Detección Molecular de Fusarium solani en Suelo y Plantas

1. Introducción.

2. Objetivos.

3. Materiales y Métodos.

4. Resultados.

5. Discusión.

Detección Molecular de Fusarium solani en Suelo y Plantas de Fresa

Detección Molecular de Fusarium solani en Suelo y Plantas de Fresa / [De la Lastra, E., Basallote-

Ureba, M. J., De los Santos, B., Miranda, L., Vela-Delgado M. D. y Capote, N.]. – Sevilla. Consejería de

Agricultura, Ganadería, Pesca y Desarrollo Sostenible, Instituto de Investigación y Formación Agraria y

Pesquera, 2020. 1-17 p. Formato digital (e-book) – (Protección Vegetal Sostenible)

Palabras clave: Fresa – Fusarium solani – qPCR – densidad de inóculo - biosolarización

Este documento está bajo Licencia Creative Commons. Reconocimiento-No comercial-Sin obra derivada.


© Edita JUNTA DE ANDALUCÍA. Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera.

Consejería de Agricultura, Ganadería, Pesca y Desarrollo Sostenible.

Sevilla, Diciembre de 2020.

Autoría:

Eduardo de la Lastra

M.ª José Basallote-Ureba

Berta De los Santos

Luis Miranda

M.ª Dolores Vela-Delgado

Nieves Capote

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IFAPA, Centro Las Torres

Este trabajo se ha desarrollado en el ámbito del proyecto RTA2013-00062-C05-02, financiado por INIA

y cofinanciado por la Unión Europea a través de fondos FEDER 2014-2020 “Programa Operativo de

Crecimiento Inteligente”


1.- Introducción.

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IMAGEN

España es el cuarto productor mundial de fruto de fresa y el primero de Europa. En nuestro país, el ciclo del cultivo tiene lugar en dos etapas y en dos zonas geográficas diferentes. Las plantas de fresa se producen en viveros de altura de las provincias de Segovia, Ávila y Valladolid (Castilla y León) entre los meses de abril y septiembre. Una vez recolectadas, se trasplantan a fincas de producción de fruto de la provincia de Huelva donde tiene lugar su desarrollo vegetativo, floración y fructificación entre los meses de octubre y junio.

En la provincia de Huelva, el cultivo se establece en fincas de suelos arenosos donde se practica el monocultivo. La producción se lleva a cabo en un 90% de la superficie bajo grandes túneles con cubierta plástica o macrotúneles (Figura 1), o microtúneles (Figura 2), aunque cerca del 3% de la producción se realiza en cultivo sin suelo o hidroponia (Figura 3).

La superficie de cultivo dedicada a la fresa ha ido aumentado progresivamente en los últimos años y con ello la producción de fruto. Los cultivares de fresa utilizados han pasado de explotar una única variedad predominante, Camarosa, a cultivar principalmente entre 9-10 variedades diferentes.

Figura 1. Cultivo bajo macrotúnel Figura 2. Cultivo bajo microtúnel Figura 3. Cultivo sin suelo


1.- Introducción.

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La producción de fresa en España ha sido altamente dependiente de la utilización de fumigantes

químicos para la desinfestación de suelo en viveros y campos de producción de fruto. Debido a su

potencial efecto nocivo sobre la salud y el medioambiente, la entrada en vigor de la Directiva

91/414/CEE, y su renovación por el Reglamento (CE) 540 de 25 mayo 2011, ha supuesto la desaparición

de aproximadamente el 70% de las sustancias activas utilizadas para el control de enfermedades y plagas

que afectan al cultivo de la fresa.

Este hecho, unido a la condición de monocultivo de la fresa, se apunta como la principal causa de la

emergencia de nuevos patógenos de suelo en el cultivo de la fresa, como Macrophomina phaseolina

(Figura 4A), Fusarium oxysporum (Figura 4B) y Phytophthora cactorum (Figura 4C).

Figura 4. Cultivo in vitro de Macrophomina phaseolina (A), Fusarium oxysporum f. sp. fragariae (B)

y Phytophthora cactorum (C) en medio de cultivo PDA

A B C


1.- Introducción.

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Durante las años 2010-2013, se detectaron plantas con síntomas de marchitez (Figura 5A), enanismo

(Figura 5B), producción escasa de raíces (Figura 5C) en campos de producción de fruto de fresa de la

provincia de Huelva. Ocasionalmente, las coronas de las plantas afectadas presentaban una coloración

marrón oscuro o necrosis (Figura 5D).

Figura 5. Síntomas de

Fusarium solani en

plantas de fresa:

marchitez (A); enanismo

(B); escasa producción

de raíces nuevas (C) y

necrosis en corona (D)

A BBAA

CC DD


1.- Introducción.

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El agente causal de estos síntomas se identificó como el hongo de suelo Fusarium solani (Figura 6A), bien adaptado a la supervivencia en el suelo y capaz de formar estructuras de resistencia llamadas clamidosporas (Figura 6B). Este hongo se ha reportado anteriormente como patógeno de otros cultivos hortícolas como calabaza1, guisante2, judía3, espárrago4 y ajo5.

Figura 6. Cultivo in vitro de Fusarium solani en medio PDA (A); Macroconidias y clamidosporas de F. solani (B)

A B

1García-Jiménez, J.; Armengol, J.; Moya, M.J.; Sales, R. (1997). First report of Fusarium solani f. sp. cucurbitae Race 1 in Spain. Plant Disease. 81, 1216.2Tello, J. C., Lacasa, A.; Navas, A. (1988). Prospección de micosis en el cultivo del guisante (Pisum sativum L.) en Murcia. Phytoma España 1,46-53.3Tello, J. C., Lacasa, A., Molina, R. (1985). Una nota fitopatológica sobre el complejo parasitario del pie de la judía (Phaseolus vulgaris). ITEA 61,57-69.4Corpas-Hervias, C.; Melero-Vara, J.M.; Molinero-Ruíz, M.L.; Zurera-Muñoz, C.; Basallote-Ureba, M.J. (2006). Characterization of isolates of Fusarium spp. obtained from asparagus in Spain. Plant Dis. 90 (11), 1441-14515Basallote, M. J., Zurera, C., Melero, J. M., Prados, A. M. (2011). Nueva enfermedad en el cultivo del ajo ocasionada por Fusarium spp. Phytoma España. 229, 56-58.


1.- Introducción.

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Tradicionalmente, la detección de este tipo de hongos patógenos se realiza mediante la observación de síntomas en las plantas afectadas y el cultivo en placa de los tejidos sintomáticos. Este método requiere de un ojo experto y, aún así, la detección y posterior identificación a veces resulta errónea.

Por ello, el uso de técnicas moleculares en el laboratorio ayudan a realizar una detección rápida y fiable del hongo. Para ello, se extrae el ADN de una muestra de la planta afectada o del suelo donde éstas se cultivan y, si F. solani está presente, se detecta específicamente su ADN de forma muy sensible, mediante una técnica denominada PCR (amplificación de un fragmento específico del ADN del hongo). En el presente estudio se ha utilizado la PCR cuantitativa en tiempo real o qPCR que permite detectar y cuantificar ADN de F. solani presente en la planta o en el suelo mediante fluorescencia (Figura 7).

Figura 7. A partir de ADN extraído de planta o suelo se detecta el ADN de Fusarium solani mediante fluorescencia (PCR en tiempo real)

A Densidad de inóculo F. solani

Fluorescencia


2.- Objetivos.

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1. Diseñar una herramienta molecular para la detección y cuantificación rápida, fiable y específica de F. solani en plantas y en muestras de suelo.

2. Validar este método en muestras de plantas de fresa y suelo de cultivo.

3. Aplicar este método en un escenario de campo para evaluar el efecto de la biosolarización en la disminución de la densidad de inóculo de F. solani en el suelo y el aumento de la producción de fruto de fresa.

4. Ofrecer un servicio de detección de F. solani y el diagnóstico de la enfermedad producida por el hongo a agricultores, técnicos y cooperativas.


3.- Materiales y Métodos.

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Muestreos

Se hicieron prospecciones en campos de producción de fruto de la

provincia de Huelva y se colectaron plantas con síntomas y muestras de

suelo a lo largo de las campañas 2014, 2015 y 2016 (Figura 8). Cada

muestra se analizó en paralelo por el método de detección tradicional

(aislamiento en medio de cultivo) y por el método molecular diseñado

(qPCR).

Plantas sintomáticas: Más de 90 plantas sintomáticas fueron recolectadas

y analizadas a lo largo de las 3 campañas.

Suelo: Se tomaron muestras de suelo antes de la plantación, recogidas en

zig-zag (20cm de profundidad) por cada lomo y, a lo largo de la campaña,

se tomaron muestras de suelo de debajo de las plantas infectadas.

Figura 8. Muestreos en campos

de producción de fruto de fresa


3.- Materiales y Métodos.

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Biosolarización

Se plantaron plantas de fresa procedentes de vivero en

la finca experimental El Cebollar (Moguer, Huelva) en

octubre en dos campañas consecutivas (2015/16 y

2016/17). Las plantas se cultivaron en dos parcelas: una

con suelo desinfestado mediante biosolarización con

gallinaza (2.500 g/m² y posterior cubierta con plástico)

y la otra no biosolarizada. En cada parcela se

establecieron 4 lomos con 38 plantas / lomo (Figura 9).

En ambas parcelas se determinó a lo largo de las dos

campañas:

● la densidad de inóculo de F. solani previa al tratamiento, mediante detección molecular y detección tradicional en placa

● la incidencia de la enfermedad como porcentaje de plantas muertas a lo largo de la campaña

● la producción acumulada como gramos de fruto de fresa producidos por planta.Figura 9. Plantas de fresa trasplantadas en

lomos biosolarizados con gallinaza


4.- Resultados.

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Validación de la detección molecular en plantas

De 93 plantas muestreadas, en 25 se detectó F. solani y 55 fueron negativas por ambos métodos (qPCR y cultivo en

placa). Hubo 12 plantas que fueron positivas por qPCR pero negativas por cultivo en placa*. Finalmente, una

planta se detectó por cultivo en placa pero no por qPCR (Figura 10).

Figura 10. Concordancia entre los métodos de detección de F. solani en plantas: tradicional (cultivo en

placa) y molecular (qPCR)

*Esto indica una mayor sensibilidad de la detección molecular.


4.- Resultados.

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Validación de la detección molecular en suelo

De 21 muestras de suelo analizadas, en 14 se detectó F. solani y 3 fueron negativas por ambos métodos (qPCR y

cultivo en placa). Hubo 3 plantas que fueron positivas por qPCR pero negativas por cultivo en placa*.

Finalmente, una planta se detectó por cultivo en placa pero no por qPCR (Figura 11).

Figura 11. Concordancia entre los métodos de detección de F. solani en suelo: tradicional (cultivo en

placa) y molecular (qPCR)

*Esto indica una mayor sensibilidad de la detección molecular.


4.- Resultados.

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Eficiencia de la Biosolarización

La densidad de Fusarium solani fue significativamente menor en suelos biosolarizados que en no biosolarizados,

tanto si se midió mediante qPCR (picogramos de ADN por gramo de suelo, pg/g suelo) como por cultivo en placa

(unidades formadoras de colonias por gramo de suelo, ufc/g suelo). Murieron más plantas a causa de F. solani en el

suelo no biosolarizado aunque no hubo diferencias significativas en el número de plantas muertas entre las

parcelas biosolarizadas y el control. La producción acumulada de fruto de fresa fue significativamente mayor en el

suelo biosolarizado (Figura 12).

Figura 12. Densidad de inóculo de F. solani en suelos pre-plantación biosolarizados y no biosolarizados

medida como ufc/g suelo (método tradicional) y pg ADN /g suelo (qPCR), porcentaje de plantas muertas y

producción acumulada de fruto de fresa (gramos / planta). Los datos son el promedio y error estándar de 4

lomos por tratamiento en dos campañas consecutivas (2015/16 y 2016/2017).


4.- Discusión.

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En este trabajo se ha desarrollado un método molecular basado en qPCR para la detección rápida, fiable y

específica del hongo patógeno de fresa Fusarium solani en plantas enfermas y muestras de suelo.

La alta sensibilidad y especificidad de este método permiten usarlo para el análisis de plantas de vivero y suelos de

plantación antes del cultivo como método preventivo de control y evaluación de riesgos. El uso de técnicas

moleculares para detección de F. solani permite obviar los análisis tradicionales de cultivo en placa, que requieren

un mayor esfuerzo y tiempo.

Además, este método molecular se puede aplicar, entre otros, para el estudio de susceptibilidad de variedades y

la eficacia de tratamientos de desinfesción de suelo. En este caso, se ha demostrado que tratamientos de

biosolarización con gallinaza disminuyeron la densidad de inóculo de F. solani en el suelo y la incidencia de la

enfermedad, y aumentaron el rendimiento de producción de fruto.

La técnica molecular utilizada representa una herramienta muy útil para el manejo de la fusariosis provocada por

F. solani en fresa y para llevar a cabo análisis de riesgos antes de la plantación. El IFAPA Las Torres pone esta

técnica a disposición de agricultores, técnicos y cooperativas.

Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera

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Este trabajo ha sido cofinanciado al 80% por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, dentro del Programa Operativo FEDER de Andalucía 2014-2020

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Detección Molecular de Fusarium solani en Suelo y

Plantas de Fresa

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