de la
proteína (Kusminski y col., 2005). Existe evidencia de que la resistina es inducida durante la
diferenciación de los preadipocitos 3T3-L1 (Kim y col., 2001; Steppan y col., 2001) con el
objetivo de inhibir la conversión adiposa de estas células, lo cual sugiere que también puede
servir como señal de retroalimentación para restringir la expansión del tejido adiposo (Kim y
col., 2001). Por tanto, una disminución de la producción de resistina durante el desarrollo
temprano de obesidad bajo una dieta hipergrasa podría permitir una expansión inicialmente
más rápida del tejido adiposo, con el fin de evitar lipotoxicidad.
Curiosamente, nuestros resultados indican un aumento en los niveles de resistina tras
la suplementación con 2-hidroxioléico, siendo similares a los obtenidos en el estudio de Catta-
Preta y colaboradores, que también determinaron altos niveles de esta proteína en ratones
alimentados con una dieta rica en AGMI (Catta-Preta y col., 2012).
140
Otro estudio, sin embargo, mostró que la dieta mediterránea, incluyendo importantes
cantidades de AGMI y AGPI, no cambió el nivel de resistina sérica entre los adultos obesos
(Cabrera de León y col., 2014). Faltan resultados suficientes en la bibliografía para sacar
conclusiones más claras.
Con respecto a la suplementación con AGPI n-3, observamos que, si bien se produjo
una recuperación parcial en la secreción basal de resistina, los niveles de secreción estimulada
por LPS fueron más bajos que en grupo control, y de proporciones similares a los del grupo
DO. Se ha sugerido que el EPA puede promover una pequeña reducción en la expresión del
ARNm de resistina en adipocitos murinos (Haugen y col., 2005). Así mismo, en ratas con
esteatohepatitis no alcohólica, la concentración de resistina se redujo en 8 semanas con una
dieta rica en AGPI n-3 (Wen y col., 2014). El posible mecanismo subyacente al impacto de los
AGPI n-3 sobre los niveles de resistina puede explicarse parcialmente por la relación de EPA,
DHA y resistina con el PPARγ, un tipo de receptores nucleares expresado principalmente en el
tejido adiposo, colon y macrófagos, y que regula el almacenamiento de ácidos grasos, la
diferenciación celular y el metabolismo energético (Fajas y col., 1997). Se ha sugerido que la
activación de PPARγ puede verse afectada por la concentración sérica de EPA y DHA (Han y
col., 2014), y el PPARγ a su vez puede influir en la secreción de adipoquinas (Neschen y col.,
2006). También se ha demostrado que la expresión del gen resistina se potencia mediante la
sobreexpresión de PPARγ (Way y col., 2001, Steppan y col., 2001, Patel y col., 2003).
Respecto de las citoquinas y las moléculas de adhesión, ningún tratamiento en nuestro
estudio tuvo un impacto significativo, ya fuera en adipocitos o en plasma. Los mecanismos
precisos que enlazan la inflamación con la obesidad y complicaciones asociadas permanecen
todavía sin establecer completamente (Weiss y Caprio, 2005; Pérez de Heredia y col., 2012). A
medida que la obesidad se desarrolla, en el tejido adiposo se infiltran numerosos macrófagos
activados, lo que conduce a la producción aumentada de diversos factores pro-inflamatorios,
como TNF-α, IL-6, MCP-1 y PAI-1 (Shoelson y col., 2007). Los mecanismos moleculares que
subyacen en el reclutamiento de macrófagos en el tejido adiposo no se comprenden
claramente, aunque sabemos que los ácidos grasos libres activan la vía del factor nuclear
kappa B (NF-κB) a través de TNF-α, el receptor de la IL-6 y el receptor tipo toll (TLR)-4.
141
La vía NF-κB desempeña un papel de puente entre la inmunidad innata y el metabolismo
(Schaffler y Scholmerich, 2010; Majdalawieh y Ro, 2010). Las citoquinas inflamatorias IL-6, IL-
1β y TNF-α están implicadas en la regulación del metabolismo y la ingesta de alimentos,
modulando la acción de la insulina y la liberación de leptina en el tejido adiposo, y estos efectos
pueden potenciarse mediante el polimorfismo del gen receptor-2 del TNF-α, que está asociado
con la resistencia a la leptina y la obesidad (Das 2001; Engström y col., 2003). Por lo tanto, se
cree que se establece un círculo vicioso entre la obesidad y la inflamación inducida por
cambios en el tejido adiposo (Oliveira y Bressan, 2010).
Con respecto a las moléculas de adhesión, pueden estar elevadas en individuos
obesos (Ouchi y col., 1999; Pontiroli y col., 2004; Couillard y col., 2005; Gomes y col., 2010),
aunque no en todos los casos (Matsumoto y col., 2002). A este respecto, los estudios que
vinculan estas moléculas y los marcadores antropométricos de la obesidad siguen siendo
controvertidos e inconclusos (Demerath y col., 2001; Miller y col., 2003; Ponthieux y col., 2004).
El alto consumo de grasas saturadas y un patrón dietético occidental se han asociado con
mayores concentraciones de las mismas (Lima y col., 2014). La sE-selectina, que regula las
interacciones entre las células sanguíneas y el endotelio activado, se ha relacionado con
hipercolesterolemia (Hackman y col., 1996), hipertensión (Ferri y col., 1999) y marcadores de
aterosclerosis y obesidad (Ito y col., 2002; Desideri y col., 2005).
Estudios in vitro e in vivo han arrojado luz sobre el efecto inflamatorio de los AGS
(Ajuwon y Spurlock, 2005; Bradley y col., 2008; Wang y col., 2013), y se ha visto que una
ingesta alta en grasa puede provocar inflamación de bajo grado (Aljada y col., 2004; Jackson y
col., 2005). No todos los estudios han demostrado tales efectos de forma consistente, ya que
otros trabajos muestran efectos nulos sobre de la grasa de la dieta sobre los niveles de
citoquinas (Manning y col., 2008; van Dijk y col., 2012; Teng y col., 2014).
En general, las dietas que contienen AGMI están relacionadas con la supresión de la
producción de citoquinas (Puertollano y col., 2007). Otros trabajos no han encontrado efectos
de los AGMI sobre las citoquinas con actividad pro-inflamatoria tales como TNF-α o IL-6 (de
Pablo 1998b).
142
Se ha observado que el ácido oleico no estimula los procesos inflamatorios (Baer y col., 2004).
Dado que nuestro estudio es el primero que ha evaluado los efectos aislados del 2-
hidroxioléico en las moléculas de adhesión, se desconoce si diferentes dosis o duraciones del
tratamiento podrían conducir a efectos adicionales en los niveles de las moléculas de adhesión
celular y las citoquinas en general. Los posibles efectos de la ingesta de AGMI en el desarrollo
de patologías crónicas prevalentes, como las enfermedades cardiovasculares, siguen sin estar
claros y el principal motivo es que los estudios que más apoyan los efectos saludables de los
AGMI se han llevado a cabo en el contexto de un patrón alimentario como la dieta
mediterránea, por lo que es imposible atribuir los efectos observados a un macronutriente
exclusivamente (Ros y col., 2015).
La evidencia hasta la fecha sugiere que tampoco hay un efecto beneficioso claro del
consumo de AGPI sobre las citoquinas inflamatorias (Molvig y col., 1991; Cooper y col., 1993;
Cannon y col., 1995; Schmidt y col., 1996; Yaqoob y col., 2000; Thies y col., 2001; Wallace y
col., 2003; Aguilera y col., 2004; Jellema y col., 2004; Kew y col., 2004; Miles y col., 2004; Teng
y col., 2014), o las moléculas de adhesión (Hansen y col., 2000; Kew 2003; Miles 2004; Pot y
col., 2009). Los AGPI n-3 podrían prevenir la inflamación del tejido adiposo por interferir
predominantemente con la función de los adipocitos. Podría especularse que los AGPI n-3
normalizan su metabolismo, lo que previene la expresión de las citoquinas pro-inflamatorias
(Wellen y Hotamisligil, 2005), por mecanismos aún no conocidos. Los resultados acerca del
efecto de los AGPI n-3 sobre el sistema inmune han sido contradictorios, debido a la dificultad
a la hora de diseñar estudios adecuados (Yaqoob 2003). Además, el equilibrio ideal entre EPA
y DHA puede jugar un papel crítico, ya que la evidencia sugiere que EPA puede ser más anti-
inflamatorio que DHA (Sijben y Calder, 2007; Lin y col., 2010). El efecto beneficioso de los
AGPI n-3 sí se ha mostrado evidente en pacientes con obesidad grave (IMC ≥ 40 kg/m2) (Teng
y col., 2014).
143
4. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE LOS PARÁMETROS DE ESTRÉS
OXIDATIVO
La obesidad se asocia a una función inmune deteriorada, vinculada a un estado de inflamación
crónica y un marcado estrés oxidativo (EO) (Keaney y col., 2003; Dandona y col., 2004;
Furukawa y col., 2004; Vincent y col., 2004; Vincent y col., 2005; Vincent y Taylor, 2006; Rath y
Haller, 2011; De la Fuente y De Castro, 2012; Giménez-Llort y col., 2012; De Tursi Rispoli,
2013; De la Fuente 2014; Maté y col., 2015). El EO puede ser el mecanismo de enlace entre la
obesidad y las enfermedades relacionadas (Higdon y Frei, 2003; Morrow 2003). Además, el EO
se ha propuesto como un biomarcador de edad biológica y envejecimiento (De la Fuente y
Miquel, 2009; Pandey y Rizvy, 2010; De la Fuente 2014).
El tipo de grasa de la dieta tiene la capacidad de modular el EO (Camargo y col., 2010;
Pérez-Martínez y col., 2010; Meneses y col., 2011; Cruz-Teno y col., 2012). En el presente
trabajo de investigación se aporta información nueva acerca del efecto de la grasa de la dieta
sobre el EO a nivel esplénico, ya que observamos mayores niveles de GSSG, GSSG/GSH,
peroxidación lipídica y actividad XO en los animales alimentados con la DO. Nuestros
resultados coinciden con estudios previos realizados en otros órganos y/o especies (Capel y
Dorrell, 1984; Kolesnikova y col., 2013; Hunsche y col., 2016).
El sistema GSH es cuantitativamente la defensa antioxidante endógena más importante
(Abilés y col., 2008), y niveles intracelulares óptimos de GSH son esenciales para generar y
mantener una respuesta inmunitaria apropiada (Meydani y col., 1995). Los estudios sobre
envejecimiento, además, describen una disminución de los niveles de GSH con la edad, en el
bazo (Furukawa y col., 1987; Bolzan y col., 1995; Zhang y col., 2011) y en otros órganos y
células inmunitarios (Jones y col., 2002; Rebrin y Sohal, 2004; De la Fuente y col., 2004b).
Nuestros resultados no mostraron ningún cambio en los niveles de GSH en este órgano
linfoide, pero sí un aumento del GSSG y del cociente GSSG/GSH. En la actualidad, este
cociente se considera un buen indicador del grado de EO intracelular (Pastore y col., 2003), y
su aumento se ha asociado con la DM2, y por lo tanto puede ser un marcador de salud útil en
la evaluación de comorbilidades relacionadas con la obesidad (Lee y col., 2008).
144
El aumento del cociente GSSG/GSH está también relacionado con la expresión de genes
implicados en la apoptosis, lo que puede contribuir a la arteriosclerosis, característica de los
pacientes con obesidad abdominal (Jones 2002).
Los niveles de MDA mostraron una tendencia al alza en los animales alimentados con
DO en nuestro estudio. La descomposición de los peróxidos lipídicos conduce a un mayor nivel
de MDA y una disminución de antioxidantes, lo que resulta en un mayor EO y potencial daño
oxidativo (Chen y Zhou, 2001; Xie y col., 2002; Zhou y col., 2002; Wang y col., 2004; Zhou y
col., 2005). Los RL y los biomarcadores de peroxidación lipídica entran en la circulación
sistémica e inician un círculo vicioso de EO sistémico en la obesidad (Furukawa y col., 2004).
Efectivamente, el MDA se ha visto incrementado en personas obesas (Van Gaal y col., 1998;
Prazny y col., 1999; Blakely y col., 2003; Yesilbursa y col., 2005; Mohora y col., 2006), en
pacientes con síndrome metabólico (Karaman y col., 2015), y en pacientes hipertensos (Redon
y col., 2003; Kashyap y col., 2005), y se ha descrito que después de someterse a restricción
calórica, los niveles de MDA disminuyen en pacientes obesos (Mohn y col., 2005; Crujeiras y
col., 2006). Así mismo, se ha detectado peroxidación lipídica elevada en el plasma de
pacientes con angina de pecho (Mendis y col., 1995) y enfermedades de las arterias coronarias
(Sakuma y col., 1997), y se sabe que la peroxidación lipídica aumenta también con el
envejecimiento (Kiray y col., 2007, Viveros y col., 2007, Alvarado y col., 2006).
En el presente trabajo también se encontró que la actividad XO fue mayor en el grupo
DO que en el grupo control, lo que puede contribuir al daño oxidativo, ya que la enzima emplea
como sustrato el oxígeno y genera en consecuencia radicales libres como el anión superóxido
y peróxido de hidrógeno (De la Fuente y Miquel, 2009; Batelli y col., 2014; De la Fuente 2014;
Hunsche y col., 2015). Otros estudios en roedores han puesto de manifiesto incrementos
similares de la actividad XO en otros órganos, como el timo de ratas obesas y peritoneo de
ratones obesos (De la Fuente y De Castro, 2012; Hunsche y col., 2015; Hunche y col., 2017)y
en niños y adolescentes obesos (Chiney y col., 2011; Tam y col., 2014).
145
La enzima XO desempeña un importante papel en el EO asociado a diversas patologías, como
enfermedades cardiovasculares y DM2 (Harrison 2002; Desco y col., 2002; Berry y Hare, 2004;
Harrison 2004; Gibbings y col., 2011), y los ROS generados por la XO presente en macrófagos
y neutrófilos son una fuente importante para la potenciación de procesos inflamatorios en los
tejidos (Grumy col., 1990; Vorbach y col., 2003). Un aumento de la actividad y de la expresión
de la XO en animales y humanos de edad avanzada (Newaz y Adeeb, 1998; Newaz y col.,
2006; Aranda y col., 2007; Arranz y col., 2010) sugiere que esta enzima podría desempeñar un
papel en el envejecimiento fisiológico (Harrison 2002; Labat-Robert y Robert, 2014). De hecho,
la actividad XO aumenta a lo largo de la edad (Vida y col., 2011).
En relación al papel de los ácidos grasos insaturados sobre el estrés oxidativo, en
nuestro estudio constatamos que la suplementación con ácido 2-hidroxioléico redujo tanto los
niveles de GSSG como la relación GSSG/GSH, así como los niveles de MDA, en comparación
con el grupo DO, mientras que la actividad de la enzima XO fue menor en el grupo
suplementado con AGPI n-3 (DO-N3) comparado con el grupo DO.
Los AGPI n-3 han sido estudiados más extensamente en el contexto del EO (Calder y
Grimble, 2002), mientras que se ha prestado menos atención a los efectos de los AGMI,
aunque pueden contribuir a reducirlo (Fitó y col., 2007). Los AGPI son más propensos a la
oxidación, mientras que los AGMI son relativamente resistentes al deterioro por EO
(Cheeseman y Slater, 1993; Fitó y col., 2000). Los lípidos con mayor grado de insaturación son
más susceptibles a reaccionar con el oxígeno, ocasionando pérdida de la fluidez y funciones de
las membranas de las que forman parte, inactivación de los receptores y enzimas unidos a las
membranas, aumento de la permeabilidad iónica y, eventualmente, ruptura de membrana y
muerte celular (Gutteridge y Halliwell, 1990; Gutteridge 1995). Estas características podrían
explicar que el ácido 2-hidroxioléico tiene más eficacia en la reducción del EO, en comparación
con los AGPI n-3.
146
Aunque los estudios son escasos, nuestros resultados están en consonancia con
trabajosanteriores que demuestran que el consumo de aceite de oliva puede favorecer las
defensas antioxidantes mediadas por el sistema del glutatión (De La Cruz y col., 2000), reducir
los niveles de peroxidación lipídica (Pérez-Martínez y col., 2010; El-Kholy y col., 2014;
Musumeci y col., 2014) y mejorar la capacidad antioxidante del plasma (Pitsavos y col., 2005).
Covas y colaboradores (2006) encontraron que el aceite de oliva virgen modulaba
beneficiosamente el equilibrio entre GSH y GSSG. Igualmente, en pacientes con síndrome
metabólico, el consumo de una dieta rica en AGMI mejora la relación GSH/GSSG en
comparación con una dieta rica en AGS (Pérez-Martínez y col., 2010).
Se ha descrito que los niveles de MDA disminuyen tras la suplementación con aceite
de pescado (Songur y col., 2004; Ozen y col., 2008) aunche en nuestro estudio no se
observaron cambios. La literatura científica presenta resultados contradictorios sobre los
efectos de suplementos de aceite de pescado en el estado redox (Yuan y col., 1998; Higdon y
col., 2000; Wander y Du, 2000: Frenoux y col., 2001; Song y Miyazawa, 2001), y en los índices
de peroxidación de lípidos (Meydani y col., 1991; Wander y col., 1996).
En relación con los AGPI n-3 y la actividad XO, se obtuvieron resultados similares en las
células inmunes peritoneales de nuestros ratones (Hunsche y col., 2017). De igual manera,
otros autores vieron disminución de la XO en el hipotálamo de ratas alimentadas con
suplementos de AGPI n-3 (0,4 g / kg / día) durante 30 días (Sarsılmaz y col., 2003). En general,
nuestros hallazgos sugieren que los ácidos EPA y DHA, y el ácido 2-hidroxioléico tienen un
papel en la mejora del estado redox en los ratones obesos (Gheorghe y col., 2017).
147
5. EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS
La nutrición tiene gran importancia en el mantenimiento de la función inmune (Marcos y col.,
2003). Una baja calidad de la dieta, incluso un exceso de determinados nutrientes, puede
incidir negativamente en la respuesta inmunitaria (Walrand y col., 2001). El consumo excesivo
de grasa y la obesidad se asocian con una respuesta inmune disfuncional (Lamas y col., 2004;
Karlsson y col., 2010; De la Fuente y de Castro, 2012; Pérez de Heredia y col., 2012; Sheridan
y col., 2012 Huttunen y Syrjänem, 2013; Hunsche y col., 2016). Recientemente se ha
encontrado que el desarrollo de obesidad en ratones da como resultado características
similares de deterioro del sistema inmunológico a los encontrados en los individuos de edad
avanzada, lo que sugiere un envejecimiento prematuro de los sujetos obesos (De la Fuente y
de Castro, 2012; Hunsche y col., 2015). En nuestro estudio, efectivamente, los ratones obesos
presentaron características típicas de inmunosenescencia prematura (Gheorghe y col., 2017),
tal y como se detallará en esta sección.
A diferencia de los efectos negativos de la ingesta excesiva de calorías y grasa en las
funciones inmunes, cantidades adecuadas de AGMI y AGPI n-3 parecen tener efectos
beneficiosos sobre las funciones inmunes (Padovese y Curi, 2009; Pisani y col., 2009;
Rodrigues y col., 2010; Paschoal y col., 2013). Se ha demostrado que los AGMI y los AGPI n-3
muestran acciones anti-inflamatorias capaces de modular varias funciones de inmunidad innata
y adaptativa, incluyendo quimiotaxis, actividad natural killer (NK) y la proliferación de células B
y T (Yaqooby col., 1994; De Pablo y col., 1998; Robinson y Field, 1998; Yaqoob y col., 1998;
Padovese y Curi, 2009; Rodrigues y col., 2010; Paschoal y col., 2013; Teague y col., 2013).
En nuestro estudio no observamos cambios significativos en los recuentos de
las subpoblaciones de linfocitos CD3+ (linfocitos T) y CD19+ (linfocitos B) en sangre y bazo con
ninguno de los tratamientos experimentales. Si bien la investigación sobre las relaciones entre
obesidad e inmunidad se ha centrado principalmente en los leucocitos circulantes, los propios
órganos inmunes pueden verse comprometidos. El mayor órgano inmune secundario en los
mamíferos es el bazo; contiene macrófagos, células dendríticas, células plasmáticas y una
cuarta parte de los linfocitos del cuerpo, y participa en varias funciones, como la activación de
células T y B en respuesta a antígenos sanguíneos, la producción de anticuerpos o la
148
eliminación de células apoptóticas circulantes (contribuyendo a la tolerancia inmune periférica)
(Cesta 2006). En el presente estudio se valoraron distintas funciones de las células inmunes
del bazo: la capacidad de quimiotaxis, la actividad NK y la proliferación en respuesta a
mitógenos.
Nuestros datos muestran que todos los grupos alimentados con la dieta
obesogénica presentaron valores más altos de quimiotaxis que el grupo control. La capacidad
de quimiotaxis permite la migración de las células inmunitarias circulantes hacia los tejidos y su
acumulación en sitios de infección o lesión, con el fin de producir una respuesta inflamatoria y
defensiva adecuada (Doherty y col., 1987). Comprender la importancia del aumento de la
quimiotaxis en nuestros ratones obesos requeriría más investigación, ya que la evidencia
disponible no es unánime en este sentido. Por un lado, se ha observado una disminución de la
quimiotaxis en neutrófilos de ratones genéticamente obesos (Kordonowy y col., 2012), así
como en células inmunitarias peritoneales de ratones envejecidos en situación de estrés
oxidativo (de la Fuente y col., 2008; de la Fuente y Miquel, 2009). Por otro lado, se observó un
aumento en los índices quimiotácticos de los linfocitos del bazo en un modelo murino de
Alzheimer, otra condición con un altoestadode estrés oxidativo (Giménez-Llort y col., 2008), y
en células inmunitarias de ratones alimentados con una dieta hipergrasa (Qiao y col., 2009). Se
ha puesto de manifiesto que el consumo alto de grasas induce la activación de la adherencia
celular (Esser y col., 2013), que a su vez está relacionada con el estrés oxidativo (De la Fuente
y Miquel, 2009). El aumento de quimiotaxis observado en nuestro estudio, por lo tanto, es
probable que esté relacionado con el estado de estrés oxidativo de los ratones obesos. Es
importante destacar que los cambios en la función quimiotáctica pueden depender del tipo de
células y órganos inmunológicos analizados
La dieta mediterránea modula la respuesta inmune y ejerce propiedades anti-
inflamatorias (Minich y Bland, 2008). Esto puede deberse en gran parte a su alto contenido en
AGMI n-9 y AGPI n-3, que han demostrado acciones inmunomoduladoras (de Pablo y col.,
1998; Padovese y Curi, 2009; Paschoal y col., 2013).
149
En nuestro trabajo, la suplementación con 2-hidroxioléico, pero no con AGPI n-3, fue capaz de
prevenir o revertir parcialmente el aumento del índice de quimiotaxis asociado con la obesidad.
De acuerdo con nuestros hallazgos, estudios previos han reportado ausencia de efecto de
AGPI n-3 sobre la quimiotaxis de neutrófilos (Schmidt y col., 1996; Healy y col., 2000; Hill y col.,
2007), aunque otros autores sí observaron una quimiotaxis neutrofílica disminuida en respuesta
a estos ácidos grasos (Leey col., 1985, Luostarine y col., 1992, Sperling y col., 1993). En
relación con la suplementación con 2-hidroxioléico, nuestro estudio es, hasta donde sabemos,
el primero en presentar una mejora significativa de los cambios relacionados con la obesidad
en la quimiotaxis de leucocitos de bazo.
En relación a la citotoxicidad de las células NK, nuestros resultados indican una menor
actividad en todos los grupos alimentados con la dieta obesogénica. Estudios previos en
animales sometidos a dietas hipergrasas, así como estudios en humanos, han descrito también
una disminución de la misma (Morrow y col., 1985; Lamas y col., 2004; O 'Shea y col., 2010;
De la Fuente y de Castro, 2012). Las células NK constituyen la línea defensiva más importante
contra células malignas e infectadas por virus (MacArthur 1998); por lo tanto, una disminución
de su actividad puede hacer que los animales presenten una mayor susceptibilidad a
infecciones y tumores. Curiosamente, se han observado cambios similares en la actividad NK
en animales viejos y envejecidos prematuramente (Alvarado y col., 2006; Viveros y col., 2007;
de la Fuente y Miquel, 2009).
Ni la suplementación con 2-hidroxioléico ni la suplementación con AGPI n-3 consiguió
mejorarla actividad NK, en línea con resultados previos (Berger y col., 1993; Yaqoob y col.,
1998; Yaqoob y col., 2000). Los efectos de los ácidos grasos sobre la actividad de las células
NK son aún poco claros. Dado que los suplementos de ácidos grasos utilizados en nuestro
estudio se mostraron eficaces en la recuperación del estado de EO de los animales, podríamos
especular que los cambios en la actividad NK en nuestros ratones no estuvieron directamente
relacionados con dicho estado oxidativo, sino con otras alteraciones asociadas con la obesidad
y/o el alto consumo de grasa.
150
Finalmente, nuestros resultados muestran que la capacidad linfoproliferativa en condiciones
basales fue similar en todos los grupos experimentales, lo que en principio es coherente con la
ausencia de cambios en los recuentos celulares mencionada anteriormente. En los animales
obesos disminuyó la capacidad linfoproliferativa en respuesta a la estimulación con ConA,
aunque no con LPS. ConA es un mitógeno de células T, mientras que el LPS actúa como un
mitógeno de células B; estas diferencias en la acción de los mitógenos podrían explicar por qué
la dieta obesogénica no afectó la proliferación en todas las condiciones, y sugieren en su lugar
que la obesidad afecta específicamente a ciertos tipos de células inmunes, tal y como se ha
observado en otros trabajos (Pérez de Heredia y col., 2015). Este hecho coincide con
resultados obtenidos en otros estudios en leucocitos de bazo y peritoneo de ratas
genéticamente obesas (De la Fuente y De Castro, 2012). Nuestros resultados podrían sugerir
que la obesidad y/o la dieta obesogénica no afectaron la capacidad de proliferación basal de
los linfocitos per se, pero podrían haber comprometido la capacidad del bazo para responder a
un ataque al no poder aumentar la población de linfocitos T específicamente. Por otra parte,
teniendo en cuenta que la capacidad proliferativa se deteriora significativamente con la edad
(De la Fuente y col., 2004; De la Fuente y Miquel, 2009), nuestros resultados apoyanuna vez
más la idea de que los animales obesos presentan inmunosenescencia prematura (Guayerbas
y de la Fuente, 2003). Se ha propuesto que la disminución de la respuesta linfoproliferativa en
ratas obesas puede ser, en parte, debida a la disminución de la captación de glucosa, la
principal fuente de energía para la proliferación de los linfocitos, ya que las ratas obesas
parecen tener una menor expresión del transportador de glucosa 1 (GLUT-1) en las
membranas de las células inmunitarias (Moriguchi y col., 1998).
En nuestros animales, la suplementación con 2-hidroxioléico consiguió restaurar los niveles de
linfoproliferación en respuesta a ConA, y también dio como resultado una mayor proliferación
en respuesta a la estimulación con LPS, mientras que la suplementación con AGPI n-3 no
afectó significativamente la capacidad proliferativa en ninguna condición experimental.
151
Los efectos de EPA y DHA sobre la proliferación de linfocitos ex vivo de sujetos sanos han sido
publicados en diferentes publicaciones, sin resultados significativos en algunosde ellos (Sijben
y Calder 2007); otros autores, por el contrario, han encontrado que los AGPI n-3 pueden
reducir la proliferación de los linfocitos in vitro (Peterson y col, 1998).
También en contraposición a nuestros resultados, otros estudios han mostrado una menor
respuesta linfoproliferativa inducida por AGMI, cuando se comparan con otros tipos de grasa
(De Pablo y col., 1998), e incluso una inhibición de la proliferación de linfocitos con
suplementos de AGMI (Yaqoob y col., 1994), mientras que otros trabajos no han mostrado
cambios (Yaqoob y col., 1998). Es posible que estos resultados contradictorios pudieran estar
relacionados con las dosis de los diferentes suplementos.
A este respecto, un estudio encontró que dosis bajas (25 μM) de ácido oleico pueden
aumentar la proliferación de linfocitos, mientras que concentraciones más altas (75 μM y 100
μM) podrían resultar en la inhibición de la proliferación a través de un aumento de la apoptosis
(Gorjão y col., 2007). Se necesita seguir investigando para confirmar los efectos de los
tratamientos con ácidos grasos insaturados en la modulación de la proliferación de los
leucocitos del bazo. Sí parece claro que nuestros animales presentaron alteraciones en las
funciones inmunológicas estudiadas similares a las observadas en estudios de envejecimiento.
Este hecho junto con los resultados del EO, sugiere un envejecimiento prematuro relacionado
con la obesidad y la alimentación alta en grasa.
CONCLUSIONES
153
VI. CONCLUSIONES
1. Los animales que ingirieron la dieta rica en grasa aumentaron significativamente su
pesoy grasa corporales, siendo el dicho incremento especialmente marcado en las
áreas abdominal y periovárica.
2. Los animales que recibieron el tratamiento con ácido 2-hidroxioléico experimentaron
una reducción significativa de peso y grasa corporal, y superior a la observada con el
tratamiento con los AGPI n-3.
3. Los animales obesos presentaron valores más altos de tensión arterial y
concentraciones plasmáticas de triglicéridos que los controles.
4. El tratamiento con ácido 2-hidroxioléico redujo la tensión arterial y los triglicéridos
plasmáticos, incluso por debajo de los valores del grupo control.
5. La inducción dietética de obesidad se acompañó de valores más altos de leptina
plasmática, menor secreción de adiponectina estimulada por LPS, menor secreción de
resistina, basal y estimulada por LPS, y menor secreción basal de MCP-1 en adipocitos
aislados en cultivo.
6. El tratamiento con ácido 2-hidroxioléico revertió el aumento de la leptina circulante y
restauró parcialmente la secreción de adiponectina, resistina y MCP-1, mientras que el
tratamiento con AGPI n-3 revertió parcialmente la secreción basal de resistina y la
secreción estimulada de adiponectina.
7. La inducción temprana de la obesidad dietética condujo a un aumento del estrés
oxidativo y al deterioro de la función leucocitaria en el bazo, sugieriendo
inmunosenescencia prematura.
8. La suplementación con 2-hidroxioléico, y en menor medida con AGPI n-3, fue capaz de
reducir el grado de estrés oxidativo, así como la alteración de las funciones
leucocitarias estudiadas.
9. El ácido 2-hidroxioléico muestra un potencial preventivo y terapéutico frente al
desarrollo de la obesidad y alteraciones asociadas, tales como hipertensión, estrés
oxidativo y disfunción immunológica.
BIBLIOGRAFIA
155
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ANEXOS
255
ANEXO 1: Mujico JR, Baccan GC, Gheorghe A, Díaz LE, Marcos A (2013). Changes in gut
microbiota due to supplemented fatty acids in diet-induced obese mice. British Journal of
Nutrition.110:711-20.
Changes in gut microbiota due to supplemented fatty acids in diet-inducedobese mice
Jorge R. Mujico1*, Gyselle C. Baccan2, Alina Gheorghe1, Ligia E. Dıaz1 and Ascension Marcos1
1Institute of Food Science, Technology and Nutrition (ICTAN-CSIC), C/Jose Antonio Novais 10, 28040 Madrid, Spain2Institute of Health Sciences, Federal University of Bahia, Salvador, Brazil
(Submitted 17 May 2012 – Final revision received 12 November 2012 – Accepted 14 November 2012 – First published online 10 January 2013)
Abstract
Consumption of a high-fat diet (HFD), which is associated with chronic ‘low-grade’ systemic inflammation, alters the gut microbiota (GM).
The aim of the present study was to investigate the ability of an oleic acid-derived compound (S1) and a combination of n-3 fatty acids
(EPA and DHA, S2) to modulate both body weight and the GM in HFD-induced obese mice. A total of eighty mice were fed either a control
diet or a HFD, non-supplemented or supplemented with S1 or S2. At week 19, faeces were collected in order to analyse the GM. Group-
specific primers for accurate quantification of several major bacterial groups from faecal samples were assayed using quantitative PCR. The
HFD induced an increase in body weight, which was reduced by supplementation with S1. Furthermore, S1 supplementation markedly
increased total bacterial density and restored the proportions of bacteria that were increased (i.e. clostridial cluster XIVa and Enterobacter-
iales) or decreased (i.e. Bifidobacterium spp.) during HFD feeding. S2 supplementation significantly increased the quantities of Firmicutes
(especially the Lactobacillus group). Correlation analysis revealed that body weight correlated positively with the phylum Firmicutes and
clostridial cluster XIVa, and negatively with the phylum Bacteroidetes. In conclusion, the consumption of a HFD induced changes in the
faecal microbiota, which were associated with the appearance of an obese phenotype. Supplementation of the HFD with S1 counteracted
HFD-induced gut dysbiosis, together with an improvement in body weight. These data support a role for certain fatty acids as interesting
nutrients related to obesity prevention.
Key words: Gut microbiota: Fatty acids: Obese mice: Quantitative PCR
The worldwide prevalence of overweight and obesity has
increased dramatically in the past decades, reaching epidemic
levels(1). It is well known that a high-fat diet (HFD) leads,
especially in genetically predisposed individuals, to an
accumulation of adipose tissue(2) and to the development of
a cluster of metabolic and cardiovascular disorders such as
type 2 diabetes, atherosclerosis, hypertension and stroke(3).
The gut microbiota (GM) has an important role in supplying
nutrients and vitamins, giving colonisation resistance against
pathogenic bacteria and interacting with the host immune
system and intestinal epithelium(4). The possible involvement
of the host genotype, particularly as it relates to immunophe-
notype, has been frequently postulated as a major influence
on GM composition and stability. Other variables known to
broadly influence the composition of the GM include the
type of delivery (vaginal or caesarean), age, the use of anti-
biotics and other drugs, and ‘lifestyle’ (such as diet, physical
activity and stress)(5–9). The significance of the protective
role of the GM has been highlighted by the profound impact
seen when the GM is absent or disrupted. Germ-free mice
have poorly developed mucosal architecture and rudimentary
development of the mucosa-associated lymphoid tissue, being
generally small and underweight, and also highly susceptible
to intestinal infection(10).
In obese patients, there is a significant change in the
composition of the GM compared with lean controls(11,12),
and, in rats, these modifications can be induced by the
ingestion of a HFD(13). Furthermore, host nutritional status
may be markedly influenced by the composition and activities
of the GM since the Bacteroidetes:Firmicutes ratio seems to be
decreased in obese individuals and genetically obese mice
harbour an ‘obese microbiome’, with a transferable elevated
capacity for energy sequestration(14).
Given the important role of the GM in association with
obesity, several studies have focused on the hypothesis
that the onset of obesity may be influenced by targeted
modification of the GM by specific nutrients. Indeed, the
decrease in bifidobacteria occurring in obese mice fed with
*Corresponding author: Dr J. R. Mujico, fax þ34 915493627, email [email protected]
Abbreviations: CD, control diet; GM, gut microbiota; HFD, high-fat diet; HFD-S1, high-fat diet supplemented with an oleic acid-derived compound; HFD-S2,
high-fat diet in combination with n-3 fatty acids; qPCR, quantitative PCR.
British Journal of Nutrition (2013), 110, 711–720 doi:10.1017/S0007114512005612q The Authors 2012
British
Journal
ofNutrition
a HFD(15,16) was counteracted through the administration
of non-digestible oligosaccharides such as inulin-type
fructans(17).
The Mediterranean diet has been related to lower rates of
obesity(18,19). In this diet, there is a high consumption of
olive oil, which contains the MUFA oleic acid, and fish, a
rich source (especially oily fish) of n-3 PUFA. Some authors
have described the effects of oleic acid and others unsaturated
fatty acids on body weight in human and experimental
models. Vogler et al.(20) evaluated the actions of C18 fatty
acids on the body weight of rats and found that oleic acid
could lead to a reduction in adipose tissue mass. In the
same study, the authors showed that 2-hydroxyoleic acid,
a synthetic derivative of oleic acid, promoted a drastic
decrease in the body weight of the treated rats(20). Moreover,
supplementation with long-chain PUFA, notably EPA and
DHA, can attenuate weight gain and reduce body fat in
rodents, particularly epididymal (visceral) fat(21). It has been
hypothesised that these fatty acids could exert their effects
by promoting changes in GM.
The aim of the present study was to evaluate the effect of a
HFD, supplemented or not with fatty acids frequently found in
the Mediterranean diet (such as oleic acid and n-3 fatty acids),
on body weight in a mouse model, and to relate that effect to
the changes in the faecal microbiota composition.
Materials and methods
Animals
A total of eighty female ICR (CD-1w) outbred mice (8 weeks
old at the beginning of the study; Harlan Laboratories) were
housed in groups of 6 ( ^ 2) animals per cage (polyurethane
boxes) and maintained at a constant temperature (22 ^ 28C)
in a controlled environment (12 h light–12 h dark cycle,
lights off at 18.00 hours), with free access to food and water.
Mice were specifically pathogen-free as tested by Harlan and
according to the Federation of European Laboratory Science
Associations recommendations. Mice were treated according
to the guidelines of the European Community Council
Directives (86/6091 EEC) as well as to the Spanish laws
about protection of animals. The experiments were performed
according to the institutional guidelines and were approved
by the Complutense University Ethical Committee for Animal
Experimentation.
Diet intervention
During the acclimatisation period (for their adaptation to
their new location), all mice were fed with a maintenance
diet (Teklad Global 14 % Protein Rodent Maintenance Diet,
reference 2014; Harlan Laboratories). At week 4, mice were
separated into four groups (three cages per group: cage A,
n 8; cage B, n 6; cage C, n 6) as follows:
(1) The control diet (CD) group continued with the mainten-
ance diet until the end of the study.
(2) The HFD group received a HFD (Adjusted Calories Diet
60/Fat, reference TD.06 414; Harlan Laboratories) until
the end of the study.
(3) The HFD-supplementation 1 (S1) group was fed for 8
weeks with the HFD, and for another 7 weeks with the
same HFD supplemented with an oleic acid-derived
compound (1500 mg/kg per d; BTSA-Biotecnologıas
Aplicadas S.L.).
(4) The HFD-S2 group was fed for 8 weeks with the HFD, and
for another 7 weeks with the same HFD supplemented
with a combination of n-3 fatty acids (EPA and DHA,
3000 mg/kg per d; BTSA-Biotecnologıas Aplicadas S.L.).
The full composition of both the maintenance diet and the
HFD is given in Table 1. The energy content of the mainten-
ance diet consisted of 67·3 % carbohydrate, 20·1 % protein,
12·6 % fat and 22·1 % fibre; meanwhile the HFD consisted of
21·3 % carbohydrate, 18·4 % protein, 60·3 % fat and 6·5 %
fibre. Body weight and food intake (monitored by weighing
the food provided and left uneaten, and taking into account
spillage) were recorded twice per week.
Faecal microbiota analysis
Extraction and purification of DNA from faecal samples. At
the end of the study (week 19), faeces from every cage
were collected and stored at 2808C. For analysis of the
microbial community composition, DNA was extracted from
the frozen faecal samples (cages B and C), using the
QIAampw DNA Stool Mini Kit (QIAGEN GmbH), according
to the manufacturer’s instructions, using the optional high-
temperature step (at 958C). The faecal samples were thawed
on ice; for each extraction, 471–955 mg of faeces were
weighed and diluted to 100 mg/ml with stool lysis buffer.
At the end, DNA was eluted in 200ml of elution buffer and
stored at 2208C until use.
The concentrations of the extracted DNA were determined
by a fluorometric method based on the fluorochrome
Hoechst 33 258 (Fluorescent DNA Quantification Kit; Bio-
Rad), which is fluorescent when bound to double-stranded
DNA. The measurements were performed using the Synergy
Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader
(Biotek Instruments) with an excitation wavelength of
360 nm and an emission wavelength of 460 nm. Data analysis
Table 1. Composition of the diets
Maintenance diet High-fat diet
Carbohydrate (%) 48·0 27·3Protein (%) 14·3 23·5Fat (%) 4·0 34·3
Saturated (%) 0·7 12·7Monounsaturated (%) 0·8 16·1Polyunsaturated (%) 2·5 5·5
Fibre (%) 22·1 6·5Soluble (%) 4·1 –Insoluble (%) 18·0 6·5
Energy density (kJ/g) 12·1 21·4Energy from carbohydrate (%) 67·3 21·3Energy from protein (%) 20·1 18·4Energy from fat (%) 12·6 60·3
J. R. Mujico et al.712
British
Journal
ofNutrition
was performed using Gen5 Software (version 1.10.8), also
supplied by Biotek Instruments.
Primers. The abundance of specific intestinal bacterial
groups was measured by quantitative PCR (qPCR) with
group-specific 16S rRNA gene primers (Isogen; Table 2). A
short segment of the 16S rRNA gene (200 bp) was specifically
amplified by qPCR, using a conserved 16S rRNA-specific
primer pair (Table 2), to determine the total amount of com-
mensal bacteria in the faeces (the so-called ‘Eubacteria/Pan-
bacteria’ group). Using the same genomic DNA from each
sample, qPCR were completed using group-specific primers
to determine the amount of bacteria in each of the following
major groups: (1) the phylum Firmicutes, the first quantitat-
ively dominant phylum in mouse faeces, which contains the
cell wall-less mycoplasmas (class Mollicutes) and the low
G þ C Gram-positive bacteria (classes Clostridia and Bacilli);
(2) clostridial cluster XIVa (the largest group of the class
Clostridia); (3) the group Lactobacillus (the so-called lactic
acid bacteria, the largest group of the order Lactobacillales,
from the class Bacilli); (4) the Gram-negative phylum
Bacteroidetes, the second quantitatively dominant phylum in
mouse faeces; (5) the order Enterobacteriales (from the
Gram-negative phylum Proteobacteria); (6) Bifidobacterium
spp. (from the high G þ C Gram-positive phylum Actino-
bacteria), one of the major genera of bacteria that make up
the colon microbiota in mice.
Quantitative PCR amplification of 16S rRNA gene
sequences. Faecal DNA samples from the four treatment
groups (n 2 animals per group) were subjected to qPCR,
which were performed to study the effect of the HFD (alone
or in combination with supplementations S1 and S2) on the
composition of the intestinal microbial community. qPCR
experiments were carried out with a Stratagene Mx3000P
(Agilent Technologies), using Mx3000Pw ninety-six-well non-
skirted PCR plates (Agilent Technologies) covered with PCR
adhesive films (Eppendorf AG). Analyses were performed in
duplicate and mean values were calculated. Each qPCR, with
a final volume of 20ml, was composed of 10ml of 2 £ Brilliant
III Ultra-Fast SYBRw Green QPCR Master Mix (Agilent Tech-
nologies), 2ml of 2mM forward primer, 2ml of 2mM reverse
primer, 0·3ml of the diluted reference dye ROX (30 nM final
concentration), 3·7ml of nuclease-free PCR-grade water and
2ml of either an optimised dilution of 1:500 of extracted tem-
plate DNA for specimen analysis or a serial dilution series of
bacterial reference genomic DNA for standard curves. All reac-
tions were paralleled by a non-template control analysis. The
amplification programme started with an initial step of 3 min at
958C, followed by thirty cycles of 15 s at 958C and 20 s at 608C.
Data were acquired in the final step at 608C.
Melt curve analysis was carried out after each qPCR assay to
distinguish the fluorescence signal obtained from the specific
amplification product from artifacts such as primer-dimers.
Melting curves were obtained by slow heating from 55 to
958C, with fluorescence measurements taken at every 18C
increase in temperature.
Data analysis was performed using MxPro–Mx3000P soft-
ware (version 4.10; Agilent Technologies). In ‘analysis term
settings’ amplification-based threshold fluorescence and
adaptive baseline correction were selected.
Preparation of PCR standards and quantification of target
bacterial DNA in faecal samples by quantitative PCR.
Standard curves for individual qPCR assays were used for
the quantification of target bacterial DNA (in relative units)
from faecal DNA preparations. The standard curves were gen-
erated using duplicate 2-fold dilutions of the DNA extracted
from the faeces of one of the cages of the CD group (cage
A, week 6). At least five non-zero standard dilutions were
used in each assay. The same amount of all faecal DNA
samples (1000 or 100 pg) was amplified by the qPCR assays,
so that the threshold cycle (CT) values were always inside
the range of the standard curves. No positive signals were
generated within the standard curves in these assays by
non-template control.
Statistical analysis
Statistical analysis was performed using GraphPad Prism
Software for Windows OS (version 5.04; Graphpad Software).
Statistically significant differences in body weight and DNA con-
tent between the four treatment groups were determined by the
non-parametric Kruskal–Wallis test, with Dunn’s multiple com-
parison post-test. Correlations between body weight and DNA
Table 2. Primers used for bacterial quantification by quantitative PCR
Bacterial group Oligonucleotide sequence Amplicon size (bp) Reference
Total bacteria F: 50-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-30 200 36R: 50-ATTACCGCGGCTGCTGG-30
Firmicutes phylum F: 50-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-30 126 36R: 50-AGCTGACGACAACCATGCAC-30
Lactobacillus group F: 50-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-30 341 14R: 50-CACCGCTACACATGGAG-30
Clostridial cluster XIVa F: 50-GCGGTRCGGCAAGTCTGA-30 81 37R: 50-CCTCCGACACTCTAGTMCGAC-30
Enterobacteriales order F: 50-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-30 177 38R: 50-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-30
Bifidobacterium spp. F: 50-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-30 243 14R: 50-RCCACATCCAGCRTCCAC-30
Bacteroidetes phylum F: 50-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-30 126 36R: 50-AGCTGACGACAACCATGCAG-30
F, forward; R, reverse.
Changes in gut microbiota due to fatty acids 713
British
Journal
ofNutrition
content were assessed by the non-parametric Spearman’s corre-
lation test. P,0·05 was considered as statistically significant.
Results
Effect of the high-fat diet on mice weight
After an acclimatisation period of 4 weeks, mice were divided
into four groups: one control group fed with a maintenance
diet (CD group) and three groups fed with a HFD for
8 weeks (HFD, HFD-S1 and HFD-S2 groups). Body weight
increased progressively only in the three groups of mice that
consumed the HFD (Fig. 1(a)). The evolution of weight gain
was statistically different between the control group (CD,
mice fed with the maintenance diet) and the other three
groups (HFD, HFD-S1 and HFD-S2, mice fed with the HFD)
(Fig. 1(b)).
After diet-induced obesity, we evaluated the effect of two
different supplementations on weight gain in obese mice.
We found that S1 supplementation (an oleic acid-derived com-
pound) led to a progressive decrease in body weight
(Fig. 2(a)). This effect could not be explained by changes in
food consumption, since the total food intake was not differ-
ent between the HFD and HFD-S1 groups (data not shown).
S2 supplementation (a combination of n-3 fatty acids) did
not show any effect on mouse body weight or weight gain
(Fig. 2(a) and (b)).
Effect of the high-fat diet on total DNA content in the faeces
Compared with the control group, the HFD (non-sup-
plemented and supplemented with S2) decreased the total
DNA content in the faeces (Fig. 3(a)). However, S1 sup-
plementation was capable of increasing the total DNA content
up to a similar level to that of the control group (Fig. 3(a)).
Although these differences were not statistically significant
(P.0·1), when the total DNA content was plotted against
body weight, a significant negative correlation was observed
(Fig. 3(b)).
Effect of the high-fat diet on faecal microbiota composition
The standard curves had correlation coefficient values
ranging from 0·990 to 0·999 (Table 3). The amplification
efficiencies for the SYBR Green I assays were obtained by
plotting the CT values against the target DNA starting quantity.
Using the formula E ¼ (10(21/slope) 2 1), the efficiencies for
the individual assays ranged from 86·0 to 101·4 % (Table 3).
The fluorescence signal was not detected in the non-template
control during amplification, which indicated that the primer-
dimers were denatured at this temperature and could not con-
tribute to the fluorescence.
At the end of the study (week 19), the faecal levels of total
bacteria, Firmicutes phylum, Lactobacillus group, clostridial
cluster XIVa, Enterobacteriales order, Bifidobacterium spp.
60
50
40
30
20
10
00 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (weeks)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0CD HFD HFD-S1 HFD-S2
** *
Bo
dy
wei
gh
t (g
)
AU
C
HFD/HFD-S1/ HFD-S2
CD
(a) (b)
Fig. 1. (a) Effect of a high-fat diet (HFD) on body weight. Mice were fed for 8 weeks with either a control diet (CD) or a HFD (non-supplemented (HFD), sup-
plemented with an oleic acid-derived compound (HFD-S1) and a combination of n-3 fatty acids (HFD-S2)). Body weight was determined twice per week. Values
are means (cages B and C, n 12), with standard errors represented by vertical bars. (b) The groups’ AUC were compared by the non-parametric Kruskal–Wallis
test, with Dunn’s multiple comparison post-test. * Mean value was significantly different from that of the CD group (P,0·05).
60
50
40
30
20
10
00 1 2 3 4 5 6 7
Time (weeks)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0CD HFD HFD-S1 HFD-S2
*†*†
Bo
dy
wei
gh
t (g
)
AU
C
HFD/HFD-S2
CD
(a) (b)
HFD-S1
Fig. 2. (a) Effect of supplementation with different fatty acids on body weight. Diet-induced obese mice continued with the high-fat diet (HFD) for another 7 weeks,
non-supplemented (HFD) or supplemented with an oleic acid-derived compound (HFD-S1) or a combination of n-3 fatty acids (HFD-S2). Meanwhile, the control
diet (CD) group continued with the maintenance diet. Body weight was determined twice per week. Values are means (cages B and C, n 12), with standard errors
represented by vertical bars. (b) The groups’ AUC were compared by the non-parametric Kruskal–Wallis test, with Dunn’s multiple comparison post-test. * Mean
value was significantly different from that of the CD group (P,0·05). † Mean value was significantly different from that of the HFD-S1 group (P , 0·5).
J. R. Mujico et al.714
British
Journal
ofNutrition
and Bacteroidetes phylum were determined by qPCR (Fig. 4).
The correlations between these levels and body weight were
also calculated (Fig. 5).
Total bacteria. Although not statistically significant, the
administration of the HFD induced an increase in total bacteria
when compared with control mice, an effect that was poten-
tiated by the co-administration of an oleic acid-derived com-
pound (HFD-S1), which significantly increased the total
bacteria (P,0·1; Fig. 4(a)). No correlation was found between
total bacteria and body weight (r 0·0, P¼1·0232; Fig. 5(a)).
Nevertheless, when considering DNA content per mg of
faeces, total bacteria in HFD and HFD-S2 mice were lower
than that in the control mice (data not shown), and a negative
correlation was established between total bacteria and body
weight (r 20·7143, P¼0·0576).
Bacterial groups. When compared with the CD group (fed
with the maintenance diet), the administration of the HFD
induced an increase in all the groups of Firmicutes (the
phylum Firmicutes, the Lactobacillus group and clostridial
cluster XIVa), as well as the order Enterobacteriales
(Fig. 4(b)–(e)), a difference that was statistically significant
only in the last group (P,0·1). Conversely, and although
not statistically significant, Bifidobacterium spp. and the
phylum Bacteroidetes were decreased after the ingestion of
the HFD (Fig. 4(f) and (g)).
HFD-induced microbial community changes were (partially
or completely) counteracted by the supplementation of the
HFD with an oleic acid-derived compound (HFD-S1), as
shown by the modest decrease in the phylum Firmicutes
and the group Lactobacillus (Fig. 4(b) and (c)), the significant
decrease in clostridial cluster XIVa and the order Enterobacter-
iales (Fig. 4(d) and (e)) and the significant increase in
Bifidobacterium spp. and the phylum Bacteroidetes (Fig. 4(f)
and (g)), up to a level even higher than the CD group in the last
group of bacteria.
When compared with the HFD group, supplementation
with a combination of n-3 fatty acids (HFD-S2) did not
change the levels of clostridial cluster XIVa, Bifidobacterium
spp. and the phylum Bacteroidetes (Fig. 4(d), (f) and (g)).
However, S2 supplementation was capable of increasing the
phylum Firmicutes and the group Lactobacillus, compared
with the HFD group (NS) and the CD group (P,0·1;
Fig. 4(b) and (c)). Similarly to S1 supplementation, the
increase in the order Enterobacteriales induced by the HFD
was partially restored by the S2 supplementation (Fig. 4(e)).
Although many of the mentioned differences were not stat-
istically significant (P.0·1), when the quantitative values of
the analysed microbial groups were plotted against body
weight, significant positive correlations were observed with
the phylum Firmicutes (Fig. 5(b)) and clostridial cluster XIVa
(Fig. 5(d)) and a significant negative correlation with the
phylum Bacteroidetes (Fig. 5(g)). No correlations were
found for the Lactobacillus group, the order Enterobacteriales
and Bifidobacterium spp. (Fig. 5(c), (e) and (f)).
14
12
10
8
6
4
2
0CD HFD HFD-S1 HFD-S2 0
(b)(a)
2 4 6 8 10 12 14
Total DNA (ng DNA / mg faeces)
To
tal D
NA
(n
g D
NA
/mg
fae
ces)
80
60
40
20
0
Bo
dy
wei
gh
t (g
)
Fig. 3. Total DNA content and its correlation with body weight. Mice were fed with either a control diet (CD, X) or a high-fat diet (HFD), non-supplemented
(HFD, B) or supplemented with an oleic acid-derived compound (HFD-S1, O) or a combination of n-3 fatty acids (HFD-S2, V). Total DNA content is expressed as
ng DNA/mg faeces. Body weight values (g) are presented as means (cages B and C, n 6 animals per cage), with standard errors represented by vertical bars.
(b) Spearman’s correlation r 20·8810, P¼0·0072, R 2 0·8108.
Table 3. Amplification slopes, efficiencies and correlation coefficients for individualquantitative PCR assays
PCR assay Slope PCR efficiency (%) Correlation coefficient
Total bacteria 23·288 101·4 0·999Firmicutes phylum 23·382 97·6 0·999Lactobacillus group 23·709 86·0 0·999Clostridial cluster XIVa 23·439 95·3 0·999Enterobacteriales order 23·379 97·7 0·990Bifidobacterium spp. 23·613 90·2 0·997Bacteroidetes phylum 23·401 96·9 0·999
Changes in gut microbiota due to fatty acids 715
British
Journal
ofNutrition
Discussion
The HFD used in the present study induced an increase of
body weight and a decrease of total DNA content in the
faeces. Supplementation of the HFD with an oleic acid-derived
compound (HFD-S1) restored both parameters up to similar
levels to that of the control group (Figs. 2(b) and 3(a)).
The GM is a complex ecosystem made up of 500–1000
different bacterial species(22), the majority of which are obli-
gate anaerobes whose investigation by culture-dependent
techniques is laborious and prone to misinterpretation(23).
Recent advances in molecular approaches to the identification
and quantification of bacteria using 16S ribosomal sequences
have significantly advanced our understanding of the GM(24).
qPCR is a powerful advancement of the basic PCR technique,
which has been successfully applied for the quantification of
bacterial DNA in various environments such as faeces, colonic
tissue, rumen, gastric tissue and periodontal samples(25). In the
present study, selected predominant bacteria from mouse
faecal samples were quantified by qPCR, using SYBR Green
I chemistry (Table 2). The DNA isolation and purification pro-
tocol yielded high-quality DNA, which was established by the
fact that increasing the total DNA template amount subjected
to qPCR did not have any inhibitory effect. This facilitates
the detection and quantification of minor subpopulations in
the faeces.
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CD
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CD HFD HFD-S1 HFD-S2
CD HFD HFD-S1 HFD-S2 CD HFD HFD-S1 HFD-S2
CD HFD HFD-S1 HFD-S2 CD HFD HFD-S1 HFD-S2
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Fig. 4. Faecal bacterial content of (a) total bacteria, (b) Firmicutes phylum, (c) Lactobacillus group, (d) clostridial cluster XIVa, (e) Enterobacteriales order, (f) Bifi-
dobacterium spp. and (g) Bacteroidetes phylum. Bacterial quantities are expressed as relative units. Mice were fed with either a control diet (CD, X) or a HFD,
non-supplemented (HFD, B) or supplemented with an oleic acid-derived compound (HFD-S1, O) or a combination of n-3 fatty acids (HFD-S2, V). * Mean value
was significantly different from that of the CD group (P,0·1; Kruskal–Wallis).
J. R. Mujico et al.716
British
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(b) (c)
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Total bacteria (relative units)
Firmicutes phylum (relative units) Lactobacillus group (relative units)
Clostridial cluster XIVa (relative units) Enterobacteriales order (relative units)
Bifidobacterium spp. (relative units) Bacteroidetes phylum (relative units)
Fig. 5. Correlation between body weight and the faecal bacterial content of (a) total bacteria (Spearman’s r 0·0, P¼1·0232 (NS), R 2 0·0329), (b) Firmicutes phy-
lum (Spearman’s r 0·8333, P¼0·0154, R 2 0·7424), (c) Lactobacillus group (Spearman’s r 0·6429, P¼0·0962 (NS), R 2 0·1897), (d) clostridial cluster XIVa (Spear-
man’s r 0·9286, P¼0·0022, R 2 0·5072), (e) Enterobacteriales order (Spearman’s r 0·5952, P¼0·1323 (NS), R 2 0·3643), (f) Bifidobacterium spp. (Spearman’s
r 20·5538, P¼0·1966 (NS), R 2 0·2453) and (g) Bacteroidetes phylum (Spearman’s r 20·7857, P¼0·0279, R 2 0·5678). Mice were fed with either a control diet
(CD, X) or a HFD, non-supplemented (HFD, B) or supplemented with an oleic acid-derived compound (HFD-S1, O) or a combination of n-3 fatty acids (HFD-S2,
V). Bacterial quantities are expressed as relative units. Body weight values (g) are presented as means (cages B and C, n 6 animals per cage), with standard
errors represented by vertical bars.
Changes in gut microbiota due to fatty acids 717
British
Journal
ofNutrition
Animal and human studies have revealed a remarkable
microbial influence on host metabolism, energy utilisation
and storage, and metabolic diseases(26–29). However, this com-
plex ecosystem remains poorly studied; therefore, more
precise monitoring of the gut bacteria is vital for better under-
standing of their contribution to health and disease.
Recently, it has been proposed that alterations in the
composition of the GM (known as dysbiosis) participate in
the development of obesity(30). In the present study, adminis-
tration of a HFD induced a significant increase in the Entero-
bacteriales order (P,0·1; Fig. 4(e)). A bloom in the
g-Proteobacteria class, to which belongs the Enterobacteriales
order, was also observed in the study of Hildebrandt et al.(31).
An increase in the Enterobacteriaceae family within this order
has been associated with gut inflammation; induction of
experimental colitis in rodents was followed by an increase
in this family, suggesting that it may be a consequence of
gut inflammation rather than a cause(32).
More than 90 % of the distal GM of mice and humans is
composed of the Bacteroidetes and Firmicutes phyla(31),
while other members, such as lactic acid bacteria and Proteo-
bacteria, are present in much lower amounts(33). Similar to
previously reported well-defined experiments using in part
even genetically modified animals(34) or strictly controlled
human studies(14,35), administration of a HFD induced an
increase in all the groups of Firmicutes (the phylum Firmi-
cutes, the group Lactobacillus and clostridial cluster XIVa;
Fig. 4(b)–(d)) and a decrease in the phylum Bacteroidetes
(Fig. 4(g)). However, further reports have linked an increased
proportion of Bacteroidetes in obese rats(13) and human sub-
jects(9,36,37). The most probable explanation for this discre-
pancy could be that some of these studies did not control
for other possible confounding variables of obesity, such as
intensity, regularity of exercise as well as total daily energy
intake(37). Methodological differences in DNA extraction pro-
tocols, primer design and qPCR techniques may also have
caused additional variation. Either way, obesity seems to be
related to changes in the Firmicutes:Bacteroidetes ratio that
could be involved in a greater capacity to extract energy
from nutrients(38,39).
The compositions of the diets employed in the present
study are probably responsible for some changes related to
the GM composition. According to the manufacturer, the CD
contains cereal products that contribute to 18·0 % of insoluble
fibre (including cellulose, hemicellulose and lignin) and 4·1 %
of soluble fibre (including fermentable carbohydrates). In con-
trast, the HFD has much less fibre (6·5 %), which is exclusively
obtained from cellulose, a poorly fermentable insoluble fibre.
The absence of soluble fibre in the HFD could explain the
lower levels of Bifidobacterium spp. (Fig. 4(f)).
Supplementation of the HFD with S1 markedly increased
total bacterial density and restored the proportions of
bacteria that were increased (i.e. clostridial cluster XIVa and
Enterobacteriales) or decreased (i.e. Bifidobacterium spp.)
during HFD feeding (Fig. 4(d)–(f)). The decrease in body
weight only in the HFD group supplemented with an oleic
acid-derived compound (S1) could be explained by the
decrease in the Firmicutes:Bacteroidetes ratio up to a level
even lower than the CD group, but a combination of n-3
fatty acids (S2) did not.
The HFD-induced levels of clostridial cluster XIVa, Bifido-
bacterium spp. and the phylum Bacteroidetes were not
restored by supplementation with a combination of n-3 fatty
acids (HFS-S2; Fig. 4(d), (f), and (g)). However, the elevated
number of Enterobacteriales induced by the HFD, and prob-
ably associated with gut inflammation, was partially restored
by S2 supplementation (Fig. 4(e)), which are well-known
modulators of the inflammatory process(40).
n-3 PUFA influence the gastrointestinal microbiota and
specifically the population level of lactic acid bacteria
(mainly bifidobacteria and lactobacilli), which are generally
considered to be beneficial. A study carried out in fish has
reported an increase in the content of lactobacilli by n-3
PUFA consumption(41). According to Kankaanpaa et al.(42),
low concentrations of n-3 fatty acids (5mg/ml) promoted
growth and mucus adhesion of Lactobacillus casei Shirota.
In gnotobiotic piglets, the oral administration of an oil contain-
ing PUFA significantly increased the number of Lactobacillus
paracasei adhering to the jejunal mucosa compared with the
control group(43). Moreover, mice fed with a diet depleted in
n-3 PUFA for two generations exhibited a huge decrease in
lactobacilli and, unexpectedly, an increase in bifidobacteria
in the caecal content when compared with mice fed a diet
with an adequate content in n-3 PUFA(44). Coherently, we
show here in mice that S2 supplementation increased the
quantities of Firmicutes (especially the Lactobacillus group),
when compared with the HFD (NS) and CD groups (P,0·1;
Fig. 4(b) and (c)).
The adhesion to mucosal surfaces is pivotal in health-
promoting effects by probiotics. Although further studies are
needed to confirm this hypothesis in vivo, evidence suggests
that some physiological effects of probiotics could be associ-
ated with the interactions between probiotics and dietary
PUFA. It has been suggested that dietary PUFA affect the
attachment sites for the gastrointestinal microbiota, possibly
by modifying the fatty acid composition of the intestinal
wall(41–43). The stimulatory effect of PUFA upon adhesion
of lactobacilli could be used for enhancing the effectiveness
of probiotics in inhibiting digestive tract pathogens.
Conclusions
Consumption of a HFD induced changes in the faecal
microbiota (an increase in all the tested groups of Firmicutes,
as well as the order Enterobacteriales, and a decrease in
Bifidobacterium spp. and the phylum Bacteroidetes), which
were associated with the appearance of an obese phenotype.
Correlation analysis revealed that body weight correlated
positively with the phylum Firmicutes and clostridial cluster
XIVa, and negatively with the phylum Bacteroidetes. Sup-
plementation of the HFD with S1 counteracted HFD-induced
gut dysbiosis, together with an improvement in body weight.
These data support a role for certain fatty acids as interest-
ing nutrients related to obesity prevention. Even if a direct
extrapolation of the present study to humans is still question-
able due to differences in digestive tract structure and in GM,
J. R. Mujico et al.718
British
Journal
ofNutrition
the present findings support the view that chronic consump-
tion of an oleic acid-derived compound (S1) could confer
potential beneficial effects with respect to the development
of obesity, through a mechanism related to the restoration of
the composition of gut bacteria. The possibility to treat ani-
mals with selected bacteria as oral probiotics could also con-
stitute one interesting perspective to investigate further on
the role of these specific gut bacteria in HFD-induced obesity.
However, and until these issues are clarified, the best way to
prevent obesity in humans is by promoting a healthy diet
and lifestyle.
Acknowledgements
The present study was performed as part of the PRONAOS
study. The authors gratefully acknowledge the financial sup-
port of the CENIT (National Strategic Consortia for Technical
Research) Programme and BTSA-Biotecnologıas Aplicadas
S.L. The authors thank Beatriz Dıaz and Aurora Hernandez
for technical assistance with the qPCR technique, and
acknowledge Oscarina Hernandez and Sara Causape (both
supervised by Prof. Monica de la Fuente, from the Complu-
tense University) for assistance with animals and housing.
They also thank Laura M. Barrios for assistance with the stat-
istical analyses. J. R. M., G. C. B., L. E. D and A. M. were
involved in the study design. G. C. B., L. E. D. and A. G.
were responsible of the animal housing and diet intervention.
J. R. M. and G. C. B. conducted both the faecal microbiota and
statistical analyses. J. R. M. wrote the first draft of the manu-
script. All the authors contributed to the final version. A. M.
had primary responsibility for the final content. The authors
declare that there are no conflicts of interest.
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256
ANEXO 2: Gheorghe A, Pérez de Heredia F, Hunsche C, Redondo N, Díaz LE, Hernández O,
et al. (2017). Oxidative stress and immunosenescence in spleen of obese mice can be reversed
by 2-hydroxyoleic acid. Exp Physiol. Online.
This is an Accepted Article that has been peer-reviewed and approved for publication in the
Experimental Physiology, but has yet to undergo copy-editing and proof correction. Please cite this
article as an Accepted Article; doi: 10.1113/EP086157.
This article is protected by copyright. All rights reserved.
DOI:-10.1113/EP086157 1
Oxidative stress and immunosenescence in spleen of obese mice can be reversed by 2-2
hydroxyoleic acid 3
Alina Gheorghe1*
, Fátima Pérez de Heredia2*
, Caroline Hunsche3, Noemí Redondo
1, Ligia 4
Esperanza Díaz1, Oskarina Hernández
3, Ascensión Marcos
1, Mónica De la Fuente
3,4 5
1Immunonutrition Research Group, Institute of Food Science, Technology and Nutrition 6
(ICTAN), Spanish National Research Council (CSIC), Madrid, Spain 7
2School of Natural Sciences and Psychology, Liverpool John Moores University, Liverpool, 8
UK 9
3Department of Animal Physiology II, Faculty of Biology, University Complutense of Madrid, 10
Spain 11
4Research Institute of the Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain 12
Running title: Oxidative stress and immunosenescence in obese mice reversed by 2OHOA 13
Keywords: oxidative stress; immune senescence; obesity 14
Word count (not including references): 4212; including references: 5943 15
Reference count: 54 16
Corresponding author: Fátima Pérez de Heredia 17
School of Natural Sciences and Psychology, Liverpool John Moores University 18
James Parsons Building 19
Byrom St, L3 3AF, Liverpool, UK 20
Telephone number: +44 (0)151 2312003 Fax number: +44 (0)151 2312338 21
Email address: [email protected] 22
* Equal contributors
2
This article is protected by copyright. All rights reserved. 2
Subject area: Human, environmental & exercise (ageing, immunity) 1
New findings 2
What is the central question of this study? 3
Evidence is growing for the link between obesity, immune dysfunction and oxidative stress, 4
but it is still not known how the properties and functions of spleen and spleen leukocytes are 5
affected. 6
What is the main finding and its importance? 7
Obesity led to premature immunosenescence, manifested as oxidative stress and changes in 8
leukocyte functions in mouse spleen. The oleic acid derivative 2-hydroxyoleate, and to a 9
lesser extent a combination of EPA+DHA, could reverse most of the observed alterations, 10
suggesting a potential therapeutic tool for obesity-related immune dysfunction and redox 11
imbalance. 12
Abstract 13
We aimed to investigate the effects of obesity on oxidative stress and leukocyte function in 14
spleen of mice, and to assess whether supplementation with 2-hydroxyoleic acid (2-OHOA) 15
or n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) could reverse those effects. Female ICR/CD1 mice 16
(8 weeks old, n=24) received an obesogenic diet (22% fat for 4 weeks and 60% fat for 14 17
weeks). After 6 weeks, mice were split in three groups (n=8/group): no supplementation, 2-18
OHOA supplementation (1500 mg/kg) and n-3 PUFA supplementation (EPA+DHA, 19
3000 mg/kg diet). Eight mice were fed standard diet for the whole duration of the study 20
(control group). At the end of the experiment, the following variables were assessed in 21
spleens: levels of reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione, GSH/GSSG, xanthine 22
oxidase (XO) activity, lipid peroxidation, lymphocyte chemotaxis, natural killer (NK) activity 23
and mitogen (ConA and LPS)-induced lymphocyte proliferation. Obese animals presented 24
higher GSSG levels (P=0.003), GSSG/GSH ratio (P=0.013), lipid peroxidation (P=0.004), 25
3
This article is protected by copyright. All rights reserved. 3
XO activity (P=0.015) and lymphocyte chemotaxis (P<0.001), and lower NK activity 1
(P=0.003) and proliferation in response to ConA (P<0.001) than controls. 2-OHOA reversed 2
totally or partially most of the changes (body weight, fat content, GSSG levels, GSH/GSSG, 3
lipid peroxidation, chemotaxis and proliferation, all P<0.05), while n-3 PUFA reversed the 4
increase in XO activity (P=0.032). In conclusion, 2-OHOA, and to a lesser extent n-3 PUFA, 5
could ameliorate the oxidative stress and alteration of leukocyte function in spleen of obese 6
mice. Our findings support a link between obesity and immunosenescence and suggest a 7
potential therapeutic tool for obesity-related immune dysfunction. 8
Introduction 9
Nutritional status is a key factor for a correct function of the immune system and the 10
maintenance of health (De la Fuente & Miquel, 2009). States of malnutrition have been 11
linked to higher vulnerability to infections and immune dysfunction. Malnutrition, however, 12
is not restricted to nutrient deficiencies anymore, but it broadly refers to inadequate nutrition 13
and nutritional imbalance, including excessive energy intake and obesity. Indeed, obesity has 14
been associated with impaired immune function, which is reflected in an enhanced, non-15
resolved inflammatory response and compromised immune surveillance (Karlsson et al., 16
2010; De la Fuente & De Castro, 2012; Perez de Heredia et al., 2012; Hunsche et al., 2016). 17
Obesity is also associated with oxidative stress when maintained for a long time, and it can be 18
mediated by either a decrease in antioxidant defences and/or increased formation of oxidants. 19
Oxidative stress in turn can damage cellular structures and trigger an inflammatory response, 20
closing a detrimental feedback loop (Perez de Heredia et al., 2012; Matsuda & Shimomura, 21
2013; Savini et al., 2013; Vida et al., 2014). Research on obesity and immunity has focused 22
mainly on circulating leukocytes, but immune organs themselves can be compromised. The 23
largest secondary immune organ in mammals is the spleen; it hosts macrophages, dendritic 24
cells, plasma cells and a fourth of the body’s lymphocytes, and is involved in several 25
4
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functions, such as activation of T and B cells in response to blood-born antigens, antibody 1
production, or clearance of circulating apoptotic cells (thus contributing to peripheral immune 2
tolerance) (Cesta, 2006). Therefore, it is important to study the impact of obesity in the spleen 3
and in spleen leukocytes. 4
The last decades have witnessed a dietary transition toward a westernized dietary 5
pattern, coincident with the rise of overweight and obesity in both developed and developing 6
countries (Cuevas et al., 2009; Bezerra et al., 2014). In contrast, the Mediterranean diet has 7
been linked to lower rates of obesity (Schroder et al., 2004), inflammation and oxidation 8
(Savini et al., 2013). The Mediterranean diet has been reported to modulate the immune 9
response and to exert anti-inflammatory and antioxidant properties (Minich & Bland, 2008). 10
This may be in great part due to its high content in monounsaturated (n-9 MUFA) and 11
polyunsaturated (n-3 PUFA) fatty acids, which have shown immunomodulatory actions (de 12
Pablo et al., 1998; Padovese & Curi, 2009; Paschoal et al., 2013). N-3 PUFA have been more 13
extensively studied in this respect (Calder & Grimble, 2002), while less attention has been 14
paid to the effects of MUFA on the immune system, although they may contribute to 15
reducing oxidative stress (Fitó et al., 2007). Evidence regarding whether dietary MUFA and 16
n-3 PUFA affect the redox state and the function of leukocytes in spleen in obesity is 17
nevertheless still scarce. 18
The aims of the current study were to investigate the effects of obesity on markers of 19
oxidative stress and leukocyte functions in spleen of mice, and to evaluate the impact of 20
subsequent supplementation with n-9 MUFA and n-3 PUFA on these parameters. 21
Methods 22
Ethical Approval 23
All experimental procedures were approved by the Committee for Animal Experimentation 24
of the University Complutense of Madrid (ref. CEA-UCM 06/2012), and conducted in 25
5
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accordance with the guidelines and protocols of the Spanish Royal Decree 1201/2005 1
regarding the care and use of laboratory animals for experimental procedures. The authors 2
acknowledge the ethical principles of Experimental Physiology, and confirm that the study 3
was conducted in compliance with the animal ethics checklist as detailed by Grundy (2015). 4
Measures were taken to ensure the well-being of animals and to minimize pain and 5
suffering to the best of our possibilities (see methodological description below). Organ and 6
tissue samples were obtained post-mortem. Animals were euthanized at the end of the study, 7
by decapitation in the morning (8:00 a.m.), and no anaesthetic was used to this effect to save 8
unnecessary suffering to the animals. This procedure is in agreement with the dispositions of 9
the European Directive 2010/63/EU. 10
Animal origin and housing conditions 11
Thirty-two female ICR/CD1 mice, 8 weeks of age, were purchased from Harlan Interfauna 12
Iberica (Barcelona, Spain). The animals were housed in polyurethane cages (4 animals per 13
cage) and maintained under standard laboratory conditions (12:12 h reversed light/dark cycle; 14
lights on at 8:00 pm, relative humidity of 50-60%, temperature of 22±2 ºC and adequate 15
ventilation). During the first 5 days of acclimatization to the new environment, all mice were 16
fed a standard maintenance diet (Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, 17
reference 2014, Harlan Interfauna Iberica). 18
Experimental groups and diets 19
Animals were split into two groups: 8 mice kept receiving the maintenance diet for the entire 20
duration of the study (18 weeks), constituting the control group, while the rest received a 21
moderately fat-rich diet for 4 weeks (3.3 kcal/g, 22% calories from fat, 23% protein, 55% 22
carbohydrates, ref. Teklad Global 2019, Harlan Interfauna Iberica), followed by an 23
obesogenic diet (60% fat, 18.4% protein, 21.3% carbohydrates, ref. TD. 06414, Harlan 24
Interfauna Iberica) for a further 8 weeks (figure 1). 25
6
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At this point, the high-fat diet-fed mice were split into three groups: 8 mice kept 1
receiving the obesogenic diet for the rest of the experiment (OD group), 8 mice were given 2
the diet supplemented with 2-OHOA (1500 mg/kg diet) (OD-HO group), and 8 mice were 3
given the diet supplemented with a combination of eicosapentaenoic (EPA, 20:5n-3) and 4
docosahexaenoic (DHA, 22:6n-3) acids (1500 + 1500 mg/kg diet), for 6 additional weeks. 5
The 2-OHOA is a synthetic derivative of oleic acid with a hydroxyl group in the α-position, 6
and it is also known as 2-hydroxy-D9-cis-octadecenoic acid. The n-3 PUFA were extracted 7
from fish (anchovy). All fatty acid supplements were provided by BTSA-Biotecnologías 8
Aplicadas, S.L. Upon reception of the supplements (2-OHOA in powdered form and n-3 9
PUFA in oil form), these were mixed at our facilities with the diet, which was of a malleable 10
consistency, and then pelleted before being presented to the mice. Animals had free access to 11
water and food during the entire study, and food intake was monitored on a weekly basis. 12
Collection of spleen and leukocyte suspensions 13
Once animals were euthanized, their spleens were collected aseptically and freed from fat. 14
One fragment of each spleen was stored at –80 ºC for the study of oxidative stress 15
parameters. Another fragment of spleen was minced with scissors and gently pressed through 16
a mesh screen (Sigma, St Louis, USA) to obtain cell suspensions. The cell suspensions were 17
centrifuged in a gradient of Ficoll-Hypaque (Sigma) with a density of 1.070 g/ml; cells from 18
the interface were collected and suspended in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 19
medium enriched with L-glutamine (PAA, Pasching, Austria) and supplemented with 10% 20
heat-inactivated foetal calf serum (Gibco, Canada) and 1% gentamicin (100 µg/ml, Gibco). 21
After a wash step, leukocytes were counted in a Neubauer chamber and their number adjusted 22
to 106 cell/ml. Cell viability was routinely measured before each experiment by the trypan-23
blue exclusion test, and was higher than 95% in all experiments. All incubations were 24
performed at 37 ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2. 25
7
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Analysis of oxidative stress 1
GSH and GSSG levels 2
Reduced glutathione (GSH) is one of the most important anti-oxidant defence mechanisms in 3
the organism, and as such a relevant marker of its antioxidant capacity. Both reduced and 4
oxidized (GSSG) glutathione were determined in spleen using a fluorometric method (Hissin 5
& Hilf, 1976). This is based on the reaction of a fluorescence probe, o-phthaldialdehyde 6
(OPT), with GSH at pH=8 and with GSSG at pH=12, which generates a fluorescence 7
derivative. The spleen samples were homogenized (50 mg/ml) in sodium phosphate-EDTA 8
buffer (0.1 M, pH=8) and proteins were precipitated by adding 5 μl of 60% perchloric acid. 9
Homogenized spleen samples were centrifuged (9,500 g, 10 min, 4 °C) and supernatants were 10
maintained in ice for measurement of GSH and GSSG levels. For GSH levels determination, 11
10 μl of the supernatant, 190 μl of sodium phosphate-EDTA buffer and 20 μl of OPT solution 12
(1 mg/ml in methanol) were added to a 96-well black microplate and incubated at room 13
temperature for 15 minutes. Fluorescence was determined in a microplate reader using 14
excitation at 350 nm and emission detection at 420 nm. For the determination of GSSG 15
levels, 10 μl of the supernatant and 4 μl of N-ethylmaleimide (NEM, 0.04 M) were added to a 16
96-well black microplate and incubated at room temperature for 30 minutes. Then, 186 μl of 17
sodium hydroxide (NaOH, 0.1 N) with 20 μl of OPT solution were added to each well. After 18
incubation (room temperature, 15 min), fluorescence was measured as previously described 19
for GSH determination. The results were analysed with GSH and GSSG standard curves at 20
different concentrations and expressed as nmol/mg protein. Protein concentration of the 21
samples was measured following the bicinchoninic acid protein assay kit protocol (Sigma-22
Aldrich, Madrid, Spain). The GSSG/GSH ratio was then calculated for each sample. All 23
assays were performed in duplicates. 24
Xanthine oxidase (XO) activity 25
8
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XO activity was assayed by fluorescence in homogenates of spleen, using a commercial kit 1
(Amplex Red Xanthine/Xanthine Oxidase Assay Kit, Molecular Probes, Paisley, UK). In the 2
assay, XO catalyses the oxidation of purine bases (xanthine) to uric acid and superoxide 3
anions. The superoxide anion spontaneously degrades in the reaction mixture to H2O2, which 4
in the presence of horseradish peroxidase (HRP) reacts with Amplex Red reagent to generate 5
the red-fluorescent oxidation product, resorufin. Tissue samples were homogenized in 6
phosphate buffer (50 mM, pH=7.4) containing 1 mM EDTA and normalized to total protein. 7
The homogenate was centrifuged (5,000 g) and the supernatant (50 µl) was collected and 8
incubated with 50 µl working solution of Amplex Red reagent (100 µM) containing HRP (0.4 9
U/ml) and xanthine (200 µM). After 30 min of incubation at 37 ºC, measurement of 10
fluorescence was performed in a microplate reader (Fluostar Optima, BMG Labtech, 11
Biomedal, Spain), using excitation at 530 nm and emission detection at 595 nm. XO supplied 12
in the kit was used as the standard. The results were expressed as international milliunits of 13
enzymatic activity per milligram of protein (mU XO/mg protein). Protein content of the 14
samples had been previously assessed by the bicinchoninic acid protein assay kit protocol 15
(Sigma-Aldrich, Madrid, Spain). All assays were performed in duplicates. 16
Lipid peroxidation 17
Lipid peroxidation levels were determined by measuring the formation of malondialdehyde 18
(MDA) using a colorimetric assay kit (BioVision, Inc., Mountain View, CA, USA). The 19
spleen samples were homogenized (10 mg) in 300 μl of MDA lysis buffer with 3 μl 20
butylhydroxytoluene (BHT) (X100) and then centrifuged (13,000 g, 10 min) to remove 21
insoluble material. An aliquot (200 μl) of each supernatant was added to 600 μl of 22
thiobarbituric acid (TBA) and incubated at 95 °C for 60 minutes. The samples were then 23
maintained in an ice bath for 10 minutes and 200 μl from each 800 μl reaction mixture were 24
placed into a 96-well microplate for spectrophotometric measurement at 532 nm. The results 25
9
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were analyzed with MDA standard curve at different concentrations and expressed as 1
nmol/mg protein. Protein concentration of the samples was measured following bicinchoninic 2
acid protein assay kit protocol (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain). All assays were performed in 3
duplicates. 4
Leukocyte functions 5
Chemotaxis assay 6
The assay was carried out following the method previously described by De la Fuente and 7
colleagues (2004). Chambers with two compartments separated by a filter of 3 μm pore 8
diameter (Millipore, Ireland) were used. Aliquots of 300 μl of leukocyte suspensions were 9
placed in the upper compartment, and 400 μl of the chemoattractant fMet-Leu-Phe (fMLF, 10
Sigma), at a concentration of 10-8
M, were placed in the lower compartment. After 3 h 11
incubation, the filters were fixed and stained, and the number of lymphocytes on the lower 12
face of the filters was counted in one third of them, with an optical microscope, and recorded 13
as the chemotaxis index (CI). All the samples were assayed in duplicate. 14
NK activity assay 15
An enzymatic colorimetric assay was used for measurements of cytolysis of target cells 16
(Cytotox 96 TM Promega, Boerinher Ingelheim, Germany), based on the determination of the 17
activity of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH), and using tetrazolium salts, as 18
previously published (De la Fuente et al., 2004). Briefly, target cells (YAC-1 cells from a 19
murine lymphoma) were seeded in 96-well U-bottom culture plates (Nunclon, Denmark) in 20
RPMI 1640 medium without phenol red, at a concentration of 104 cell/well. Effector cells 21
(leukocytes from spleen) were added at a concentration of 105
cell/well, thus obtaining an 22
effector/target rate of 10/1. The plates were centrifuged at 250 g for 4 minutes to facilitate 23
cell-to-cell contact and then incubated for 4 h. After incubation, plates were centrifuged again 24
at 250 g for 4 minutes and LDH activity was measured in the supernatants (50 µl/well) by 25
10
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addition of the enzyme substrate with absorbance recording at 490 nm. The results were 1
expressed as percentage of lysis. Each sample was assayed in triplicate. Three kinds of 2
control measurements were performed: a target spontaneous release, a target maximum 3
release and an effector spontaneous release. To determine the percentage of lysis of target 4
cells, the following equation was used: % lysis = ([E-ES-TS]/ [M-ES-TS]) × 100 5
where E is the mean absorbance in the presence of effector cells; ES is the mean absorbance 6
of effector cells incubated alone (effector spontaneous release); TS is the mean absorbance in 7
target cells incubated with medium alone (target spontaneous release), and M is the mean of 8
maximum absorbance after incubating target cells with lysis solution (target maximum 9
release). 10
Lymphoproliferation assay 11
Following the method previously described (De la Fuente et al., 2004), aliquots (200 µl) of 12
leukocytes (106 cells/ml complete medium) were seeded in 96-well flat-bottomed microtiter 13
plates (Numc, Roskilde, Denmark). Then, 20 µl of concanavaline A (ConA, 1µg/ml, Sigma, 14
St Louis, MO) or 20 µl of lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli 055:B5, 1µg/ml, Sigma) 15
were added per well. In order to assess spontaneous proliferation, 20 µl of complete medium 16
were added to some wells instead of the mitogens. After 48 h of incubation at 37 °C in an 17
atmosphere of 5% CO2, 0.5 µCi 3H-thymidine (Du Pont, Boston, MA, USA) were added to 18
each well. The cells were harvested in a semiautomatic microharvester 24 h later. Thymidine 19
uptake was measured using a beta counter (LKB, Uppsala, Sweden). The results were 20
expressed as 3H-thymidine uptake (cpm). All assays were performed in triplicates. 21
Statistical analysis 22
We tested the following hypotheses: 1) spleen from obese animals would be subjected to 23
higher oxidative stress than those from controls; 2) leukocytes from spleens of obese animals 24
would present altered chemotaxis, NK activity and proliferation in response to mitogens in 25
11
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relation to controls; 3) supplementation with 2-OHOA and n-3 PUFA would reverse the 1
observed changes. 2
Sample size was 8 per experimental group (unless otherwise specified), with assays 3
being conducted in triplicates (NK activity and lymphoproliferation) or duplicates (the rest of 4
assays). In those cases, the average value of the replicas was used. The results are expressed 5
as mean ± standard deviation (SD), or median and interquartile range (IQR), depending upon 6
normality of the data, which was checked by the Shapiro-Wilk test. For normally distributed 7
variables (XO activity, MDA levels, CI, NK activity and proliferation), one-way ANOVA 8
with Bonferroni post-hoc test were conducted to compare the four experimental groups. For 9
non-normally distributed variables (body weight, GSH and GSSG levels and GSSG/GSH), 10
the Kruskal-Wallis test was used to compare the four experimental groups, and Mann-11
Whitney was used to run pairwise comparisons when the Kruskal-Wallis test was significant. 12
Significance level was always set at P<0.05. All statistical tests were performed using IBM 13
SPSS v23. 14
Results 15
Effect of the treatments on body weight gain 16
The animals fed the obesogenic diet started gaining significantly more weight than the 17
controls after five weeks of high-fat feeding (P=0.036). Supplementation with 2-OHOA 18
resulted in progressive reduction of body weight, and at the end of the experiment the average 19
weight of the OD-HO group was significantly lower than that of controls (P=0.009). The 20
supplementation with n-3 PUFA did not have a significant effect on body weight when 21
compared to the OD group (figure 2). 22
Effect of the treatments on the oxidative stress parameters in spleen 23
The levels of reduced glutathione (GSH) were similar among experimental groups (P=0.518) 24
(figure 3A). On the contrary, the levels of oxidized glutathione (GSSG) and the GSSG/GSH 25
12
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ratios were significantly different between groups (P=0.003 and P=0.013, respectively). The 1
OD group presented the highest values; treatment with 2-OHOA seemed to prevent or reverse 2
the increase in both GSSG levels and GSSG/GSH, while n-3 PUFA seemed to ameliorate 3
only the rise in GSSG/GSH (figures 3B and 3C). Similarly, xanthine oxidase activity (figure 4
4) was different among experimental groups (P=0.015). The highest value corresponded to 5
the OD group (P=0.032 vs control), and the increase was abolished by supplementation with 6
n-3 PUFA (P=1.000 and P=0.032 vs control and OD groups, respectively), and partially by 2-7
OHOA (P=1.000 and P=0.114 vs control and OD groups, respectively). Lipid peroxidation 8
(measured as malondialdehyde [MDA] levels) was also different among treatments 9
(P=0.004), the differences being found between the OD and OD-HO groups (P=0.012), and 10
between the OD-HO and OD-N3 groups (P=0.017) (figure 5). 11
Effect of treatments on spleen leukocytes functions 12
Significant differences were found among the experimental groups for the chemotaxis index 13
(CI) of spleen lymphocytes (P<0.001), which was lowest in controls, and highest in the OD 14
group. Supplementation with 2-OHOA partially prevented or reversed the increase in the CI 15
(P=0.002 vs the OD group), while no significant effect could be attributed to n-3 PUFA 16
supplementation (P=0.863 vs the OD group) (figure 6). In contrast, the natural killer (NK) 17
activity of spleen leukocytes was higher in the control group than in all groups fed the 18
obesogenic diet (P=0.003), with no statistical differences observed between the OD group 19
and the groups that received the fatty acid supplements (P=1.000 for both post-hoc contrasts) 20
(figure 7). 21
With regards to the proliferative capacity of lymphocytes, no significant differences 22
were observed between groups in basal conditions (control group: 1395 ± 550; OD: 23
1283 ± 463; OD-HO: 1363 ± 346; and OD-N3: 1193 ± 361 cpm). In response to stimulation 24
by ConA, the OD group showed the lowest values of proliferation (P<0.001), a decrease that 25
13
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was totally reversed by supplementation with 2-OHOA and partially by supplementation with 1
n-3 PUFA (figure 8A). In response to LPS stimulation, the obesogenic diet per se did not 2
result in a significant alteration of the lymphoproliferative response, but the supplementation 3
with 2-OHOA was accompanied by higher levels of proliferation, in comparison with both 4
the control group (P<0.001) and the OD group (P=0.002) (figure 8B). 5
Discussion 6
The results of the current study support that the induction of dietary obesity during the 7
juvenile period leads to the development of obesity, oxidative stress and impaired leukocyte 8
function in spleen in adulthood. The supplementation with 2-OHOA, and to a lesser extent 9
with n-3 PUFA (EPA+DHA), was able to partially or completely ameliorate the alteration of 10
most leukocyte functions, and to improve the oxidative stress status in the obese mice. 11
We found that 2-OHOA supplementation, but not n-3 PUFA, led to a progressive 12
decrease in body weight. This was not accompanied by a decrease in food intake (data not 13
shown). Our results agree with Vögler and colleagues (2008), who previously reported that 2-14
OHOA-treated mice experienced a decrease in body weight through reduction of adipose fat 15
mass. With regards to n-3 PUFA, despite a considerable body of evidence (Thorsdottir et al., 16
2007; Buckley & Howe, 2010), a recent meta-analysis indicated that PUFA supplementation 17
does not promote anti-obesity effects in overweight/obese individuals, in agreement with our 18
results (Du et al., 2015). 19
The obese animals in our study presented increased oxidative stress and altered 20
function of leukocytes in spleen. Obesity is a risk factor for the progressive deterioration of 21
cellular immune functions (Tarantino et al., 2013), and has been associated with premature 22
immunosenescence, a situation of both oxidative and inflammatory stress (De la Fuente & De 23
Castro, 2012; De la Fuente, 2014). The pathophysiological mechanisms by which cellular 24
immune functions are affected by obesity are still under investigation but the spleen may play 25
14
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an important role (Tarantino et al., 2013). The increased oxidative stress in our mice was 1
manifested by higher GSSG, GSSG/GSH ratio, lipid peroxidation and xanthine oxidase 2
activity levels. This suggests that obesity was accompanied by elevated formation of oxidants 3
rather than a decrease in the levels of antioxidants, at least in the spleen. This is the first time 4
to our knowledge that GSH, GSSG, and the GSSG/GSH ratio have been investigated in the 5
spleen of dietary obese mice, but our results agree with previous studies that looked at other 6
organs and/or species (Capel & Dorrell, 1984; Kolesnikova et al., 2013; Hunsche et al., 7
2016). An increased GSSG/GSH ratio has been associated with a number of diseases, 8
including type-2 diabetes (Lee et al., 2008), and it can therefore be a useful health marker in 9
the assessment of obesity-related comorbidities. In a similar manner, the activity of XO in 10
thymus has been reported to be higher in obese rats than in normal weight controls (De la 11
Fuente & De Castro, 2012), and to be elevated in obese children when compared to non-obese 12
children (Chiney et al., 2011). In our study, the supplementation with unsaturated fatty acids 13
proved to be effective at improving the oxidative state of obese mice; 2-OHOA 14
supplementation reduced both GSSG levels and GSSG/GSH ratio, as well as MDA levels 15
(the marker of lipid peroxidation), when compared to the OD group, while XO activity was 16
decreased by n-3 PUFA supplementation (in relation to the OD group). Our results are in 17
agreement with previous evidence showing that olive oil consumption can favour tissue 18
antioxidant defence mediated by the glutathione system (De La Cruz et al., 2000), reduce 19
lipid peroxidation levels (El-Kholy et al., 2014), and improve plasma antioxidant capacity 20
(Pitsavos et al., 2005). 21
In our study, obese animals presented as well higher chemotaxis, lower cytotoxic 22
activity and lower mitogen-induced proliferation in spleen leukocytes. The chemotaxis 23
capacity enables the migration of circulating immune cells into tissues and their accumulation 24
in infection or injury sites, in order to produce an adequate inflammatory and defensive 25
15
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response (Doherty et al., 1987). Understanding the significance of increased chemotaxis in 1
our obese mice would require further research, as evidence available is not unanimous in this 2
respect. On the one hand, decreased chemotaxis has been reported in neutrophils from 3
genetically obese mice (Kordonowy et al., 2012), and in peritoneal immune cells from aged 4
mice, which are in a state of oxidative stress (De la Fuente & Miquel, 2009). On the other 5
hand, a rise in the chemotactic indices of spleen lymphocytes was observed in a mouse model 6
of Alzheimer’s disease, another condition with a high oxidative situation (Giménez-Llort et 7
al., 2008), while another study showed enhanced immune cell chemotaxis in mice fed a high-8
fat diet (Qiao et al., 2009). High-fat consumption has been reported to induce cellular 9
adherence activation (Esser et al., 2013), which in turn is linked to oxidative stress (De la 10
Fuente & Miquel, 2009). The increased chemotaxis observed in our study, therefore, is likely 11
to be related to the oxidative stress state of the obese mice. It is important, however, to 12
highlight that changes in chemotactic function can be dependent on the type of immune cells 13
and organs analysed. Supplementation with 2-OHOA, but not with n-3 PUFA, was able to 14
partially prevent or reverse the rise in the chemotaxis index associated with obesity in our 15
mice. In agreement with our findings, previous studies have reported no effect of n-3 PUFA 16
on neutrophil chemotaxis (Schmidt et al., 1996; Healy et al., 2000; Hill et al., 2007), 17
although other authors did observe diminished neutrophil chemotaxis in response to these 18
fatty acids (Lee et al., 1985; Luostarinen et al., 1992; Schmidt et al., 1992; Sperling et al., 19
1993). In relation to 2-OHOA, our study is to our knowledge the first to report a significant 20
amelioration of obesity-related changes in spleen leukocyte chemotaxis. 21
Natural killer cytotoxic activity was lower in all the groups fed the obesogenic diet. 22
These results are consistent with previous studies indicating that high-fat-fed mice, obese rats 23
and obese humans suffer from diminished NK cell cytotoxicity (Morrow et al., 1985; 24
Moriguchi et al., 1998; Lamas et al., 2004; O’Shea et al., 2010; De la Fuente & De Castro, 25
16
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2012). NK cells constitute the most important defensive line against malignant and virus-1
infected cells. Thus, a decrease in their activity renders the animals more susceptible to 2
infections and tumours. Interestingly, similar changes in NK activity have been observed in 3
old and prematurely aging animals (De la Fuente et al., 2004; De la Fuente & Miquel, 2009). 4
In our study, neither 2-OHOA nor n-3 PUFA supplementation resulted in any improvement 5
of NK activity, in agreement with previous work (Berger et al., 1993; Yaqoob et al., 2000). 6
Therefore, we can speculate that changes in NK activity in our study were not directly linked 7
to the oxidative stress status of the animals, but to other alterations associated with obesity 8
and/or high fat intake. 9
Finally, obesity in our study was accompanied by decreased lymphoproliferative 10
response after stimulation with the mitogen ConA, but not with LPS or under basal 11
conditions. ConA is a T-cell mitogen, while LPS acts as a B-cell mitogen. These different 12
mitogen actions could explain why the experimental treatments did not affect proliferation in 13
all conditions, and suggest instead that obesity impacts specifically on certain types of 14
immune cells (Perez de Heredia et al., 2015). In addition, we did not observe statistically 15
significant differences in the percentages of CD3+ cells (T lymphocytes) and CD19
+ cells (B 16
lymphocytes) among the experimental groups (data not shown), which would be in 17
agreement with the lack of proliferative response to LPS and also with the similar levels of 18
lymphoproliferation in the basal state. We can only speculate at this point, but our results 19
could suggest that obesity and/or the high-fat diet did not affect the basal proliferation 20
capacity of lymphocytes per se, but could impair the ability of the spleen to respond to an 21
offense by increasing the population of T lymphocytes specifically. More research is needed 22
to understand the pathways and mechanisms by which obesity can impact lymphocyte 23
maturation in spleen. Supplementation with 2-OHOA led to restored lymphoproliferation 24
levels in response to ConA, and also resulted in higher proliferative response to LPS 25
17
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stimulation in our study, while n-3 PUFA supplementation did not affect significantly either 1
ConA- or LPS-stimulated proliferation. Other authors, by contrary, have reported lower olive 2
oil-induced lymphoproliferative response to both ConA and LPS, when comparing to other 3
types of fat (de Pablo et al., 1998), and that n-3 PUFA could reduce in vitro lymphocyte 4
proliferation (Peterson et al., 1998). Further research is required as well in order to confirm 5
the effects of both 2-OHOA and n-3 PUFA in modulating the proliferation of spleen 6
leukocytes. 7
Our study has certain limitations that should be addressed. Additional measures of 8
anti-oxidant markers, like total anti-oxidant capacity of the spleen, could contribute to 9
confirm our hypothesis that oxidative stress in obesity is due to increased generation of 10
oxidants rather than decreased anti-oxidant defence mechanisms. The analysis of the activity 11
of the enzymes glutathione peroxidase and glutathione reductase could contribute to explain 12
the results obtained in relation to levels of GSH and GSSG. Similarly, the analysis of the 13
activity of the superoxide dismutase could shed light on the results obtained in relation to 14
xanthine oxidase. Unfortunately, the amount of tissue available limited the number of 15
analyses that could be conducted in the spleens. In this line, it would have also been 16
interesting to analyse antioxidant markers in plasma, in order to confirm the oxidative stress 17
state associated with obesity, but again the amount of blood available from each mouse was 18
very limited and it was necessary to conduct a set of humoral and metabolic determinations. 19
In conclusion, early induction of dietary obesity led to oxidative stress and impaired 20
leukocyte function in mice, suggesting premature immunosenescence. Supplementation with 21
2-OHOA, and to a lesser extent with n-3 PUFA, was able to reduce body weight and to 22
ameliorate the oxidative stress and alteration of several leukocyte functions in the spleen of 23
obese mice. 24
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26
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Additional information 1
Competing interests 2
The authors want to declare that the work was partially funded by BTSA-Applied 3
Biotechnologies S.L., who was the manufacturer of the experimental fatty acid supplements. 4
This funding was not provided directly to the researchers; it occurred in the context of a 5
larger consortium coordinated by the CENIT (National Strategic Consortia for Technical 6
Research) Program under the supervision of the Spanish Ministry of Science and Innovation. 7
Author contributions 8
M.d.l.F., L.E.D and A.M. were responsible of the conception and design of the research; A.M. 9
was the research coordinator; A.G., L.E.D., C.H. and O.H., performed the experiments; A.G., 10
N.R., C.H., O.H. and F.P.d.H. participated in the data analysis; F.P.d.H., N.R. and A.G. 11
interpreted the results of experiments; A.G. and F.P.d.H. prepared the figures; F.P.d.H., A.G., 12
L.E.D. and M.d.l.F. drafted the manuscript; F.P.d.H., A.G., L.E.D., M.d.l.F., C.H., N.R. and 13
A.M. revised, edited and approved the final version of the manuscript. 14
Funding 15
Work was supported by CENIT (National Strategic Consortia for Technical Research) 16
Program and BTSA-Applied Biotechnologies S.L., the Spanish Ministry of Economy and 17
Competitiveness (MICINN; BFU2011-3036), the RETICEF (RD12/0043/0018) and FIS 18
(PI15/01787) from the Carlos III Health Institute (ISCIII)-FEDER of the European Union and 19
The PRONAOS Study (CDTI 20081114). 20
Acknowledgements 21
The present study was performed as part of the PRONAOS study. The authors wish to 22
acknowledge Belén Garzón and Laura Barrios, from the Department of Computer Science at 23
CSIC (SGAI-Spanish National Research Council) for their support and assistance in the 24
statistical analysis of data. 25
27
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FIGURE LEGENDS 1
Figure 1. Experimental design and timing. 2-OHOA: 2-hydroxyoleic acid; PUFA: 2
polyunsaturated fatty acids; C: control; OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-3
OHOA; OD-N3: obesogenic diet + n-3 PUFA. 4
5
Figure 2. Evolution of the body weight of mice in the four experimental groups (C: control; 6
OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA; OD-N3: obesogenic diet + n-3 7
PUFA; n=8 animals/group). The dotted lines indicate, left to right, the beginning of the 8
administration of the moderate-fat diet, the high-fat diet and the supplements. Arrows 9
indicate the weeks when the average body weights started to differ significantly between 10
controls and obesogenic diet-fed animals (P=0.036), and between the OD-HO group and the 11
other two obesogenic-diet fed groups (P=0.011), as analysed by Kruskal-Wallis. 12
28
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1
Figure 3. Levels of reduced (GSH) (A) and oxidized glutathione (GSSG) (B) and the 2
GSSG/GSH ratios in the spleen homogenates of mice from the four experimental groups (C: 3
control; OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA; OD-N3: obesogenic diet 4
+ n-3 PUFA; n=7 animals/group). All assays were performed in duplicates. Differences 5
between treatments analysed by Mann-Whitney, *P<0.05, **P<0.01. 6
29
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1
30
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1
31
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1
Figure 4. Xanthine Oxidase (XO) activity in the spleen homogenates of mice from the four 2
experimental groups (C: control; OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA; 3
OD-N3: obesogenic diet + n-3 PUFA; n=7 animals/group). All assays were performed in 4
duplicates. Boxplots represent means, 95% CI, minimum and maximum values. Different 5
superscript letters indicate significant differences as analysed by one-way ANOVA with post-6
hoc correction by Bonferroni, P<0.05. 7
32
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1
Figure 5. Lipid peroxidation, measured as levels of malondialdehyde (MDA), in the spleen 2
homogenates of mice from the four experimental groups (C: control [n=6]; OD: obesogenic 3
diet [n=6]; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA [n=4]; OD-N3: obesogenic diet + n-3 PUFA 4
[n=5]). All assays were performed in duplicates. Boxplots represent means, 95% CI, 5
minimum and maximum values. Different superscript letters indicate significant differences 6
as analysed by one-way ANOVA with post-hoc correction by Bonferroni, P<0.05. 7
33
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1
Figure 6. Chemotaxis index of spleen leukocytes of mice from the four experimental groups 2
(C: control; OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA; OD-N3: obesogenic 3
diet + n-3 PUFA; n=8 animals/group). All assays were performed in duplicates. Boxplots 4
represent means, 95% CI, minimum and maximum values. Different superscript letters 5
indicate significant differences as analysed by one-way ANOVA with post-hoc correction by 6
Bonferroni, P<0.05. 7
34
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1
Figure 7. Natural killer (NK) activity of spleen leukocytes of mice from the four 2
experimental groups (C: control; OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA; 3
OD-N3: obesogenic diet + n-3 PUFA; n=8 animals/group). All assays were performed in 4
triplicates. Boxplots represent means, 95% CI, minimum and maximum values. Different 5
superscript letters indicate significant differences as analysed by one-way ANOVA with post-6
hoc correction by Bonferroni, P<0.05. 7
35
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1
Figure 8. Lymphoproliferative response to concanavalin A (ConA) (A) and to 2
lipopolysaccharide (LPS) (B) of spleen leukocytes of mice from the four experimental groups 3
(C: control; OD: obesogenic diet; OD-HO: obesogenic diet + 2-OHOA; OD-N3: obesogenic 4
diet + n-3 PUFA; n=7 animals/group). All assays were performed in triplicates. Boxplots 5
represent means, 95% CI, minimum and maximum values. Different superscript letters 6
indicate significant differences as analysed by one-way ANOVA with post-hoc correction by 7
Tamhane (ConA) or Bonferroni (LPS), P<0.05. 8
9
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1
![Manual Bromatología Alumno[1]](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/577cc4b01a28aba7119a1d8d/manual-bromatologia-alumno1.jpg)
