Độ chính xác, độ đúng

Ñaùp öùng(response)

Khoaûng tuyeán tính

Ñoä nhaïy(S>2N)

Specific detector

Transport detector

Những yêu cầu cơ bản của detector

Bulk property detectorRID, ECD…

Solute property detectorUV. Fluorescense

Detector noise

1. Short term noise (grass) Nguyên nhân: Detector, recorder electronics.Khắc phục: sử dụng noise filter

2. Long term noise -> seriousKhó phân biệt với peak chất tan Nguyên nhân: sự không ổn định detector làm

thay đổi môi trường xung quanh.(VD: RID detector độ nhạy phụ thuộc

nhiệt độ và áp suất)

3. Drift Nguyên nhân: -Mất cân bằng trong detector do Nguồn điện cung cấp cho detector dẫn đến slowly changing output.Thay đổi nhiệt độ xung quanh.- Thay đổi pha động -> cân bằng trên cột không hoàn toàn

sensitivity

4. Total noise (tổng hợp 3 loại trên

Các loại detector noise

ND = v1.A = v1/Sv1 ( mV) đo trên recorder scale.

A : attenuation factorS : amplification factor

Specific detector(UV, Fluorescence)

Chất tan có tình chất đặc biệt mới được dò tìm.Hạn chế trong việc lựa chọn dung môi.Độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng,

- Dung môi được loại bỏ nhờ quá trình bay hơi- Chất tan được dò tìm nhờ quá trình đốt cháy hay nhiệt phân…..-> Không hạn chế lựa chọn dung môi (reasonably volatile)- Thích hợp cho việc rửa giải gradient- Ít nhạy hơn specific detector- Khoảng tuyến tính tương đối rộng.

Transport detector

NOTE: Cả hai đều yêu cầu về độ tinh khiết của dung môi.

UV DetectorUV Detector

Conductivity DetectorConductivity Detector (CDD).(CDD).

Rafractive index Detector Rafractive index Detector (RID)(RID)

Fluorescense Detector Fluorescense Detector (Đầu dò huỳnh quang)(Đầu dò huỳnh quang)

Detector for LC

UV DetectorUV Detector

Hợp chất (olefin, vòng thơm, >CO, >CS, -N=O, -NΞN-, hấp thu vùng UV (200-350 nm)

Đầu dò bước sóng cố địnhĐầu dò bước sóng cố định

Đầu dò đa bước sóng Đầu dò đa bước sóng

Electrochemical DetectorElectrochemical Detector

Mối liên hệ giữa cường độ ánh sáng UV truyền qua cell đo và nồng độ chất tan

IT = Io e-kLC

Io : cường độ ánh sáng tới cell.IT : cường độ ánh sáng truyền qua.

L: chiều dài của cell đo.C: nồng độ chất tan.

k: hệ số dập tắt phân tử (chất tan, bước sóng).Ln IT = Ln Io- kLC

Độ nhạy - k: (chất tan, bước sóng) <- Lựa chọn- Chiều dài đường truyền ánh sáng qua cell-> L (không tăng vô hạn) gây ra sự phân tán peak (band dispersion)

Hình 1: Mô tả đầu dò bước sóng cố định

Detecto Alltech Model 450Ñoä tuyeán tính : 0,005-1ñôn vò haáp thu AUCuvet chuaån : 13µlTroâi ñöông neàn : < 5x10-5AU/giôøNhieãu : 2x 10-5AU

Kích thước Cell đo (L=1-10 mm, bk = 1mm)

Đèn : Đèn hơi thủy ngân (253.7 nm) -> đầu dò nhạy với nhiều chất tan

Đèn hơi kẽm (212.9 nm và 307.6 nm)Đèn hơi Cd (228.8, 326.1, 340.3, 346.6 nm)

Ưu điểm : Độ nhạy cao (5x10-5 mg/ml), độ chọn lọc cao

Khoảng tuyến tính (5x10-5 to 5x10-1 mg/ml)Response Index (0.98 – 1.02)

Đầu dò bước sóng cố định

1- Đầu dò phân tán đa bước sóng 2- Đầu dò diode array

Ưu điểm : độ nhạy cao (10-4 mg/ml), độ chọn lọc caoKhoảng tuyến tính (5x10-4 to 5x10-1 mg/ml)

Response Index (0.97 – 1.03)

Đầu dò đa bước sóng

Đầu dò phân tán giám sát chất tan chỉ ở Đầu dò phân tán giám sát chất tan chỉ ở một bước sóngmột bước sóngƯu điểm : độ nhạy cao, độ linh hoạt và đáp Ưu điểm : độ nhạy cao, độ linh hoạt và đáp ứng tuyến tính thỏa đáng.ứng tuyến tính thỏa đáng.Kích thước lớn do không gian quang học Kích thước lớn do không gian quang học bên trong tương đối lớnbên trong tương đối lớn

1- Đầu dò phân tán đa bước sóng

2- Đầu dò diode array Ghi lại thời gian của một peak đặc trưng, phổ đồ của chất tan

1- Đầu dò phân tán đa bước sóng

Detecto Model 200 Variable UV/VIS,AlltechÑoä haáp thu : 0,0005-2AUÑoä tuyeán tính :<1%-2AUÑoä chính xaùc : ±1nmÑoäñuùng :±1nmTroâi neàn : 2x10-4AU/giôøNhieãu neàn : <±1x10-5AUôû 254nmCuvet : 9µl

D2 or Xenon

2- Đầu dò diode array

Cho cuøng luùc thôøi gian löu cuûa hoaù chaát, phoåUV hay Vis cuûa hoaù chaát

Chiều dài Chiều dài cộtcột

Bề rộng Bề rộng peakpeak

Flow cell đề nghịFlow cell đề nghị

<=5cm<=5cm 0.025 phút0.025 phút Micro flow Micro flow cellcell

10cm10cm 0.05 phút0.05 phút Semimicro Semimicro flow cellflow cell

20cm20cm 0.1 phút0.1 phút Flow cell Flow cell chuanchuan

>=40cm>=40cm 0.2 phút0.2 phút

Tỉ lệ dòngTỉ lệ dòng 0.05-0.2 0.05-0.2 ml/minml/min

0.2-0.4 0.2-0.4 ml/minml/min

0.4-0.8 0.4-0.8 ml/minml/min

1-2 ml/min1-2 ml/min

Đường kính cộtĐường kính cột 1 mm1 mm 2.1 mm2.1 mm 3 mm3 mm 4.6 mm4.6 mm

Flow cell lớn – giới hạn phát hiện tốt.Flow cell nhỏ - độ phân giải peak tốt.

Dispersion ảnh hưởng nghiêm trọng đến phản ứng sau cột

Turbulence (sự xáo trộn) trong detector connecting tube hoặc cell gây ra sự khuyếch tán của chất tan

Tăng noise -> giảm độ nhạy

Khắc phục: Thay đổi hính dạng của ống

Hạn chế: dễ dàng gây tắc nghẽn -> tạo áp suất ngược trên cột

-> lựa chọn kích thước cho phù hợp

Ảnh hưởng của nhiệt đến cell

From column

Sự khác biệt khi sử dụng heat exchanger

Methanol Absorption Spectrum

If dissolved oxygen concentration becomes high, organic If dissolved oxygen concentration becomes high, organic solvent absorbance becomes high. solvent absorbance becomes high.

This effect is pronounced in short wavelength region. This effect is pronounced in short wavelength region.

Air saturation

Degassed

Thay đổi background trong UV detectorPha động

Detection: UV- 210nm

The difference in dissolved air quantities in mobile phase and The difference in dissolved air quantities in mobile phase and sample solvent solutions can be expressed as peaks. sample solvent solutions can be expressed as peaks.

Degassed mobile phase

Mobile phase not degassed

Oxygen bubbling

Air saturation

He bubbling

Oxygen bubbling

Air saturation

He bubbling

Không khí hòa tan trong pha động ảnh hưởng peak trong UV detector

In general, spectrum shape is affected by ambient temperature.In general, spectrum shape is affected by ambient temperature.

Measurement wavelength

Spectrum at high temperature

Absorbance difference due to temperature change

Spectrum at low temperature

Abs

orba

nce

Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector UV

Comparison of peak area values without temperature control Comparison of peak area values without temperature control (34(34C)C)

0.9680.9680.9850.985p-p-toluic acidtoluic acid

0.9860.9860.9910.991Benzoic acidBenzoic acid

0.9910.9910.9940.994PhenolPhenol

50ºC50ºC40ºC40ºC

Peak Area Ratios Compared with Areas at 34ºCPeak Area Ratios Compared with Areas at 34ºC

ColumnColumn : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.) : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.)

Mobile phase : 10mM acetic acid (sodium) buffer solution (pH 4.5) /Mobile phase : 10mM acetic acid (sodium) buffer solution (pH 4.5) / Methanol = 7/3, (v/v) Methanol = 7/3, (v/v)

Flow rateFlow rate : 1mL/min : 1mL/min

Temperature : 40ºCTemperature : 40ºC

DetectionDetection : UV-VIS (260nm) : UV-VIS (260nm)

Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector UV

Ưu điểm của UV detector- Được sử dụng rộng rãi và nhiều nhất.

- Độ chọn lọc tương đối cao.- Khoảng tuyến tính rộng.

-Có sự kết hợp tốt giữa độ nhạy, độ tuyến tính và độ tin cậy-Thiết bị không mắc tiền, tương đối đơn giản

-Thể tích chết tương đối nhỏ nên UV detector kết hợp hiệu quả với cột hiệu năng cao

Hạn chế của UV detector:Không xác định được hợp chất không phân cực, không hấp thu as UV-VIS

DETECTO HUYØNH QUANG DETECTO HUYØNH QUANG ( Fluorescence Detector)( Fluorescence Detector)

1.Duøng tia1.Duøng tia UV UV ñeå kích thích hoaù chaát, hoaù chaát ñeå kích thích hoaù chaát, hoaù chaát vôùi caáu truùc thích hôïp seõ phaùt huyønh quang ôû vôùi caáu truùc thích hôïp seõ phaùt huyønh quang ôû böôùc soùng daøi hôn so vôùi böôc soùng kích thích, böôùc soùng daøi hôn so vôùi böôc soùng kích thích, ngöôøi ta ño cöôøng ñoä phaùt huyønh quang ñeå töø ngöôøi ta ño cöôøng ñoä phaùt huyønh quang ñeå töø ñoù tính ra ñöôïc noàng ñoä chaát caàn phaân tích ban ñoù tính ra ñöôïc noàng ñoä chaát caàn phaân tích ban ñaàu.ñaàu.

2.Ñaàu doø huyønh quang thuoäc loaïi coù ñaëc tính 2.Ñaàu doø huyønh quang thuoäc loaïi coù ñaëc tính choïn loïc cao,choïn loïc cao,

chæ coù chaát coù tính huyønh quang môùi ñöôïc phaùt chæ coù chaát coù tính huyønh quang môùi ñöôïc phaùt hieän vaø ño ñöôïc. Nhö vaäy, hoaëc chaát coù tính hieän vaø ño ñöôïc. Nhö vaäy, hoaëc chaát coù tính huyønh quang töï nhieân, hoaëc thöïc hieän phaûn huyønh quang töï nhieân, hoaëc thöïc hieän phaûn öùng tröôùc hay sau coät saéc kyù loûng ñeå taïo daãn öùng tröôùc hay sau coät saéc kyù loûng ñeå taïo daãn xuaát coù tính huyønh quang roài môùi ño.xuaát coù tính huyønh quang roài môùi ño.

3. Ñaàu doø huyønh quang raát nhaïy, coù theå ño 3. Ñaàu doø huyønh quang raát nhaïy, coù theå ño löôïng hoaù chaát raát nhoû. löôïng hoaù chaát raát nhoû.

ÑAÀU DOØ HUYØNH QUANGÑAÀU DOØ HUYØNH QUANG

The fluorescence signal (If) is given by If = ө Io (1– e -kcl) ө: is the quantum yields (the ratio of the number of photons emitted and the number of photons absorbed), (Io) is the intensity of the incident light, (c) is the concentration of the solute, (k) is the molar absorbance, (l) is the path length of the cell.

The Single Wavelength Excitation Fluorescent Detector

low-pressure mercury lamp 253.7 nm

1.Ñeøn XENON, 150w1.Ñeøn XENON, 150w 2.Khoaûng böôùc soùng : 200-650 hoaëc 2.Khoaûng böôùc soùng : 200-650 hoaëc

200-900nm200-900nm 3.Ñoä chính xaùc : ±0,2nm3.Ñoä chính xaùc : ±0,2nm 4. Ñoä ñuùng : ±2nm4. Ñoä ñuùng : ±2nm 5. Ñoä nhaïy : S/N 300 hay hôn cho vaïch 5. Ñoä nhaïy : S/N 300 hay hôn cho vaïch

RAMAN cuûa nöôùcRAMAN cuûa nöôùc 6. Cuvet : 12µl6. Cuvet : 12µl

ÑAÀU DOØ HUYØNH QUANG ÑAÀU DOØ HUYØNH QUANG RF-10AXL SHIMADZURF-10AXL SHIMADZU

Sử dụng thấu kính để tập trung ánh sáng huỳnh quang

Sử dụng gương parabol để tập trung ánh sáng huỳnh quang vào ống nhân quang tăng độ nhạy

The Multi Wavelength Fluorescence Detector

2 monochromators, 1 cái để chọn bước sóng kích thích và cái còn lại để chọn bước sóng huỳnh quang

Lựa chọn bước sóng kích thích và bước sóng phát huỳnh quang

để tăng độ nhạy

1 Naphthalene 9 Chrysene 2 Acenaphthene 10 Benzo(b)fluoranthene 3 Fluorene 11 Benzo(k)fluoranthene 4 Phenanthrene 12 Benzo(a)pyrene 5 Anthracene 13 Dibenz(a,h)anthracene6 Fluoranthene 14 Benzo(ghi)perylene 7 Pyrene 15 Indeno(123-cd)pyrene 8 Benz(a)anthracene

Time Wavelength of Wavelength of Excitation Light Emitted Light 0 280 nm 340 nm 220 290 nm 320 nm 340 250 nm 385 nm 510 260 nm 420 nm 720 265 nm 380 nm 1050 290 nm 430 nm 1620 300 nm 500 nm

min0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

mAU

0

100

200

300

400

BPA

Degassed

Not degassed* Analysis of bisphenol A by fluorescence detection

Degassing : Helium purging

Mobile phase degassing may affect fluorescence Mobile phase degassing may affect fluorescence intensity.intensity.

Ảnh hưởng của hệ thống đuổi khí đến detector huỳnh quang

Gas-liquid membrane separation degasser takes time to get

degassing result.

0

1

2

3

4

5

0 10 20 30 40 50 60Time from start of degassing (min)

Pea

k A

rea

Val

ue

(×

106 )

Degasser OFF

Degasser ONColumnColumn : Shim-Pack VP-ODS : Shim-Pack VP-ODS

(150mm L x 4.6mm I.D.) (150mm L x 4.6mm I.D.)Mobile Phase: acetonitrile/HMobile Phase: acetonitrile/H22O = 4/1 O = 4/1

(v/v)(v/v)Flow rateFlow rate : 1mL/min : 1mL/minTemperature : 40ºCTemperature : 40ºC

Analyte Analyte : Pyrene: Pyrene

DetectionDetection : Fluorescence : Fluorescence (Ex 310nm, Em 390nm) (Ex 310nm, Em 390nm)

Degassin :Degassin :Gas-liq. separation Gas-liq. separation membranemembrane

Ảnh hưởng của hệ thống đuổi khí đến detector huỳnh quang

Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector huỳnh quang

Thông thường nhiệt độ càng tăng, độ nhạy của detector càng giảm

Analysis result of acridine (Temp. effect on fluorescence intensity)

Areas 20→25C13.5% decrease

Without temperature control (RF-10AXL) With temperature control (RF-10AXLsuper)

Areas at 20→25C2.2% decrease

InstrumentInstrument :: Shimadzu Amino Acid Analysis SystemShimadzu Amino Acid Analysis System (Post-column derivitization using (Post-column derivitization using o-phthaladehyde) o-phthaladehyde)

DetectionDetection :: RF-10AXL SuperRF-10AXL Super (Ex 350nm, Em 450nm) (Ex 350nm, Em 450nm) (Cell temperature ; (Cell temperature ; 20ºC20ºC, , 40ºC40ºC))

0.770.7791101791101711855141185514LEULEU

0.770.771126683112668314573401457340ILEILE

0.770.7779001379001310268391026839METMET

0.780.781226042122604215654401565440VALVAL

0.780.78138426138426177078177078CYSCYS

0.770.771203529120352915585601558560ALAALA

0.790.791924900192490024407722440772GLYGLY

0.860.86436522436522505373505373PROPRO

0.770.771017768101776813154621315462GLUGLU

0.770.771204273120427315707431570743SERSER

0.770.771143925114392514784471478447THRTHR

0.780.781165757116575715004271500427ASPASP

4040ººCC2020ººCC

Area RatioArea RatioAA4040/A/A2020

Peak AreaPeak Area Area RatioArea RatioAA4040/A/A2020

Peak AreaPeak Area

4040ººCC2020ººCC

0.760.7683918383918311055301105530ARGARG

0.690.69336837336837487433487433LYSLYS

0.790.791431665143166518196751819675HISHIS

0.760.7699583299583213154791315479PHEPHE

0.740.7485097685097611568501156850TYRTYR

Ảnh hưởng của nhiệt độ cell đến detector huỳnh quang

　　　　　　　 Fluorescence Spectrum of Bisphenol A in Each Solvent　　　　　　　 (Excitation wavelength 270nm, with background correction) 　　　

Methanol

Acetonitrile

Wavelength(nm)

Ảnh hưởng của dung môi đến độ nhạy detector huỳnh quang

ÑAÀU DOØ CHÆ SOÁ KHUÙC ÑAÀU DOØ CHÆ SOÁ KHUÙC XAÏ RIDXAÏ RID

Electrochemical detector ( đầu dò điện hóa):

Xác định hợp chất hoặc chất chứa nhóm chức có tính oxi hóa hay khử

Ưu điểm:Độ nhạy cao.

Độ chọn lọc cao.Có khả năng áp dụng rộng rãi

Note: 1- Cấu trúc cell đo (1,2 ảnh hưởng dòng đo)2- Tốc độ dòng chảy của chất rửa giải sử dụng bơm chuyển động dạng pittong-> pulse free constant flow3- Hệ thống pha đảo hay hệ thống chỉ có một chất điện phân?

- Dung môi và dung dịch chất phân tích phải được loại trừ bọt khí, không chứa vết tạp chất kim loại - Sản phẩm của phản ứng điện hóa có thể tạo ra sản phẩm làm thay đổi tính chất của bề mặt điện cực, gây noise drift, giảm đáp ứng

Detector với hệ 3 điện cực:- Reference electrode Ag/AgCl hay calomen bão hòa

- Working electrode trơ về mặt hóa học,dẫn điện tốt,không mắc, dãy thế làm việc rộng -0.8V 1.3V (cacbon paste, vàng)

- Auxiliary electrode glassy cacbon, platinum, thép không gỉ

(n) is the number of electrons per molecule in the reaction, (F) is the Faraday Constant, (A) is the area of the working electrode, (KT) is the limiting Mass Transfer Coefficient, (c) is the solute concentration, (u) is the linear velocity of the mobile phase over the surface of the electrode, (a) is a constant usually taking a value between 1/3 and 1/2.

Mối quan hệ giữa dòng đo được và nồng độ chất phân tích

Different Electrode Configurations

A và B (thông dụng):Làm tăng u, bề mặt điện cực

luôn được làm sạch

Electrical Conductivity Detector(bulk property detector)

can only detect those substances that ionizeinorganic acids, bases and saltsorganic acids and bases

- Detector sensor cell: a few micro-liters in volume containing two electrodes (platinum, noble metal, stainless steel) two or three millimeters apart - Đầu dò rất nhạy với nhiệt độ nên cần thermostatic control.

mobile phase leaving the column must be removed(passing through short reverse phase column )

only ions of interest enter detector minimal background conductivity.

- Sensitivity of detector (minimum detectable concentration) of about 5 x 10-9 g/ml - Linear dynamic range of about 200 where 0.97 < r < 1.03. - 95% of all analyses involving ion exchange procedures to separate inorganic and organic ions.