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Facultat de Biologia
Departament de Microbiologia
DETECCION DE METABOLITOS DE BIODEGRADACIÓN DE HAPs EN
SUELOS CONTAMINADOS
Memoria de Practicum I
Máster Oficial en Microbiología Avanzada por la Universidad de Barcelona
Presentado por William Ricardo Calero Cáceres
V° B° de los codirectores
Dra. Magdalena Grifoll Ruiz Dr. Joaquim Vila Grajales
Barcelona, septiembre de 2012
Programa de Máster: Microbiología Avanzada, 2011-2012
Estudios de Maestría financiados por una beca del Gobierno de la República del Ecuador SENESCYT Convocatoria Abierta 2011
Contenido
1. Introducción ................................................................................................................ 1
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos .................................................................................. 1
Metabolismo de Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos .................................................. 1
Degradación de HAPs en mezclas. Cometabolismo. ......................................................... 2
Presencia ambiental de los metabolitos de HAPs ............................................................. 3
2. Planteamiento y objetivos ........................................................................................ 4
3. Material y métodos .................................................................................................... 5
3.1. Productos químicos ....................................................................................................... 5
3.2. Medios de cultivo y soluciones ....................................................................................... 5
3.3. Microorganismos ........................................................................................................... 5
3.4. Análisis de muestras de suelos. ...................................................................................... 5
3.4.1.Obtención de las muestras ........................................................................................... 5
3.4.2. Extracción de HAPs y OPAHs del suelo. ...................................................................... 5
3.4.3. Extracción de metabolitos àcidos a partir de lixiviados del suelo. ................................ 6
3.4.4. Análisis cualitativo y cuantitativo. .............................................................................. 6
3.5. Obtención de metabolitos diana para análisis de discriminación isotópica ..................... 7
3.5.1.Incubaciones con células lavadas con HAPs. ................................................................. 7
3.5.2. Cinética de producción de metabolitos. ....................................................................... 7
3.5.3. Extracción e identificación de metabolitos. .................................................................. 7
4. Resultados ................................................................................................................. 8
4.1. Detección y cuantificación de HAPs. ............................................................................. 8
4.2. Detección y cuantificación de OHAPs. .......................................................................... 9
4.3. Ratios de concentración entre OPAHs y PAHs. ........................................................... 14
4.3. Producción de metabolitos a partir de Bulkhodelria cepacia F297 y Acenafteno. ........... 15
5. Discusión ................................................................................................................... 17
6. Bibliografía ................................................................................................................. 18
1
1. Introducción
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos
Los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs) son un grupo de contaminantes orgánicos persistentes
comúnmente encontrados en emplazamientos industriales. En muchos casos, estos compuestos provienen de la
creosota utilizada como presevante de la madera. Debido a su toxicidad y persistencia ambiental, en 1979 la Agencia
de Protección Ambiental de Estados Unidos US EPA incluyó 16 de estos compuestos en la lista de contaminantes
prioritarios (Keith & Telliard, 1976). Esta lista es comúnmente utilizada por las autoridades regulatorias para
identificar sitios contaminados y como indicadores para la monitorización de la calidad del aire, en muestras
biológicas para el seguimiento de efectos sobre la salud, en sedimentos y moluscos para evaluación ambiental, y en
productos alimentarios por razones de seguridad (Poster et al., 2006).
Metabolismo de Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos
Es de considerable interés el uso de sistemas biológicos para la remediación de ambientes contaminados con HAPs
por su eficiencia y bajo costo. Los procesos de bioremediación han sido desarrollados para muchos contaminantes
orgánicos peligrosos, los cuales se encuentran basados en la capacidad de ciertos microorganismos ubicuos para
degradar contaminantes. Los microorganismos pueden metabolizar hidrocarburos aromáticos mediante tres
mecanismos: (a) la oxidación del anillo aromático mediante dioxigenasas, que se da exclusivamente en organismos
procariotas y en general forman parte del proceso de utilización del sustrato, como fuente de carbono y energía para
el crecimiento; (b) la oxidación mediante lignino y manganeso peroxidasas excretadas por los hongos de la
podredumbre blanca de la madera, proceso que a pesar de haberse observado la mineralización del sustrato es de
naturaleza cometabólica; y (c) la oxidación mediante monooxigenasas del citocromo P-450 presentes en organismos
eucariotas y algunos procariotas, y que está generalmente asociada a la detoxificación y posterior excreción de los
metabolitos formados, no implicando por tanto la mineralización del sustrato.
En las vías productivas bacterianas el primer ataque lo producen dioxigenasas que introducen dos átomos de
oxígeno molecular en el núcleo aromático dando lugar a la formación de dihidrodioles con configuración cis. Los
dihidrodioles son luego deshidrogenados por cis-diol deshidrogenasas, que rearomatizan el núcleo bencénico
formando intermediarios dihidroxilados. La ruptura puede tener lugar entre los grupos hidroxilo (orto-ruptura o
ruptura intradiólica) o en los enlaces del carbono adyacentes a los grupos hidroxilo (meta-ruptura o ruptura
extradiólica) (Cerniglia, 1992). En general, las bacterias Gram-negativas del grupo Pseudomonas son las principales
responsables de la degradación de HAPs de 2 y 3 anillos mediante rutas bien conocidas. En cambio, el aislamiento
de bacterias degradadoras de HAPs de elevado peso molecular (HMW, 4 o más anillos) da lugar a la obtención de
actinobacterias que presentan rutas de degradación ramificadas que producen la mineralización y transformación
simultànea del substrato acumulando productos finales de degradación, principalmente àcidos dicarboxílicos, cuyo
destino ambiental todavía no se ha establecido (Kanaly & Harayama, 2000).
Los estudios del metabolismo de hidrocarburos aromáticos en microorganismos eucariotas han utilizado al hongo
Cunninghamella elegans como modelo. Este microorganismo, al igual que los mamíferos, utiliza el sistema
citocromo P450 para incorporar un átomo de oxígeno en el núcleo aromático reduciendo el otro átomo a agua. Los
intermediarios oxidados resultantes pueden convertirse en sustrato de la enzima epóxido hidrolasa dando lugar a la
formación de un dihidrodiol con configuración trans, o de otro lado se puede dar un reordenamiento enzimático
produciendo un fenol que será posteriormente conjugado con sulfato, ácido glucurónico o glucosa. Citocromos
P450 monooxigenasas que realizan reacciones similares han sido también en micobacterias, sin que se conozca si su
objetivo es la detoxificación o son en realidad mecanismos de degradación.
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Fig.1. Ruta metabólica propuesta para la degradación de pireno por Mycobacterium sp. cepa AP1. (Vila et al., 2001)
Degradación de HAPs en mezclas. Cometabolismo.
Las rutas de degradación de HAPs se han descrito en condiciones de laboratorio utilizando sustratos individuales y
cultivos puros (University of Minnesota, 2012). La información obtenida, constituye una fuente de información
básica para predecir el comportamiento cinético de degradación de estos compuestos en el medio ambiente. Sin
embargo, la diversidad de las poblaciones microbianas ambientales, la elevada complejidad de la composición de los
contaminantes y las interacciones químicas y microbiológicas propias del medio ambiente, hacen necesario abarcar
el estudio a otros niveles.
Debido a la especificidad relajada de algunas de las enzimas degradadoras, sobre todo las dioxigenasas, las bacterias
degradadoras de HAPs presentan una elevada versatilidad para actuar sobre análogos de su sustrato habitual.
Además, algunas de estas enzimas, como la naftaleno dioxigenasa, pueden catalizar la monooxigenación de grupos
metilénicos, metílicos y de heteroátomos (Selifonov et al., 1996). De esta forma, cuando están expuestas a mezclas
ambientales de HAPs (creosota o los derivados del crudo de petroleo), las bacterias degradadoras pueden actuar de
forma fortuita sobre distintos componentes de las mismas, dando lugar a la acumulación de productos de oxidación
y de degradación parcial. El resultado de estas reacciones cometabólicas es la producción de cetonas, quinonas y
ácidos carboxílicos que se acumulan en el medio (Grifoll et al., 1995; López et al., 2008).
El papel de este tipo de reacciones en la degradación de mezclas ambientales de HAPs ha sido mostrado en estudios
previos del grupo. La cepa degradadora de fluoreno Bukholderia cepacia F297 creció en una mezcla de HAPs de la
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creosota causando la desaparición de todos los compuestos de 2 o 3 anillos. Como consecuancia, acumuló en el
medio ácidos naftoicos resultado de la monooxidación de los metilnaftalenos, ácidos hidroxinaftoicos procedentes
de la dioxigenación y meta-ruptura (degradación parcial) de fenantreno y antraceno, y cetonas aromáticas derivadas
del ataque cometabólico del acenafteno y acenaftileno (Grifoll et al., 1995). En el caso de las cepas degradadoras de
pireno Mycobacterium sp. AP1 y CP1, crecieron sobre la misma mezcla causando la desaparición simultánea de los
HAPs de 2 y 3 anillos, y atacando en menor extensión a los de 4 anillos. Ello se acompañó a la acumulación de
cetonas y àcidos aromáticos dicarboxílicos resultado de reacciones cometabólicas sobre otros componentes de la
mezcla. Los productos acumulados por estas cepas fureon diferentes a los acumulados por la cepa F297, abundando
los acidos dicarboxilicos resultantes de la orto-ruptura de compuestos de 2 y 3 anillos (López et al., 2008).
Resultados similares se observaron al estudiar la degradación de una mezcla de orígen petrogénico como el fuel oil
vertido por el Prestige por la cepa degradadora de pireno Mycobacterium sp. AP1 (Vila y Grifoll, 2009).
Presencia ambiental de los metabolitos de HAPs
Estos estudios de laboratorio, por lo tanto, ponen de manifiesto que durante los procesos de degradación de
mezclas ambientales, tales como creosota (Concentración >80% HAPs) y petróleo, la degradación de HAPs va
asociada a la acumulación de productos polares con distintos estados de oxidación. Esta acumulación, por lo tanto,
también podría darse en el medio ambiente y podría verse estimulada durante la implantación de estrategias de
bioremediación, al incrementarse la actividad microbiana. De hecho, diversos autores han iniciado estudios
relacionados con la detección de compuestos aromàticos polares en suelos, detectando algunos de los productos de
oxidación/transformación observados previamente en el laboratorio, mayoritariamente PAHs oxigenados e
hidroxilados (OHAPs), como compuestos con grupos carbonilo, cetonas, quinonas, anhídridos y cumarinas
(Lundstedt, et al, 2007) (figura 2). Sorprendentemente, pràcticamente ningun trabajo de la literatura recoge la
detección de àcidos carboxílicos, tan habituales durante la degradación de mezclas de HAPs en el laboratorio.
Fig.2. Estructuras de ciertos Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos Oxigenados (OPAHs).
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Estudios toxicológicos han puesto de manifiesto que algunos de estos OPAHs son más tóxicos que el propio
parental (Brooks, et.al, 1998). Además, estos compuestos oxidados presentan una mayor solubilidad en agua,
indicada como un bajo coeficiente de distribución octanol-agua, lo que los hace más biodisponibles e incrementa su
movilidad en el medio ambiente (Bandowe, et al, 2010) por lo que el área de contaminación puede extenderse. Por
este motivo, a pesar de que la legislación actual todavía no regula su presencia en los emplazamientos
contaminados, la detección de estos productos parece esencial para llevar a cabo una adecuada evaluación de
riesgo.
2. Planteamiento y objetivos
El trabajo que se propone se enmarca dentro del proyecto "Identificación, Evaluación y Explotación de las funciones
catabólicas de la rizosfera para la recuperación de suelos contaminados con HAPs", del que la Dra. Grifoll es la
Investigadora Principal. El objetivo de este proyecto es reducir el riesgo asociado a las concentraciones residuales de
HAPs en suelos contaminados a través de procesos biotecnológicos, que implican la utilización mejorada de las
funciones microbianas.
Dentro de nuestro grupo de investigación se han desarrollado métodos analíticos para la detección y cuantificación
de metabolitos bacterianos que han sido aplicados con éxito en microcosmos de suelos contaminados (Arias et al.,
2008) y aguas de acuífero. Ello ha sido posible gracias a los estudios previos del grupo sobre el metabolismo
bacteriano que han permitido desarrollar una base de datos analítica esencial para la identificación de los productos
detectados.
El objetivo general de este trabajo es aplicar las tecnicas desarrolladas para investigar la presencia de OPAHs en
suelos contaminados con creosota, determinar su mobilidad respecto a los parentales y evaluar su posible
utilización como indicadores de biodegradación o en la evaluación del riesgo. Para ello se plantean los siguientes
objetivos específicos:
Analizar dos suelos contaminados con creosota de distintos orígenes para determinar la presencia de OHAPs y
su movilidad.
Cuantificar aquellos productos de los que se disponga de patrones comerciales para poder estimar OHAPs como
metabolitos y compuestos signatura para la estimación de ratios y niveles de riesgo.
Analizar una muestra de creosota comercial para descartar que procedan directamente de la fuente de
contaminación.
Producir los metabolitos detectados mediante procesos de degradación bacteriana para investigar la posibilidad
de utilizar técnicas de discriminación isotópica para demostrar el orígen biológico de los productos detectados
en suelos.
Este último objetivo es el fruto de una colaboración con el proyecto “Polar aromatic compounds (PACs) in soils of
Switzerland: Contamination status, in-situ formation and controls on spatial distribution”, del Dr. Benjamin
Bandowe del grupo de Ciencia del Suelo del Instituto de Geografía de la Universidad de Berna, Suiza. Este proyecto
tiene como uno de sus objetivos identificar bioindicadores de degradación de HAPs a través de discriminación
isotópica. El grupo de Biodegradación y Biorremediación del Departament de Microbiología de la UB se encanrgará
de la producción de metabolitos de origen bacteriano (OPAHs) a partir de la incubación de cultivos puros
bacterianos (Bulkhodelria cepacia F297 y Pseudomonas sp. NAPH 3.1) en presencia de HAPs diana.
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3. Material y métodos
3.1. Productos químicos
Los solventes empleados (diclorometano, acetona, metanol, hexano, acetato de etilo) fueron adquiridos en JT Baker
Chemicals (Center Valley, EUA). Los hidrocarburos Aromáticos Policíclicos para la producción de metabolitos y los
Oxi e Hidroxi-PAHs utilizados para las rectas patrón fueron de Sigma Aldrich Chemical (Milwaukee, EUA), el ácido
clorhídrico al 37%, el sulfato de sodio, la sílica y el ácido fosfórico fueron adquiridos en Panreac (Barcelona,
España). El diazometano utilizado en la derivatización de los extractos ácidos fue sintetizado previamente en el
grupo a partir de la descomposición alcalina de Diazald (N-methyl-N-nitroso-p-toluenesulfonamide) (Sigma-
Aldrich). La creosota comercial fue adquirida a Chem Service (West Chester, EUA) y corresponde al lote 42-1313.
Todos los reactivos y disolventes utilizados fueron de la máxima pureza disponible.
3.2. Medios de cultivo y soluciones
-Medio Mineral Basal con metales traza (BMTM)
Solución A: K2H2PO4·3H2O, 42,5 g; NaH2PO4·H2O, 10g; NH4Cl, 20g y 1 L de agua desionizada tipo MilliQ. Solución B:
MgSO4·7H2O, 0,12 g; MnSO4·H2O, 0,03 g; ZnSO4·7H2O, 0,03 g; CoCl2·6H2O, 0,01 g; C6H7NO6Na2, 1,23 g y 1 L de agua
desionizada tipo MilliQ. Un litro de medio se prepara utilizando 100 mL de cada solución y aforándolo a 1 L con
agua.
-Medio Luria Bertani (LB)
Se preparó con 2 g de glucosa; 5 g de extracto de levadura; 2,5 g de NaCl y 10g de peptona.
-Solución Tampón de fosfato (50 mM)
Se utilizó KH2PO4, 6,8 g en 1 L de agua milliQ, el pH se ajustó utilizando una solución de NaOH 0,1 N. Los HAPs
para la producción de metabolitos se adicionaron de forma individual directamente sobre el medio de cultivo.
3.3. Microorganismos
Para la producción de metabolitos a partir del acenafteno, se utilizó la cepa degradadora de fluoreno Bukholderia
cepacia F297 (Grifoll et.al., 1995), ampliamente estudiada en estudios relacionados.
3.4. Análisis de muestras de suelos.
3.4.1.Obtención de las muestras
Las muestras de suelo fueron obtenidas de emplazamientos contaminados con creosota, provenientes de Finlandia
por colaboración de la Dr. Marja Tuomela de la Universidad de Helsinki, y de Jaén, España, por colaboración del Dr.
José Julio Ortega Calvo del CSIC.
3.4.2. Extracción de HAPs y OPAHs del suelo.
Se utilizaron muestras por triplicado de 10 g de suelo previamente homogenizado y se mezclaron con 10 g de sulfato
de sodio anhidro para eliminar la humedad del suelo. Estas mezclas se introdujer0n en un cartucho de celulosa y se
sometieron a un proceso de extracción mediante Soxhlet durante 6,5 horas utilizando 200 mL de una solución
diclorometano-acetona en proporción 2:1 respectivamente. Los extractos obtenidos se concentraron en un rotavapor
hasta un volumen final de 5 mL.
6
1 mL de estos extractos se utilizaron para el clean up utilizando columnas empaquetadas con 2,5 g de sílica (50-230
mesh) desecada a 125 °C y posteriormente inactivada añadiendo un 5% de agua milliQ. A continuación se procedió
al fraccionamiento de la muestra utilizando distintas mezclas de solventes:
-Fracción 1 (F1): En esta fracción se eluyeron los HAPs, se utilizaron 13 mL de la solución hexano/diclorometano en
una proporción 80:20 y finalmente 2 mL de diclorometano..
-Fracción 2 (F2): En esta fracción se eluyeron los metabolitos neutros, se utilizó 1 mL de diclorometano y
finalmente 6 mL de metanol.
Ambas fracciones se concentraron en rotavapor hasta un volumen comprendido entre 1 y 10 mL de acuerdo a la
cantidad de materia orgánica eluida en cada fracción. Para el análisis de la creosota se utilizó arena de mar muflada
como fase sólida a la cual se añadió 50 mg de creosota comercial, se homogenizó y se procedió a extraerla siguiendo
los protocolos establecidos para las muestras ambientales.
3.4.3. Extracción de metabolitos àcidos a partir de lixiviados del suelo.
El anàlisis de los àcidos carboxílicos presentes en los dos suelos se realizó a partir de lixiviados obtenidos de la
mezcla de 10 g de la muestra homogénea del suelo con 20 mL de agua MilliQ en un matraz erlenmeyer de 100 mL.
Tras su agitación en un shaker orbital a 180 rpm durante 15 minutos, se dejó decantar la muestra durante 15
minutos, y posteriormente se filtró el sobrenadante utilizando un matraz kitasato y papel filtro Whatman. El
lixiviado filtrado posteriormente se extrajo 3 veces en embudos de decantación utilizando 10 ml de diclorometano.
El extracto orgànico se seccó por filtración a través de sulfato de sodio anhidro utilizando un embudo y se
concentró en un rotavapor hasta un volumen final de 1 mL utilizando matraces aforados, obteniéndose el extracto
neutro. Posteriormente, la fase aquosa, se se acidificó con HCl 5N hasta un pH de entre 2,5 y 3,0, y se extrajo
nuevamente tres veces utilizando 10 mL de acetato de etilo. Tras su secado con sulfato de sodio anhidro el extracto
orgánico se concentró con un rotavapor, se secó bajo atmósfera de nitrógeno y se llevó a un volumen final de 1 mL
con diclorometano, obteniéndose el extracto àcido. Ambos extractos se conservaron en viales de 1,5 mL a -80°C
hasta su anàlisis mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).
3.4.4. Análisis cualitativo y cuantitativo.
Los extractos neutros de la fase acuosa (lixiviados), la fracción de HAPs (F1) y la fracción neutra (F2) fueron
analizados directamente en GC-MS inyectando 1 L de cada muestra. En cambio, los extractos ácidos de la fase
acuosa (lixiviados) fueron previamente derivatizados utilizando diazometano, el cual introduce el grupo -CH3 en los
grupos hidroxilo presentes en la muestra, con la finalidad de incrementar la volatilidad de los analitos y disminuír
su retención en la columna. Los análisis mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas, se
realizaron utilizando un método térmico con dos rampas, la inicial de 36 °C hasta 50 °C con un gradiente de
60°C/min, y la segunda que va de 50 °C hasta 300°C con un gradiente de 7°C /min. El cromatógrafo se equipó con
una columna DB5 de 30 metros. Todos los análisis se realizaron en los Serveis Cientificotècnics de la Universitat de
Barcelona. La identificación de los productos detectados se realizó mediante la comparación del tiempo de
retención y espectro de masas de cada uno de los analitos con los obtenidos a partir del análisis de patrones
comerciales, de los disponibles en la base de datos del National Institute of Standards and Technology (NIST) o de
la base de datos de metabolitos de origen bacteriano disponible en nuestro grupo de investigación.
Cuantitativamente se analizaron los HAPs, oxi e hidroxi HAPs utilizando tres estándares, el primero de los 16 HAPs
incluidos en la lista de contaminantes prioritarios de la US EPA, el segundo de compuestos neutros (cetonas y
quinonas) y el tercero de compuestos ácidos (àcidos carboxílicos derivatizados con diazometano). En todos los
casos se obtuvieron rectas de calibración con 5 puntos para cada analito a concentraciones estimadas de 50; 25; 12,5;
7
6,25; 3,125 ppm. En las rectas de calibración se considera la pendiente con la ordenada al origen, convirtiendo la
ecuación final al modo Y=BX.
3.5. Obtención de metabolitos diana para análisis de discriminación isotópica
3.5.1.Incubaciones con células lavadas con HAPs.
A partir de una placa de trabajo con la cepa Bulkhodelria cepacia F297 se realizó un estriado en una placa de agar LB
y se incubó a temperatura ambiente durante 3 días. Al observar colonias separadas se siembraron 5 clones
paralelamente en agar LB (placa madre) y en agar BMTM con cristales de fluoreno en la tapa (control de capacidad
degradadora), incubados a temperatura ambiente. A partir de la placa madre, se seleccionó una colonia que
mantenía la capacidad de degradación de fluoreno y se inoculó en un tubo de ensayo estéril con 10 mL de medio
líquido LB. Este cultivo se incubó durante 24 horas a 30°C en un shaker orbital a 180 rpm (DO650=0,7).
Posteriormente se recuperaban las células mediante centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm, y se lavaba 3
veces utilizando medio mineral estéril. Las células lavadas se utilizaban como inóculo de un matraz Erlenmeyer que
contenía 400 ml de medio mineral con L-Glutamina (5 mM) y 1 g/L de fluoreno. Estos cultivos se incubaron en un
agitador orbital a 23°C y 200 rpm. Tras unas 20 horas, cuando el crecimiento se encuentra en fase exponencial
(densidad óptica de A650=0,65), los cristales de fluoreno residual fueron removidos por medio de algodón de vidrio
estéril, y el cultivo se incubaba nuevamente durante 30 minutos adicionales para que asegurar el consumo total del
fluoreno remanente. Las células fueron lavadas por medio de centrifugación dos veces utilizando tampón de fosfato
50 mM a pH 7,2 y resuspendidas utilizando el mismo tampón hasta una densidad celular aproximada de 4 veces el
cultivo inicial. Para la producción de metabolitos, se añade el HAP parental a una concentración de 0,5 g/L en un
matraz Erlenmeyer conteniendo 50 mL de la suspensión celular obtenida (A650=2,5, aproximadamente). Estas
supensiones se incubaron en un shaker orbital a 23°C y 200 rpm (Grifoll M. et.al., 1995).
3.5.2. Cinética de producción de metabolitos.
Se realizó un control de la producción de metabolitos por medio de barrido espectral en el espectrofotómetro UV-
Visible y paralelamente por medio de cuantificaciones en el equipo de Cromatografía Líquida de Alta resolución
(HPLC). Para ello, se tomaron muestras de las suspensiones celulares a 0, 5, 18 y 36 horas de incubación y se
centrifugaron para eliminar las celulas. Los sobrenadantes se filtraron y 10 l de muestra se inyectaron en un
sistema de HPLC (Waters) formado por una bomba acoplado a un detector de arreglo de diodos (PDA) operando a
254 nm. La separacion de los compuestos se realizó en fase reversa utilizando una columna de C18 (Waters) de 25 cm
de longitud, un diámetro interno de 4,6 mm y un tamaño de partícula de 5 m. Como fase móvil se utilizó un
gradiente del 10% al 90% de Metanol grado HPLC en agua MilliQ con ácido fosfórico al 0,6%.
3.5.3. Extracción e identificación de metabolitos.
Finalizado el tiempo de incubación (36 horas) las suspensiones de células lavadas fueron centrifugadas para
remover las células y cualquier parental no disuelto, y los sobrenadantes se extrajeron tres veces con un volumen
total de 200 mL de acetato de etilo (extracto neutro). Posteriormente, la fase acuosa se acidificó hasta un pH de 2,5
con HCl 6N y se extrajo de la misma manera (extracto ácido). Ambos extractos se secaron sobre sulfato de sodio
anhidro y se concentrados en un rotavapor. Para la detección e identificación de metabolitos, ambos extractos se
analizaron por GC-MS previa derivatización con diazometano tal y como se ha descrito anteriormente (apartado
3.4.5).
8
4. Resultados
4.1. Detección y cuantificación de HAPs.
Los HAPs presentes en las dos muestras de suelo (Finlandia y Jaén) y en una muestra de creosota comercial se
cuantificaron a partir del análisis por triplicado de cada una de las muestras, utilizando la fracción F1 del extracto
Sohxlet. De esta forma, se estimó el nivel de contaminación de cada uno de los emplazamientos contaminados y se
determinó el grado de envejecimiento de la creosota residual en comparación con una muestra de creosota no
degradada (creosota comercial). De acuerdo a los perfiles cromatográficos (GC-MS) se puede observar en el primer
gráfico el perfil de una muestra de creosota comercial (figura 3, a), la cual al no ser degradada presenta una gran
cantidad de HAPs de bajo peso molecular como los Naftalenos y los Metil naftalenos. En cambio, en las muestras de
suelos (figura 3, b y 3, c) es notable que proceden de enclaves contaminados envejecidos ya que no presentan una
concentración significativa de HAPs de dos y tres anillos aromáticos. Esta desaparición puede deberse a fenómenos
de volatilización, catálisis microbiana u oxidación físico-química. Es notable enumerar que el perfil de la creosota
detectada en el suelo de Finlandia es ligero, ya que su proporción de HAPs de elevado peso molecular (HMW HAPs)
es muy baja.
Figura 3. Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs) presentes en las muestras de:
a) Creosota comercial; b) suelo de Jaén-España; y c) suelo de Finlandia.
1H 2H 3H 4H5H 6H
7H
8H
9H
10H
11H
12H
13H
14H
15H
16H
a)
b)
c)
9
Tabla 1. Concentración de HAPs.
COMPUESTO # Ión, m/z CREOSOTA JAÉN-ESPAÑA FINLANDIA
ug/g Creosota
ug/g Suelo
ug/g Suelo
Naftaleno 1H 128 261982,30 52,30 ± 2,10 -
Acenaftileno 2H 152 27840,33 14,41 ± 1,67 5,54 ± 0,78
Acenafteno 3H 154 5166,27 524,36 ± 30,29 524,40 ± 81,41
Fluoreno 4H 166 47068,96 464,92 ± 25,57 350,51 ± 63,07
Fenantreno 5H 178 136679,16 1683,64 ± 90,75 1294,14 ± 224,47
Antraceno 6H 178 30027,11 333,88 ± 20,43 54,17 ± 9,80
Fluoranteno 7H 202 80665,32 1105,36 ± 77,45 1481,77 ± 239,29
Pireno 8H 202 55428,20 607,10 ± 43,48 775,99 ± 123,83
Benzoa]antraceno 9H 228 26608,33 164,39 ± 15,29 21,99 ± 6,29
Criseno 10H 228 24602,20 164,54 ± 13,54 34,33 ± 6,65
Benzob]fluoranteno 11H 252 14102,06 71,42 ± 9,66 6,29 ± 1,88
Benzok]fluoranteno 12H 252 17593,09 60,76 ± 5,39 6,29 ± 2,36
Benzoa)pireno 13H 252 19223,28 42,51 ± 4,92 4,28 ± 1,42
Indeno1,2,3 cd]pireno 14H 276 8572,69 17,87 ± 2,54 -
Dibenzoa,h]antraceno 15H 278 1262,66 3,62 ± 0,53 -
Benzog,h,i]perileno 16H 276 7958,10 15,71 ± 2,36 -
TOTAL 764780,04 5326,80 ± 345,98 4559,69 ± 761,24
4.2. Detección y cuantificación de OHAPs.
La identificación y cuantificación de los derivados oxidados de HAPs presentes en las muestras de suelo y en la
creosota comercial se llevó a cabo a partir del análisis por GC-MS de la fracción F2 del extracto Soxhlet del suelo, y
de los extractos neutros y ácidos de los lixiviados. Los perfiles cromatográficos de los distintos extractos de los
suelos de Jaen y Finlandia se muestran en las figuras 4 y 5, respectivamente.
10
Figura 4. Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos Oxidados (OHAPs) presentes en un suelo procedente de Jaén-España.
a) Extracto Neutro Fase acuosa (Lixiviados); b) Extracto Neutro F2 Sohxlet, c) Extracto Ácido Fase acuosa (Lixiviados).
1N 3N4N
18A
12A5N
2N
3N
6N 5N7N
8N
9N
10N
3 A – 4 A
1 A
2A
5A6A
7A
8A
9A
10A, 11A
12A14A
13A
15A
a)
b)
c)
11
Figura 5. Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos Oxidados (OHAPs) presentes en un suelo procedente de Finlandia.
a) Extracto Neutro Fase acuosa (Lixiviados); b) Extracto Neutro F2 Sohxlet, c) Extracto Ácido Fase acuosa (Lixiviados).
21N
5N
2N
3N
6N 5N7N
8N
9N
10N
4A
16A
17A
5N7N
11N
19A
20A
18A
a)
b)
c)
12
Hay que destacar que en ambas muestras de suelo se detectaron una gran cantidad de derivados oxidados de HAPs,
observándose sobretodo la acumulación de cetonas y quinonas, que se recuperaron mayoritariamente en la fracción
F2 del extracto soxhlet, y de ácidos mono- y dicarboxílicos que se detectaron exclusivamente en el extracto ácido de
los lixiviados.
Entre los metabolitos neutros detectados, se observó la presencia de un gran número de compuestos cuyo origen
biológico es ampliamente conocido, habiendo sido descritas las rutas metabólicas bacterianas que dan lugar a su
acumulación. De esta forma, se detectó la presencia de Acenaftilenona (1N), 1,2-Acenaftilenodiona (4N) y el
Anhídrido naftálico (12 A), los cuales pueden proceder de la transformación parcial del Acenafteno mediante ataque
dioxigenásico (Selifonov et al., 1998) o pueden ser productos intermediarios de la ruta de degradación del
fluoranteno por micobacterias (Weissenfels et al., 1994; López et al., 2006); la Indanona (2N), metabolito
intermediario en la degradación de indano o de fluoreno (Casellas et al., 1997); la 9-Fluorenona (3N), procedente de
la monooxigenación del fluoreno (Casellas et al., 1997); el ácido bifenil-4-carboxílico ha sido detectado como
metabolito en la degradación de bifenilo por parte de un cultivo de enriquecimiento sulfato reductor por medio de
una conversión cometabólica (Selesi y Meckenstock, 2009); la antraquinona (5N) y la metil antraquinona (8N), las
cuales se forman habitualmente como resultado de la monooxigenación del antraceno y su derivado metilado,
respectivamente (Dean-Ross et al., 2001); o 11H-Benzo[a]fluoren-11-ona (9N) y 7H-Benz[de]antracen-7-ona (10N),
las cuales pueden provenir de ataques monooxigenásicos a sus respectivos parentales.
En cuanto a los metabolitos ácidos, también se detectó una gran diversidad de productos, entre los cuales varios de
ellos se han descrito como productos intermediarios o finales de rutas metabólicas bacterianas conocidas. En este
sentido, destaca el ácido ftálico (1 A), un metabolito que forma parte del metabolismo central de degradación de
diferentes HAPs (p. ej. fenantreno, fluoranteno o pireno) (Kanaly & Harayama, 2000), y su variante con sustitución
CH3 (2 A) que proviene de sus respectivos derivados metilados; los ácidos naftoicos (3 A, 4 A), los cuales pueden
provenir de la monooxigenación del grupo alquilo de los distintos isómeros de los monometil naftalenos; el ácido 3-
hidroxinaftoico (6 A), el cual se ha descrito como metabolito intermediario de la degradación del fenantreno (Evans
et al.,1965); el ácido 1,2,4-bencenotricarboxílico, el cual resulta de la hidrólisis del ácido 1,8-naftalenodicarboxílico,
previa acción de dioxigenasas sobre diversos HAPs como por ejemplo el fluoranteno (López et al., 2006); el ácido
difénico (8 A) el cual resulta de la orto-ruptura del fenantreno (Vila et al., 2001; Moody et al., 2001); en el caso de los
ácidos naftalenodicarboxílicos (9 A, 10 A, 11 A), la mayoría resultarían de la monooxigenación de los grupos metilo
de los dimetilnaftalenos, excepto en el caso del isómero 1,8- y de su el anhídrido (12 A), que se han descrito como
intermediarios de la degradación de acenafteno, acenaftileno y fluoranteno (Selifonov et al., 1996; López et al.,
2006).
Los metabolitos 14 A y 15 A se identificaron como el anhídrido del ácido fenantreno-4,5-dicarboxílico y el ácido 6,6-
dihidroxi 2, 2'-bifenil dicarboxílico, respectivamente, ambos productos intermediarios de la ruta de degradación del
pireno por micobacterias ( Vila, 2000; Vila et al., 2001). Ante la ausencia de patrones comerciales y de datos
analíticos en la base de datos NIST, su identificación se realizó por comparación del espectro de masas de estos
productos con los incluidos en la base de datos analítica desarrollada por nuestro grupo de investigación, que
recoge los datos recogidos de los estudios de metabolismo bacteriano de HAPs realizados previamente..
Para descartar que los OHAPs detectados en los enclaves contaminados procedan primariamente de la creosota, es
decir, que procedan directamente de la fuente contaminante y no de su formación por catálisis microbiana, se
analizó la fracción F2 del extracto del suelo, y los extractos neutro y ácido de los lixiviados. De esta forma, se
observó que la creosota presentaba distintos productos polares. Entre estos productos se pueden distinguir los
compuestos NOS y sus derivados (ej. dibenzofurano e hidroxi-dibenzofurano), que se encuentran en la creosota, y
en los que la presencia de grupos polares no responde en ningún caso a actividad microbiana, y algunos productos
13
idénticos a los detectados previamente en los suelos y que serían análogos a algunos productos intermediarios de
rutas de degradación conocidas. Entre estos últimos destaca la presencia de indanona, fluorenona y 7H-
Benz[de]antracen-7-ona, que se habían detectado también en los dos suelos analizados (figura 6). Finalmente, es
importante resaltar también la ausencia de ácidos carboxílicos derivados de HAPs en el extracto ácido de los
lixiviados.
Figura 6. Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos Oxidados (OHAPs) presentes en creosota comercial. a) Extracto
Neutro Fase acuosa (Lixiviados); b) Extracto Neutro F2 Sohxlet, c) Extracto Ácido Fase acuosa (Lixiviados).
2N 17N
18N19N
2N 3N16N
10N
2N17N
a)
b)
c)
14
Tabla 2. Resultados de la cuantificación de OHAPs en creosota comercial y en los suelos contaminados de Jaén y
Finlandia.
TIP
O
# COMPUESTO Ión m/z
JAÉN FINLANDIA CREOSOTA
ug/g suelo
ug/g suelo
ug/g creosota
NEU
TRO
S
2N 1H-Indan-1-ona, 2,3-dihidro 132 6,21 ± 1,09 - 5049,46 ± 7,17
3N 9H-Fluoren-9-ona 180 103,51 ± 15,10 7,31 ± 1,35 814,99 ± 52,06
5N 9, 10-Antracenodiona 208 166,17 ± 19,84 136,42 ± 21,40 -
7N Ciclopenta(def)fenantrenona 204 115,38 ± 19,04 89,13 ± 12,44 -
8N 9, 10-Antracenodiona, 2-metil- 222 51,54 ± 6,93 37,39 ± 5,76 -
9N 11H-Benz[a]fluoren-11-ona 230 78,13 ± 16,50 84,67 ± 13,25 -
10N 7H-Benz[de]antracen-7-ona 230 137,13 ± 0,82 16,71 ± 2,93 3039,28 ±30,65
15N 5, 12-Naftacenodiona 258 - 23,19 ± 4,23 -
ÁC
IDO
S
1A Dimetil ftalato 163 0,09 ± 0,01 - -
3A Ácido 1-naftalenocarboxílico, metil ester 155 0,30 ± 0,04 0,13 ± 0,05 -
4A Ácido 2- naftalenocarboxílico, metil ester 155 0,10 ± 0,02 0,03 ± 0,01 -
5A Ácido 2-hidroxi-1-naftoico, metil ester 170 0,11 ± 0,03 1,16 ± 0,73 -
6A Ácido 2-naftalenocarboxílico,3-hidroxi, metil ester 170 0,09 ± 0,02 0,32 ± 0,17 -
8A Dimetil difenato 211 0,27 ± 0,04 - -
9A Ácido 2, 6-naftalenodicarboxílico, dimetil ester 213 7,03 ± 1,29 - -
10A Ácido naftalenodicarboxílico, dimetil ester 213 7,03 ± 1,29 - -
12A Anhídrido 1,8-naftálico 154 9,27 ± 1,53 - -
18A 2-Hidroxifluoreno 182 - 0,62 ± 0,30 -
4.3. Ratios de concentración entre OPAHs y PAHs.
La concentración de HAPs en el suelo de Jaén es de 5326,80 g/g suelo, en el suelo de Finlandia de 4559,69 g/g
suelo, y del control de creosota de 764780,04 g/g. La sumatoria de los ocho OHAPs cuantificados es de 568,07
g/g suelo en Jaén; 394,82 g/g suelo en Finlandia y 8173,73 g/g de creosota. Sus proporciones relativas frente a los
HAPs totales en las muestras de suelo son del 11% para el suelo de Jaén y del 9% para el suelo de Finlandia, en
cambio para la creosota comercial sin degradar representa únicamente el 1%. Por lo tanto, parece evidente que el
proceso de envejecimiento que sufre la creosota en el suelo, resultado de la acción microbiológica y de procesos
físico-químicos, da lugar a la formación de compuestos polares. En los casos en los que el origen de los OHAPs se
podía asociar claramente a un único compuesto parental, se determinaron las ratios OHAP/HAP específicas para
cada uno de los compuestos, con el objetivo de establecer ratios diagnóstico del grado de envejecimiento (tabla 3).
De esta forma, hipotéticamente, se podría discriminar si un compuesto se ha formado en el suelo, o si tiene su
origen en la fuente de contaminación original.
Tabla 3. Ratios entre OHAPs neutros cuantificados y su potencial parental.
Muestra Fluorenona/
Fluoreno
Antraquinona/
Antraceno
7H-Benz[de]antracen-
7-ona/
Benzo[a]antraceno
Jaén 0,22 0,5 0,83
Finlandia 0,02 2,51 0,75
Creosota 0,02 - 0,11
15
A pesar de que ambos suelos contaminados presentan una concentración de OHAPs neutros muy similar, sus ratios
de acumulación de metabolitos son muy diferentes. En el suelo de Jaén ocurre una mayor acumulación de
fluorenona siendo significativa su diferencia frente a la presentada en la creosota comercial, situación que no ocurre
con el suelo de Finlandia, donde presenta concentraciones similares. En el caso de la Antraquinona en cambio el
ratio demuestra que en el suelo de Finlandia existe una acumulación superior en 2,5 veces, en cambio en Jaén es de
0,5. En el caso de la 7H-Benz[de]antracen-7-ona presenta una diferencia más significativa y homogénea entre las
muestras ambientales y la creosota comercial. Esta proporción incrementada del producto oxidado respecto al
parental del cual derivan es un claro indicador de que durante el periodo de residencia en el suelo los HAPs de la
creosota sufren distintos procesos de oxidación. Sin embargo, en este punto, no se puede atribuir esta variación
exclusivamente a un proceso de degradación biológica, ya que algunos de estos productos también se pueden
generar como resultado de procesos de oxidación química y fotooxidación. Por este motivo, para poder utilizar estas
ratios diagnóstico como indicador de degradación biológica activa, son necesarias otras técnicas analíticas que
permitan discriminar su origen.
4.4. Producción de metabolitos a partir de Bulkhodelria cepacia F297 y Acenafteno.
Como hemos visto, en los suelos contaminados con creosota, como consecuencia del envejecimiento, se observa
una acumulación de productos oxidados (OPAHs) cuyo origen es incierto. Para establecer si la formación de estos
compuestos se puede atribuir a una oxidación físico-química o biológica, una de las aproximaciones es establecer
ratios de discriminación isotópica entre el producto oxidado y el parental a partir del cual se han originado. Por
este motivo, nuestro grupo de Investigación, en colaboración con la Universidad de Berna (Suiza), se encuentra
realizando un proyecto que tiene como finalidad el determinar si la proporción isotópica de los productos de origen
bacteriano difieren de manera significativa de aquellos que tienen un origen físico-químico y proponerla como una
alternativa analítica. Para desarrollar este proyecto, el primer paso es obtener metabolitos mediante degradación
biológica en el laboratorio, evitando la interacción con otros procesos fisico-químicos que pudan contribuir a su
formación. De esta manera, una vez purificados estos productos, se puede comparar si hay un enriquecimiento en
ciertos isótopos del carbono respecto a la molécula parental no degradada. En caso de observarse un
enriquecimiento selectivo, este análisis podría realizarse posteriormente con muestras ambientales.
Debido a que en los análisis de suelo contaminado diversos de los productos detectados (acenaftenona,
acenaftenoquinona, ácido naftaleno 1,8-dicarboxílico y su anhídrido) podían resultar de la degradación microbiana
del acenafteno, se escogió este HAP para iniciar la producción de metabolitos en el laboratorio. Para ello, se
seleccionó la cepa degradadora de fluoreno Bulkholderia. cepacia F297, que se había visto en estudios previos del
grupo que era capaz de transformar el acenafteno (Grifoll et al., 1995). Se utilizaron células de esta cepa préviamente
inducidas en fluoreno y se incubaron en presencia de acenafteno durante 25 horas. A distintos tiempos se realizó un
seguimiento de la producción de metabolitos por medio de barridos espectrales entre 200 y 600 nm y análisis por
HPLC. El perfil cromatográfico obtenido al final de la incubación y la cinética de acumulación de metabolitos se
muestran en la figura 7.
16
Figura 7. Producción de metabolitos a partir de acenafteno, a) Cromatograma HPLC extracto acuoso sin purificar (40
horas), b) Cinética de acumulación de metabolitos, c) Espectros UV/Vis de los metabolitos con mayor abundancia.
El análisis por HPLC mostró tres picos principales. El metabolito I presenta un espectro UV/Visible similar a la
acenaftenoquinona, el cual fue utilizado como indicador del punto final de incubación, para conocer la composición
del resto de compuestos se realizó una extracción en condiciones neutras y ácidas del cultivo, y ambos extractos se
analizaron por GC-MS (figura 8).
AU
0.00
0.20
0.40
0.60
Minutes
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
I
II
III
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00
I
II
III
AU
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
nm
220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00
226.8
287.1
351.3 371.4387.0
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
nm
220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00
258.7
370.2
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
nm
220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00
275.2
371.4
I
II
III
Tiempo, h
IA ACNIIA ACN
IIIA ACN
IVA ACN
VA ACN
a)
b)
c)
a)
17
Figura 8. Metabolitos de la cepa B. cepacia F297 a partir de Acenafteno. a) Extracto ácido derivatizado. b) Extracto
neutro derivatizado; Potencial metabolito OHAP; Quinolinas; Ácidos grasos.
Tabla 4. Abundancia relativa de metabolitos de Acenafteno.
Extracto Núm. Compuesto Abundancia
Ácido derivatizado
I A 1-(2H)-Acenaftenona 2,8 %
II A Metil 2-(3-hidroxi-2,3-dihidro-1H-inden-4-il)acetato 4,5 %
V A Ácido 1,8-Naftalenodicarboxílico 40,7%
Neutro derivatizado
I N 1-(2H)-Acenaftenona 54,0%
II N 1-Acenaftenol 3,6 %
III N 1,2-Acenaftenodiona 27,8 %
IV N 1,8-Anhídrido naftálico 2,8%
La obtención de 1-(2H)-Acenaftenona, 1,2-Acenaftenodiona y Ácido 1,8-Naftalenodicarboxílico fue satisfactoria, se
encuentra en ejecución la síntesis de 1-(2H)-Acenaftenona por método químico para llevar a cabo la cuantificación
de los distintos metabolitos acumulados.
5. Discusión
Los resultados de la cuantificación de HAPs en los suelos nos indican que se tratan de emplazamientos con una
elevada contaminación, presentando concentraciones del total de HAPs alrededor de 5000 ppms. Estas
concentraciones, están claramente por encima de los niveles de referencia que marca la legislación actual a nivel
español (Real Decreto 9/2005, del 14 de enero) y europeo. Esta legislación, además de establecer los niveles
máximos de concentración de hidrocarburos totales, establece las concentraciones de ciertos máximas de ciertos
contaminantes diana de especial interés, como el Benzoa]pireno, cuyo nivel de referencia esta establecido en 2
ppm para suelos de uso industrial, y que estan claramente superados en el suelo de Jaén (42 ppm).
El análisis de OHAPs neutros y de ácidos carboxílicos mostró la presencia de un gran número de productos de
oxidación de HAPs, lo que indica la validez del método analítico desarrollado previamente (Arias 2008) para el
análisis de suelos contaminados. Los productos neutros detectados incluyen mayoritariamente cetonas y quinonas
aromáticas, algunas de las cuales ya habían sido detectadas y cuantificadas en estudios similares realizados por
otros autores (Bandowe et al., 2010; Lundstedt, y otros, 2007). Estos OPAHs neutros se encuentran en una
IN ACNIIN ACN
IIIN ACNIVN ACN
b)
18
concentración muy similar en los dos suelos analizados, presentando una concentración similar y en algunos casos
incluso superior a la de los productos parentales de los cuales derivan. Esto queda patente en las ratios específicas
de concentración OHAP/HAP calculadas para compuestos espcíficos como la antraquinona/antraceno (0,5 y 2,5) o
7H-Benz[de]antracen-7-ona/Benzo[a]antraceno (0,83 y 0,75). La elevada concentración de estos compuestos, y el
hecho de que se detecten en suelos de orígen tan distinto como los dos analizados en este trabajo sugieren que
estos compuestos son habituales en suelos contaminados por HAPs, por lo sería necesario incluirlos en la actual
legislación de suelos contaminados, que tal y como ya se ha comentado, sólo tiene en cuenta los niveles de ciertos
HAPs parentales. Además, hay que tener en cuenta que estos compuestos, debido a su mayor polaridad, son en
muchos casos más biodisponibles y por lo tanto potencialmente más tóxicos que los HAPs de los cuales derivan
(Brooks et al., 1998).
La concentración del total de OHAPs y de OHAPs específicos fueron mucho más elevadas en los suelos
contaminados analizados que en la creosota comercial. Esto indica claramente, que durante el proceso de
envejecimiento en el suelo hay una formación de derivados oxidados de HAPs, y que las ratios OHAP/HAP
establecidas entre los compuestos oxidados y su parental de origen podrían ser un buen indicador del grado de
envejecimiento de la muestra. A pesar de todo, estas diferencias no son evidencia suficiente de que se están
produciendo fenómenos de biodegradación activa, punto clave para la descontaminación de suelos mediante
tecnologías de atenuación natural monitorizada, ya que algunos de estos compuestos se pueden formar tanto por
oxidación microbiana como por foto oxidación. En este sentido, la utilización de nuevos métodos analíticos de
discriminación isotópica podrían ser clave para discernir el origen de estos productos.
Además este estudio se puso en evidencia la detección y cuantificación de OHAPs ácidos como el ácido difénico, el
ácido 6,6’-dihidroxi-2,2’-bifenildicarboxílico, o los ácidos hidroxi naftoicos, que son productos intermediarios clave
de rutas descritas en la bibliografía. La detección en suelos de este tipo de productos no ha sido reportada
previamente por ningún grupo de investigación, lo que sugiere que la obtención de lixiviados de suelos parece un
paso clave para su detección en muestras ambientales. Este tipo de compuestos no se encuentran presentes en la
creosota comercial sin degradar, y desde el punto de vista ecológico pueden ser indicadores muy claros de
degradación activa, ya que al ser tan polares en el medio ambiente serían rápidamente lixiviados mostrando un
tiempo de residencia en el suelo relativamente corto. Por lo tanto su presencia en el suelo indicaría una formación
relativamente próxima en el tiempo.
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21) Poster, D., Schantz, M., Sander, L., & Wise, S. (2006). Analysis of polyciclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in environmental samples: A critical review of gas chromatographic (GC) methods. Anal Bional Chem , 386, 859-881.
22) Selesi, D., & Meckenstock, R. (2009). Anaerobic degradation of the aromatic hydrocarbon biphenyl by a sulfate-reducing enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology , 68 (1), 89-93.
23) Selifonov, S., Chapman, P., Akkerman, S., Gurst, J., Bortiatynski, J., Nanny, M., y otros. (1998). Use of 13C nuclear magnetic resonance to assess fossil fuel biodegradation: fate of [1-13C]acenaphthene in creosote polycyclic aromatic compound mixtures degraded by bacteria. Applied and Environmental Microbiology , 64 (4), 1447-1453.
24) Selifonov, S., Grifoll, M., Eaton, R., & Chapman, P. (1996). Oxidation of Naphtenoaromatic and Methyl-Substituted Aromatic Compounds by Naphtalene 1,2-Dioxygenase. Applied and Environmental Microbiology , 62 (2), 507-514.
25) University of Minnesota. (30 de Julio de 2012). Biocatalysis/Biodegradation Database. Obtenido de http://umbbd.ethz.ch/
26) Vila, J. (2000). Tesis DEA "Caracterizació catabòlica de soques bacterianes degradadores d'hidrocarburs". Barcelona: Universitat de Barcelona.
27) Vila, J., & Grifoll, M. (2009). Actions of Mycobacterium sp. Strain AP1 on the Saturated- and Aromatic-Hydrocarbon Fractions of Fuel Oil in a Marine Medium. Applied and Environmental Microbiology , 75 (19), 6232-6239.
28) Vila, J., López, Z., Sabaté, J., Minguillón, C., Solanas, A., & Grifoll, M. (2001). Identification of a Novel Metabolite in the Degradation of Pyrene by Mycobacterium sp. Strain AP1: Actions of the Isolate on Two. and Three-Ring Polyciclic Aromatic Hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology , 67 (12), 5497-5505.
29) Weissenfels, W., Beyer, M., & Klein, J. (1994). Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by pure bacterial cultures. Applied and Environmental Microbiology , 32 (4), 479-484.
ANEXO
Tabla 5. Determinación cualitativa de OHAPs en el suelo de Jaén-España.
# RT IONES, m/z (%) ID %
EXTR
AC
TO Á
CID
O L
IXIV
IAD
OS
1A 21,977 194 (M+, 7%), 163 (M+ -CH3O, 100%), 135 (M+ -CH3OCO, 4%), 104 (4%), 92 (7%), 77 (15%) Dimetil ftalato 0,81
2A 24,803 208 (M+, 14%), 177 (M+ -CH3O, 100%), 135 (M+ -CH3OCO, 5%), 135 (3%), 106 (4%), 91 (13%), 77 (3%) Ácido 1, 2 - Bencenodicarboxílico, 4-metil, dimetil ester 0,38
3A 25,976 186 (M+, 68%), 155 (M+ -CH3O, 100%), 127 (M+ -CH3OCO, 85%), 115 (3%), 101 (6%), 77 (10%), 63 (5%) Ácido 1-Naftalenocarboxílico, metil ester 2,84
4A 26,393 186 (M+, 71%), 155 (M+ -CH3O, 100%), 127 (M+ -CH3OCO, 82%), 101 (5%), 77 (11%), 63 (8%) Ácido 2-Naftalenocarboxílico, metil ester 1,61
5A 28,512 202 (M+, 34%), 170 (M+ -CH3OH, 100%), 114 (54%) Ácido 2-hidroxinaftoico, methyl ester 0,80
6A 29,314 234 (M+, 20%), 202 (M+ -CH3OH, 55%), 170 (M+ -CH3OH -CH3OH, 100%), 142 (M+ -CH3OH -CH3OH -CO 69%), 114 (M+ -CH3OH -CH3OH -CO -C2H4 52%), 89 (13%)
Ácido 2-Naftalenocarboxílico, 3-hidroxi, metil ester 1,00
7A 30,683 252 (M+, 5%), 221 (M+ -CH2OH 100%), 202 (23%), 186 (14%), 161 (8%), 145 (12%), 131 (14%), 115 (16%), 103 (12%), 91 (11%) Ácido 1, 2, 4-Bencenotricarboxílico, trimetil ester 0,22
8A 32,228 270 (M+, 3%), 239 (M+ -CH2OH 3%), 211 (M+ -CH3OCO 100%), 196 (15%), 180 (11%), 168 (5%), 152 (11%), 139 (8%), 76 (8%) Dimetil difenato 4,39
9A 33,988 244 (M+, 38%), 213 (M+ -CH2O 100%), 185 (M+ -CH2O -CO 27%), 170 (34%), 154 (9%), 126 (11%), 114 (18%) Ácido 2, 6-Naftalenodicarboxílico, dimetil ester 5,32
10A 33,553 244 (M+, 42%), 213(M+ -CH2OH, 100%), 195 (11%), 170 (11%), 127(11%) Ácido Naftalenodicarboxílico, dimetil ester 0,50
11A 34,285 244 (M+, 34%), 213(M+ -CH2OH, 100%), 127 (23%) No elucidado, perfil peculiar 2,28
12A 34,455 198 (M+, 69%), 154 (M+ -COO 100%), 126 (M+ -COOCO 88%), 98 (5%), 74 (15%), 63 (19%), 50 (6%) 1, 8-Naphtalic anhydride 0,84
13A 39,66 296 (M+, 9), 264 (M+ -CH3OH, 14%), 236(M+ -CH3OH -CO, 100%), 205(21%), 178 (28%), 165(28%) No elucidada 1,64
14A 42,49 300 (M+, 65%), 269 (M+ -CH2OH, 42%), 241 (M+ -CH2OH -CO, 100%), 226(58%), 210(9%) Anhídrido del Ácido fenantreno 4,5-dicarboxílico 0,99
15A 45,76 248(M+, 100%), 204(86%), 176(100%), 150(23%), 88(30%) Acido 6,6-dihidroxi 2, 2'-bifenil dicarboxílico
E. N
EUTR
O L
IXIV
IAD
OS 1N 26,759 168 (M+, 95%), (M+ -CO 100%), 139 (M+ -HCO 85%), 98 (M+ -CO - C2H3 10%), 89 (7%), 70 (11%), 63 (9%) 1 (2H)-Acenaftilenona 0,42
3N 28,487 180 (M+, 100%), 152 (M+ -CO 37%), 130 (15%), 76 (11%), 63 (7%) 9H-Fluoren-9-ona 1,70
4N 31,301 182 (M+, 53%), 154 (M+ -CO 93%), 126 (M+ -CO -CO, 100%), 98 (7%), 74 (14%), 63 (12%), 50 (7%) 1,2-Acenapftilenodiona 1,10
18A 31,925 198 (M+ 100%), 182 (72%), 152 (36%), 127 (7%), 115 (9%), 76 (11%), 63 (7%), 51 (4%) 2-Hidroxifluoreno 0,93
12A 32,266 184 (M+ 79%), 155 (M+ -HCO 100%), 127 (M+ -HCO -CO 81%), 77 (14%), 63 (12%), 51 (7%) 1H, 3H, Nafto [1, 8 -cd]piran-1-ona 1,33
5N 33,225 208(M+ 100%), 180 (M+ -CO 85%), 152 (M+ -CO -CO 68%), 126 (9%), 76 (24%), 50 (11%) 9, 10-Antracenodiona 1,71
F2 S
OH
XLE
T
2N 17,35 132 (M+, 97), 104 (M+ -CO, 100), 103 (57), 85 (8), 78 (47), 77 (48), 76 (26), 63 (22) Indanona 0,31
3N 28,474 180 (M+ 100%), 152 (M+ -CO 35%), 126 (M+ -CO -C2H2 5%), 76 (11%), 63 (5%) 9H-Fluoren-9-ona 1,81
6N 31,919 198 (M+, 100%), 182 (72%), 152 (36%), 127 (7%), 115 (9%), 76 (11%), 63 (7%), 51 (4%) Ácido bifenil-4-carboxílico 0,63
5N 33,225 208(M+ 100%), 180 (M+ -CO 87%), 152 (M+ -CO -CO 66%), 126 (7%), 76 (24%), 63 (7%), 50 (11%) 9, 10-Antracenodiona 2,22
7N 34,632 204 (M+ 100%), 176 (M+ -CO 31%), 150 (M+ -CO -C2H2 9%), 88 (11%), 75 (4%), 62 (3%) Ciclopenta(def)fenantrenona 2,69
8N 35,761 222 (M+ 100%), 194 (M+ -CO 39%), 165 (M+ -CO -HCO 82%), 139 (11%), 115 (14%), 97 (4%), 82 (9%) 9,10-Antracenodiona, 2-metil- 0,98
9N 40,019 230 (M+ 100%), 202 (M+ -CO 19%), 200 (M+ -H2CO 19%), 174 (3%), 150 (3%), 115 (3%), 101 (11%), 88 (5%) 11H-Benzo[a]fluoren-11-ona 1,67
10N 40,537 230 (M+ 100%), 202 (M+ -CO 53%), 174 (4%), 150 (4%), 115 (5%), 101 (15%), 88 (8%), 75 (3%) 7H-Benz[de]antracen-7-ona 0,95
10N 42,284 230 (M+ 100%), 202 (M+ -CO 42%), 174 (5%), 152 (4%), 115 (5%), 101 (16%), 88 (15%), 75 (3%), 63 (3%) 7H-Benz[de]antracen-7-ona 0,75
Tabla 6. Determinación cualitativa de OHAPs en el suelo de Finlandia.
# RT IONES, m/z (%) ID
Abundancia, %
FRA
CC
IÓN
ÁC
IDA
LIX
IVIA
DO
S
4A 25,901 186 (M+, 71%), 155 (M+ -CH3O, 100%), 127 (M+ -CH3OCO, 82%), 101 (5%), 77 (11%), 63 (8%) Ácido 2-Naftalenocarboxílico, metil ester 0,48
16A 27,635 204 (M+, 58%), 172(M+ -CH3OH, 49%), 145(100%), 130(58%), 115(74%), 91(30%) Ácido (1-Oxoindan-2-il)-acético, metil ester 0,96
17A 30,146 192 (M+, 100%), 177(22%), 149 (16%), 121(16%), 107(16%), 91(16%), 77(19%) 5, 6-dimetoxi-1-indanona 0,67
18A 31,812 182(M+, 100%), 165(17%), 152(39%), 127(20%) 2-Hidroxifluoreno 0,63
5N 33,118 208 (M+, 100%), 180 (M+ -CO, 86%), 152 (M+ - 2 CO, 68%), 76 (29%), 50 (9%) 9, 10-Antracenodiona 1,64
7N 34,531 204 (M+ 100%), 176 (M+ -CO, 33%), 150 (M+ -CO -C2H2, 10%), 88 (18%), 75 (6%) Ciclopenta(def)fenantrenona 0,56
11N 35,919 218(M+, 100%), 189(M+ -CHO, 29%), 109(17%), 94(22%) Benzo[b]nafto[2,3-d]furano 0,84
19A 36,461 238(M+, 76%), 207(M+ -CH2OH, 100%), 180(47%), 151(76%) 9-Fluorenona-1-carboxylic acid, methyl ester 0,78
20A 38,959 256(M+, 27%), 196(100%), 183(41%), 155(33%), 127(44%) Derivado del Ácido naftaleno 1-hidroxi-2(3-oxobutanoico) ME
2,85
F. N
. L
21N 32,234 254(M+, 39%), 239(60%), 192(79%), 182(100%), 165(31%) Perfil peculiar de fragmentación 2,38
5N 33,13 208 (M+, 100%), 180 (M+ -CO, 86%), 152 (M+ - 2 CO, 68%), 76 (29%), 50 (9%) 9, 10-Antracenodiona 3,98
F2 S
OH
XLE
T
3N 28,393 180 (M+, 100%), 152 (M+ -CO, 41%), 126 (M+ -CO -C2H2, 7%), 76 (17%), 63 (8%) 9H-Fluoren-9-ona 0,68
5N 33,196 208 (M+, 100%), 180 (M+ -CO, 86%), 152 (M+ - 2 CO, 68%), 76 (29%), 50 (9%) 9, 10-Antracenodiona 6,83
7N 34,602 204 (M+ 100%), 176 (M+ -CO, 33%), 150 (M+ -CO -C2H2, 10%), 88 (18%), 75 (6%) Ciclopenta(def)fenantrenona 5,83
13N 36,272 194 (M+, 100%), 165 (M+ -COH, 45%), 139 (9%), 97 (9%) 2-Fenantrenol 1,11
9N 39,952 230 (M+, 100%), 200 (M+ -CO, 19%), 101 (12%), 88 (6%) 11H-Benzo[a]fluoren-11-ona 2,81
10N 40,461 230 (M+, 100%), 202 (M+ -CO, 23%), 101 (10%), 88 (6%) 7H-Benz[de]antracen-7-ona 1,21
9N 40,915 230 (M+, 100%), 200 (M+ -CO, 19%), 101 (12%), 88 (6%) 11H-Benzo[a]fluoren-11-ona 2,47
12N 41,81 244 (M+ 100%), 229 (M+ -CH3, 32%), 215 (M+ -CHO , 41%), 200 (9%), 189(11%) 11H-Benzo[a]fluoren-11-ona, 10-metil- 0,40
13N 42,063 244 (M+ 18%), 228 (68%), 218 (100%), 189 (70%), 94(23%) No elucidada, perfil peculiar (similar al hidroxipireno) 0,59
14N 42,202 244 (M+ 30%), 230 (100%), 202 (48%), 101 (18%) 7H-Benz[de]antracen-7-ona 0,42
15N 44,902 258 (M+ 100%), 230 (M+ -CO, 37%), 202 (M+ -CO -CO, 60%), 101 (22%), 88 (14%) 5, 12-Naftacenodiona 0,91
Tabla 7. Determinación cualitativa de OHAPs en creosota comercial.
# RT IONES, m/z (%) ID
Abundanc
ia, %
F. Á
CID
A 2n 17,365 132 (M+, 100%), 104 (M+ -CO, 86%), 78 (34%), 51 (18%) 1H-Inden-1-ona, 2,3-dihidro 2,01
17n 23,364 168(M+, 100%), 139(M+ -COH, 33%) Dibenzofurano 0,97
F. N
EUTR
A L
IXIV
IAD
OS 2n 17,384 132 (M+, 100%), 104 (M+ -CO, 86%), 78 (34%), 51 (18%) 1H-Inden-1-ona, 2,3-dihidro 3,42
18n 23,371 168(M+, 100%), 139(M+ -COH, 33%) Dibenzofurano 1,87
19n 26,815 170 (M+, 88%), 169(100%), 152(M+ -H2O, 58%), 141(33%), 115 (21%) 1,2-Dihidroacenaften-1-ol 0,68
20n 31,118 184(M+, 100%), 155(9%), 128(16%) Dibenzob,dfuran-2-ol 0,39
F2 S
OH
XLE
T
2n 17,403 132 (M+, 100%), 104 (M+ -CO, 86%), 78 (34%), 51 (18%) 1H-Inden-1-ona, 2,3-dihidro 1,71
3n 28,468 180 (M+ 100%), 152 (M+ -CO 35%), 126 (M+ -CO -C2H2 5%), 76 (11%), 63 (5%) 9H-Fluoren-9-ona <0,5
16n 40,663 218 (M+ 100%), 189 (M+ -HCO, 77%), 163 (7%), 109(11%), 94(36%) 1-Hidroxipireno 2,37
10n 42,284 230 (M+ 100%), 202 (M+ -CO 45%), 101 (14%) 7H-Benz[de]antracen-7-ona 2,64
