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FERNANDES, K. V.
i
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOENSAIO PARA
DETECÇÃO DE RICINA E UTILIZAÇÃO DA FERMENTAÇÃO
EM ESTADO SÓLIDO PARA DESTOXIFICAÇÃO DA TORTA
DE MAMONA E PRODUÇÃO DE LIPASE
KEYSSON VIEIRA FERNANDES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ.
FEVEREIRO de 2010
FERNANDES, K. V.
ii
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOENSAIO PARA
DETECÇÃO DE RICINA E UTILIZAÇÃO DA FERMENTAÇÃO
EM ESTADO SÓLIDO PARA DESTOXIFICAÇÃO DA TORTA
DE MAMONA E PRODUÇÃO DE LIPASE
KEYSSON VIEIRA FERNANDES
Orientadora: Drª. Olga Lima Tavares Machado
Co-Orientadora: Drª. Denise Maria Guimarães Freire
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Química e Função de
Proteínas e Peptídeos, no Centro de Biociências e Biotecnologia, sendo
apoiado financeiramente pelo CNPq, UENF, FAPERJ e TECNORTE.
UNIIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ.
FEVEREIRO DE 2010.
FERNANDES, K. V.
iii
Dissertação de mestrado apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências
e Biotecnologia.
Banca Examinadora:
...............................................................................................................
Dr.André de Oliveira Carvalho, LFBM/CBB/UENF
...............................................................................................................
Drª. Marília Amorim Berbert de Molina, LBT/CBB/UENF
...............................................................................................................
Dr. Reginaldo Ramos de Menezes, IQ/LABENZ/UFRJ
...............................................................................................................
Drª. Olga Lima Tavares Machado, LQFPP/CBB/UENF (Orientadora)
...............................................................................................................
Drª Denise Maria Guimarães Freire, LABIM/IQ/UFRJ (Co-Orientadora)
UNIIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ.
FEVEREIRO DE 2010.
FERNANDES, K. V.
iv
“Viva. Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida
com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, porque o
mundo pertence a quem se atreve e a vida é muito para ser
insignificante.”
Charles Chaplin
Dedico à minha mãe, familiares
e todos os amigos, que de
alguma forma me ajudaram a
chegar até aqui.
FERNANDES, K. V.
v
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora e amiga, Profª. Olga Lima Tavares Machado, pela
orientação, atenção e toda a paciência que teve comigo durante minha
iniciação científica e o mestrado.
À minha co-orientadora, Profª. Denise Maria Guimarães Freire, por todo
o suporte dado a esse trabalho, e por me receber tão bem no seu laboratório,
onde fiz amigos incríveis.
Ao Prof. Edésio José Tenório de Melo, pela colaboração no trabalho,
cedendo o seu laboratório para o desenvolvimento de toda a parte de biologia
celular, e pela revisão desta dissertação.
Aos companheiros e eternos amigos do LQFPP: Viviane, Cristiane,
Hélio, Nathália, Jucélia, Thiago, Karol, Iuri, Fernanda e Mariana. Um
agradecimento em especial ao Fabinho, que infelizmente não está mais entre
nós, mas que deixa grande saudade e um exemplo incrível de profissinalismo.
Agradeço a ele por tudo que me ensinou durante minha iniciação científica, que
utilizei durante o meu mestrado e que carregarei por toda a minha vida
acadêmica.
A todos os demais professores, alunos e técnicos do LQFPP, em
especial a Isabela e o Cristóvão.
Ao doutorando Mateus Godoy pela amizade e por toda a ajuda fornecida
durante os trabalhos de fermentação realizados no LaBiM.
Aos companheiros e amigos do LaBiM: Tais, Elisa (Pops), Bruno, Joab,
Jaque 1 e 2, Lívia, Val, Lu, Mel, Robertinha, Aline, Fernanda... enfim, todos.
Às alunas do LBCT Zu, Cris e Glau, por todo o apoio e a amizade
À Zu e a Viviane novamente, por me auxiliarem com os experimentos na
UENF durante o período que eu estive na UFRJ
Agradeço a todos os membros da banca pela atenção dedicada à
avaliação deste trabalho.
À minha família, especialmente minha mãe, minha avó Hercília e minha
tia Rosângela, por toda a força e carinho que foram essenciais para que eu
chegasse até aqui.
Aos meus amigos (irmãos) de Aperibé, em especial ao Ralph pela
paciência para conversar sobre trabalho comigo, o “Manél” pelas cervejas de
FERNANDES, K. V.
vi
sexta-feira e pelo meu sobrinho emprestado que chega no meio do ano, e o
Michell e o Beneto pelos momentos de rock n’ roll. Todos os demais também
foram e são muito importantes na minha vida, e me deram muito apoio durante
estes dois anos de mestrado.
Aos companheiros de UENF, principalmente aos que me aturaram com
mais freqüência: Luana (a que mais me aturou), Liana, Raul, David, Fabrício,
Giliane, Fernanda, Renan, Juliana, Marcelita, Edson, Cristina, Maria Clara,
Antônio, Euzimar, Isa, Natália e Lucilene. Obrigado por todo o apoio e amizade.
Aos companheiros de república Jair e Davi, e todos os outros que
passaram por lá durante estes dois anos, pela amizade e paciência.
Aos meus companheiros de banda Caio, “Scooby” e Mader, por toda a
paciência com os meus horários apertados na reta final do mestrado.
À Tia Regina, Tio Jorge, Isabela e Michelle por me abrigar e me acolher
como membro da família durante o tempo que estive no Rio de Janeiro para os
experimentos na UFRJ. Da Mesma forma agradeço aos meus amigos Thiago e
Pamella por cederem um cantinho para mim na casa deles durante o fim do
referido período.
Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a
conclusão deste trabalho, e a Deus que tornou tudo isso possível!
Obrigado!
FERNANDES, K. V.
vii
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS............................................................................................1
LISTA DE TABELAS............................................................................................2
LISTA DE ABREVIAÇÕES..................................................................................3
RESUMO.............................................................................................................4
ABSTRACT..........................................................................................................5
1 – INTRODUÇÃO...............................................................................................6
1.1 – Características botânicas da mamoneira.........................................7
1.2 – Aspectos econômicos da mamona..................................................9
1.2.1 – Produtos da mamona.......................................................11
1.2.2 – Torta de mamona.............................................................13
1.3 – Componentes alergênicos e tóxicos..............................................15
1.3.1 – Albuminas 2S de R. communis.........................................15
1.3.2 – Ricinina.............................................................................16
1.3.3 – Ricina................................................................................17
1.3.3.1 – Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs).....17
1.3.3.2 – Estrutura e função...............................................18
1.3.3.3 – Internalização e rota intracelular.........................20
1.3.3.4 – Aplicações da ricina............................................21
1.3.3.5 – Métodos de detecção da ricina...........................22
1.3.3.6 – Eliminação da ricina na torta de mamona...........23
1.4 – Fermentação em estado sólido......................................................24
1.4.1 – Microrganismos e substratos utilizados em FES..............28
1.4.2 – Aplicações da FES...........................................................29
1.5 – Aspergillus niger.............................................................................31
1.6 – Lípases...........................................................................................33
1.6.1 – Estrutura e mecanismo catalítico......................................34
1.6.2 – Aplicações das lipases.....................................................35
FERNANDES, K. V.
viii
1.6.2.1 – Alimentos............................................................35
1.6.2.2 – Detergentes.........................................................36
1.6.2.3 – Papel e celulose..................................................36
1.6.2.4 – Química fina e fármacos.....................................36
1.6.2.5 – Biodiesel..............................................................37
1.6.2.6 – Tratamento de efluentes.....................................37
1.6.3 – Produção de lipases por fermentação em estado sólido..38
2 – OBJETIVOS.................................................................................................40
2.1 – Objetivos gerais..............................................................................40
2.2 – Objetivos específicos.....................................................................40
3 – MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................41
3.1 – Padronização do método de avaliação da toxicidade usando
células Vero.............................................................................................41
3.1.1 – Purificação da ricina.........................................................41
3.1.2 – Obtenção do extrato protéico da torta de mamona..........42
3.1.3 – Testes de atividade tóxica em cultura de células.............42
3.1.3.1 – Ensaio de citotoxidade e curva de dose-
resposta........................................................................................42
3.1.3.1.a – Avaliação da toxicidade na presença de
anticorpo anti-ricina.................................................43
3.1.3.1.b– Avaliação da atividade tóxica.................43
3.2 – Processo de destoxificação por fermentação em estado sólido....44
3.2.1 – Microrganismos......................................................44
3.2.2 – Preparo da torta de mamona.................................44
3.2.3 – Propagação de inoculo..........................................44
3.2.4 – Fermentação no estado sólido...............................45
3.2.5 – Medida de parâmetros durante a fermentação......45
3.2.5.1 – Medida de crescimento............................45
3.2.5.2 – Medida de teor de umidade......................46
3.2.5.3 – Medida da atividade de água (Aw)............46
3.2.5.4 – Medida de pH...........................................46
FERNANDES, K. V.
ix
3.2.6 – Avaliação da toxicidade da torta de mamona
fermentada.........................................................................45
3.2.7 – Determinação das atividades enzimáticas na torta
fermentada.........................................................................47
3.2.7.1 – Extração das enzimas..............................47
3.2.7.2 – Dosagem da atividade lipásica.................47
3.2.7.3 – Dosagem da atividade proteásica............48
3.3 – Avaliação da toxicidade para torta de mamona submetida a
diversos processos de destoxificação.....................................................49
4 – RESULTADOS.............................................................................................50
4.1 – Obtenção da ricina parcialmente pura...........................................50
4.2 – Determinação do limite de detecção da ricina em cultura de células
Vero.........................................................................................................51
4.3 – Fermentação em estado sólido......................................................54
4.4 – Avaliação da destoxificação da torta de mamona por fermentação
em estado sólido.....................................................................................55
4.3 – Avaliação da toxicidade da torta de mamona................................59
5 – DISCUSSÃO................................................................................................64
6 – CONCLUSÕES............................................................................................71
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................72
FERNANDES, K. V.
1
LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Mamoneira..........................................................................................7 Figura 2 – Agroindústria da mamona.................................................................12 Figura 3 – Estrutura do ácido ricinoléico............................................................12 Figura 4 – Estrutura das RIPs 1 e 2...................................................................18 Figura 5 – Estrutura da ricina.............................................................................19 Figura 6 – Loop de RNAr e o sítio de despurinação pela ação da ricina...........20 Figura 7 – Esquema de alguns dos processos, em microescala, que ocorrem durante a fermentação em estado sólido...........................................................25 Figura 8 – A) SDS-PAGE 12% da fração obtida ao fim da purificação da ricina e B) Alinhamento, feito através do ClustalW2......................................................50 Figura 9 – Comportamento celular após tratamento com ricina em diferentes concentrações....................................................................................................52 Figura 10 – Comparativo entre a avaliação do teste de citotoxicidade.............53 Figura 11 – A) Variação de umidade, Aw e pH durante a FES. B) Produção de lípase e protease em função do crescimento do A. niger..................................54 Figura 12 – SDS-PAGE do extrato protéico da torta de mamona fermentada..55 Figura 13 – Determinação da atividade tóxica na torta de mamona fermentada.........................................................................................................56 Figura 14 – Cultura de células Vero, tratadas com extrato protéico de torta de torta de mamona fermentada.............................................................................58 Figura 15 – SDS-PAGE para o extrato protéico de torta e rejeito de mamona submetidos a diferentes tipos de tratamento.....................................................59 Figura 16 – Teste de citotoxicidade para o extrato protéico de torta e rejeito de mamona submetidos à diferentes tipos de tratamento......................................61 Figura 17 – Cultura de células Vero, tratadas com extrato protéico de torta de torta de mamona submetida a diferentes processos de destoxificação............63
FERNANDES, K. V.
2
LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Produção brasileira e mundial de óleo de mamona.........................10 Tabela 2 – Comparativo da área e produção da mamona no Brasil.................11 Tabela 3 – Composição bromatológica da torta de mamona............................14 Tabela 4 – Principais diferenças entre a FES e a FS........................................27 Tabela 5 – Exemplos dos principais produtos e processos para FES...............30 Tabela 6 – Comparativo entre os diferentes métodos utilizados para detecção da ricina na torta e no rejeito de mamona.........................................................62
FERNANDES, K. V.
3
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ASP Aspergilopepsina
Aw Atividade de água
CB-1A Castor Bean Allergens
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
EDTA Ácido etileno diamino tetracético
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
FES Fermentação em estado sólido
FIA Fluoroimunoensaio (fluoroimmunoassay)
FS Fermentação submersa
GRAS Geralmente considerado seguro (generally recognized as safety)
IgG Imunoglobulina do tipo G
iPCR Imuno-PCR (Polymerase chain reaction)
JIP60 Proteína de cevada induzida por jasmonato (jasmonate-incuced
protein)
LDH Lactato desidrogenase (lactate dehidrogenase)
PAP Pokeweed antiviral protein
PBS Tampão fosfato salino (Phosohate buffered saline)
PDA Potato dextrose Agar
p-DAB p-dimetilaminobenzaldeido
RCA Aglutinina de mamona (Ricinus communis agglutinin)
RIP Proteínas inativadoras de ribossomos (ribossome inactivating
proteins)
RNAr Ácido ribonucléico (RNA) ribossomal
RTA Cadeia A da ricina (ricin toxin A)
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SNC Sistema nervoso central
TCA Ácido tricloroacético
UV Ultra violeta
FERNANDES, K. V.
4
RESUMO
A mamona é uma oleaginosa cogitada para a produção de biodiesel. Além
disso, a torta residual é de grande utilidade para adubação e é rica em proteínas,
abrindo a possibilidade da sua utilização como ração animal. No entanto, esta
segunda aplicação enfrenta o problema da presença da ricina, uma proteína
extremamente tóxica. Nos últimos anos, diversas metodologias vêm surgindo para
destoxificar a torta de mamona e utilizá-la na alimentação animal. Dentre estes
métodos, a fermentação em estado sólido (FES) mostrou-se promissora na
destoxificação do rejeito de mamona, e pode ainda ser utilizada para produção de
enzimas de importância biotecnológica, agregando valor ao produto. No presente
trabalho foi proposta a destoxificação da torta de mamona por FES, bem como a
produção simultânea de lípases. Além disso, foi desenvolvido bioensaio em cultura de
células Vero para detecção rápida e precisa de ricina, bem como seus efeitos
citotóxicos. O limite de detecção de ricina para o teste proposto foi de 10 ng/mL. Os
ensaios de citotoxicidade conjugados com anticorpo anti-cadeia A da ricina para
demonstrar a especificidade desta proteína também foram realizados. As
fermentações foram conduzidas utilizando a torta de mamona como substrato para o
crescimento do fungo filamentoso Aspergillus niger (GRAS), em condição de 48% de
umidade, suplementado com 6,25% de melaço. Observou-se que a produção de
lípases foi baixa (6,25 U/g) quando comparado com outros trabalhos na literatura (até
782 U/g), no entanto, ajustes nas condições de cultivo podem levar a uma otimização
da produção. A torta fermentada foi testada para toxicidade, e foi visto que o processo
se mostrou eficiente para a eliminação da ricina na torta. Outros processos de
destoxificação (como a extrusão com adição de CaO e a autoclavagem) também
tiveram sua eficiência avaliada pelo ensaio de citotoxicidade. Nestes, verificamos que
a adição de CaO à torta extrusada pode ser uma outra alternativa de destoxificação, e
a autoclavagem da torta utilizada na fermentação não elimina a ricina do resíduo.
Assim, concluímos que a FES é promissora para destoxificação da torta de mamona,
pois além de eliminar a ricina presente no resíduo ainda pode agregar valor com a
produção de lípases. E o teste de citotoxicidade proposto pode ser uma forma rápida e
simples de detectar a ricina na torta de mamona.
Palavras chave: torta de mamona, ricina, fementação em estado sólido, lípase,
destoxificação
FERNANDES, K. V.
5
ABSTRACT
The castor bean is an oilseed considered for biodiesel production. Moreover, the
residual cake is very useful for fertilization as well as being rich in protein. The use of
castor bean meal as animal feed faces the problem of the presence of ricin, a type 2
ribossome-inactivating protein. In recent years, several methodologies have emerged
to detoxify the castor bean cake and use it in animal feed. Among these methods, the
solid-state fermentation (SSF) proved to be promising in the detoxification of castor
bean waste, and can be used to produce biotechnologically important enzymes, adding
value to the product. In this study was proposed the detoxification of castor bean by
SSF and the simultaneous lipase production. In addition, we developed an in vitro
bioassay for quick and accurate detection of ricin in Vero cell culture as well as its
cytotoxic effects. The limit of detection for ricin in the proposed test was 10 ng/mL.
Cytotoxicity assays with the addition of an anti-ricin A chain antibody to demonstrate
the specificity of this protein were also performed. The fermentations were performed
using the castor cake as substrate for the Aspergillus niger (GRAS) growth in 48%
humidity, supplemented with molasses 6.25%. It was observed that the production of
lipase was low (6.25 U/g) compared with other studies (782 U/g), however,
adjustments in growing conditions can lead to an optimization of production. The
fermented cake was tested for toxicity, and it was seen that the process was efficient
for the reduction of ricin in the cake. Other detoxification processes like extrusion with
CaO addition and autoclaving were also evaluated by the cytotoxicity test. For these,
we have seen that the CaO addition to extrused cake could be another way to
detoxification, and the autoclaving was not the responsable in fermented cake
detoxification.Thus, we conclude that the FES is promising for detoxification of castor
bean cake because as well as eliminate ricin present in the residue it still can adds
value by production of lipases. And the proposed assay of cytotoxicity can be a quick
and simple way to detect ricin in castor bean cake.
Key words: castor bean cake, ricin, solid-state fermentation, lipase, detoxificaion
FERNANDES, K. V.
6
1 – INTRODUÇÃO
O Brasil é um grande produtor de oleaginosas, o que lhe confere um
enorme potencial na produção de óleos vegetais e derivados. Entre os diversos
produtos deste setor, o biodiesel é aquele que vem recebendo o maior
destaque, decorrente do crescente aumento nos preços do petróleo e a
preocupação com o meio ambiente. Para Oliveira (2001), o biodiesel é tido
como uma evolução na substituição do óleo mineral, porque possui o mesmo
conteúdo energético do diesel mineral e adicionalmente é renovável e menos
poluente.
O Brasil se inseriu formalmente na produção de biodiesel a partir da Lei
nº 11.097/2005, que estabelece a sua mistura em escala comercial, na
proporção de 2% de biodiesel e 98% de óleo diesel, mistura denominada B2,
que passou a ser obrigatória em 2008 (BRASIL, 2005). A proporção da mistura
deverá subir para 5% (B5) ainda em 2010 (MOTA, 2009).
Dentre as plantas oleaginosas cogitadas para a produção de biodiesel
no Brasil está a mamona (Ricinus communis L.), uma euforbiácea amplamente
cultivada no Nordeste do país e que vem ganhando atenção e espaço nas
demais regiões. As sementes de mamona são a fonte do óleo de rícino, que
possui inúmeras aplicações, muitas destas relacionadas com a presença de
90% de ácido ricinoléico, o que lhe confere uma alta viscosidade.
A extração do óleo de mamona pode ser feita de três maneiras:
prensagem das sementes a frio; prensagem das sementes a quente; extração
por solvente (BELTRÃO & LIMA, 2007). É bom salientar que nestes processos,
o subproduto, conhecido como torta de mamona, é alvo de grande interesse
comercial graças ao seu alto valor nutricional. A torta bruta é muito utilizada
como adubo e, quando tratada para a eliminação de resíduos tóxicos, como a
ricina, a ricinina e o componente alergênico CB-1A, pode ser utilizada na
composição de rações para animais (GHANDI et al., 1994). Muitos trabalhos
vêm sendo feitos no intuito de eliminar os componentes tóxicos e alergênicos
da torta de mamona, e, dentre este, um método promissor é o processo de
fermentação em estado sólido (FES), que já se mostrou eficiente na remoção
total da ricina e parcial das albuminas 2S (proteínas de baixo peso molecular
que compõem o complexo alergênico) em um resíduo extremamente tóxico,
FERNANDES, K. V.
7
alergênico e alcalino, denominado rejeito de mamona, obtido pela trituração
das sementes simultaneamente ao processo de transesterificação alcalina
(GODOY et al., 2009).
1.1 – Características botânicas da mamoneira
A mamoneira (Ricinus communis L. – Figura 1) é uma oleaginosa de
relevante importância econômica e social, com inúmeras aplicações industriais.
É encontrada disseminada em várias regiões do Brasil. Sua origem não é muito
bem esclarecida, sendo ora dita como asiática, ora dita como africana
(possivelmente da antiga Absínia, hoje Etiópia), e até mesmo, como planta
nativa da América. No Brasil, conhece-se a mamona sob as denominações de
mamoneira, rícino, carrapateira, enxerida, bafureira, baga e palma-cristi; na
Inglaterra e Estados Unidos, ela é conhecida pelos nomes de "castor bean" e
"castor seed"; em espanhol, “higuerilla”, “higuerete”, “palma christi”, “higuera” e
“tártaro”; em francês, “ricinu”; e em alemão como “wunder-baun” (RODRIGUES
et al., 2002). Em nosso país a mamona foi introduzida durante a colonização
portuguesa. O óleo extraído de suas sementes era utilizado para lubrificar as
engrenagens dos engenhos de cana da época (BELTRÃO & LIMA, 2007).
Figura 1. Mamoneira ornamental. Observa-se o formato palmatiforme das folhas com muita facilidade, bem como a coloração do fruto (vermelho), que pode variar entre cultivares.
FERNANDES, K. V.
8
A mamoneira possui a seguinte classificação (MOSHKIN, 1986):
A mamoneira uma espécie tolerante à seca e exigente em calor e
luminosidade, que é encontrada em diversas partes do mundo, em especial
nas regiões que apresentam clima temperado ou tropical (RODRIGUES et al.,
2002). É uma planta bastante complexa no que diz respeito à morfologia,
biologia floral e fisiologia, apresentando metabolismo fotossintético C3
(AZEVEDO & LIMA, 2001).
A mamoneira é na maioria das vezes um arbusto, ou com menor
freqüência uma árvore, que geralmente mede cerca de 2 metros de altura, mas
que, algumas vezes, pode atingir entre 10 e 15 metros. É uma planta
encontrada em diversos lugares no Brasil, podendo, ainda, ser cultivada em
jardins e no campo. O caule é cilíndrico, grosso, podendo alcançar, em alguns
casos, até 30 centímetros de diâmetro na base. Apresenta aspecto nodoso e
sua coloração externa pode variar de verde avermelhado a castanho
acinzentado. As folhas são alternas, medem geralmente de 15 a 30
centímetros de diâmetro, podendo alcançar 40 centímetros. São palmatiformes
com limbo peltado, com 7 a 11 lóbulos, glabras, verdes ou, mais raramente no
Brasil, vermelho-escuras com nervuras de tom um pouco mais claro. A margem
foliar é denteada. Os pecíolos são cilíndricos fistulosos longos, podendo
alcançar 60 centímetros de comprimento por cerca de 2 centímetros de
diâmetro. O contorno foliar é orbicular e a inserção do pecíolo ocorre na região
central do limbo. O pecíolo próximo da inserção do limbo foliar apresenta duas
formações glandulares (RODRIGUES et al., 2002).
Subdivisão: Fanerogamae ou Espermatophita
Filo: Angiospermae
Classe: Dicotiledonae
Subclasse: Archychlamideae
Ordem: Geraniales
Família: Euphorbiaceae
ênero: Ricinus
Espécie: Ricinus communis
Subespécie: Ricinus communis communis
FERNANDES, K. V.
9
As flores são monóicas e dispostas em grupos sobre racemos opostos
às folhas. As flores femininas, que ocupam a parte superior dos racemos, são
providas de estilete e estigma trífido e bifurcado, e densamente papiloso. As
flores masculinas ocupam a parte inferior dos racemos e são constituídas por
numerosos estames com filetes ramificados e anteras com tecas globulares
separadas (RODRIGUES et al., 2002).
Os frutos apresentam aspecto globoso característico, do tipo tricoca,
medindo 3 centímetros de diâmetro, providos de três lojas, cada uma delas
contendo uma semente, e que se abrem com deiscência explosiva. Sua parte
externa possui elevações espiniformes (RODRIGUES et al., 2002).
A semente de mamona é muito variável quanto a cor, forma, tamanho,
peso, proporção do tegumento, presença ou ausência de carúncula e maior ou
menor aderência do tegumento ao endosperma (MAZZANI, 1983). O peso de
100 sementes varia muito, de 10 a 100 g, ou seja, de 0,1 a 1 g por semente,
com média de 30 g nas cultivares anãs, e de 45 a 75 g nas cultivares de porte
médio (AZEVEDO & LIMA, 2001). De acordo com Moshkin (1986), a semente
da mamoneira varia de 0,8 a 3 cm de comprimento, de 0,6 a 1,5 cm de largura
e de 0,4 a 1 cm de espessura.
O tegumento externo da semente é representado pela casca, dura e
quebradiça, tendo ainda uma película interna, fina, que envolve o albúmen, que
é branco, compacto e rico em óleo (AZEVEDO & LIMA, 2001).
1.2 – Aspectos econômicos da mamona
Economicamente, a mamona é cultivada em várias partes do mundo. A
partir da industrialização de sua semente obtém-se o óleo e a torta, sendo o
primeiro o principal produto e o segundo um produto com capacidade de
restaurar terras esgotadas (SANTOS et al., 2007). O óleo é muito utilizado para
fins medicinais e industriais (ANANDAN et al., 2005).
Os principais países produtores são a Índia e a China com cerca de 60%
e 20% da produção mundial, respectivamente. Na América do Sul, o Paraguai
é o produtor tradicional de mamona, com produção variável entre 10.000 e
25.000 toneladas anuais de mamona em baga. O Brasil, que já foi o maior
produtor mundial, perdeu sua hegemonia a partir de 1983, com o aumento
FERNANDES, K. V.
10
gradativo da área de cultivo e da produção dos principais concorrentes, além
das dificuldades de relacionamento comercial entre a indústria e o agricultor
(SAVY FILHO, 2005). A produção de óleo de mamona no Brasil também sofreu
uma grande queda no início dos anos 90, quando comparada à produção
mundial (Tabela 1).
Tabela 1. Produção brasileira e mundial de óleo de mamona (Savy Filho, 2005).
Ano
Óleo de mamona (t)
Brasil (a) Mundial (b) (a/b) %
1990 66.400 460.782 14,41
1991 73.300 507.063 14,46
1992 54.400 419.700 12,96
1993 26.900 407.799 6,60
1994 27.900 456.854 6,11
1995 22.200 412.008 5,39
1996 21.400 469.163 4,56
1997 42.500 448.559 9,47
1998 21.100 452.125 4,67
1999 19.400 435.693 4,45
2000 39.600 608.891 6,50
2001 44.900 476.855 9,42
2002 37.000 498.818 7,42
t – Tonelada
A produção em escala comercial e tradicional da mamona no semi-árido
brasileiro é concentrada no Estado da Bahia (Tabela 2), onde na safra de
2003/2004 foram plantados mais de 140.000 hectares. A partir da safra de
2001/2002, graças ao grande interesse mundial pelas fontes renováveis de
energia, para substituição gradual das fontes minerais originárias do petróleo,
tornou evidente um programa nacional de estruturação da produção de
mamona nos outros Estados do semi-árido brasileiro (BANDEIRA et al., 2004).
A mamoneira, por ser uma planta com capacidade de produzir
satisfatoriamente bem sob condições de baixa precipitação pluviométrica, se
apresenta como uma alternativa de grande importância para o semi-árido
brasileiro. Nesta região, a cultura, mesmo tendo sua produtividade afetada,
tem-se mostrado resistente ao clima adverso quando se verificam perdas totais
FERNANDES, K. V.
11
em outras culturas, e serve desta forma, como uma das poucas alternativas de
trabalho e de renda para o agricultor da região (SANTOS et al., 2007).
Tabela 2. Comparativo da área, produção e produtividade da mamona no Brasil. Safras 2003/04 e 2004/05 (Savy Filho, 2005).
Região/UF
Área (1.000 ha) Produção (1.000 t) Produtividade (kg/ha)
Safra03/04 Safra 04/05 Safra03/04 Safra 04/05 Safra03/04 Safra 04/05
NORDESTE 162,5 186,2 103,3 143,3 636,0 770,0
PI 3,7 3,7 4,8 4,8 1.300,0 1.300,0
CE 9,3 9,3 8,8 8,8 950,0 950,0
PE 1,2 1,2 0,7 0,7 590,0 590,0
BA 148,3 172,0 89,0 129,0 600,0 600,0
SUDESTE 2,4 3,2 2,8 4,6 1.167,0 1.438,0
MG 1,7 2,5 1,7 3,5 1.000,0 1.400,0
SP 0,7 0,7 1,1 1,1 1.600,0 1.600,0
BRASIL 164,9 189,4 106,1 147,9 643,0 781,0
t – Tonelada ha – Hectare CE – Ceará PE – Pernambuco PI – Piauí BA – Bahia MG – Minas Gerais SP – São Paulo
1.2.1 – Produtos da mamona
A mamona possui destaque na economia devido à ampla variedade de
produtos que pode fornecer. Estes produtos vão desde o óleo de rícino e seus
derivados, até produtos gerados da extração deste óleo.
Segundo o Banco de Desenvolvimento de Minas Gerais S. A., da
mamona se aproveita tudo (Figura 2). As folhas servem de alimento para uma
espécie de bicho da seda e a haste, além de celulose própria para a fabricação
de papel, fornece matéria-prima para a produção de tecidos grosseiros. Além
disso, as hastes e as folhas podem ser utilizadas na melhoria das
características físicas e biológicas do solo, e a folha ainda serve para aumentar
a secreção láctea das vacas (SANTOS et al, 2007). Porém os principais
produtos derivados da semente de mamona são o óleo e a torta residual (da
extração do óleo).
O óleo da mamona tem uma estrutura química peculiar, predominando o
ácido ricinoléico (Figura 3) em 90% de sua composição. As características do
ácido ricinoléico são conferidas pela sua estrutura química, com grupo hidroxila
no carbono 12 e dupla ligação entre os carbonos 9 e 10, sendo a única fonte
FERNANDES, K. V.
12
comercial com essa singularidade. A hidroxila confere ao composto a
estabilidade e a alta viscosidade, que são mantidas em larga faixa de
condições de temperatura, ao contrário de outros óleos vegetais, que perdem
viscosidade em altas temperaturas e se solidificam em baixas temperaturas,
possuindo também estabilidade à oxidação (BORÉM & SAVY FILHO, 1999).
Figura 2. Agroindústria da mamona. Possibilidades de utilização (adaptado de Savy Filho,
2005).
Figura 3. Estrutura do ácido ricinoléico.
FERNANDES, K. V.
13
O óleo extraído das sementes possui um mercado internacional
crescente, garantido por cerca de 700 aplicações, que incluem desde o uso
medicinal e produção de cosméticos até a substituição ao petróleo na
fabricação de plásticos e lubrificantes. O produto também é utilizado na
fabricação de tintas e isolantes, na produção de fibra ótica, vidro à prova de
balas e próteses ósseas. Pelas características exclusivas de queimar sem
deixar resíduos e de suportar altas temperaturas sem perder a viscosidade (no
que supera os óleos derivados do petróleo), é o óleo ideal para motores de alta
rotação. Além disso, é indispensável para impedir o congelamento de
combustíveis e lubrificantes de aviões e foguetes espaciais quando atingem
baixíssimas temperaturas. Além destas aplicações, o óleo de mamona é
empregado para a produção de corantes, anilinas, desinfetantes, colas e
aderentes, tintas de impressão e vernizes. O óleo de mamona transformado em
plástico, sob a ação de reatores nucleares, adquire a resistência de aço,
mantendo a leveza da matéria plástica. Uma das aplicações de grande valor
econômico do óleo de mamona é na fabricação do nylon e da matéria prima
plástica onde o seu emprego é importantíssimo na fabricação de espumas
plásticas. O óleo confere ao material textura variável, desde a macia e
esponjosa até a dura e rígida (FORNAZIERI, 1986).
As fábricas de óleo existentes industrializam toda a produção, obtendo-
se como subproduto a torta de mamona (FORNAZIERI, 1986). Esta se destaca
pelo seu alto teor protéico e por funcionar como um bom adubo.
1.2.2 – Torta de mamona
Após a extração do óleo por prensagem, uma massa orgânica conhecida
como torta de mamona fica retida nos filtros (GHANDI et al., 1994). A torta de
mamona, antes considerada um subproduto da extração de óleo, é hoje um
produto da mamona que desperta considerável interesse econômico (MORAIS
& SILVA, 2008).
A torta de mamona pode ser utilizada como adubo orgânico, já que esta
se constitui em um excelente fertilizante. Nestas condições a torta de mamona
apresenta elevadíssima porcentagem de matéria orgânica e riqueza dos
macroelementos. A adição de torta de mamona no solo, com dosagens
FERNANDES, K. V.
14
variando de acordo com a cultura, o tipo do solo e a disponibilidade de
nutrientes, além de suprir as necessidades nutricionais das plantas aumenta o
pH do solo, reduzindo a acidez total, eleva o conteúdo de carbono e promove
melhoria geral na parte física do solo. A utilização da torta no solo, além de
reduzir os nematóides e elevar o poder tamponante e a capacidade de troca de
cátions do solo, tem propriedade de reduzir a densidade aparente do ambiente
em todos os tipos de solos, o que interfere positivamente no crescimento e no
desenvolvimento radicular, devido a melhor porosidade do solo, com mais
rápida renovação adequada de oxigênio (SAVY FILHO, 2005).
Apesar de apresentar alto teor de proteínas (Tabela 3), não se
recomenda o uso da torta in natura para ração, pois esta é tóxica devido à
presença da proteína ricina, da ricinina e do complexo alergênico denominado
nas décadas passadas de CB-1A (Castor bean allergen) que é uma mistura de
proteínas de baixo peso molecular (YOULE & HUANG, 1978).
A ricinina é um alcalóide tóxico denominado 1,2-dihidro-4-metoxi-1-metil-
2-oxo-3-piridinocarbonitrila (C8H8N2O2), sendo sublimável na temperatura de
152ºC. Esse composto encontra-se na torta em menor quantidade,
apresentando também uma menor toxidez em relação a ricina (BELTRÃO &
LIMA, 2007).
Tabela 3. Composição bromatológica da torta de mamona (Souza, 1979).
Fração Teor
Matéria seca 91,5%
Proteína bruta 42,5%
Fibra 20,04%
Cálcio 0,68%
Fósforo 0,78%
Extrato etéreo 4,23%
Dos três componentes listados anteriormente, a ricina é a toxina mais
potente e a maioria das tentativas de destoxificação da torta apontam para a
eliminação desta proteína. As demais frações tóxicas e alergênicas são de
baixa preocupação no que diz respeito à nutrição animal, seja pela sua baixa
FERNANDES, K. V.
15
concentração ou pela baixa toxidez. Os alérgenos não afetam os animais
alimentados com a torta. O maior problema relacionado à fração alergênica,
formada por proteínas da família das albuminas 2S, é a manipulação da torta
de mamona pelos trabalhadores. O conhecimento destas toxinas e alérgenos é
um ponto importante no desenvolvimento de processos de destoxificação da
torta.
1.3 – Componentes alergênicos e tóxicos
1.3.1 – Albuminas 2S de R. communis
As albuminas 2S constituem o principal grupo de proteínas de reserva
presente nas dicotiledôneas. Além de estar presente nas sementes de
mamona, constituem também os principais alérgenos de nozes e sementes
como castanha do maranhão, avelã, algodão e mostarda (BREITENEDER &
RADAUER, 2004).
Em 1943, Spies e Coulson isolaram da semente de mamona uma fração
protéica de baixo peso molecular, estável ao calor, que foi denominada CB-1A.
Em 1977, Li et al isolaram e caracterizaram uma proteína das sementes de
Ricinus communis de baixo peso molecular com um alto teor de glutamina e
um espectro não comum de UV que mostrou propriedades similares aqueles do
alérgeno de Ricinus communis isolados em 1943.
Em 1978, Youle e Huang concluíram que a fração CB-1A era a albumina
2S de reserva caracterizada por Li et al (1977). Em 1982, Sharief e Li
seqüenciaram uma proteína das sementes de Ricinus communis (Ric c 1), com
coeficiente de sedimentação 2S, constituída de duas subunidades unidas por
pontes de enxofre. A menor contendo 34 aminoácidos (Ric c 1 leve) com
massa molecular aparente de 4 kDa e maior composta de 61 aminoácidos (Ric
c 1 pesada) com massa molecular de 7 kDa.
Machado e Silva (1992), isolaram e seqüenciaram uma segunda
albumina 2S, denominada Ric c 3, tendo peso molecular em torno de 11 kDa,
presente no mesmo precursor (29 kDa) de Ric c 1. Em 2003, Machado e
colaboradores forneceram dados bioquímicos e imunológicos para a presença
FERNANDES, K. V.
16
de pelo menos nove frações diferentes de albumina 2S em sementes de
mamona (MACHADO et al., 2003).
Atualmente sabe-se que as albuminas 2S representam cerca de 12,5%
do peso da torta, como determinado pelo teste de precipitação de antígenos
diluídos. A presença de proteínas alergênicas em sementes de mamona já é
conhecida há muitos anos. No entanto, os tratamentos que são aplicados hoje
para a torta de mamona se referem à destoxificação, mas são geralmente
ineficientes para a desalergenização da torta (ANANDAN et al., 2005). A fração
alergênica é termicamente estável, não sendo eliminada com processos de
cozimento simples. Recentemente, Carrielo-Gama (2006) mostrou que a
utilização do reagente de Woodward (N-etil-5-fenilsoxazolium-3-sulfonato), um
modificador de grupos carboxílicos em proteínas, é eficiente para a desativação
de alérgenos. No entanto, o processo precisa ser otimizado para a torta in
natura a fim de que a mesma possa ser utilizada com segurança na
agroindústria. Um outro método que se mostrou apropriado para o processo de
desalergenização da torta é o tratamento desta com sais de cálcio (OLIVEIRA,
2009).
1.3.2 – Ricinina
A ricinina é um alcalóide que atua na defesa vegetal, sendo sintetizado
em maior quantidade em situações como danos mecânicos ou alta
temperatura. Segundo Beltrão e Lima (2007), este alcalóide foi isolado pela
primeira vez por Tuson, em 1864, e teve sua estrutura determinada por Henry,
em 1949. A contribuição da ricinina à toxicidade da torta de mamona é muito
pequena, por apresentar baixa atividade tóxica e estar presente em baixa
concentração (CARVALHO, 1978). Moshkin (1986) afirma que a concentração
de ricinina na semente aumenta de dentro para fora, ou seja, o endospoerma
contém uma pequena quantidade dela (30,8 mg/kg a 77,1 mg/kg), aumentando
seu teor no tegumento da semente (257,6 mg/kg a 431,2 mg/kg) e
apresentando uma concentração ainda mais elevada na cápsula (1664,4
mg/kg)(BELTRÃO & LIMA, 2007).
FERNANDES, K. V.
17
1.3.3 – Ricina
As sementes de Ricinus communis L. são conhecidas pela sua
toxicidade há algum tempo. Este veneno vem sendo utilizado desde a
antiguidade tanto na medicina popular, quanto em práticas criminosas de
envenenamento. Segundo Olsnes (2004), Dixson, em 1887, já imaginava que a
toxina da mamona fosse uma proteína, mas isso só foi realmente comprovado
em 1913, por Kobert. O nome ricina foi dado por Stillmark em 1888.
1.3.3.1 – Proteínas inativadoras de ribossomos
A ricina é uma das mais potentes fitotoxinas conhecidas e é
classificada como uma proteína inativadora de ribossomos (RIP) do tipo 2.
As RIPs apresentam papéis interessantes na história das ciências
biomédicas, e a estrutura e o mecanismo de ação destas toxinas tem sido
estudados intensamente desde 1970, quando foi visto que a ricina e a abrina,
presente na semente de Abrus precatorius, (vulgar olho-de-cabra) se
mostravam mais tóxicas contra células cancerígenas do que contra células
normais, sugerindo uma aplicabilidade na terapia anti-câncer (LIN et al., 1970).
Desde então, diversas proteínas capazes de inativar ribossomos
enzimaticamente foram caracterizadas. As RIPs apresentam atividade RNA N-
glicosidase. Assim, estas proteínas removem uma adenina em uma região de
loop bem conservada no RNAr. Existem dois tipos de RIPs. As do tipo 1 (RIP 1)
são monômeros, tais como a PAP (pokeweed antiviral protein), a tricosantina
(de Trichosantes kirilowii), e a curcina, presente no pinhão manso (Jatropha
curcas), que também é uma oleaginosa cogitada para a produção de biodiesel
no Brasil. Atualmente existem mais de 50 RIPs 1 já conhecidas (GIRBÈS et al.,
2004). As RIPs do tipo 2 (RIP 2) são heterodímeros compostos de duas
cadeias: um homólogo enzimático da RIP 1 (cadeia A) e uma subunidade
lectina (cadeia B), que são unidas por ponte disulfeto. Este grupo compreende
proteínas altamente tóxicas como a abrina, a modecina, a nigrina, a ebulina e a
ricina presente na mamona.
FERNANDES, K. V.
18
Uma RIP isolada em milho (WALSH et al., 1991) apresenta uma
estrutura incomum que não se enquadra perfeitamente em nenhuma das duas
classificações. Ela é formada por uma cadeia homóloga às RIPs 1 e esta é
ativada após a remoção de um curto segmento peptídico interno. Outro
exemplo incomum é a JIP60 (Figura 4), da cevada, na qual a cadeia ativa está
ligada a outro segmento sem função definida (REINBOTHE et al., 1994).
Inicialmete foi sugerida uma nova classificação para estas toxinas, como RIP 3,
no entanto estas são consideradas exceções entre as RIP do tipo 1. Aquelas
que possuem estrutura semelhante às RIP 2, mas sem função definida para a
cadeia B, são classificadas como RIP 2. (STIRPE & BATELLI, 2006), que é o
caso da nigrina (Figura 4), de Sambucus nigra (vulgar sabugueiro).
Figura 4. Estrutura das RIPs 1 e 2: cadeia ativa (barra aberta), cadeia lectina (barra cinza) e cadeia com função desconhecida (barra preta), e as pontes disulfeto (-S-S-) (adaptado de STIRPE & BATELLI, 2006).
1.3.3.2 – Estrutura e função
A ricina é uma proteína encontrada exclusivamente no endosperma das
sementes de mamona, não sendo detectada em nenhuma outra parte da
planta. É uma proteína que consiste de duas partes funcionalmente diferentes,
uma cadeia A (32 kDa), enzimaticamente ativa, e uma cadeia B (34 kDa)
ligante de receptores, ligadas por uma ponte dissulfeto (Figura 5). Outras
proteínas tóxicas também pertencem a essa família A-B de lectinas, como
toxinas microbianas de difteria, pseudomonas, cólera, shiga e antrax (OLSNES
Estrutura geral Exceções
b-32 de milho
JIP60
Nigrina
RIP tipo 1
RIP tipo 2
FERNANDES, K. V.
19
et al., 1999). No caso da toxina vegetal abrina (RIP 2 de Abrus precatorius),
existe uma grande similaridade entre a cadeia A desta com a da ricina.
Day et al. (1996) mostrou que na ricina, os resíduos Glu177 e Arg180,
localizados no sítio ativo da cadeia A são particularmente importantes, e que
mutações nestes resíduos provocam diminuição considerável da atividade
enzimática. A seqüência de aminoácidos da ricina foi determinada por Funatsu
(1979).
Figura 5. Estrutura da ricina. A cadeia B está a direita (laranja), e a cadeia A está a esquerda (azul). O círculo vermelho indica a ponte dissulfeto (RUTENBER & ROBERTUS, 1991). Figura preparada através do programa MOI:MOI, por Korardi et al. (1996).
A cadeia A da ricina possui atividade catalítica (MOTANARO et al.
1973). Endo et al. (1987), apontaram a cadeia A como uma glicosidase, que
remove um resíduo de adenina numa região de “loop” no RNA ribossomal
(Figura 6). Esta região do RNAr modificada é essencial para ligação do fator
de alongamento, sendo assim, os ribossomos modificados não podem dar
suporte à síntese protéica (OLSNES et al., 1975). A ricina é tão eficiente que
uma molécula de cadeia A pode inativar cerca de 2000 ribossomos por minuto
(OLSNES et al., 1975). Assim, uma molécula de ricina inativa ribossomos numa
velocidade em que a célula não pode acompanhar sintetizando novos.
FERNANDES, K. V.
20
Figura 6. Loop de RNAr e o sítio de despurinação pela ação da ricina (adaptado de STIRPE & BATELLI, 2006).
A ricina é mais tóxica para células animais do que para células vegetais,
e em bactérias há uma resistência ainda maior, necessitando de uma
concentração mais elevada de ricina para matá-las (ENDO et al., 1991).
A cadeia B liga frações de β-D-galactopiranosídeo, e é a porção
correspondente à lectina (OLSNES, 2004). A habilidade da ricina de ligação à
galactose não é apenas necessária para a ligação aos receptores na superfície
celular, mas também para ligação às moléculas intracelulares (YOULE et al.,
1981). Essa ligação é feita através de dois sítios globulares chamados 1α e 2γ.
Ambos os sítios devem ser mutados para eliminar a atividade ligante de
galactose (SPHYRIS et al., 1995).
A ricina é sintetizada como uma única cadeia polipeptídica na célula, que
posteriormente é clivada nas cadeia A e B. O seu precursor, apesar de ser
capaz de se ligar à galactose, não faz a retirada da purina do RNAr
(RICHARDSON et al., 1989).
1.3.3.3 – Internalização e rota intracelular
Após se ligar à superfície celular, a toxina penetra na célula por
endocitose, o que ocorre numa taxa bem lenta, de cerca de 10% por hora
(SANDVIG & VAN DEURS, 2000). A toxina endocitada é transportada para os
endossomos, e daí uma parte da ricina retorna à superfície celular, outras são
degradadas por lisossomos, e só uma pequena quantidade da toxina chega ao
FERNANDES, K. V.
21
destino final (OSLNES, 2004). Cerca de 5% da ricina endocitada é translocada
até a rede trans-Golgi (VAN DEURS et al., 1989), mas ainda não se sabe quais
moléculas de superfície guiam a toxina para o complexo (OLSNES, 2004).
Uma vez no complexo de Golgi, a toxina precisa ser transportada para o
retículo endoplasmático. Algumas toxinas, como a da cólera, possuem uma
seqüência C-terminal KDEL que direciona a toxina do Golgi para o retículo
endoplasmático. Isto não acontece com a ricina. No entanto, acredita-se que a
ricina se ligue, através da cadeia B, a um resíduo de galactose presente na
glicoproteína calreticulina, que por sua vez apresenta uma seqüência KDEL na
região C-terminal (OLSNES, 2004).
Após chegar ao retículo endoplasmático, parte das moléculas de ricina é
transportada para o citosol, aparentemente por um processo envolvendo o
complexo Sec61 (LORD & ROBERTS, 1998). Este complexo está envolvido no
transporte de proteínas mal enoveladas do retículo para o citosol (PILON et al.,
1997). No citosol parte da toxina é degradada pelos proteassomas, e outra
parte desempenha seu papel tóxico inativando ribossomos (OLSNES, 2004).
1.3.3.4 – Aplicações da ricina
Uma utilização da ricina bem conhecida e muito temida é o
bioterrorismo. Desde a antiguidade há relatos do uso da ricina e de outras RIPs
em casos de homicídio. A ricina também já teve seu uso como arma estudado
durante as duas guerras mundiais, visto que se trata de uma proteína solúvel
em água e que poderia ser utilizada, por exemplo, para o envenenamento de
tropas através da contaminação de fontes de água. Em 2007, Brzezinski e
Craft desenvolveram um bioensaio pra detecção de ricina em fontes passiveis
de contaminação acidental ou proposital, como café, leite, suco de laranja e
refrigerantes. Os sintomas da intoxicação por ricina geralmente consistem em
diarréia, a qual pode progredir para hipotensão e disfunções renal e hepática,
problemas neurológicos e cardiovasculares. A morte ocorre alguns dias depois
por falência múltipla dos órgãos (AUDI et al,. 2005).
Já a utilização de toxinas no tratamento de tumores acontece desde a
década de 70. Um exemplo mais comum é a utilização da ricina como uma
imunotoxina. Imunotoxinas correspondem a um composto onde a cadeia B da
FERNANDES, K. V.
22
toxina é substituída por um anticorpo, hormônio, ou fator de crescimento que
vai direcioná-la até uma célula alvo, como por exemplo, uma célula
cancerígena, que será alvo da ação tóxica da ricina (OLSNES, 2004).
1.3.3.5 – Métodos de detecção da ricina
Atualmente, apesar de não haver um método como referência oficial
para a detecção de ricina, muitos ensaios estão disponíveis. A maioria dos
métodos existentes para detecção desta proteína envolve ensaios
imunológicos baseados no seu reconhecimento por um anticorpo específico. As
técnicas mais comuns são o ELISA (LIM et al., 2005), a cromatografia de
afinidade (LIM et al., 2005), o fluoroimunoensaio (FIA) (ANDERSON et al.,
2002), e o iPCR (LUBELLI et al., 2006), sendo este o último o que oferece os
menores limites de detecção. Existem também os ensaios in vivo, geralmente
realizados em camundongos, e os ensaios in vitro, dentre os quais estão a
medida da liberação de adenina liberada e a medida de inibição da síntese
protéica (HALE, 2001). Estes métodos, pelo fato de apenas detectarem a
presença da toxina sem confirmar a sua atividade biológica, necessitam ser
complementados com ensaios de atividade biológica, o que acaba tornando-os
demorados e inviáveis, por exemplo, em laboratórios que não apresentam
instalações apropriadas para animais.
Um bioensaio unindo reconhecimento por anticorpo e medida da
atividade enzimática foi desenvolvido recentemente para detecção de ricina em
fontes alimentícias como leite, suco e café (BRZEZINSKI & CRAFT, 2007). O
ensaio baseia-se na medida da atividade da enzima lactato desidrogenase
(LDH – EC 1.1.1.27), uma enzima presente no citosol das células (em maior
quantidade em células que constituem tecidos mais dependentes de respiração
anaeróbica) e que é utilizada como indicador de morte celular. A dosagem de
LDH é utilizada também em estudos clínicos de determinação de lesões
teciduais, como infarto do miocárdio, por exemplo.
No caso da torta de mamona, se faz necessário o desenvolvimento de
um ensaio para detecção rápida e precisa da ricina, visto que vários métodos
de destoxificação vêm surgindo nos últimos anos, mas a forma como é feito a
validação destes processos é muitas vezes falha ou inviável para aplicar em
FERNANDES, K. V.
23
uma escala maior. O ensaio proposto por Brzezinski & Craft (2007) seria uma
boa opção para esse tipo de avaliação. No entanto, adequações precisam ser
feitas para que o método possa ser feito de forma simples em laboratórios que
não apresentam estrutura para manutenção de animais para testes in vivo e,
para que posteriormente, possa ser convertido num kit comercializável para
detecção de ricina.
1.3.3.6 – Eliminação da ricina na torta de mamona
O óleo de mamona não possui ricina, pois toda a proteína da semente
permanece na torta após o processo de extração. Os níveis de ricina na
semente podem variar entre os genótipos de mamona produzidos pelos
programas de melhoramento (PINKERTON et al., 1999). Entre os genótipos
mais cultivados no Brasil os níveis desta toxina variam entre 1,4% a 4,5% das
proteínas totais na semente (FERNANDES, 2008).
A transformação da torta de mamona em um produto atóxico que possa
ser usado para alimentação animal já vem há muito tempo despertando a
atenção de diversos pesquisadores no mundo, tendo-se obtido alguns
resultados satisfatórios embora alguns passos tecnológicos ainda necessitem
ser melhorados para que o produto possa tornar-se economicamente viável
(OLSNES, 2004). Em virtude de sua baixa estabilidade térmica e da
solubilidade em água, a ricina poderia ser eliminada da torta de mamona por
qualquer processo de cozimento com vapor de água saturado (BELTRÃO &
LIMA, 2007), tal como a autoclavagem (ANANDAN, 2005). Este processo, no
entanto, não apresenta viabilidade para aplicação em escala industrial devido o
seu alto custo. A ação de metalo-proteases (induzidas pelo esmagamento da
semente) na degradação da ricina durante o período de armazenagem da torta
também se mostrou uma forma eficiente de destoxificação deste resíduo
(CRESPO-NETO, 2009). É possível que estas proteases tenham origem na
própria semente ou até mesmo que sejam produzidas por microorganismos
presentes no material. Sabe-se ainda que, resíduos da produção de biodiesel a
partir de sementes de mamona (Petrobras, patente PI0105888-6) têm seus
níveis de ricina reduzidos a zero quando submetidos a processos de
fermentação em estado sólido, para obtenção de lipase, utilizando-se o fungo
FERNANDES, K. V.
24
filamentoso Penicillium simplicissium (GODOY et al., 2009), sendo esta
tecnologia uma possível alternativa na destoxificação da torta de mamona.
1.4 – Fermentação em estado sólido
O termo fermentação em estado sólido (FES) denota o cultivo de
microrganismos em substratos sólidos umedecidos na ausência de uma fase
aquosa livre (PANDEY, 2003). No entanto, o substrato deve apresentar
umidade adequada para manter o crescimento e o metabolismo do
microrganismo, sem exceder a capacidade de retenção máxima de água pela
matriz. A FES se assemelha ao habitat natural dos microorganismos e,
portanto, é uma escolha interessante para estes crescerem e gerarem produtos
de interesse tecnológico (Figura 7). A matriz sólida utilizada no processo pode
ser tanto a fonte de nutriente quanto simplesmente um suporte impregnado
com os nutrientes adequados ao desenvolvimento do microrganismo (DURAND
et al., 1997).
Apesar de ainda ser menos difundida no ocidente, a FES é amplamente
utilizada nos países asiáticos, principalmente na indústria de alimentos
fermentados. Enzimas e metabólitos microbianos também são produzidos
através desta tecnologia, que já vem sendo utilizada há milhares de anos
(HÖLKER & LENZ, 2005). Nos países ocidentais, a FES enfrenta os avanços
técnicos da fermentação submersa (FS), que foi amplamente aprimorada e
difundida em função do seu intenso uso para a produção de antibióticos
durante a Segunda Guerra Mundial (HÖLKER & LENZ, 2005). Durante 1950-
1960 foi visto o uso de cultura de fungos para a transformação de esteróides e
relatos da produção de micotoxinas utilizando FES, e durante 1960-1970 os
avanços na área permitiram que a técnica voltasse a conquistar espaço
(SINGHANIA et al., 2009). Outro ponto importante no aumento da utilização
desta tecnologia foi o seu uso no enriquecimento protéico de ração para gado,
utilizando resíduos agroindustriais, oferecendo então um processo único para
agregar valor à estes resíduos de baixo custos e até então considerados como
poluentes (SINGHANIA et al., 2009).
FERNANDES, K. V.
25
Figura 7. Esquema de alguns dos processos, em microescala, que ocorrem durante a fermentação em estado sólido. Após a esporulação, as hifas do fungo se desenvolvem em um emaranhado micelial (preto), o qual se espalha sobre a superfície da partícula utilizada como substrato sólido (marrom). Da malha de micélios crescem hifas tanto para o espaço gasoso quanto em direção do substrato penetrando os poros. Em níveis normais de umidade, os espaços vazios entre as hifas aéreas são preenchidos por gás (g), enquanto os espaços vazios na malha de micélios e dentro do substrato são preenchidos com líquido (l). As atividades metabólicas mostradas ocorrem principalmente próximo à superfície do substrato e dentro dos poros. No entanto, regiões expostas do micélio (como as hifas aéreas) também apresentam metabolismo e pode haver o transporte de substâncias das hifas penetrativas para as aéreas. Enzimas hidrolíticas (azul claro), as quais são produzidas pelo micélio, se difundem para a matriz sólida e catalisam a degradação de macromoléculas em unidades menores (verde). Estas serão mais tarde utilizadas como nutrientes para os fungos. O O2 é consumido e o CO2, H2O, calor e produtos de interesse bioquímico são produzidos durante a fermentação. Por isso o desenvolvimento de gradientes dentro do biofilme que, por instância, força o O2 a difundir-se da fase gasosa para dentro de regiões mais profundas (rosa) e o CO2 a difundir-se destas regiões para para a fase gasosa (vermelho). A geração de calor (Q; laranja) leva a um aumento na temperatura (T), a qual representa um sério problema durante a FES. O calor é portanto removido do substrato não somente por condução, mas também por evaporação, que é parte do balanço complexo da água no sistema (azul escuro). Além da evaporação, o balanço hídrico induz a captura de água pelo micélio no seu crescimento, consumo desta durante as reações de hidrólise e produção através da respiração. Como outro fator importante, o pH local poderia ser alterado pela liberação de ácidos carbônicos e pela troca de amônia (cinza). Os produtos de interesse (magenta) que são liberados na matriz sólida e espaços aquosos durante a fermentação poderiam ser absorvidos pelo substrato sólido e então extraídos para uso futuro no fim do processo. Todos estes e mouitos outros fenômenos podem influenciar fortemente o processo durante a FES. (adaptado de HÖLKER & LENZ, 2005)
Produtos
Monômeros
Polímeros
Enzimas
Ácidos
Hifas penetrativas
Hifas aéreas
Malha de micélios Superfície do substrato
Poros do substrato
FERNANDES, K. V.
26
Existem diferenças significativas entre os processos de FES e FS
(Tabela 4). A principal diferença entre FES e FS é a quantidade de água livre
no meio de cultivo. Na FS, a quantidade de sólidos não ultrapassa 50g/L,
enquanto na FES o conteúdo de sólidos varia de 20 a 70% do peso total.
Assim, a FES é um processo que ocorre na ausência ou quase ausência de
água livre (MITCHELL et al., 2002).
As características da FES conferem a este processo diversas vantagens
sobre a fermentação submersa. Uma das principais vantagens da FES é a
utilização de meios de cultura simples, compostos de materiais de origem
vegetal, como farelos e cascas de arroz, trigo, milho e outros cereais,
necessitando de poucos nutrientes adicionais ao meio. Isso possibilita a
utilização de resíduos agro-industriais como substrato, representando, em
países como o Brasil, matéria prima abundante e de baixo custo (GRAMINHA
et al., 2008).
Devido ao baixo teor de umidade e à ausência de água livre no meio, a
probabilidade de contaminação por bactérias é reduzida. A pequena
quantidade de água empregada na FES também implica em vantagens, tais
como menor volume de meio reacional; menor espaço requerido para os
fermentadores em relação ao rendimento do produto; e maior concentração do
produto (HÖLKER & LENZ, 2005).
Dentre as características da FES, a baixa atividade de água (Aw) do
meio de cultivo sólido influencia nos aspectos fisiológicos dos microrganismos,
tais como no seu crescimento vegetativo, esporulação, germinação de esporos,
produção de enzimas e atividade enzimática (GRAMINHA et al., 2008). Muitas
vezes, essa diferença na fisiologia do microrganismo leva a obtenção de
produtos com características mais interessantes. Esporos fúngicos produzidos
por FES são mais estáveis, resistentes à desidratação e possuem uma taxa de
germinação maior do que quando produzidos por FS (HÖLKER & LENZ, 2005).
O efeito de repressão catabólica na FES é muitas vezes minimizado,
quando comparado com FS. Azeredo et al. (2007) observaram um efeito
regulatório, causado pela adição de fontes de carbono facilmente assimiláveis,
bem menos acentuado na fermentação no estado sólido empregando o fungo
Penicillium restrictum na produção de lipase.
FERNANDES, K. V.
27
Tabela 4. Principais diferenças entre a FES e a FS (adaptado de Mitchell & Lonsane, 1992).
Fermentação no Estado Sólido Fermentação Submersa
Meio de cultivo sem fase líquida Meio de cultivo com fase líquida
Substratos insolúveis em água Substratos solúveis em água
Água presente no meio apenas na
quantidade necessária para o
crescimento do microrganismo
Grande quantidade de água
A absorção de nutrientes ocorre a
partir do substrato sólido umedecido
Ocorre a absorção de nutrientes
dissolvidos no meio líquido
Presença de gradientes de calor,
nutrientes, produto e O2
Calor, nutrientes, produto e O2
uniformemente distribuídos
Apresenta fases sólida, líquida e
gasosa
Apresenta fases líquida e gasosa
Fase liquida descontínua Fase líquida contínua
Maiores concentrações de inoculo Menores concentrações de inoculo
Aeração disponibiliza O2 e remove o
calor metabólico e os produtos
gasosos
Aeração disponibiliza O2 e remove os
produtos gasosos, mas o calor
metabólico é removido por
dispositivos específicos para troca de
calor
Agitação facultativa Agitação geralmente essencial
Produtos mais concentrados Produtos menos concentrados
O crescimento fúngico envolve a
penetração das hifas no substrato
sólido
O crescimento fúngico ocorre na
forma de micélios individuais ou em
aglomerados uniformemente
distribuídos no meio agitado
Bactérias e leveduras crescem
aderidas ao substrato sólido
Bactérias e leveduras crescem
distribuídas uniformemente no meio
agitado
A FES também pode, em alguns casos, ser economicamente mais
interessante na produção de enzimas (lipases). Castilho et al. (2000)
realizaram uma análise econômica da produção de lipase por Penicillium
FERNANDES, K. V.
28
restrictum tanto por FES quanto por FS. Os autores relatam que o investimento
total necessário para a produção de lipase por FS foi 78% maior do que o
necessário para produção por FES devido, principalmente, ao custo do meio de
cultivo.
Apesar das inúmeras vantagens da FES em relação à FS, observa-se
que a FES é um sistema heterogêneo, onde a distribuição de nutrientes e
oxigênio, a concentração de produto e o crescimento não são uniformes por
todo meio e a utilização de agitação requer elevados gastos de energia.
Adicionalmente, a heterogeneidade do meio implica em dificuldades de
monitoramento e o controle de parâmetros muito importantes para o processo
fermentativo, como a temperatura, pH, umidade e oxigênio. Quanto aos tipos
de microrganismos utilizados, existe também uma certa restrição devido a
baixa concentração de água livre no meio de cultura (PANDEY, 2003).
1.4.1 – Microrganismos e substratos utilizados em FES
Muitas bactérias, leveduras e fungos filamentosos crescem em
substratos sólidos, dando origem a diversos produtos de interesse. Porém
entre os microrganismos estudados, os fungos filamentosos são os mais
adaptados a este sistema (MITCHELL & LONSANE, 1992). Dentre os fungos
filamentosos, os mais empregados são os Phycomycetos (gêneros: Mucor e
Rhizopus), os Ascomycetos (gêneros: Penicillium e Aspergillus) e
Basidiomycetos (PANDEY et al., 2000). Os fungos filamentosos possuem uma
grande facilidade de se adaptar à FES devido principalmente ao seu
crescimento em forma de hifas e às suas características fisiológicas. A
penetração de hifas permite uma maior acessibilidade aos nutrientes do que no
caso dos microrganismos unicelulares, reduzindo a distância em que os
processos de difusão devem ocorrer. Isso é de grande importância,
principalmente nos estágios finais da fermentação, quando os nutrientes da
superfície encontram-se esgotados (MITCHELL & LONSANE, 1992;
MITCHELL et al., 2002). A ausência de água livre é outro fator que influencia
positivamente o crescimento de fungos filamentosos em substrato sólido
(PANDEY, 2003).
FERNANDES, K. V.
29
A grande maioria dos substratos usados para FES é de origem agro-
industrial, e estes podem ser divididos em três grupos: substratos que possuem
amido como principal fonte de carbono, como resíduo de batata doce, farelos
de trigo e de arroz, e farinhas de milho, de mandioca e de banana; substratos
que possuem celulose e lignocelulose como principal fonte de carbono, como
palha de trigo, polpa de beterraba e restos de madeira; e substratos que
possuem açúcares solúveis como principal fonte de carbono, como forragem,
açúcar de beterraba e resíduo de abacaxi (MITCHELL et al., 2002).
1.4.2 – Aplicações da FES
Mal interpretada como “sistema de baixa tecnologia”, a FES parece ser
promissora para a síntese de produtos de “alto custo e pequeno volume”
(Tabela 5), como biofármacos, por exemplo. Embora a FES tenha sido
desenvolvida para a manufatura de produtos tradicionais, como alimentos e
bebidas fermentadas, sua aplicação, atualmente, tem se estendido às
indústrias farmacêuticas e bioquímicas, destacando-se alguns produtos e
processos como enzimas, ácidos orgânicos, etanol, biogás, antibióticos,
surfactantes, toxinas, agentes de bioremediação, cogumelos comestíveis,
polissacarídeos microbianos, biopesticidas, enriquecimento protéico de
alimentos fermentados, pré-digestão de rações animais, e variações dos
tradicionais alimentos fermentados (MITCHELL et al., 2000; PANDEY, 2003).
Os processos de FES oferecem vantagens potenciais na biorremediação
e na destoxificação biológica de compostos tóxicos (PANDEY et al., 2000). No
que diz respeito a destoxificação de rejeitos, seja com a intenção de aproveitá-
los na alimentação animal ou de simplesmente eliminá-los de forma segura, a
FES vem se apresentando como uma arma em potencial. O gossipol, um
pigmento polifenólico tóxico que se apresenta como um limitante para a
utilização da torta de algodão para a alimentação animal, pode ser eliminado
por FES utilizando-se o fungo Candida tropicalis ZD-3 (ZHANG et al., 2007).
Rejeitos de café submetidos a FES utilizando-se cepas do fungo Rhizopus sp.
tiveram 57% e 87% de redução nos níveis de taninos e cafeína,
respectivamente (LEIFA et al. 1999).
.
FERNANDES, K. V.
30
Tabela 5. Alguns exemplos dos principais produtos e processos que utilizam FES, além dos microorganismos empregados para cada um. Produto Microrganismo Referência Enzimas Fitase Rhizopus spp Ramachandran et al.,
2008 α-amilase Bacillus
amyloliquefaciens Gangadharan et al., 2005
Inulinase Kluyveromyces S120 Xiong et al., 2007 Celulase Trichoderma reesei Singhania et al., 2007 Lipase Penicillium
simplicissimum Godoy et al., 2009
α-galactosidade Streptomyces griseoloalbus
Anisha et al., 2008
Lacase Trametes spp Rodrígues Couto et al., 2004
L-glutaminase Zygosaccharomyces rouxii
Kashyap et al., 2002
Ácidos orgânicos Ácido lático Lactobacillus delbrueckii John et al., 2006 Ácido cítrico Aspergillus niger Vandenberghe et al.,
2000 Antibióticos e outros metabólitos secundários Cefamicina C Streptomyces
clavuligerus Kota & Sridhar, 1999
Penicilina Penicillium chrysogenum Domingues et al., 2000 Pigmentos Monascus spp Babitha et al., 2007 Ácidos graxos polinsaturados
Mortierella alpina Hung-der & Shang-Shyng, 2008
Hexil laurato Lipase de Rhizomucor miehei
Chang et al., 2007
Biocombustíveis Etanol Sacharomyces
cereviseae Olofsson et al., 2008
Biodiesel Lipase de Rhizopus oryzae
Hama et al., 2007
Processos Biodegradação da madeira
Ceriporiopsis subvermispora
Ferraz et al., 2003
Delignificação Trichoderma spp Haddadin et al., 1999 Destoxificação Penicillium
simplicissimum Godoy et al., 2009
Enriquecimento nutricional de ração animal
Penicillium decumbens Yang et al., 2001
FERNANDES, K. V.
31
Recentemente foi mostrado que o processo de fermentação em estado
sólido pode ser uma forma eficiente e barata de eliminação da ricina presente
em rejeitos de mamona. Godoy et al. (2009) mostrou que durante a produção
de lipase por FES os níveis desta toxina foram reduzidos a zero. O utilizado
utilizado não foi a torta, e sim o resíduo de mamona originado da produção de
biodiesel patenteada pela Petrobras (PI0105888-6). Diferente da torta de
mamona, este não é um co-produto clássico da extração do óleo. Dessa forma,
a utilização da torta de mamona tradicional como substrato para a FES seria
interessante, visto que existe a possibilidade da eliminação das toxinas
presentes através deste processo. Além disso, a escolha do microrganismo
também é outro fator importante, visto que a destoxificação do material poderia
torná-lo interessante para aplicação em alimentação animal. A escolha de um
microrganismo de status GRAS (generally recognized as safety) como por
exemplo o fungo Aspergillus niger, talvez seja a mais adequada neste caso.
1.5 – Aspergillus niger
O fungo filamentoso Aspergillus niger é utilizado na pesquisa e na
indústria há algumas décadas. Sua importância foi mostrada em 1919, quando
sua habilidade de produção de ácido cítrico foi explorada. No entanto, desde
1960 A. niger vem sendo utilizado para a produção de várias enzimas utilizadas
em especial na indústria de alimentos (SCHUSTER et al., 2002).
Como descrito por Reiss (1986), A. niger é capaz de crescer em ampla
faixa de temperatura (6-47 ºC), com um ótimo entre 35-37 ºC. A atividade de
água limite para o crescimento é 0,88, a qual é relativamente alta se
comparada com outras espécies de Aspergillus. A faixa de pH em que A. niger
cresce também é bem ampla, variando entre 1,4-9,8. Estas habilidades e a
abundante produção de conidiosporos, os quais são distribuídos pelo ar,
garantem a ocorrência da espécie em vários lugares, principalmente nos mais
quentes e úmidos (REISS, 1986).
O ácido cítrico é um dos principais produtos obtidos através de A. niger,
sendo um importante acidulante utilizado na indústria de alimentos e bebidas.
Este possui ainda aplicação na indústria farmacêutica, produção de
detergentes, couro sintético, entre outras aplicações (SCHUSTER et al., 2002).
FERNANDES, K. V.
32
A produção de enzimas por A. niger teve início com a pectinase,
protease e amiloglucosidase (FROST & MOSS, 1987). Outras enzimas de
importância econômica também são produzidas pelo fungo, como lipases
(DANTAS & AQUINO, 2009), amilases (ROSÉS & GUERRA, 2009) e celulases
(VILLENA & GUTIÉRRES-CORREA, 2006).
A. niger é considerado um microrganismo GRAS. Isto está documentado
em listas de organizações responsáveis pela segurança e saúde, a exemplo da
Berufsgenossenschaft der Chemischen Industrie (1998). Em casos raros,
quando pessoas são expostas intensivamente à esporos, podem ocorrer
reações de hipersensitividade (SCHUSTER et al., 2002). Quanto à toxicidade
para animais, sabe-se que nem a inalação (BHATIA & MOHAPATRA, 1969)
nem a ingestão (NYIREDY et al., 1975) de grandes doses de esporos induzem
micoses em animais.
Apesar da longa história e intensivos estudos sobre a natureza de A.
niger, somente poucos casos de formação de toxina por este fungo foram
documentadas. No entanto, em nenhum destes casos foi provada a produção
de aflatoxinas. Quanto à ocratoxina A, uma micotoxina nefrotóxica e
carcinogênica, alguns estudos confirmam que pode ser produzida por algumas
espécies de Aspergillus, entre estas, A. niger , quando cultivado sob as
condições para produção desta toxina (ABARCA et al., 1994). Uma série de
nafto-γ-pironas, produzidas por algumas cepas de A. niger, atuam como
agentes tóxicos ao SNC dos vertebrados. No entanto, estes metabólitos
secundários não são considerados micotoxinas, uma vez que não apresentam
toxicidade quando administrados por rota natural, e sim quando administrados
por injeção intraperitoneal (SCHUSTER et al., 2002).
Uma outra aplicação para A. niger é a destoxificação de resíduos. Birk et
al. (1996) utilizou o fungo, através de FES, para eliminar o cianeto presente em
uma variedade de mandioca, conhecida vulgarmente como mandioca-brava
(Manihot esculenta). O processo reduziu o conteúdo de cianeto em 95% e
aumentou o conteúdo protéico em 50%. Um outro exemplo é a remoção de
metais pesados, como o cromo, em efluentes dos moinhos de curtimento de
couro, através da biosorção por A. niger. Os resultados mostraram uma
remoção de mais de 75% do cromo, e foi visto que este metal se acumulava
nos micélios do fungo (SRIVASTAVA & THAKUR, 2006). Mais recentemente
FERNANDES, K. V.
33
(EHREN et al., 2009) foi mostrado que uma enzima proteolítica produzida por
A. niger, a aspergillopepsina (ASP), pode ser utilizada como um destoxificante
para intoxicações causadas por glúten, já que a protease em questão favorece
a digestão desta proteína.
1.6 – Lipases
As lipases (EC 3.1.1.3) são enzimas que vêm se destacando cada vez
mais no cenário da biotecnologia enzimática. Estas são biocatalisadores com
diversas aplicações, razão pela qual a sua participação no mercado mundial de
enzimas industriais cresce significativamente (SHARMA et al., 2001).
As lipases atuam, por definição, catalisando a hidrólise de ligações
éster-carboxílicas e liberando ácidos e álcoois orgânicos. Além de catalisarem
naturalmente reações de hidrólise, são também capazes de promover reações
reversas de síntese, como esterificação, acidólise, alcoólise, interesterificação
e amilólise, quando encontradas em ambientes aquo-restritos (JAEGER &
EGGERT, 2002).
As lipases são encontradas em microrganismos, em animais e em
vegetais, porém, industrialmente os microrganismos são a fonte preferida, uma
vez que têm alta velocidade de síntese, alto rendimento de conversão de
substrato em produto, grande versatilidade e maior simplicidade na
manipulação ambiental e genética de sua capacidade produtiva (ILLANES,
1994).
Atualmente, as pesquisas em lipases concentram-se na caracterização
estrutural e na elucidação do mecanismo de ação, na exploração e no
aprimoramento de suas propriedades enantioseletivas, assim como na
clonagem e na expressão de genes de lipases com características
interessantes em organismos de fácil cultivo, em larga escala (SHARMA et al.,
2001; REETZ et al., 2002; ALMEIDA et al., 2006). Com o auxílio da biofísica,
da cristalografia e da modelagem molecular, cresce o grau de conhecimento
sobre a estrutura e a relação estrutura-função das lipases (FREIRE &
CASTILHO, 2008).
FERNANDES, K. V.
34
1.6.1 – Estrutura e mecanismo catalítico
Em lipases de diferentes origens, verifica-se o aumento da atividade
enzimática na presença de interfaces aquosas, como proposto por Sarda e
Desnuelle (1958). Foi sugerido que a adsorção da lipase pancreática em uma
interface água-lipídeo provoca a ativação da enzima e que isto está associado
às alterações conformacionais da enzima. Este fenômeno, denominado
“ativação interfacial”, foi empregado, por muito tempo, para distinguir lipases de
esterases (BORNSCHEUER, 2002).
A partir da determinação das primeiras estruturas tridimensionais das
lipases (BRADY et al., 1990; WINKLER et al., 1990), verificou-se que elas têm
o mesmo dobramento básico, conhecido como dobramento de α-β-hidrolases,
encontrado, por exemplo, em muitas esterases e peptidases. Verificou-se,
também, que embora as lipases cristalizadas nestes trabalhos tivessem
competência catalítica, o sítio ativo destas enzimas, formado pela tríade Ser-
His-Asp/Glu, não estava exposto na superfície da proteína. O sítio ativo
encontrava-se recoberto por loops das cadeias de superfície, que passaram a
se chamar “tampa” das lipases, impedindo o acesso direto da enzima ao
substrato. Os estudos de cristalografia mostraram também que, a maior parte
das lipases conhecidas apresentam o sítio ativo recoberto, sugerindo que o
estado inativo provavelmente prevalece em solução. Com base nestas
observações, postulou-se que seria necessário um rearranjo conformacional ou
de posição da tampa da enzima, para permitir o acesso do substrato ao centro
ativo, rearranjo este que foi efetivamente verificado para diferentes lipases
(FREIRE & CASTILHO, 2008). Estudos de cristalização da enzima na presença
de inibidores ou co-fatores mostraram que a estrutura obtida encontra-se
sempre na conformação aberta (NARDINI et al., 2000). No caso das lipases
não complexadas, o estado conformacional depende da composição e das
propriedades microscópicas da solução (CYGLER & SCHRAG, 1997). Assim,
as estruturas das lipases já determinadas até hoje são geralmente divididas em
duas categorias: as que tem o sítio ativo acessível ao solvente (estrutura
aberta) e as que têm sítio ativo inacessível ao solvente (estrutura fechada). No
caso de algumas lipases, ambas as estruturas foram observadas, levantando a
FERNANDES, K. V.
35
questão da relevância desta forma para a atividade destas enzimas
(GONZÁLEZ-NAVARRO et al., 2001).
A tríade catalítica presente nas lipases é bastante semelhante ao
observado em serino-proteases. Desta forma, a hipótese mais aceita a respeito
do seu mecanismo de ação sugere que a catálise por lipases ocorra de forma
similar à catálise por serino-proteases (JAEGER et al., 1999). Acredita-se que o
mecanismo cinético das lipases não dependa do tipo de reação catalisada
(hidrólise, acidólise, esterificação, etc). A reação inicia-se com o ataque
nucleofílico ao carbono da ligação éster do lipídeo susceptível pelo átomo de
oxigênio do grupo hidroxila do resíduo de serina do sítio ativo, formando um
complexo enzimático acilado e havendo a liberação de álcool e do lipídeo.
Posteriormente, ocorre a hidrólise do complexo enzimático acilado,
regenerando a lipase (JAEGER et al., 1994).
1.6.2 – Aplicações das lipases
A capacidade das lipases em catalisar tanto a hidrólise de ésteres,
quanto, em meios não-aquosos ou restritos em água, as reações de
esterificação, interesterificação e transesterificação, permite que estas enzimas
sejam utilizadas na síntese regioseletiva ou na resolução estereoseletiva de
álcoois, ácidos carboxílicos e aminas, dando origem a produtos ativos (ésteres
e amidas) e ampliando consideravelmente as possibilidades de aplicações
comerciais destas enzimas (FREIRE & CASTILHO, 2008). Por isso as lipases
são excelente alternativa para as sínteses químicas clássicas, podendo ser
utilizadas nas indústrias de alimentos, de detergentes, oleoquímica,
farmacêutica, de química fina, de cosméticos e fragâncias, de polpa e papel, de
couro, de biossensores e no tratamento de efluentes ricos em óleo e graxas
(PANDEY et al., 1999; HASAN et al., 2006).
1.6.2.1 – Alimentos
Na indústria alimentícia as lipases têm sido utilizadas no
desenvolvimento de aromas de queijos e derivados, achocolatados e bebidas
alcoólicas, através da catálise da hidrólise seletiva de triacilgliceróis e liberação
FERNANDES, K. V.
36
de ácidos graxos, que atuam como flavorizantes ou como precursores destes
(JAEGER & REETZ, 1998; DIVARAK & MANOHAR, 2007). As lipases podem
também ser utilizadas na hidrólise da gordura do leite, na obtenção de melhor
textura de massas de pães, na maturação de salsichas ou ainda na remoção
de gordura dos produtos de carnes e peixes (SAXENA et al., 1999;
KASLAUSKAS et al., 1998).
1.6.2.2 – Detergentes
O uso de lipases como aditivos em detergentes ainda representa a maior
aplicação industrial destas enzimas (KIRK et al., 2002). Para esta finalidade
são requeridas algumas características dessas enzimas, como uma baixa
especificidade pelo substrato, não devendo diferenciá-lo e sim ter a capacidade
de hidrolisar gorduras de diferentes composições. É necessário, ainda, que
estas lipases sejam capazes de atuar em ambiente alcalino e em ampla faixa
de temperatura, condições essas encontradas em sistemas de lavagem. Muitos
detergentes têm em suas formulações surfactantes e outras enzimas, como
proteases e alquil benzeno sulfonatos, devendo as lipases ser resistentes à
ação dos mesmos (SHARMA et al., 2001).
1.6.2.3 – Papel e celulose
Na indústria de papel e celulose, as lipases são utilizadas para a
remoção do pitch, que é um conjunto de componentes hidrofóbicos da madeira,
como triacilgliceróis e cera, que são indesejáveis na manufatura de papel
(JAEGER & REETZ, 1998).
1.6.2.4 – Química fina e fármacos
A utilização de lipases nas indústrias química e farmacêutica também
tem crescido consideravelmente. Devido às características de régio e enâncio
seletividade de diversas lipases conhecidas, essas enzimas têm sido utilizadas
na resolução de misturas racêmicas e remoção seletiva de certos compostos
para a síntese de drogas quirais (KATZ et al., 1993; BERGLUND & HUTT,
FERNANDES, K. V.
37
2000). As lipases catalisam reações sobre substratos pró-quirais e propiciam a
resolução cinética de misturas racêmicas, atuando sobre diferentes grupos
funcionais, como álcoois e ésteres carboxílicos quirais ou pró-quirais,
cianidrinas, dióis, a e b-hidróxi ácidos, aminas, diaminas e aminoálcoois
(JARGER & REETZ, 1998; JAEGER et al., 1999; FREIRE & CASTILHO, 2008).
1.6.2.5 – Biodiesel
Outra aplicação das lipases que tem gerado grande interesse
atualmente é a produção de biodiesel. A produção deste tipo de biocombustível
consiste na transesterificação de óleos ou gorduras com álcoois de cadeias
curtas, principalmente metanol e etanol, produzindo alquil ésteres de ácidos
graxos (biodiesel) e glicerol em uma única etapa. Por via química, a catálise se
dá por um ácido ou por uma base, não apresentando diferença significativa
entre eles quanto aos resultados da reação. Entretanto, essa reação pode ser
também catalisada por enzimas. A utilização desses biocatalizadores
apresenta algumas vantagens potenciais quando comparada às vias químicas
tradicionais, como a facilidade de separação do biocatalizador (enzima
imobilizada); a fácil recuperação do glicerol e a conversão dos ácidos livres
presentes no óleo vegetal em biodiesel. Desta forma, apesar da via química de
produção de biodiesel a partir de óleos vegetais encontrar-se bem estabelecida
industrialmente, a utilização de uma via enzimática, catalisada especificamente
por lipases, apresenta-se como uma excelente alternativa para a redução dos
impactos ambientais. A partir da transesterificação de óleos vegetais também é
possível a produção de biolubrificantes (SHIEH et al., 2003). Entretanto, para
viabilizar a utilização de lipases neste setor industrial, necessita-se da sua
obtenção a custos reduzidos.
1.6.2.6 – Tratamento de efluentes
Apesar de geralmente clivarem triacilgliceróis específicos, as lipases
podem não ser totalmente específicas e catalisar reações de hidrólise de
triacilgliceróis que contêm, em sua composição, diferentes ácidos graxos, o que
pode ser de grande interesse para o tratamento de efluentes com alto teor de
FERNANDES, K. V.
38
gordura (SAXENA et al., 2003). As lipases podem ser utilizadas para a
remoção de óleo presente nas águas residuárias de fábricas, restaurantes e
residências, ou oriundas de indústrias de refinação de óleos e que poluem
solos e águas (JAEGER & REETZ, 1998; PANDEY et al., 1999; CAMMAROTA
et al., 2001).
1.6.3 – Produção de lipases por FES
As lipases microbianas são classicamente produzidas por fermentação
submersa. Entretanto, nos últimos anos, diversas pesquisas têm sido dirigidas
para a produção de lipases utilizando-se sistemas de fermentação no estado
sólido, obtendo-se inclusive alta produtividade (MATEOS DIAZ et al., 2006;
RODRÍGUES et al., 2006; VARGAS et al., 2008; MAHANTA et al., 2008; SUN
et al., 2009; GUTARRA et al., 2009).
Diferentes resíduos sólidos têm sido utilizados para a produção de
lipases de diferentes espécies de microrganismos por FES utilizados para
produção de lipase por fermentação no estado sólido
Mateos Diaz et al. (2006) compararam a produção de lipase de Rhizopus
homothallicus por FS e FES. As enzimas produzidas em ambos sistemas
apresentaram diferenças em suas propriedades, como atividade específica e
estabilidade térmica. A lipase produzida por FES mostrou-se mais termoestável
que a produzida por FS – na primeira, a meia vida a 50 ºC foi de 0,72 horas,
enquanto por FS foi de 0,44 horas. Outra característica interessante
encontrada na lipase estudada por esse grupo foi a alta especificidade por
ligações éster na posição interna dos triglicerídeos, propriedade nunca antes
relatada em lipases de Rhizopus sp. Diversos outros trabalhos comparam a
produção de lipase por FES e FS (CHRISTEN et al., 1995; BENJAMIN &
PANDEY, 1997a e 1997b). Todos relatam maiores produções e estabilidade
enzimática quando empregado o sistema de FES.
O Laboratório de Biotecnologia Microbiana da UFRJ (LABIM/IQ) tem
selecionado diversas cepas de fungos filamentosos produtores de lipase,
dentre as quais uma cepa de Penicillium restrictum mostrou-se excelente
produtora de lipase tanto por FS (FREIRE et al., 1997; FREIRE et al., 1999),
FERNANDES, K. V.
39
como por FES (GOMBERT et al., 1999; PALMA et al., 2000). Gutarra (2003)
selecionaram o fungo filamentoso Penicillium simplicissimum como um
excelente produtor de lipase por FES em torta de babaçu suplementada com
3,3% (m/m) de óleo de oliva. Através do uso da técnica de planejamento
experimental, foi possível determinar condições que permitiram aumentar ainda
mais a produção desta enzima por FES através do emprego de temperatura de
incubação de 30 ºC, teor de umidade inicial de 70% (m/m) e suplementação
com melaço a 6,25% (m/m base seca) (GUTARRA et al., 2007). Em trabalhos
posteriores, Gutarra et al. (2009) relatam que a lipase da cepa de P.
simplicissimum obtida por FES em torta de babaçu apresenta características
ácidas e termotolerantes - pH 4,0 a 6,0 e temperatura de 45 a 60 oC -
apresentando altas atividades lipásicas. Godoy (2009), também utilizando o
método de planejamento experimental, obteve grande atividade lipásica por
FES utilizando o P. simplicissimum crescido em rejeito de mamona.
Existem alguns trabalhos referentes à produção de lipases por A. niger
em diferentes rejeitos agroindustriais, inclusive em torta de mamona (KAMINI et
al., 1998; DANTAS & AQUINO, 2009). No entanto, estes trabalhos se focam
exclusivamente na produção da enzima, ignorando a avaliação da toxicidade
deste material após o processo, e assim deixando de lado uma outra aplicação
para este resíduo, que é sua utilização como ração animal.
FERNANDES, K. V.
40
2 – OBJETIVOS
2.1 – Objetivos gerais
Padronizar um teste eficiente para detecção de ricina e da sua atividade
biológica em extrato protéico de torta de mamona. Empregar o processo de
fermentação em estado sólido para agregar valor (produção de lipase) e
destoxificar simultaneamente a torta de mamona.
2.2 – Objetivos específicos
• Purificar ricina de torta de mamona;
• Avaliar o efeito tóxico da ricina sobre células Vero;
• Padronizar ensaios de determinação da atividade tóxica da ricina
através da determinação do crescimento celular e de dosagens da
atividade lactato desidrogenase;
• Avaliar a destoxificação da torta de mamona por FES através do teste
de citotoxicidade proposto.
• Avaliar a produção de lipases e proteases microbianas.
FERNANDES, K. V.
41
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Padronização do método de avaliação da toxicidade da ricina
usando células Vero
3.1.1 – Purificação da ricina
A ricina foi extraída a partir da torta de mamona e purificada seguindo a
metodologia descrita por Anandan (2005). Amostras de torta de mamona (500
g) foram trituradas em grau com auxílio de um pistilo, embebidas com 2,5 L de
água destilada. Esta suspensão foi acidificada com HCl até pH 3,8 e mantida
sob agitação por 6 horas a 30ºC. Após sedimentação dos sólidos, o
sobrenadante foi filtrado em gaze. O precipitado foi ressuspenso em 1,5 L de
água destilada (sem HCl) sob agitação por 3 horas e, novamente filtrada. Esta
etapa foi repetida mais uma vez.
O filtrado, cerca de cinco litros, contendo toda ricina e porções de
ricinina, foi evaporado em centrífuga a vácuo (Speed Vac) até 300 mL. Esta
solução foi tratada com NaCl até a saturação e foi a seguir centrifugada à 2000
g por 20 minutos para separar o precipitado contendo ricina.
O precipitado foi dissolvido em 200 mL de água deionizada, re-
precipitado com sulfato de amônio (90% de saturação). Após duas outras
precipitações com o mesmo sal, o precipitado foi diluído em 200 mL de água
deionizada e dialisado à 4 ºC por um período de 72 horas, contra tampão tris
pH 6,8. A troca do tampão foi feita uma vez a cada 2 horas, nas primeiras 12
horas, e subseqüentemente uma vez a cada 6 horas no tempo restante.
Após 72 horas, o dialisado foi centrifugado à 2000 g por 10 minutos para
separar a matéria insolúvel do sobrenadante contendo a ricina. A solução foi
concentrada à vácuo. A quantidade de ricina no dialisado foi estimada pelo
método de Bradford (1976) e a qualidade do material foi avaliada por SDS-
PAGE 12% (LAEMMLI, 1970). A sequência de aminoácidos (8 resíduos) dos
peptídeos presentes em uma das bandas vistas no gel foi obtida por
degradação de Edman (1950), e esta foi comparada com a seqüência N-
terminal da cadeia A da ricina (RTA) e da aglutinina de Ricinus comunis (RCA)
utilizando-se o software ClustalW2.
FERNANDES, K. V.
42
A toxina purificada foi utilizada para o preparo de uma solução estoque
de ricina 50 µg/mL em tampão PBS pH 7,0. O material foi esterilizado em fluxo
laminar, utilizando-se filtros de 0,22 µm.
Os testes foram primeiramente realizados utilizando-se ricina purificada
para que pudessem ser estabelecidos o tempo e a concentração ótima para os
ensaios subseqüentes envolvendo o extrato protéico total da torta de mamona.
3.1.2 – Obtenção do extrato protéico da torta de mamona
A torta de mamona triturada (1 g) foi embebida com 4 mL de tampão
PBS pH 7,0. A mistura foi mantida sob agitação durante 3 horas em
temperatura ambiente e, em seguida, submetida à centrifugação a 2.000 g
durante 5 minutos. O sobrenadante foi submetido à outra centrifugação (10.000
g por 15 minutos). O sobrenadante final (extrato bruto de proteínas) foi
coletado. Baseando-se nos dados obtidos por Fernandes (2008), cuja
concentração de ricina variava entre 1,5 a 4,5% em função da cultivar usada,
admitimos o valor médio, ou seja, 3% para esta proteína. Diluições deste
extrato foram feitas de modo a obter uma solução estoque contendo ricina 50 a
µg/mL em tampão PBS pH 7,0. O material foi esterilizado em fluxo laminar,
utilizando-se filtros de 0,22 µm.
3.1.3 – Testes de atividade tóxica em cultura de células
3.1.3.1 – Ensaio de citotoxidade e curva de dose-resposta
Foram utilizadas para o ensaio células Vero (derivadas do rim de
Cercopithecus aethiops). Além de ser amplamente utilizada em estudos de
toxicologia, a escolha do tipo celular foi feita levando-se em conta a avaliação
do ensaio por contagem de células, visto que as células Vero são aderentes, e
ao morrerem se desprendem do substrato, facilitando a contagem. Estas foram
cultivadas em meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Médium)
suplementado com 5% de soro fetal bovino, a 37ºC e na presença de 5% de
CO2.
FERNANDES, K. V.
43
As células para o ensaio foram desprendidas de uma garrafa de 25 cm2
(TPP / 90025) contendo uma cultura em monocamada. Para isso utilizamos
uma solução de tripsina (tripsina 0,5 mg/mL + EDTA 0,2 mg/mL), durante 5
minutos à 37ºC. As células foram resuspendidas em meio de cultura (DMEM +
5% de soro fetal bovino). As células em suspensão foram contadas em
microscópio ótico, e esta suspensão foi dividida em uma placa de 24 poços, na
proporção de 2,0 x 104 células por poço. A cultura foi mantida a 37 ºC por 48
horas (até atingir o estágio de monocamada). O material teste filtrado foi então
incubado com as células, em duplicata, numa concentração de 10 µg/mL.
Este ensaio foi primeiramente conduzido utilizando-se a ricina obtida
como descrito no item 3.1.1, afim de determinar a dose mínima para induzir
morte celular na cultura de células Vero. Para isso, foram utilizadas diferentes
diluições da proteína feita em PBS pH 7,0: 100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL, 100
ng/mL, 10 ng/mL, 1, ng/mL, 100 pg/mL e 10 pg/mL.
3.1.3.1.a – Avaliação da toxicidade na presença de anticorpo anti-ricina
Para determinar a especificidade da ricina, foi utilizado um ensaio
conjugado com anticorpo. Para isso, foi utilizado anticorpo anti-cadeia A (IgG
de cabra). O anticorpo foi administrado na cultura de células (8 µg) juntamente
com a amostra em teste. Para os testes de determinação do limite de detecção
do ensaio, o anticorpo foi administrado junto com uma dose de 1 µg de
ricina/mL.
3.1.3.1.b – Avaliação da atividade tóxica
Para determinar o efeito tóxico das amostras sobre a cultura, foram
realizadas: contagens de células nos tempos 0, 12, 24, 36 e 48 horas após a
incubação, em microscópio ótico e dosagem da atividade lactato
desidrogenase (LDH). A citotoxicidade pela dosagem de LDH foi determinada
nos tempos de 24 e 48 horas após a incubação. Os ensaios foram conduzidos
em placa de 96 poços. Em cada poço da placa foram adicionados 100 µL do
meio de cada cultura tratada, seguido de 100 µL da solução do kit para
FERNANDES, K. V.
44
detecção de LDH (Roche / Citotoxicity Detection Kit [LDH]). A placa foi mantida
na ausência de luz por 30 minutos para evitar a formação de interferentes
durante o tempo de reação. Durante a reação, o NADH (formado em grande
quantidade pela redução de NAD durante a conversão de lactato à piruvato
pela LDH) reduz estequiometricamente o sal de tetrazolio INT formando o
formazan, de cor vermelha. Então foi feita uma leitura colorimétrica em
espectrofotômetro a 490 nm, onde absorbância maior que 0,15 classifica o
material como tóxico. Como controle positivo para o teste foi utilizado Triton X-
100 2%, como controle negativo utilizou-se PBS, e DMEM foi utilizado como
branco.
3.2 – Processo de destoxificação por FES
3.2.1 – Microrganismos
Foi utilizada no processo de destoxificação uma cepa do fungo
filamentoso Aspergilus niger (status GRAS), oriundo da coleção de culturas do
Laboratório de Biotecnologia Microbiana (LaBiM-IQ-UFRJ).
3.2.2 – Preparo da torta de mamona
A torta de mamona foi primeiramente triturada e logo depois submetida à
separação granulométrica em peneiras com malha variante de 0,42-1,18 mm.
Em seguida, foi feita a autoclavagem do material (1 atm por 15 minutos).
3.2.3 – Propagação de inoculo
Para obtenção de esporos, o fungo foi cultivado a 30 °C por 7 dias em
meio PDA (Potato Dextrose Agar), contendo 1% de agar e 1% de azeite de
oliva. Os esporos foram raspados e suspensos em tampão fosfato de sódio (50
mM, pH 7,0) estéril. A concentração de esporos foi determinada através de
contagem ao microscópio óptico em câmara de Neubauer. Foi utilizada como
inóculo nos ensaios de fermentação uma concentração de esporos de 107
esporos/g de rejeito.
FERNANDES, K. V.
45
3.2.4 – Fermentação no estado sólido
Foram empregados biorreatores do tipo bandeja, cilíndricos com 10 cm
de diâmetro e 15 cm de altura (becker de 500 mL) com 20 g de torta,
perfazendo uma altura de leito de 1 cm. Como meio de cultivo foi empregada
torta de mamona fornecida pela empresa Bioóleo (Feira de Santana, BA),
autoclavada, com 48% de umidade, suplementada com melaço 6,25% (m/m).
As fermentações foram conduzidas por 120 horas, em triplicata, em câmara
climática com temperatura e umidade controlada em 30 ºC e 90%,
respectivamente. A amostragem foi realizada a cada 24 horas para medida de
parâmetros como pH, atividade de água e crescimento microbiano.
3.2.5 – Medida de parâmetros durante a fermentação
3.2.5.1 – Medida de crescimento
A quantificação do crescimento fúngico foi realizada de forma indireta
através da dosagem de N-acetilglicosamina (AIDOO et al., 1981). Na primeira
etapa, de hidrólise da parede celular do fungo, adicionou-se 5 mL de HCl 6 N a
0,5 g de amostra, colocando-se a mistura em banho de água fervente por 2
horas. Em seguida, a amostra foi resfriada e filtrada. Foi transferido 1 mL do
filtrado para um balão de 15 mL, adicionando-se 1 gota de solução alcoólica de
fenolftaleína 0,5% (m/v), sendo a neutralização efetuada com solução de NaOH
3 N, até que a coloração atingisse tonalidade rosa. Em seguida, foi feita a
titulação reversa com KHSO4 1%, até que esta coloração desaparecesse. O
volume do balão foi, então, completado com água destilada. Após esta etapa,
tomou-se 1 mL da solução anterior e adicionou-se à mesma 1 mL de solução
de acetil acetona em Na2CO3 0,5 N (1:50), colocando a mistura em banho de
água fervente por 20 minutos. Após resfriamento, foram adicionados 6 mL de
etanol e, em seguida, 1 mL de solução de p-DAB (p-dimetilaminobenzaldeido -
reagente de Erlich). Os tubos foram incubados a 65 ºC por 10 minutos e a
absorbância foi lida a 530 nm para a construção da curva de crescimento
celular. Maior absorbância representa maior quantidade de glicosamina
liberada. A glicosamina é um produto da degradação da quitina presente na
FERNANDES, K. V.
46
parede celular do fungo, e sua concentração está então diretamente associada
ao crescimento do microrganismo.
3.2.5.2 – Medida de teor de umidade
O teor de umidade foi medido através da análise de aproximadamente
0,5 g de material fermentado diretamente em balança determinadora de
umidade (AND – MX-50), a qual calcula a diferença de peso entre o material
umido e o material seco, após evaporar a água presente, por aquecimento à
160ºC.
3.2.5.3 – Medida da atividade de água (Aw)
Amostras de aproximadamente 1,0 g de material fermentado foram
analisadas em um higrômetro (Aqualab Decagon), para a determinação da
atividade de água nos diversos tempos de fermentação.
3.2.5.4 – Medida de pH
Adicionou-se 5 mL de água destilada a 0,5 g de material fermentado, e
a mistura foi vigorosamente agitada. Após 10 minutos, o pH do sobrenadante
foi medido em potenciômetro (GOMBERT et al., 1999).
3.2.6 – Avaliação da toxicidade da torta de mamona fermentada
O extrato protéico total da torta fermentada foi obtido como descrito no
item 3.1.2. A detecção da ricina foi primeiramente realizada por fracionamento
do extrato bruto em SDS-PAGE 12% em condições semi-desnaturantes
(ausência de β-mercaptaetanol). A atividade tóxica do material foi também
investigada por inoculação do extrato protéico e de ricina purificada da torta em
cultura de células Vero (item 3.1.3.1). O comportamento das células foi
avaliado por contagem de células e pela dosagem da atividade de LDH (item
3.1.3.1.b). Foram empregados ensaios de conjugação com anticorpo para
mostrar a especificidade da ricina presente na torta fermentada (item 3.1.3.1.a).
FERNANDES, K. V.
47
Como controle positivo foi utilizado extrato protéico bruto de torta de mamona
in natura, e para controle negativo foi utilizado PBS.
3.2.7 – Determinação da atividade enzimática na torta fermentada
3.2.7.1 – Extração das enzimas
Ao fim da fermentação foi realizada a extração das enzimas produzidas
no processo. Para isso foi utilizado tampão fosfato de sódio 0,1 M e pH 7,0, na
proporção de 5:1 (5 mL de tampão para 1 g de torta fermentada). A extração
foi feita em agitação por 20 minutos a 200 rpm e 35 ºC. Para separar o extrato
enzimático, primeiramente foi utilizada uma prensa para espremer o rejeito
embebido em tampão, e então o material foi centrifugado à 3000 rpm por 5
minutos a 20ºC. O extrato enzimático foi utilizado para a avaliação da atividade
de lipase e protease (GOMBERT et al, 1999; GUTARRA et al, 2007).
3.2.7.2 – Dosagem da atividade lipásica
A atividade lipolítica foi medida por titulação, utilizando goma arábica
como estabilizante para a reação (FREIRE et al., 1997). O método baseia-se
na titulação com NaOH 0,04 N dos ácidos graxos liberados pela ação das
lipases presentes no extrato enzimático (da fermentação), que clivam os
triacilglicerídeos do substrato lipídico, composto por 5% de azeite de oliva
emulsionado em 5% de goma arábica e tampão fosfato de sódio 0,1 M e pH 7,0
por 20 minutos à 35ºC. O ensaio branco foi realizado nas mesmas condições,
porém sem a adição do extrato enzimático. A atividade de lipase (1 U) foi
definida como a quantidade de enzima que libera 1 µmol de ácido graxo por
minuto, e foi medida a cada 24 horas de fermentação. A seguinte equação foi
utilizada pra determinar a atividade:
AL = (V – Vb) . M . 1000
t . Va
Onde:
AL = atividade (U/mL)
FERNANDES, K. V.
48
V = volume de solução de NaOH gasto para a titulação da amostra (mL)
Vb = volume de solução de NaOH gasto para a titulação do branco (mL)
M = Molaridade da solução de NaOH (milimoles/ml)
t = tempo de reação (min)
Va = volume de amostra (mL)
3.2.7.3 – Dosagem da atividade proteásica
A atividade proteásica foi determinada pelo método descrito por Charney
e Tomarelli (1947), que baseia-se na formação de peptídeos solúveis em TCA
(ácido tricloroacético) a partir da digestão de uma solução de azocaseína com
enzimas proteolíticas presentes no extrato. Foi diluído 0,5 mL da amostra em
tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,0), e a esta foi adicionado 0,5 mL de
azocaseína 0,5% (m/v) (também em tampão acetato). A mistura resultante foi
incubada a 37 ºC por 40 minutos. Em seguida, a reação foi paralisada pela
adição de 0,5 mL de TCA 10% em banho de gelo por 5 minutos. A seguir, a
mistura foi centrifugada a 3000 rpm por 2 minutos para remover o substrato
não digerido. Depois da centrifugação, 1 mL do sobrenadante foi colocado em
1 mL de uma solução de hidróxido de potássio 5 N. A absorbância dessa
solução foi medida em espectrofotômetro a 428 nm. O branco do aparelho foi
preparado adicionando-se 0,5 mL de tampão em substituição da amostra. O
branco da reação foi preparado adicionando-se 0,5 mL da amostra previamente
diluída somente após a adição do TCA. Uma unidade de atividade proteásica
(U) é definida como a quantidade de enzima que causa diferença unitária de
absorbância entre a amostra e seu respectivo branco por minuto, nas
condições de ensaio, de modo que o cálculo da atividade enzimática foi feito
pela equação seguinte:
Ap=(Absa . fa – Absb . fb) t . Va
Onde:
Ap = atividade (U/mL)
Abs a = absorbância da amostra
FERNANDES, K. V.
49
fa = fator de diluição da amostra
Absb = absorbância do branco da amostra
fb = fator de diluição do branco
t = tempo de reação (min)
Va = volume de amostra (mL)
3.3 – Avaliação da toxicidade para torta de mamona submetida a diversos
processos de destoxificação
Além de avaliar a destoxificação da torta por fermentação, foram
avaliados resíduos de mamona submetidos a outros processos para eliminação
da ricina. Os resíduos testados foram: a torta de mamona extrusada apenas, e
com adição de 4%, 6% e 7% de CaO (ASCHERI et al., 2007) cedidas pelo Dr.
Luiz Ascheri, da Embrapa; rejeito de mamona fermentado por P.
simplicissimum por 72 horas (GODOY et al., 2009), cedidos cedidos pelo
doutorando Mateus Godoy, do LABIM / UFRJ; e a torta de mamona
autoclavada para o uso na FES. A avaliação da toxicidade das tortas/rejeito de
mamona avaliados foi feita por SDS-PAGE e pelo ensaio de citotoxiciade (item
3.2.7).
FERNANDES, K. V.
50
4 – RESULTADOS
4.1 – Obtenção da ricina parcialmente pura
A primeira etapa do trabalho foi a purificação parcial da ricina para
utilização da mesma como padrão nos testes de citotoxicidade para determinar
o limite de detecção do ensaio proposto.
A Figura 8 mostra por SDS-PAGE 12% que a ricina foi parcialmente
purificada através da metodologia proposta (ANANDAN et al., 2005). Foram
visualisadas três bandas, sendo duas delas (seta verde e azul) com massa
molecular semelhante às cadeias A e B da ricina. A banda indicada pela seta
vermelha possui peso molecular semelhante à cadeia B da aglutinina de
Ricinus communis (RCA, 37 kDa), que por sua vez é um pouco maior que a da
cadeia B da ricina (34 kDa, seta azul). A sequência N-terminal parcial da
terceira banda (seta verde), determinada por degradação de Edman (Ile-Phe-
Pro-Gln-Tyr-Pro-Met-Lys), apresentou identidade com a região N-terminal da
cadeia A da ricina e da RCA. Assim como a cadeia B da RCA pode ser uma
das bandas que aparecem no gel, acredita-se que a cadeia A da RCA pode
estar em sobreposição com a banda correspondente à cadeia A da ricina.
Figura 8. A) Visualização eletroforética em SDS-PAGE 12% da fração obtida ao fim da purificação, mostrando a presença de três bandas com massa entre 34 e 24 kDa. As setas indicam a cadeia A (verde) e provável B (azul) da ricina, e a provável cadeia A da aglutinina (vermelha). M = Marcador. B) Alinhamento, feito através do ClustalW2, da seqüência obtida a partir da terceira banda, com a seqüência N-terminal da cadeia A da ricina (RTA) e com a cadeia A da aglutinina de R. communis (RCA).
14,3 kDa
A B
18,4 kDa
66 kDa
45 kDa
M R
34 kDa
24 kDa
FERNANDES, K. V.
51
Desta forma constatamos que a purificação da ricina pela metodologia
proposta não é eficiente, visto que não foi feita a separação da fração de RCA
presente no extrato.
4.2 – Determinação do limite de detecção da ricina em cultura de células
Vero
Antes de testar o extrato protéico de torta de mamona, foram realizados
ensaios para determinar o limite de detecção da ricina em cultura de células
Vero. Para isso, soluções com concentrações definidas de ricina (diluições)
foram testadas e o limite de detecção foi determinado pelo monitoramento de
morte celular através de contagem de células e pela dosagem da atividade de
LDH.
Os testes mostraram que a ricina pode ser detectada, através do ensaio
proposto, em concentrações muito baixas. Constatou-se que a concentração
mínima para induzir morte celular em cultura de células Vero (2,0 x 104
células/poço) é de 10 ng de ricina/mL (Figura 9 A). Esta concentração reduz
em cerca de 25% o número de células no intervalo entre 12 e 24 horas de
exposição, em com 48 horas a concentração celular chega a quase 50% do
inicial. Concentrações menores de ricina foram testadas, mas foi visto que em
concentrações igual ou menores que 1 ng de ricina/mL não ocorria morte
celular. As únicas concentrações que induziram 100% de morte celular após as
48 horas de incubação foram 100 µg/mL e 10 µg/mL. No entanto, para as
demais, basta a informação de que induzem morte celular a partir das 12 horas
de incubação, o que as classifica como tóxicas. Assim, o tempo mínimo para a
detecção da atividade tóxica foi determinado, sendo este de 24 horas. Isto
porque no tempo de 12 horas o comportamento das células tratadas ainda não
é bem definido para algumas diluições, como para a própria concentração
mínima (10 ng/mL), que permanece quase constante até as 12 horas, e após
este tempo verificamos redução considerável no número de células.
Além de definir o limite de detecção para o ensaio, foi
determinado através deste primeiros testes que o uso de um anticorpo anti-
FERNANDES, K. V.
52
cadeia A de ricina pode ser uma forma de apontar especificamente esta
proteína como agente tóxico presente no material em teste. Foi visto que o
anticorpo administrado junto com a toxina na cultura de células anula os efeitos
tóxicos da ricina, servindo como um ensaio imunológico para detecção desta
proteína. Isto ocorre provavelmente devido ao bloqueio do sítio ativo da cadeia
A, eliminando sua atividade tóxica pela incapacidade da enzima ligar-se ao
substrato (Figura 9 B).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 12 24 36 48
Tempo de exposição (horas)
Concentração
celular (%
)
PBS pH 7,0
100 ug/mL
10 ug/mL
1 ug/mL
100 ng/mL
10 ng/mL
1 ng/mL
100 pg/mL
10 pg/mL
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 12 24 36 48
Tempo de exposição (horas)
Concentração
celular (%
)
PBS pH 7,0
1 ug/mL + IgG
1 ug/mL
Figura 9. A) Comportamento celular (quanto à sobrevivência) após tratamento com ricina em diferentes concentrações, num período de 0, 12, 24, 36 e 48 horas após a incubação da toxina. Como controle foi utilizado PBS pH7,0. B) Comportamento celular após tratamento com solução de ricina 1 µg/mL na presença e na ausência IgG anti-cadeia A de ricina. As concentrações partem de 100% no tempo 0.
A
B
FERNANDES, K. V.
53
Verificamos também, como indica a Figura 10, que tanto a avaliação do
ensaio por contagem de células quanto pela dosagem da atividade de LDH
apresentam resultados semelhantes, podendo ser utilizado um ou outro para tal
fim. Para a dosagem de LDH feita após as 24 horas de incubação, verificou-se
resultados semelhantes aos obtidos pela contagem, com redução do número
de células nas culturas tratadas com 10 ng de ricina/mL ou concentrações
maiores (contagem) e com liberação de LDH no meio de cultura, também para
as células tratadas com estas concentrações de ricina. A LDH age como um
indicador de lesão tecidual, dessa forma, quanto maior a sua atividade
(mostrada no ensaio por método colorimétrico, onde maior absorbância indica
maior ativiadade), maior o número de células mortas.
0
50
100
150
200
250
300
PBS
pH 7
,0
1ug/
mL
+ Ig
G
10 p
g/m
L
100
pg/m
L
1 ng
/mL
10 n
g/m
L
100
ng/m
L
1 ug
/mL
10 u
g/m
L
100
ug/m
L
Concentração
celular (%
) 24 horas
após tratam
ento
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
DM
EM
PBS p
H 7
,0
Trito
n 2%
100
ug/
mL
10 u
g/m
L
1 ug
/mL
100
ng/
mL
10 n
g/m
L
1 ng
/mL
100
pg/
mL
10 p
g/m
L
1 pg
/mL
1 ug
/mL
+ Ig
G
Atividad
e de LDH (490 nm)
Figura 10. Comparativo entre a avaliação do teste de citotoxicidade através da contagem de células em microscópio ótico (A) e pela dosagem da atividade de lactato desidrogenase (B) após 24 horas de incubação. PBS pH 7,0 foi utilizado como controle negativo, e na dosagem de LDH utilizou-se DMEM como branco do ensaio.
A
B
FERNANDES, K. V.
54
4.3 – Fermentação em estado sólido
Foi avaliada a cinética de produção de lipase pelo fungo Aspergillus
niger em torta de mamona com 48% de umidade inicial, suplementada com
melaço a 6% (m/m) e temperatura controlada em 30 ºC. Foram avaliados,
ainda, o efeito de alguns parâmetros como umidade, atividade de água (Aw) e
pH (Figura 11 A), bem como produção de proteases e determinação indireta do
crescimento fúngico (através da dosagem de N-acetilglicosamina) ao longo de
120h de fermentação (Figura 11 B).
Figura 11. A) Variação de umidade (preto), atividade de água (vermelho) e pH (azul) durante fermentação em estado sólido pelo fungo A. niger, utilizando como substrato torta de mamona. B) Produção de lipase (verde) e protease (azul) em função do crescimento do A. niger (N-acetilglicosamina, em amarelo).
A
B
FERNANDES, K. V.
55
As atividades das enzimas lipase e protease apresentaram perfis
cinéticos similares atingindo um máximo de 6,25 U/g e 1,2 U/g,
respectivamente em 48 h de fermentação (Figura 11 B). Após este tempo as
atividades decresceram juntamente com a umidade e a atividade de água do
meio de cultivo (Figua 11 A). Por outro lado o perfil da curva de concentração
de N-acetilglicosamina em função do tempo apresenta crescimento pouco
significativo.
4.4 – Avaliação da destoxificação da torta de mamona por fermentação
em estado sólido
A torta de mamona fermentada por A. niger em FES foi utilizada para
determinação da atividade tóxica da ricina nos diversos tempos de
fermentação.
A presença da ricina foi primeiramente avaliada por SDS-PAGE (Figura
12). Foi visto que nos diferentes tempos de fermentação (24, 48, 72 e 96 horas)
as bandas com massa molecular semelhante às cadeias A e B da ricina são
degradadas, e nota-se um aumento nas bandas protéicas com menos de 30
kDa.
Figura 12. SDS-PAGE 12% do extrato protéico da torta de mamona fermentada . Para cada raia foram aplicados 15 µL de amostra, com exceção da INA. M = marcador; INA= in natura 7 µL; INB = in natura 15 µL; 24h, 48h, 72h e 96h = amostras referentes a cada um dos tempos de fermentação em que foi feita medida dos parâmetros.
31
116 97
66
200
45
21
Ricina A Ricina B
M INA INB 24h 48h 72h 96h
FERNANDES, K. V.
56
Diferente do que acontece com os outros materiais testados, a torta de
mamona fermentada apresenta produtos de degradação protéica em diferentes
faixas de massa molar. Este fato dificultou a análise da ricina utilizando apenas
a técnica de eletroforese.
A Figura 13 ilustra a determinação da atividade tóxica da torta de
mamona fermentada utilizando duas diferentes metodologias, a contagem de
células aderidas ao substrato (vivas) (A), e a dosagem da atividade de lactato
desidrogenase com o ensaio conduzido utilizando anticorpo anti-cadeia A da
ricina (B).
0
50
100
150
200
250
300
350
Controle In natura 24h 48h 72h 96h
Amostras
Concentração
celular (%
)
12 horas
24 horas
36 horas
48 horas
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
controle In natura 24 hs 48 hs 72 hs 96 hs
Amostras
Abs 492 nm
IgG -
IgG +
Figura 13. Determinação da atividade tóxica na torta de mamona fermentada por 24, 48, 72 e 96 horas. (A) Contagem de células. As concentrações partem de 100% no tempo 0. (B). Dosagem da atividade de LDH - Comparativo entre e o ensaio conduzido utilizando anticorpo anti-cadeia A de ricina (IgG +) e sem o anticorpo (IgG -). Como controle negativo para cada ensaio foi utilizado PBS pH 7,0.
A
B
Tempo de exposição
FERNANDES, K. V.
57
Como esperado, baseando-se nos resultados obtidos pela análise em
eletroforese, as amostras de torta fermentada não apresentaram atividade
tóxica, ou tiveram sua toxicidade reduzida (Figura 13). Verifica-se que ocorre
um aumento progressivo da concentração celular nos tempos de 12 a 36 horas
de incubação, nas amostras tratadas com torta fermentada por 24, 48 e 96
horas. A torta fermentada por 72 horas não induziu morte celular, mas o
crescimento da cultura mostrou-se inibido durante todo o tempo de exposição.
Este comportamento também pode ser visto após 48 horas de incubação para
a torta fermentada por 96 horas. Já as células tratadas com tortas fermentadas
por 24 e 48 horas apresentam comportamento de crescimento semelhante ao
controle durante as 48 horas de incubação (Figura 13 A).
No teste para detecção da atividade de LDH (Figura 13 B) foi observado
que a toxicidade da torta foi reduzida drasticamente em 24 horas de
fermentação, com aumento desta atividade em 72 e 96 horas de fermentação.
Para mostrar se realmente a ricina era a responsável pela baixa
atividade tóxica encontrada nas amostras dos tempos finais de fermentação,
foram conduzidos ensaios de conjugação com anticorpo, com o objetivo de
bloquear a atividade desta proteína. A Figura 13 B mostra que não ocorre
morte celular (ou é drasticamente reduzida) em culturas tratadas com torta in
natura, quando esta foi tratada também com anticorpo anti-ricina. No entanto,
após 72 e 96 horas de fermentação, mesmo quando o resíduo fermentado era
incubado com o anti-corpo, houve redução na proliferação celular com
concomitante liberação de LDH. Desta forma, podemos concluir que a ricina
não foi responsável pela diminuição da proliferação celular nas culturas
tratadas com torta fermentada por mais de 72 horas.
As células Vero, tratadas com extrato protéico de torta de mamona
fermentada pelo fungo A. niger foram examinadas ao microscópio ótico com
um aumento de 20x (Figura 14). Em A, verifica-se o desenvolvimento das
células Vero tratadas com PBS (controle), onde é possível ver a formação da
malha de fibrobroblastos, indicando um crescimento adequado da cultura até
48 horas de incubação. O mesmo comportamento é visto em C, D, E e F, que
representam as células tratadas com torta fermentada por 24, 48, 72 e 96
horas, respectivamente. Em B, verifica-se que as células tratadas com torta de
FERNANDES, K. V.
58
mamona in natura morrem por apoptose. O comportamento é representado
pela contração das células e seu desprendimento do substrato (setas).
Figura 14. Cultura de células Vero, tratadas com extrato protéico de torta de mamona fermentada pelo fungo A. niger, examinadas ao microscópio ótico. (x20), após 0, 24 e 48 horas de incubação. A) PBS pH 7,0; (B) Torta de mamona in natura; (C) Torta de mamona fermentada por 24 horas; (D) Torta de mamona fermentada por 48 horas; (E) Torta de mamona fermentada por 72 horas; (F) Torta de mamona fermentada por 96 horas. As setas em B-48h indicam as células contraídas. Barra = 50 µm.
0h 24h 48h
A
B
C
D
E
F
FERNANDES, K. V.
59
4.3 – Avaliação da toxicidade da torta de mamona
Uma vez mostrada a eficiência para detectar ricina purificada em cultura
de células, passamos a aplicar o ensaio para detectar a toxina na torta de
mamona in natura e submetida a diferentes processos para destoxificação.
Inicialmente foi avaliada a presença da ricina por eletroforese (Figura 15)
nas diversas amostras, a saber: torta de mamona in natura; torta de mamona
extrusada apenas, torta extrusada na presença de 4%, 6% e 7% de CaO; torta
de mamona autoclavada; rejeito de mamona (Petrobras - PI0105888-6)
fermentado por 72 horas (Penicillium simplicissimum). Observou-se que as
bandas correspondentes à ricina não aparecem nas tortas extrusadas (com e
sem CaO) e no rejeito fermentado, indicando a possível destoxificação deste
material. A torta autoclavada, que posteriormente foi utilizada como substrato
para a fermentação no estado sólido, apresentou as bandas com massa
molecular próximas da cadeia A e B da ricina, sendo então apontado, por este
teste, como o único material tóxico entre as amostras analisadas.
Figura 15. SDS-PAGE para o extrato protéico de torta e rejeito de mamona submetidos a diferentes tipos de tratamento. As setas indicam as duas cadeias da ricina. M – Marcador; IN – In natura; EX – Extrusada; 4% - Extrusada com 4% de CaO; 6% - Extrusada com 6% de CaOão; 7% - Extrusada com 7% de CaO; AUT – Autoclavada; FER – Fermentado por 72 horas.
FERNANDES, K. V.
60
Os extratos protéicos de cada uma das amostras de torta de mamona
utilizadas para a eletroforese foram também submetidos aos ensaios de
citotoxicidade para confirmação da eficiência no processo de destoxificação da
torta/rejeito. A avaliação do teste foi feita por contagem de células e por ensaio
para atividade de LDH, assim como foi feito para a ricina purificada.
Como mostra a Figura 16, os resultados foram um pouco diferentes do
que mostrado no gel de eletroforese. As tortas extrusadas, pura e com a adição
de até 6% de CaO, não tiveram o problema da toxicidade completamente
resolvido e continuaram matando as células Vero em cultura (Figura 16 A). Já o
processo de extrusão com adição de no mínimo 7% de CaO se apresentou
como um processo eficiente na destoxificação da torta, como já havia sido
mostrado por eletroforese. O mesmo ocorre com o rejeito de mamona
fermentado, que também não apresentou atividade tóxica sobre as células
tratadas. O ensaio de citotoxicidade mostra também que a ricina que aparece
nas amostras de torta autoclavada está biologicamente ativa e causa morte
celular.
A Figura 16 B mostra a determinação da atividade tóxica feita pela
dosagem de LDH, onde verifica-se que os resultados se assemelham aos
obtidos pela contagem de células. Assim, confirma-se que ambos os testes,
feito por contagem ou dosagem de LDH, são eficinetes na determinação da
atividade tóxica da ricina em cultura de células Vero.
FERNANDES, K. V.
61
050
100150200250300350400450500
PBS
In n
atur
aExt
rusa
daEx
tr. C
aO 4
%Ex
tr. C
aO 6
%Ex
tr. C
aO 7
%Aut
ocla
vada
Ferm
enta
da 7
2h
Amostras
Concentração
celular (%
)
12 horas
24 horas
36 horas
48 horas
0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000
DM
EM
PB
S
in n
atur
a
auto
clava
da
extru
sada
extru
sada
4%
CaO
exru
sada
6%
CaO
extru
sada
7%
Cao
ferm
enta
da 7
2h
Abs 490 nm
Figura 16. Teste de citotoxicidade para o extrato protéico de torta e rejeito de mamona submetidos à diferentes tipos de tratamento. (A) Contagem de células por microscopia ótica; (B) Dosagem da atividade de LDH. Foi utilizado PBS pH 7,0 como controle negativo, e na dosagem de LDH utilizou-se DMEM como controle de background.
A
B
FERNANDES, K. V.
62
A Tabela 6 faz uma comparação entre as duas metodologias utilizadas
para detectar a ricina na torta/rejeito de mamona. Através desta é possível
perceber que o teste biológico em cultura de células apresenta-se mais
sensível para a detecção da ricina
Tabela 6. Comparativo entre a detecção da ricina na torta e no rejeito de mamona por SDS-PAGE e pelo ensaio de citotoxicidade proposto. Amostra SDS-PAGE Citotoxicidade
Torta in natura + +
Torta extrusada - +
Torta extrusada + 4% CaO - +
Torta extrusada + 6% CaO - +
Torta extrusada + 7% CaO - -
Rejeito autoclavado + +
Rejeito fermentado 72h - - + Presença de ricina - Ausência de ricina
A Figura 17 mostra fotografias das culturas de células Vero tratadas com
torta in natura, torta extrusada com 7% de CaO, torta autoclavada e rejeito
fermentado. Percebe-se em B e C que o material dito como tóxico (torta in
natura e autoclavada, respectivamente) induz morte celular, vista a grande
quantidade de células que se desprendem do substrato. Em A, C e D, a cultura
apresenta um padrão de crescimento comum, formando uma malha de células
saudáveis.
FERNANDES, K. V.
63
AA 00 hh 2244 hh
BB
CC
DD
EE
Figura 17. Cultura de células Vero, tratadas com extrato protéico de torta de torta de mamona submetida a diferentes processos de destoxificação, examinadas ao microscópio ótico (x 20). Os tempos de incubação de cada amostra (eixo y) são mostrados no eixo x da figura. (A) PBS pH 7,0; (B) Torta de mamona in natura; (C) Torta de mamona autoclavada; (D) Rejeito de mamona fermentado (72h); (E) Torta de mamona extrusada com 7% de CaO. As setas indicam as células contraídas. Barra = 50 µm.
4488 hh
FERNANDES, K. V.
64
5 – DISCUSSÃO
Entre as espécies de oleaginosas cultivadas no Brasil, a mamoneira é
uma das menos exigentes em termos de clima, solo e manejo cultural. Não
obstante, ela tem a capacidade de gerar um produto (o óleo) cujo leque de
possibilidades e aplicações industriais é bastante amplo.
Com a implantação do programa de produção de biodiesel, a tendência
é que ocorra um aumento na disponibilidade de rejeitos agroindustriais
oriundos da extração de óleo, dentro dos quais encontra-se a torta de mamona.
Esta é um produto rico em nutrientes que já é utilizado como fertilizante. Devido
ao seu alto teor protéico, poderia ainda ser utilizado como um ótimo
complemento para a alimentação de animais. No entanto, esta aplicação
esbarra no problema da presença de compostos tóxicos, sendo o principal
componente tóxico da torta de mamona a proteína inativadora de ribossomos,
ricina. Atualmente encontra-se em estudo diversos tratamentos para a
eliminação da ricina presente na torta de mamona.
Um método que se mostrou eficiente para eliminação da ricina em rejeito
de mamona (um resíduo diferente da torta, gerado por um processo de
produção de biodiesel da Petrobras) é a fermentação em estado sólido. Godoy
et al. (2009) mostrou que ao utilizar este rejeito como substrato para produção
de lipases pelo fungo P. simplicissimum, os níveis de ricina eram reduzidos a
concentrações indetectáveis por SDS-PAGE e cromatografia. Além disso, a
sensibilidade aos alérgenos também era reduzida para o material fermentado.
Assim como o trabalho de destoxificação por FES (GODOY et al., 2009),
existem muitos outros métodos ditos como eficientes na eliminação da
toxicidade da torta de mamona. No entanto, a maioria destes trabalhos esbarra
no mesmo problema, o de detecção da toxina. A detecção por SDS-PAGE, por
exemplo, determina apenas a presença ou não da toxina, mas não indica se
esta continua biologicamente ativa. O mesmo ocorre para diversos ensaios
baseados na detecção por anticorpo específico para ricina. Testes biológicos,
tanto in vivo quanto in vitro, também necessitam ser complementados com
ensaios de detecção com anticorpo.
No presente trabalho foi proposto, então, o desenvolvimento de um
bioensaio para detecção de ricina, bem como de sua atividade biológica em
FERNANDES, K. V.
65
cultura de células Vero. Também foi testada a viabilidade da FES como
processo de destoxificação da torta de mamona para uso desta na alimentação
animal. Para isso foi utilizado o fungo filamentoso Aspergillus niger,
considerado um microrganismo GRAS.
O primeiro passo do trabalho foi a purificação da ricina para
padronização do teste de citotoxicidade, e para isso foi utilizada a metodologia
descrita por Anandan et al. (2005). Ao fim do processo, a pureza do material foi
avaliada por SDS-PAGE e sequenciamento protéico. Das três bandas
visualizadas (Figura 8), uma foi identificada como possível cadeia A da ricina
ou cadeia A da RCA. As outras duas, acredita-se, baseando-se na sua massa
molecular, que correspondem às cadeias B da ricina e da RCA. Apesar do
objetivo de purificar a ricina não ter sido alcançado com eficiência, ter a RCA
como contaminante não é algo preocupante, visto que a maioria dos processos
descritos para purificação da fração tóxica da mamona não excluem a
aglutinina (FERNANDES, 2009; CHAUDHARY & SOOD, 2008; OLSNES,
2004). Isto acontece devido à alta identidade encontrada entre as cadeias A
(93%) e a cadeia B (84%) da ricina e da RCA (OLSNES, 2004). Além disso, a
RCA não apresenta toxicidade. Os resíduos que diferem entre esta e a ricina é
crucial para a atividade tóxica, como foi mostrado por Olsnes et al. (1974) ao
bloquear estes resíduos com anticorpo específico, o que culminou na perda da
atividade tóxica da ricina.
Após obter o padrão de ricina, foram realizados ensaios de
citotoxicidade para determinação do limite de detecção da atividade tóxica
desta proteína em cultura de células Vero. Para isso, foram feitas diferentes
diluições da toxina em tampão PBS (pH 7,0) e estas foram incubadas com as
células por um total de 48 horas. Contagens foram realizadas nos tempos de 0,
12, 24, 36 e 48 horas de incubação. A dosagem da atividade de LDH foi feita
48 horas após a incubação. Foi visto então que o ensaio proposto é capaz de
detectar ricina na concentração de até 10 ng/mL (Figuras 9 e 10). Um ensaio
semelhante, proposto por Brzezinski e Craft (2007), mostrou que células Jurkat
(linfócitos T derivados de linfoma) tratadas com ricina respondiam à ação tóxica
numa concentração mínima de 100 pg/mL. A avaliação do ensaio foi feita
apenas por dosagem da atividade de LDH, visto que células Jurkat são de
linhagem não aderente, o que dificulta a contagem. Dessa forma, o ensaio
FERNANDES, K. V.
66
proposto no atual trabalho mostra-se em vantagem, visto que oferece uma
maior “elasticidade” na avaliação do comportamento celular, permitindo a sua
utilização em laboratórios apropriados ao uso tanto da contagem de células
aderidas quanto da dosagem de LDH. Em relação ao mínimo de ricina
detectada, Brzezinski e Craft (2007) utilizaram ricina comercial (Vector
Laboratories). No atual trabalho, a fração de aglutinina presente no material
parcialmente purificado pode ter sido responsável pela estimativa errônea da
concentração de ricina, a qual pode ter sido superestimada. Assim, é possível
que o limite de detecção de ricina para o ensaio proposto seja ainda menor do
que o mostrado.
Outros métodos descritos na literatura se mostram mais eficazes no que
diz respeito ao limite de detecção da ricina. Um exemplo é o imuno-PCR
(LUBELLI et al., 2006), que combina a especificidade de uma análise
imunológica com a amplificação exponencial do PCR, e detecta ricina em até
0,01 pg/mL. No entanto, este e muitos outros ensaios baseados em ligação de
anticorpo, não apresentam eficácia em mostrar a atividade tóxica da proteína.
Além disso, kits para PCR são caros, e a aplicação do método em maior escala
pode ser inviável.
Após confirmar a eficácia dos testes de citotoxicidade em detectar a
atividade tóxica da ricina, foram realizados experimentos de FES, utilizando a
torta de mamona como substrato para o crescimento do fungo filamentoso
Aspergillus niger, com o objetivo de avaliar a eventual destoxificação do
resíduo e produzir enzimas (lipases) de interesse biotecnológico. Foram
monitorados parâmetros como crescimento celular (dosagem de N-
acetilglicosamina), umidade, atividade de água, pH e produção de proteases
durante o processo fermentativo.
O valor de atividade lipásica verificado nos ensaios ficou um pouco
abaixo do encontrado no trabalho de Falony et al. (2006) para o fungo
Aspergillus niger cultivado em farelo de trigo suplementado com sulfato de
amônio e uréia Entretanto, os autores alcançaram uma produção máxima de
lipase (9,14 U/g ) após o a otimização do processo e da composição do meio
de cultivo, o que não foi realizado neste trabalho.
Em outro trabalho (DANTAS & AQUINO, 2009), foram conduzidos
experimentos de produção de lipase por A. niger em torta de mamona,
FERNANDES, K. V.
67
obtendo-se uma atividade máxima de 23 U/g após 96 horas de fermentação,
sob condições de 35-45% de umidade e temperatura ambiente. Entretanto,
neste trabalho foi realizado uma otimização da produção de lipases em
diferentes faixas de pH. Os autores mostraram que uma maior produtividade é
atingida em pH ácido (ao testar uma faixa de pH entre 2 a 8), podendo chegar
a 782 U/g para a torta de mamona e até 3278 U/g em torta de babaçu. Desta
forma, pode-se concluir que o processo fermentativo preliminar, realizado no
presente trabalho, ainda precisa ser aprimorado com o objetivo de para
otimizar a produção de lipases microbianas.
A FES utiliza resíduos sólidos da agroindústria, de composição bastante
complexa. Os microrganismos que crescem nesse tipo de processo necessitam
produzir diversas enzimas capazes de degradar e tornar disponíveis os
nutrientes presentes no meio de cultivo, dentre elas as proteases (Gombert et
al. 1999; Palma et al., 2000). Em contrapartida, a presença de proteases pode
ser indesejável, pois podem catalisar a hidrólise das lipases produzidas,
gerando um produto instável. A maior produção de protease foi obtida, no
presente trabalho, em 48 horas de fermentação, com uma atividade inferior a
encontrada por Godoy (2009) em um resíduo similar a este denominado
resíduo de mamona. Por outro lado, Crespo-Neto (2009) mostrou que metalo
proteases estão envolvidas na degradação da ricina armazenada durante
determinado tempo em determinadas condições. Além disso, no processo de
destoxificação do rejeito de mamona proposto por Godoy et al. (2009) verificou-
se uma maior produção de proteases pelo P. simplicissimum (atividade máxima
de 3,0 U/g), e estas poderiam estar hipoteticamente associadas à degradação
da toxina por proteólise
A manutenção da umidade na FES é um fator extremamente importante
para o processo. Crescimento microbiano e produção de enzimas se mantêm
altos quando a atividade de água é alta (CORONA et al., 2005; PANDEY,
1992), indicando que um melhor controle da umidade e da atividade de água
pode levar a maiores produções de enzimas na torta de mamona. Entretanto,
estas variáveis são de difícil controle no processo principalmente devido à
baixa capacidade de retenção de água inerente ao tipo de matriz.
Deste modo uma possível hipótese para o decréscimo da atividade
lipásica e proteásica após 48 horas de fermentação (Figura 11 B) poderia estar
FERNANDES, K. V.
68
relacionada à perda de umidade à queda da atividade de água ao longo das
120 h de fermentação (Figura 11A). Assim, a taxa de produção de lipase pelo
fungo estaria menor do que a taxa de desnaturação enzimática, levando a
menores concentrações enzimáticas ao final da fermentação.
A torta de mamona fermentada foi submetida à extração de proteínas
totais e este extrato foi testado para atividade tóxica. Os testes foram
conduzidos por SDS-PAGE e ensaio de citotoxicidade por contagem de células
e dosagem de LDH.
Por eletroforese constatou-se que a degradação parcial das bandas
correspondentes a ricina (Figura 12). No entanto, devido a grande quantidade
de produtos de degradação protéica visualizados no gel, fica inviável afirmar se
as bandas visualizadas com menor intensidade são realmente a toxina. Para
isso faz-se necessária uma análise da especificidade da ricina através de um
ensaio de conjugação com anticorpo.
A atividade biológica foi avaliada pelo ensaio de citotoxicidade, no qual
verificou-se que o material fermentado estava parcialmente isento de
componentes tóxicos. Isto porque, apesar da toxicidade não ter sido constatada
(ou vista em níveis deconsideráveis) em 24 e 48 horas de fermentação, as
amostras correspondentes a 72 e 96 horas apresentavam alguma toxicidez,
visto que o crescimento celular sofreu uma inibição (Figura 13 A). Por dosagem
da atividade de LDH também observou-se que as amostras de 72 e 96 horas
são ditas como tóxicas (Figura 13 B). No entanto, não poderíamos apontar a
ricina como agente tóxico em questão sem antes checar a especificidade
desta, o que foi feito pelo teste usando anticorpo anti-cadeia A. Desta forma,
constatou-se que a ricina provavelmente não é a toxina responsável pelo mal
crescimento das células tratadas com extrato fermentado por 72 e 96 horas.
Isto porque, mesmo com o anticorpo bloqueando o sítio ativo da cadeia A na
ricina que poderia estar presente, as células tratadas pelas amostras em
questão continuaram apresentando sinais de intoxicação (liberação de LDH).
Uma possível explicação para o caso seria a produção de algum componente
tóxico pelo fungo. Apesar de ser considerado um microrganismo GRAS,
algumas cepas de A. niger podem produzir ocratoxina A (OTA), mesmo que em
baixas concentrações (ESTEBAN et al., 2006). Ocratoxina A, a mais potente
dentre as ocratoxinas, provoca graves alterações teciduais em rim de humanos
FERNANDES, K. V.
69
e animais. Pel et al. (2007) mostraram, através do sequenciamento do genoma
de A. niger, que este apresentava homólogos aos genes envolvidos na síntese
de fumonisinas por F. verticillioides. Dessa forma, a síntese desta toxina por A.
niger pode estar relacionada às condições de cultivo deste fungo.
Após padronizar o teste de citotoxicidade para ricina purificada e para o
extrato protéico total da torta de mamona, estes ensaios foram conduzidos para
detectar a proteína em resíduos desta oleaginosa, submetidos a diferentes
processo de destoxificação. A presença de ricina foi primeiramente avaliada
por SDS-PAGE (Figura 15), para fins comparativos (Tabela 6) com o ensaio em
cultura de células (Figura 16). Para isso foram utilizadas as tortas de mamona
in natura e submetida a diferentes tratamentos para destoxificação. Os testes
indicaram que alguns tratamentos ditos como eficientes para eliminação da
ricina não corresponderam às expectativas quando avaliados pelo método em
cultura de células. A torta de mamona extrusada pura ou com a adição de 4% e
6% de CaO apresentava-se aparentemente destoxificada, visto que as bandas
correspondentes à ricina não apareciam no gel. Mas ao avaliar este material
pelo teste de citotoxicidade, verificamos que a toxicidade ainda representa
problema, diferente do que ocorre com a torta extrusada com 7% de CaO.
Dessa forma, acredita-se que a destoxificação não está relacionada apenas
com o processo de extrusão, como proposto por Ascheri et al. (2007), mas sim
com a concentração de CaO utilizada no processo. Os resíduos de Glu177 e
Arg180, localizados no sítio ativo da cadeia A da ricina, são particularmente
importantes para a atividade tóxica (DAY et al., 1996). Então, acredita-se que
este tipo de tratamento químico esteja relacionado com a modificação destes
aminoácidos críticos para a atividade catalítica da toxina. Oliveira (2009)
mostrou que a utilização de sais de cálcio, que modificam um resíduo de Glu
importante para a ligação da IgE às albuminas 2S (CARRIELO-GAMA, 2006),
apresenta-se como um método eficiente na desalergenização da torta de
mamona.
Outro resultado interessante foi visto no processo de autoclavagem da
torta. Constatou-se que esta continua tóxica após o tratamento, e então, não
podemos atribuir a destoxificação da torta fermentada a esse pré-tratamento
para esterilização do substrato para FES. Anandan et al. (2005) mostraram,
dentre diversos tratamentos, que a autoclavagem do material (15 psi por 60
FERNANDES, K. V.
70
minutos) era eficaz na destoxificação da torta de mamona. No entanto, este
processo foi validado apenas por análise em Western blotting, que assim como
o SDS-PAGE, pode deixar dúvidas em relação à real toxicidade do material,
como foi mostrado para a torta extrusada, por exemplo.
Dessa forma, constatamos que o tratamento com cálcio, bem como a
FES, podem ser formas eficazes de destoxificar e desalergeniszar a torta de
mamona. A metodologia da FES é ainda mais interessante do ponto de vista
tecnológico, visto que agrega valor a rejeitos da indústria do biodiesel,
produzindo enzimas de grande interesse tecnológico como lipases e proteases.
Ademais, este processo abre perspectivas para a procura por possíveis
aplicações dos sólidos fermentados enriquecidos proteicamente com fungo A.
niger (status GRAS), incluindo o emprego como ração animal.
FERNANDES, K. V.
71
6 – CONCLUSÕES
• A purificação parcial da ricina, para seu posterior uso como controle
positivo na padronização do teste de citotoxicidade, mostrou-se eficiente
pela metodologia adotada, embora ainda necessite de ajustes para a
separação completa da RCA presente.
• O teste de citotoxicidade desenvolvido para detecção de ricina cumpre
este objetivo perfeitamente, permitindo analisar de forma rápida (até 24
horas) e precisa a toxicidade causada por esta proteína.
• A fermentação em estado sólido mostrou-se eficiente para destoxificação
da torta de mamona e produção de lipases microbianas. Entretanto, o
processo ainda precisa passar por otimizações para melhorar a produção
de enzimas de interesse.
• A destoxificação da torta por FES foi alcançada, embora nos tempos finais
do processo ocorra uma pequena inibição do crescimento celular por este
material.
• Concluiu-se o teste de citotoxicidade é uma ferramenta necessária na
validação da eficiência dos processos de destoxificação, uma vez que a
detecção da toxina apenas por SDS-PAGE apresentou-se falha para
resíduos como a torta de mamona extrusada, apontando um falso
negativo.
Os resultados obtidos nos mostram que é possível agregar valor a
rejeitos da indústria de biodiesel, produzindo enzimas de interesse
biotecnológico e/ou destoxificando este material para sua utilização como
suplemento na alimentação animal. E que esta segunda aplicação pode ser
realizada após a confirmação da destoxificação do resíduo do uso do teste de
citotoxicidade proposto.
FERNANDES, K. V.
72
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGLÁFICAS
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