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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
Desenvolvimento de biossensor baseado em Polímeros
Molecularmente Impressos (MIPs) via eletropolimerização para
detecção celular
Thaina Brumatti de Oliveira
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.
Orientador(a):
Prof. Dr. Jonas Gruber
São Paulo
2020
1
2
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Célula eletroquímica ............................................................................12
Figura 2 – Célula preparada para eletropolimerização ..........................................13
Figura 3 – Configuração do potenciostato .............................................................13
Figura 4 – Pirrol ....................................................................................................14
Figura 5 – Levedura Dr. Oetker ............................................................................. 15
Figura 6 – Fio de titânio oxidado ...........................................................................15
Figura 7 - Palm Sens4 e Multiplexer oxidado ........................................................17
Figura 8 – Superfície polimerizada pré-lavagem ...................................................20
Figura 9 – Superfície polimerizada pós-lavagem ................................................... 21
Figura 10 – Camada polimérica em 3D .................................................................22
Figura 11 - Relação frequência x porcentagem da ligação à cavidade polimérica.23
Figura 12 – Relação impedância x concentração celular para CH1 e CH2 ...........24
Figura 13 – Gráfico dose-resposta normalizado para levedura ............................. 26
Figura 14 – Seletividade em diferentes meios .......................................................27
Figura 15 - Gráfico dose-resposta normalizado matriz complexa ..........................29
3
LISTA DE ABREVIATURAS
MIP
NIP
OCT
PBS
Molecular-Imprinted Polymer – Polímero Molecularmente Impresso
Non-Imprinted Polymer – Polímero Molecularmente Não-impresso
Optical Coherence Tomography – Tomografia de Coerência Óptica
Phosphate-Buffered Saline – Tampão Fosfato Salino
FDA
FAO
Food and Drug Administration – Administração de Alimentos e
Medicamentos
Food and Agriculture Organization – Organização das Nações
Unidas para Alimentação e Agricultura
4
RESUMO
DE OLIVEIRA, T.B. Desenvolvimento de biossensor baseado em Polímeros Molecularmente Impressos (MIPs) via eletropolimerização para detecção celular. 2020. 40. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2020. Palavras-chaves: Biossensor. MIP. Eletropolimerização. Os métodos de detecção utilizados em laboratórios atualmente podem levar até duas semanas para revelarem resultado. Tal fato pode ser extremamente prejudicial em diversas áreas da ciência, principalmente para detecção de doenças e de contaminações bacterianas ou virais em alimentos. O desenvolvimento de um novo método que possa realizar essa detecção em menos tempo e de forma mais prática traria muitos benefícios nesse sentido. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um método efetivo de detecção de células patogênicas com um biossensor baseado em polímeros molecularmente impressos (MIPs). Foram realizados experimentos para a confecção do biossensor via eletropolimerização, para a formação do MIP, e sua efetividade e seletividade foi medida posteriormente via espectroscopia de impedância eletroquímica e análises da impedância. Também se utilizou de técnicas de imagem para melhor visualização das cavidades obtidas no processo de impressão molecular. O método se mostrou positivo para a produção de um biossensor baseado em MIP para detecção de leveduras, porém ainda precisa de ajustes para detecção de Escherichia coli. A eletropolimerização é um método viável, rápido e barato para a realização de impressão de moléculas em uma base de polímero, podendo ser utilizado para produção de biossensores. Deve-se, porém, levar em consideração a particularidade de cada célula a ser utilizada e realizar adaptações ao procedimento como um todo.
5
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 7
2 OBJETIVOS..................................................................................................... 9
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 10
3.1 ELETROPOLIMERIZAÇÃO ............................................................................ 10
3.2 CÉLULA DE FLUXO ...................................................................................... 11
3.3 ESCOLHA DO MONÔMERO ......................................................................... 14
3.4 ESCOLHA DA CÉLULA ................................................................................. 14
3.5 LAVAGEM ...................................................................................................... 15
3.6 ANÁLISE DE IMAGEM ................................................................................... 16
3.7 VERIFICAÇÃO DA LIGAÇÃO VIA ESPECTROSCOPIA DE IMPEDÂNCIA
ELETROQUÍMICA ................................................................................................... 16
3.8 TESTES DE SELETIVIDADE ......................................................................... 18
3.9 SOLUÇÕES COMPLEXAS ............................................................................ 18
3.10 REPRODUÇÃO DO PROCESSO EXPERIMENTAL COM E. COLI ............... 19
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 20
4.1 TÉCNICAS DE IMAGEM ................................................................................ 20
4.1.1 Microscopia eletrônica ................................................................................. 20
4.1.2 Tomografia de coerência óptica (OCT) ....................................................... 22
4.2 ESPECTROSCOPIA DE IMPEDÂNCIA ELETROQUÍMICA ........................... 23
4.3 SELETIVIDADE ............................................................................................. 26
4.4 SOLUÇÕES COMPLEXAS ............................................................................ 28
4.5 E. COLI .......................................................................................................... 29
5 CONCLUSÕES .............................................................................................. 31
REFERÊNCIAS ............................................................................................. 32
APÊNDICE A ................................................................................................. 35
APÊNDICE B ................................................................................................. 36
APÊNDICE C ................................................................................................. 37
APÊNDICE D ................................................................................................. 38
6
APÊNDICE E ................................................................................................. 39
APÊNDICE F ................................................................................................. 40
7
1. INTRODUÇÃO
O projeto trata do desenvolvimento de um biossensor capaz de detectar
microorganismos, analisando, em tempo real, a resistência elétrica da interface de
uma camada polímérica. Esse biossensor é baseado em Polímeros
Molecularmente Impressos (MIP), e consiste num tipo de receptor biomimético que
é produzido para ser seletivo na detecção de um alvo e funciona simulando
sistemas biológicos do tipo ligante/receptor de seres vivos.
O funcionamento do biossensor se resume à detecção de células por meio de
uma camada de polímero. Essa camada se comporta como um receptor para as
células, devido à impressão de células-modelo em sua superfície. A impressão
dessas células forma um padrão de microcavidades que são compatíveis com as
células-alvo em tamanho, forma e distribuição de grupos funcionais (EERSELS et
al, 2013), tornando possível uma ligação seletiva e de alta afinidade entre as
células e suas impressões correspondentes.
O processo atual de detecção de células realizado em laboratórios pode levar
até duas semanas (BELL et al, 2016), e, segundo a FAO (apud ONU, 2019),
tratando-se de contaminação de alimentos, isto pode implicar em deterioração de
grandes lotes de alimentos e infecção da população, levando à resistência
bacteriana, sobrecarga do sistema de saúde e mortes, além do desperdício de
alimentos. As enfermidades transmitidas por comida levam à óbito cerca de 420
mil pessoas no mundo anualmente (FAO, apud ONU, 2019).
Existem diversos tipos de doenças transmitidas por alimentos e contaminações
bacterianas são responsáveis por uma grande fração destes (BRASIL, 2010).
Alimentos e bebidas podem ser infectados em vários estágios, como já em
uma fazenda, mais à frente em uma fábrica de processamento de alimentos, ou,
ainda, devido ao armazenamento e manuseio inadequado na loja ou na casa do
consumidor.
8
É aconselhável identificar amostras estragadas o mais cedo possível na cadeia
de produção para evitar a deterioração de grandes lotes de alimentos e descartar
amostras infectadas antes do consumo ser realizado.
O impacto dos alimentos inseguros gera, todos os anos, uma perda de
produtividade estimada em cerca de US$ 95 bilhões às economias em
desenvolvimento, segundo a FAO (apud ONU, 2019). A Organização Mundial de
Saúde (OMS) (apud RASZ, 2018) estima que as enfermidades transmitidas por
comida acometam mais de 77 milhões de pessoas por ano nas Américas, e,
destas, mais de 9 mil falecem. No mundo, o número chega a 420 mil mortes e, de
acordo com a OMS (apud RASZ, 2018), com o aumento de bactérias resistentes
aos antibióticos, este número tende a aumentar.
Visando o desenvolvimento de uma opção viável para resolução dos
problemas apresentados, este projeto trata do desenvolvimento de um biossensor
para a detecção in loco de Escherichia coli, um indicador geral de higiene no
manuseio de alimentos (CORNELIS et al, 2019), para o estabelecimento de um
método mais rápido e ágil que poderá salvar lotes alimentícios de maiores
contaminações e evitar a distribuição de alimentos contaminados à população.
9
2. OBJETIVOS
Este projeto visa ao desenvolvimento de receptores sintéticos para células
baseados em polímeros molecularmente impressos (MIP) obtidos pela técnica de
eletropolimerização. Com esses receptores, será possível a detecção de uma
célula-alvo em uma solução aquosa.
O método de detecção desenvolvido é rápido e pode, teoricamente, ser
aplicado para detecção de qualquer tipo de célula, trazendo inovação
principalmente para os campos medicinal – para detecção de doenças e infecções
– e alimentício. Recentemente, os biossensores vêm sendo desenvolvidos,
visando segurança alimentar e garantia de qualidade em alimentos devido à sua
rapidez e facilidade de uso, que os fazem vantajosos (MEHROTRA, 2016).
É importante ressaltar que, para o desenvolvimento de biossensores
efetivos, estes devem possuir alta afinidade e especificidade quando se fala de
reconhecimento do elemento/célula escolhido. (CHAMBERS et al, 2008;
MORALES, HALPERN, 2018; VAN DORST et al, 2010).
Ainda, deve-se considerar que o desenvolvimento de um biossensor que é
capaz de reconhecer células patogênicas em uma solução, contendo apenas a
célula em si não é o suficiente, visto que em matrizes alimentares há, na maioria
das vezes, a presença de outras células que podem também ligar-se às cavidades
e interferir na detecção.
Busca-se com esse projeto, portanto, o desenvolvimento de um biossensor
que seja não só capaz de detectar a célula desejada, mas que possa detectá-la
em meios complexos de forma viável, ágil, seletiva e eficiente.
10
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Para a confecção da camada polimérica a ser utilizada no biossensor foi
aplicada a técnica de eletropolimerização em presença celular, seguida por
lavagem do polímero, para a limpeza das cavidades formadas, e realização de
medições referentes à criação destas, bem como testes para averiguar sua
efetividade e seletividade.
Para visualizar a presença de ligação celular às cavidades formadas,
utilizou-se o método de espectroscopia de impedância eletroquímica para medir a
alteração de resistência na camada de polímero e, para confirmação de sua
seletividade, realizaram-se medições de impedância em presença de outras
células que não as células alvo que foram impressas molecularmente no polímero.
Além disso, utilizaram-se de microscopia eletrônica e da técnica de
tomografia de coerência óptica para análise da superfície formada via imagem.
Esses procedimentos serão descritos nos próximos parágrafos.
3.1 ELETROPOLIMERIZAÇÃO
A eletropolimerização é um meio simples de obtenção de filmes de
polímeros com uma certa espessura que pode ser controlada pelo número de
ciclos ou pela corrente aplicada ao eletrodo de trabalho durante o procedimento.
(ANTUÑA-JIMÉNEZ et al, 2012).
Para esta ocorrer, é necessário que a superfície do eletrodo de trabalho,
esteja submersa em uma solução com o monômero desejado, um solvente e um
eletrólito de suporte e, ainda, que haja a presença de um contra-eletrodo e
eletrodo de referência. (DE LEON, A; ADVINCULA, R. C., 2014). Depois, é
necessária a aplicação de uma corrente elétrica para efetivação do processo.
Os elétrons seguem através da interface eletrodo-eletrólito quando um
potencial é aplicado ao eletrodo de trabalho e então a camada de polímero é
formada na sua superfície. O método de eletropolimerização utilizado foi o
potenciostático, no qual o potencial foi controlado durante todo o procedimento.
11
Ao realizar a eletropolimerização em presença de um monômero e de uma
célula alvo desejada, espera-se que a camada formada possua tais células
afixadas a ela. Assim, obtém-se o MIP.
Para efeito de comparação, uma das polimerizações é realizada sem
presença de nenhuma célula, resultando, assim, em uma camada polimérica sem
impressões (NIP – Polímero Não-Impresso), para que se possa comparar a
diferença de resposta entre um polímero que possui cavidades impressas (MIP) e
outro que não as possui (NIP).
Como soluções de polimerização foram preparadas soluções contendo 60
μL de pirrol, como monômero, e 2 mL de KCl, como eletrólito suporte. Para o caso
do MIP, adicionaram-se células de levedura, Sacharomyces cerevisiae, e de
Escherichia coli para realizar a impressão, ambas na quantidade de 3x10⁷ células.
Além disso, foi utilizada uma célula de fluxo, dois fios de titânio como
superfície de polimerização (eletrodos de trabalho), um fio de platina como contra-
eletrodo e um eletrodo de referência de Ag/AgCl, conectados ao potenciostato,
para que a reação de polimerização fosse possível. Todos os experimentos foram
realizados no Laboratory for Soft Matter and Biophysics da Katholieke Universiteit
Leuven (KU Leuven), e os materiais e células foram cedidos pelo Deparment of
Physics and Astronomy da KU Leuven.
3.2 CÉLULA DE FLUXO
Para realização da polimerização, é necessária uma célula de fluxo em que
se possa adicionar as soluções para formação do polímero e posteriormente
aplicar a corrente elétrica para finalizar o processo.
O material utilizado para tal foi fabricado pelos doutorandos do Department
of Physics and Astronomy da KU Leuven e consiste em um compartimento em
resina amarela confeccionado em impressora 3D com cinco entradas e uma
cavidade central (Figura 1). A região central possui um espaço no qual é
depositado o líquido utilizado para polimerização, que entra em contato com os
fios inseridos pelas entradas do lado esquerdo e do lado direito (eletrodos de
12
trabalho). Esses fios são de titânio (0,8 mm de diâmetro) e foram fornecidos pela
universidade KU Leuven. As pontas dos fios foram polidas com lixa para que
ficassem uniformes e planas, pois é nelas que ocorre a deposição da camada
polimérica durante o processo de polimerização.
Figura 1 – Célula eletroquímica
Fonte: Elaborado pela autora
Para adição do líquido de polimerização na cavidade central, utilizou-se da
agulha inserida na entrada inferior da célula. Por meio dessa, foi possível inserir o
líquido desejado com o uso de uma seringa.
Na parte superior da célula, existem mais duas entradas: uma para o
eletrodo de referência e uma para o fio de platina (contra-eletrodo).
Os parafusos inseridos na superfície da célula funcionam como fixadores
dos fios de titânio, impedindo movimentações que possam interferir no processo
eletroquímico.
Após a organização da célula de fluxo, esta foi fixada com uma garra num
suporte, conforme mostrado na Figura 2, e conectada ao potenciostato Palm-
Sens4, que forneceu potencial constante aos eletrodos de trabalho de modo a
permitir o fluxo de uma corrente elétrica entre esses eletrodos e o contra-eletrodo,
tornando possível a polimerização do pirrol.
13
Figura 2 – Célula preparada para eletropolimerização
Fonte: Elaborado pela autora
Iniciou-se o processo de polimerização, após a inserção dos dados no
software do Palm-Sens4. Foram realizados 10 ciclos de corrente elétrica de 1 mA..
Esse procedimento levou cerca de 15 minutos, como pode se observar na Figura
3 a seguir.
Figura 3 – Configuração do potenciostato
Fonte: Elaborado pela autora
Como desejava-se preparar o NIP e o MIP nas mesmas condições, após a
conclusão da polimerização do NIP no primeiro eletrodo de trabalho, mudou-se o
cabo vermelho do potenciostato para o outro eletrodo de trabalho, inseriu-se a
14
solução de polimerização para o MIP (contendo as células) e realizou-se o mesmo
procedimento, nas mesmas condições, depositando o MIP no segundo eletrodo de
trabalho.
3.3 ESCOLHA DO MONÔMERO
O monômero de escolha para realização da eletropolimerização foi o pirrol.
O pirrol é um composto orgânico heterocíclico aromático insaturado, cuja fórmula
molecular é C4H5N e sua fórmula estrutural é mostrada na Figura 4.
Figura 4 - Pirrol
Fonte: Merck Millipore, 2020
A reação de polimerização eletroquímica do pirrol ocorre prontamente e é
de fácil visualização, pois forma uma camada de polímero escura (YI, 2016).
O polímero possui alta condutividade elétrica e existem relatos de que ele
seja biocompatível (RAMANAVICIENE, 2007), fator imprescindível, visto que o
MIP pode ser utilizado para diagnósticos médicos e em alimentos. Ainda, o
polímero possui baixo custo, o que o torna ideal para os experimentos.
3.4 ESCOLHA DA CÉLULA
Por se tratar do início do desenvolvimento do MIP, a célula de escolha para
os experimentos foi a levedura (Figura 5). As leveduras possuem parede celular
resistente, custo baixo e são inofensivas, sendo, portanto, ideais para esta fase do
projeto.
15
Figura 5 – Levedura Dr. Oetker
Fonte: Dr. Oetker, 2020
O uso de Escherichia coli ocorreria após a obtenção de resultados positivos
com a levedura, pois se trata de uma célula mais sensível às condições aplicadas
na polimerização.
3.5 LAVAGEM
Após a finalização do processo de polimerização, os fios de titânio laterais
foram cuidadosamente retirados e foi possível notar, a olho nu, que esses
possuíam uma camada preta em sua ponta, devido à polimerização do pirrol
formando polipirrol (Figura 6).
Figura 6 – Fio de titânio oxidado
Fonte: Elaborado pela autora
16
Supondo-se que a eletropolimerização ocorreu de forma correta, para o NIP
foi utilizada uma superfície de polímero “vazia” (sem impressão) e, para o MIP,
uma superfície polimérica com células de levedura fixadas na camada formada.
O próximo passo foi a retirada das células do MIP para obtenção das
cavidades formadas vazias, que seriam utilizadas para a verificação da
capacidade de religação das células de levedura ao MIP e, assim, se tornaria
possível utilizar este na detecção dessas células.
Para tal, foi realizado um processo de lavagem com ácido e base. Os fios
foram submersos em uma placa de petri contendo HCl 0,5 M por 10 minutos, e
logo após, em uma placa contendo NaOH 0,5 M por mais 10 minutos.
Após as lavagens, os eletrodos foram submersos em PBS (Tampão
Fosfato-Salino) para remover os resíduos de ácido e base da superfície, deixando,
portanto, as cavidades formadas limpas e neutras.
3.6 ANÁLISE DE IMAGEM
Para verificação visual da ligação célula-polímero, que ocorre na camada
polimérica formada, foi utilizado o método de microscopia eletrônica, em maior
aumento, das pontas dos eletrodos de titânio. Visou-se, também, verificar a
efetividade do procedimento de lavagem para liberação das cavidades.
Além dessa técnica, um dos eletrodos de titânio polimerizados e
posteriormente lavado foi enviado para um laboratório parceiro da Universidade
KU Leuven para que pudesse ser realizada a Tomografia de Coerência Óptica
(OTC), para, assim, ser possível visualizar as cavidades formadas na camada
polimérica. Com essa técnica, pode-se obter imagens tridimensionais da superfície
formada de acordo com a dispersão, espalhamento ou reflexão da luz de baixa
coerência no meio (FUJIMOTO, 2000).
3.7 VERIFICAÇÃO DA RELIGAÇÃO VIA ESPECTROSCOPIA DE IMPEDÂNCIA
ELETROQUÍMICA
17
Para verificação da ocorrência da religação das leveduras às cavidades por
elas impressas, foi medida a impedância elétrica da camada polimérica em
soluções com diferentes concentrações de levedura em PBS.
Como espera-se que as ligações ocorram de forma dependente da
concentração, foram feitas 12 soluções, sendo que se iniciou o processo de
preparação destas pesando 0,36 g de levedura Dr. Oetker e misturando este com
1 mL de PBS, resultando em uma solução principal.
A partir da solução principal, que contém 3x10⁷ células de levedura/mL de
PBS, realizou-se a diluição para as concentrações de 10⁷, 3x10⁶, 10⁶, 3x10⁵, 10⁵,
3x10⁴, 10⁴, 3x10³, 10³, 3x10² e 10². Também foi realizada a medição da resistência
apenas em PBS, para que pudéssemos ter uma linha de base considerada como
um valor nulo para impedância.
O equipamento Palm Sens4 foi novamente conectado à célula de fluxo,
porém desta vez acoplado também ao Multiplexer MUX8-R2, como demonstrado
na Figura 7, para que fosse possível medir a impedância tanto no NIP quanto no
MIP automaticamente, já que esse aparelho permite realização de medições em
mais de um eletrodo de trabalho simultaneamente.
Ao adicionar as soluções na célula de fluxo, espera-se que haja alteração
na impedância do revestimento de polímero, visto que a presença de células nas
cavidades oferece resistência para a passagem da corrente elétrica pela cavidade.
Figura 7 – Palm Sens4 e Multiplexer
Fonte: Elaborado pela autora
18
Apesar de o NIP não possuir nenhuma cavidade, é importante realizar a
medição de sua impedância para que seja possível descontar, posteriormente, os
efeitos externos, ligações passivas e interferências de outros fatores, como
integridade da camada polimérica e estabilidade do líquido, que podem ocorrer e
modificar a resistência da camada em si. Assim, torna-se possível a discriminação
de uma ligação ativa, que efetivamente ocorre, das leveduras nas cavidades.
3.8 TESTES DE SELETIVIDADE
Para verificar se a ligação que ocorre entre a célula e a cavidade é seletiva,
ou seja, se somente a célula de levedura se liga a esta cavidade ou se, ao inserir
outra célula, também ocorre a ligação, realizaram-se as medições com soluções
de E. coli e uma matriz complexa. Essas medições foram feitas com as mesmas
concentrações posteriormente utilizadas para as leveduras para se manter um
padrão e aumentar a confiabilidade do estudo.
Além disso, caso seja registrada a existência de ligação às cavidades em
presença de outra célula que não a levedura, espera-se que esta seja uma ligação
aleatória, ou seja, que não possua uma correlação de ligação concentração-
dependente. Este é o principal motivo de se utilizar diversas concentrações para a
realização desse teste.
3.9 SOLUÇÕES COMPLEXAS
Para verificar se a levedura pode ser detectada em uma solução com outros
compostos inseridos, e não somente a célula-alvo em presença de PBS, foi
realizada a medição de diferentes soluções, em diferentes concentrações, em
presença de levedura e uma matriz complexa na quantidade fixa de 100 μL.
Como na realidade dificilmente se tem uma solução que contenha apenas a
célula alvo, que, no caso, é a levedura, sem mais nenhum interferente, é
necessário verificar se a presença de outros compostos dificulta essa detecção.
19
3.10 REPRODUÇÃO DO PROCESSO EXPERIMENTAL COM E. COLI
Com a obtenção de resultados positivos na produção do biossensor com
uma célula relativamente simples, como a levedura, iniciaram-se os testes para
reprodução do experimento com células da bactéria Escherichia coli.
Todo o procedimento anteriormente realizado com a levedura foi repetido
com essa bactéria.
20
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 TÉCNICAS DE IMAGEM
4.1.1 Microscopia eletrônica
Com a imagem obtida pelo microscópio, no aumento de 1000 vezes, pode-
se verificar, na Figura 8, diversas células de levedura acopladas à superfície
polimérica, demonstrando que a eletropolimerização ocorreu de forma efetiva no
que se diz à impressão celular na superfície.
Figura 8 – Superfície polimerizada pré-lavagem
Fonte: Elaborado pela autora
Porém, a eletropolimerização não ocorreu de forma completa no sentido de
formação íntegra da camada polimérica. As partes prateadas da Figura 8, que
21
representam a reflexão da luz do microscópio, demonstram que a superfície do fio
de titânio não foi coberta integralmente por polipirrol.
Tal fato pode ser explicado por uma possível quantidade insuficiente de
ciclos de corrente elétrica durante a polimerização, ou, até mesmo, que o
polimento da superfície do fio não foi suficiente, deixando este com relevos e não-
uniformidades que dificultaram a finalização da polimerização por completo.
Figura 9 -Superfície polimerizada pós lavagem
Fonte: Elaborado pela autora
Na Figura 9, pode-se observar a camada polimérica em aumento de 2000
vezes, e nota-se que, neste ponto do experimento, a maioria das células que
estavam impressas na superfície foram retiradas, deixando somente cavidades
com o formato celular desejado, o que era esperado após o procedimento de
lavagem com ácido e base.
22
4.1.2 Tomografia de coerência óptica (OCT)
A Figura 10 foi obtida em um aparelho de OCT de um laboratório parceiro
ao Laboratory for Soft Matter and Biophysics, após envio de um dos eletrodos de
titânio já recoberto pelo polímero para análise por esta técnica que reproduz, em
um software, a superfície formada pelo polímero de forma tri-dimensional.
Figura 10 – Camada polimérica em 3D (Ampliação de 150 x)
Fonte: Elaborado pela autora
Nota-se claramente por meio desta técnica a presença de cavidades,
representadas em vermelho, na superfície verde, que representa a camada
polimérica produzida.
23
4.2 ESPECTROSCOPIA DE IMPEDÂNCIA ELETROQUÍMICA
Como as medições foram realizadas em diversas frequências,
primeiramente analisou-se em qual frequência seriam obtidos os melhores
resultados para a ligação da levedura na cavidade.
Foram subtraídos todos os valores de impedância do NIP dos valores do
MIP, para então obter o valor da ligação ativa da levedura na cavidade, sem
nenhuma outra interferência que poderia estar relacionada à presença da camada
polimérica no eletrodo de titânio.
Os resultados abaixo, na Figura 11, são representados em porcentagem de
ligação, relacionados as frequências utilizadas para medição no laboratório.
Figura 11 – Relação frequência x porcentagem da ligação à cavidade polimérica
Fonte: Elaborado pela autora
Chegou-se à conclusão de que nas menores frequências obtém-se a maior
porcentagem de ligação da levedura à camada polimérica. Isto já era esperado, de
24
acordo com a teoria, visto que em frequências menores é possível ver exatamente
a ligação mais próxima à superfície, sem grandes interferências de outros fatores
presentes no meio, como, por exemplo, a solução utilizada para a medição.
Sendo assim, após análise individual dos gráficos de menores frequências
e levando-se em consideração o desvio padrão de cada um deles, chegou-se a
conclusão que a frequência de 39.811Hz é considerada como ótima para medição
das ligações, e, portanto, esta foi utilizada para demonstração dos próximos
resultados.
Como foram realizadas medições de impedância em diferentes
concentrações de células presentes, foi possível obter gráficos que demonstram
se há ligação nas cavidades e se esta é concentração-dependente.
Essas medições foram realizadas tanto para o MIP quanto para o NIP,
portanto temos 2 gráficos para analisar. O gráfico denominado CH1 refere-se à
ligação das células de levedura no MIP e o CH2 às ligações passivas que ocorrem
na superfície do NIP.
Figura 12 – Relação impedância x concentração celular para CH1 e CH2
Fonte: Elaborado pela autora
25
O gráfico do CH1 mostra que, à medida que a concentração celular
aumenta, há também um aumento da impedância, uma vez que mais leveduras se
ligam às cavidades no MIP.
Já o gráfico do CH2 demonstra que a impedância não está diretamente
relacionada à concentração, porém é possível notar que há um aumento na
impedância à medida que a concentração aumenta. Em teoria, nenhuma ligação
ou pouca ligação passiva deve ocorrer no NIP e o gráfico deveria apresentar uma
linha horizontal, mas isso não é totalmente observado na prática. Existem alguns
fatores que podem ter contribuído para isso, podendo-se citar dentre estes o fato
de o revestimento polimérico não estar cobrindo todo o fio, levando a algumas
falhas nessas medições.
É importante ressaltar que os gráficos estão em escala diferente, portanto
analisá-los lado a lado pode levar a conclusões errôneas.
Foi construído um gráfico normalizado para análise da ligação efetiva da
levedura à cavidade, como pode-se verificar na Figura 13, e isso só foi possível de
realizar pois retiraram-se os valores de impedância obtidos no NIP (CH2) dos
valores do MIP (CH1), eliminando assim quaisquer outros fatores que poderiam
causar interferência na cavidade, como já dito anteriormente, e normalizando o
valor final.
26
Figura 13 – Dose-resposta normalizado para levedura
Fonte: Elaborado pela autora
Com isso, nota-se que a ligação ativa ocorre de forma concentração-
dependente, o que comprova a efetividade do biossensor produzido.
4.3 SELETIVIDADE
Os seguintes gráficos foram obtidos para o biossensor moldado para
detecção de levedura em soluções de levedura (coluna 1), de E. coli (coluna 2) e
em uma matriz complexa (coluna 3), demonstrados na Figura 14. Estes podem ser
visualizados em tamanho original nos Apêndices. As medições apresentadas
foram realizadas na frequência determinada como ótima, de 39.811Hz.
27
Figura 14 – Seletividade em diferentes meios
Fonte: Elaborado pela autora
Na primeira linha da Figura 14, os três gráficos se referem à impedância, no
eixo horizontal, com relação à concentração, no eixo vertical, do revestimento
obtido no MIP em presença de soluções de levedura, E. coli e uma matriz
complexa, respectivamente. Já na segunda linha, essas mesmas medições são
obtidas para o NIP.
Pode-se concluir, após análise dos gráficos, que a impedância obtida pela
ligação da levedura ao MIP está relacionada diretamente à concentração de célula
presente, ou seja, quanto mais células presentes, mais ligações às cavidades
ocorrem, o que é de se esperar para um biossensor funcional.
Já para os casos de medição de impedância para o biossensor em
presença de E. coli e matriz complexa tal fato não ocorre. Os pontos de
impedância se tornam mais aleatórios e não relacionados diretamente ao aumento
de concentração, e, portanto, as mudanças representadas pela impedância não
representam ligações ativas das células nas cavidades.
28
Para as medidas obtidas no NIP, teoricamente nenhuma das soluções
deveria apresentar significante modificação de impedância com o aumento de
concentração celular presente, mas nota-se a presença de interações que
ocorrem com a camada polimérica. Porém, estas são em escala bem menor do
que a ligação efetiva em si demonstrada para o MIP da levedura, e ainda se
demonstram aleatórias e não correlacionadas diretamente à concentração,
indicando que o que ocorre são ligações passivas a outras influências possíveis
do meio de medição, como a composição da solução ou a integridade da
superfície polimérica.
4.4 SOLUÇÕES COMPLEXAS
Para a detecção de levedura em solução complexa, apresenta-se o gráfico,
demonstrado na Figura 15, já com o resultado de sinal diferencial (%MIP - %NIP),
que demonstra a obtenção da ligação ativa da levedura à cavidade, em frequência
definida experimentalmente como ótima. O PBS foi utilizado como o zero para
padronização das medições, já que as soluções de leveduras foram dissolvidas
em PBS.
29
Figura 15 – Dose resposta normalizado matriz complexa
Fonte: Elaborado pela autora
No eixo horizontal pode-se verificar a concentração de levedura e o eixo
vertical representa a ligação ativa da levedura à sua cavidade no polímero MIP.
Como nota-se uma linha crescente com a concentração, comprova-se que a
ligação ocorre mesmo em presença de outras matrizes que poderiam vir a
atrapalhar em tal ligação.
4.5 E. COLI
Ao realizar a reprodução do procedimento com o uso da bactéria
Escherichia coli como célula alvo, os resultados obtidos não foram positivos.
A eletropolimerização ocorreu de forma aparentemente normal e os
eletrodos de titânio finalizavam o processo com a camada polimérica preta
característica formada.
30
Contudo, ao realizar medições de impedância, após as lavagens, com o
método de espectroscopia de impedância eletroquímica, os resultados diferiam do
esperado e não seguiam a correlação impedância-concentração dependente,
indicando que a ligação das bactérias às cavidades não estava ocorrendo.
Algumas hipóteses foram aventadas que poderiam justificar a não
adaptação da bactéria ao procedimento realizado da mesma forma que para a
levedura.
Chegou-se à conclusão de que a concentração salina da solução utilizada
para a polimerização pode ser elevada demais para as condições ideias de
sobrevivência da E. coli (ABDULKARIM, 2009), levando à uma ruptura da
membrana celular destas durante o procedimento.
Ainda, a corrente elétrica aplicada no procedimento pode deformar as
células, fazendo com que as cavidades formadas não possuam o formato real de
uma bactéria em condições naturais.
Também se encontrou na literatura que o pirrol pode ter propriedades
antibióticas, o que pode também deformar a célula utilizada para a impressão
molecular (KAUR, 2017).
O próximo passo do projeto é, portanto, investigar possíveis causas de
erros e buscar alternativas plausíveis e aplicáveis para solucioná-los.
31
5. CONCLUSÕES
Foi possível confeccionar um biossensor baseado em um MIP de levedura
que respondeu a diferentes concentrações da mesma, e este resultado foi obtido
mais de uma vez, provando que o experimento pode ser reprodutível.
Também foi possível visualizar as cavidades formadas por técnicas de
imagem e a diferença de impedância com o aumento da concentração celular da
célula alvo comprovou a efetividade e o funcionamento da técnica e do
biossensor.
Além disso, o biossensor apresentou seletividade e funcionalidade em
meios complexos, com mais de uma célula presente, características
extremamente importantes para tornar o mesmo aplicável em detecções nas
indústrias e hospitais.
Contudo, ao realizar o procedimento de polimerização e confecção de
sensor com uma diferente célula-alvo, E. coli, notou-se que este precisaria de um
maior aprimoramento e adaptação para poder ser utilizado em uma célula que
possui maior sensibilidade que à célula de levedura.
Como a técnica já se demonstra efetiva para um tipo celular, é uma questão
de tempo e estudo para que surjam adaptações do procedimento, tornando
possível a obtenção de biossensores produzidos por eletropolimerização para
detecção, não somente de E. coli, mas de outras bactérias e células patogênicas.
32
REFERÊNCIAS
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heat-stressed and unstressed Escherichia coli. Journal of Food Agriculture and
Environment. Scotland, v.7, p. 51-54, 2009.
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2016.
35
APÊNDICE A – MIP de levedura
36
APÊNDICE B – NIP de levedura
37
APÊNDICE C – MIP de E. coli
38
APÊNDICE D – NIP de E. coli
39
APÊNDICE E – MIP de matriz complexa
40
APÊNDICE F – NIP de matriz complexa
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Data e assinatura da aluna Data e assinatura do orientador
