DETEKSI CEKAMAN OKSIDATIF AKIBAT TOKSISITAS KROM

85

Deteksi Cekaman Oksidatif Akibat Toksisitas Krom pada Sonchus oleraceus L. (Sri Kasmiyati dan Sucahyo)

ABSTRACT

Increased production of reactive oxygen species or ROS is one of the common responses to a widerange of biotic and abiotic stresses. Increased production of ROS is outstripping endogenousantioxidant defense systems has been referred to as oxidative stress. Heavy metals are known toinitiate ROS generation which is implicated as a oxidative stress. Cr is a toxic heavy metal thatcan generate ROS like H

2O

2 and O

2- which cause oxidative stress. In this study, chromium toxicity

was studied to detect the oxidative stress on Sonchus oleraceus weed plants by the detection ofsuperoxide anion and H

2O

2. Superoxide anion was detected by staining techniques with nitroblue

tetrazolium (NBT) and hydrogen peroxide by Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) staining.Results indicated that the plants were grown in sand media generate the highest (0.89 A/g FWand 3.23 mol/g FW) than in soil media (0.23 A/g FW and 2.11 mol/g FW) superoxide anion (*O-

2)

and H2O

2 and soil containing textile sludge (0.18 A/g FW and 2.66 mol/g FW), respectively. At

application of 10 mg Cr6+/L and 250 mg Cr3+/L, the production of *O-2and H

2O

2 in leaves of

sonchus plants were significantly increased compared with the control plants. The highestproduction of H

2O

2 and *O-

2were showed in the leaves of sonchus plants grown in sand media

with Cr6+ application. In this study, either Cr3+ or Cr6+ caused oxidative stress in Sonchus oleraceusweed plants. The result also showed that sonchus plants esposed to toxic Cr can suffer fromoxidative stress leading to reduction of its fresh and dry plants biomass. NBT and DAB in anappropriate probe and significant value for monitoring the formation of *O-

2 and H

2O

2 in plants.

Keywords: anion superoksida, ROS, deteksi histokima, cekaman oksidatif, H2O

2, Sonchus oleraceus

Diterima 21 Oktober 2014, disetujui 11 November 2014

DETEKSI CEKAMAN OKSIDATIF AKIBAT TOKSISITAS KROMPADASonchus oleraceus L. MELALUI PENENTUAN SPESIES OKSIGEN REAKTIF

SECARA SPEKTROFOTOMETRI DAN HISTOKIMIA

DETECTION OF OXIDATIVE STRESS DUE TO CHROMIUM TOXICITY ONSONCHUS OLERACEUS L. BY SPECTROPHOTOMETRICALLY AND

HISTOCHEMICAL DETERMINATION OF REACTIVE OXYGEN SPECIES

Sri Kasmiyati1) dan Sucahyo1)

PENDAHULUAN

Pencemaran logam berat salah satunya krom dilingkungan akibat pembuangan limbah industri danpenggunaan pupuk serta pestisida sintetis secaraberlebihan akan memberikan dampak terhadapmunculnya cekaman oksidatif terhadap kehidupantanaman. Salah satu logam berat yang bersifattoksik terhadap tanaman adalah krom yang dapat

menimbulkan cekaman oksidatif. Adanya cekamanoksidatif pada tanaman dapat menghambat per-tumbuhan dan perkembangan, menurunkan pro-duktivitas bahkan dapat menyebabkan kematian.Salah satu faktor yang mempengaruhi toksisitaskrom terhadap pertumbuhan tanaman adalahmedia tanam, karena sifat fisik, kimia dan biologidari media tanam mempunyai peran penting dalamproses transformasi Cr dari bentuk toksik menjadi

1)Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga penulis untuk korespondensi, email: [email protected]

AGRIC Vol.26, No. 1 & No.2, Juli - Desember 2014: 85 - 98

86

bebas dalam bentuk species oksigen reaktif (ROS)sebagai hasil samping dari metabolisme aerobyang berlangsung di berbagai kompartemen selulerseperti dinding sel (peroksidase dan poliaminoksidase), sitoplasma, peroksisom (xanthinoksidase), mitokondria dan kloroplas (Kumar dkk.,2014; Vianello dkk., 2007; Malecka dkk., 2009).Pembentukan ion-ion radikal bebas seperti ROSakan mengalami peningkatan apabila tanamanmengalami cekaman baik abiotik maupun biotik.Akumulasi ion radikal bebas dalam bentuk ROSpada konsentrasi tinggi akan merusak komponen-komponen seluler dan makromolekul termasukmembran plasma, asam nukleat dan protein.Pembentukan ROS juga mempunyai fungsisebagai efektor dan regulator dalam proseskematian sel terprogram (Malecka dkk., 2014).Selain itu, pembentukan ROS dalam jumlah sangatbesar pada sel/jaringan tumbuhan juga dapatdijadikan sebagai indikator adanya cekamanoksidatif yang dapat mengancam kelangsungankehidupan tumbuhan.

Logam berat pada umumnya menginduksipembentukan ROS baik secara langsung maupunmelalui reaksi redoks. Krom merupakan logamyang bersifat non-redoks dan tidak terlibat dalamreaksi Fenton, namun dari hasil penelitian Shi danDalal (1989) dilaporkan bahwa Cr dapat berperandalam reaksi Fenton, dibuktikan bahwa Crmemiliki karakter redoks. Berdasarkan hasilpenelitiannya Strile, dkk. (2003) juga dilaporkanbahwa Cr6+dan Cr5+ secara katalitik bersifat aktifdan memiliki kemampuan untuk membentuk ROSseperti radikal hidroksil (OH-). Aktivitas katalitikCr3+ lebih tinggi dalam sistem reaksi Fentondibandingkan dengan logam yang lain seperti Co2+,Cd2+, Zn2+, Mn2+, dan Fe3+, tetapi lebih rendahdibanding Cu2+. Reaktivitas krom dapat disebabkanoleh interaksinya dengan gluthation, NADH danH

2O

2, pembentuk radikal-radikal OH- di dalam

sistem bebas sel (Shi dan Dalal, 1989). Pem-bentukan H

2O

2, OH- dan *O-

2pada kondisi stress

krom telah banyak ditunjukkan pada berbagai jenistumbuhan, dan memunculkan terjadinya stress

oksidatif yang mengakibatkan kerusakan padaDNA, protein dan pigmen, serta menginisiasiterjadinya peroksidasi lipid (Panda dan Patra,2000; Panda, 2003).

Diantara ion-ion radikal bebas yang tergolongdalam ROS, anion superoksida dan H

2O

2

merupakan dua species oksigen reaktif yangpenting sebagai indikator adanya kerusakan atautoksisitas di dalam sel, serta sebagai indikatormunculnya reaksi pertahanan terhadap berbagaikondisi cekaman lingkungan. Oleh karena itu perludikembangkan metode untuk penentuan kadarkedua species oksigen reaktif tersebut. Beberapametode yang telah diterapkan adalah mengguna-kan probe spin superoksida-spesifik seperti assaydengan chemiluminescence, fluorescence danspektrofotometer (Shulaev dan Oliver, 2006).Pengembangan metode deteksi secara langsungROS secara in vivo dengan metode histokimiadapat dilakukan menggunakan ROS tracer dyeyaitu nitroblue tetrazolium (NBT) untuk *O-

2

dan 3,3 Diaminobenzidine (DAB) untuk H2O

2.

NBT dan DAB berfungsi sebagai substratchromogenic, dan hasil reaksi warna yangterbentuk dapat diamati menggunakan mikroskop.Penelitian bertujuan untuk mendeteksi adanyacekaman oksidatif akibat toksisitas krom padagulma Sonchus oleraceus pada media tanamyang berbeda melalui penentuan kadar *O-

2dan

H2O

2 secara spektrofotometri dan histokimia.

METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan secara eksperimentalmenggunakan bahan gulma Sonchus oleraceusyang diperoleh dari daerah Getasan, KabupatenSemarang, adapun penanaman dilakukan meng-gunakan 3 media pertumbuhan meliputi pasirsteril, tanah pertanian, dan tanah mengandunglimbah sludge tekstil yang diperoleh dari salah satuindustri tekstil di Salatiga dengan perbandingan1:1 (tanah:sludge tekstil). Pemberian perlakuankrom dalam dua bentuk spesies Cr6+dalam bentuksenyawa K

2Cr

2O

7dan Cr3+ dalam bentuk senyawa

87


CrCl3 dengan konsentrasi 0 mg Cr/L (sebagai

kontrol), 5 mg Cr/L untuk Cr6+, serta 250 mg Cr/L untuk Cr3+. Perlakuan Cr diberikan sebanyak250 ml dengan konsentrasi sesuai perlakuan padamedia tanam sebanyak 750 mg. Perlakuan Crdilarutkan dalam pupuk cair lengkap dandisiramkan pada media tanam, serta dibiarkanselama 2 hari sebelum ditanami Sonchusoleraceus. Setelah 2 hari, gulma Sonchusoleraceus umur 3 minggu ditanam pada masing-masing media kontrol dan perlakuan Cr.Penanaman dilakukan sampai gulma S. oleraceusberumur ± 3 bulan. Rancangan penelitian yangdigunakan adalah RAK (rancangan acak kelom-pok) faktorial dengan 2 faktor perlakuan Cr danjenis media tanam. Setiap perlakuan dengan 10ulangan, setiap unit percobaan terdiri dari 1 gulmasonchus.

Pengamatan pertumbuhan tanaman berdasarkanpada penentuan biomassa basah dan kering.Akumulasi Cr di dalam tanaman ditentukanmelalui pengukuran kandungan Cr6+ dan Cr total.Kandungan Cr6+ dalam tanaman ditentukansecara spektrofotometris menggunakan metodedifenilkarbasid melalui pembacaan nilai serapanpada panjang gelombang 540 nm (Sharma dkk.,2011), sedangkan Cr total ditentukan dengan AAS(spektrofotometer serapan atom dengan pem-bacaan nilai serapan pada panjang gelombang357,87 nm). Cekaman oksidatif akibat perlakuanCr pada tanaman S. oleraceus ditentukan melaluipengukuran level *O-

2dan H

2O

2yang terbentuk

secara spektrofotometris menggunakan sampelpucuk. Penentuan level H

2O

2 di dalam sel menurut

metode Sergiev (1997) yang digunakan Bouazizidkk. (2007), sedangkan *O-

2dengan metode

Kumar dkk. (2014) dan Malecka dkk. (2014).Deteksi *O-

2 yang terbentuk pada daun dilakukan

secara histokimia menggunakan NBT sebagaisubstrat kromogenik dan hasil reaksi warna yangterbentuk setelah diinkubasi selama 1 jam diamatimenggunakan mikroskop. Data level anionsuperoksida dan H

2O

2 dianalisis menggunakan

analisis sidik ragam (ANOVA) dan dilanjutkan

dengan uji Duncan pada taraf uji 5 persen. Ujikorelasi Pearson dilakukan untuk mengetahuikorelasi antar varibel, sedangkan data histokimiadianalisis secara deskriptif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Biomassa tanaman

Biomassa massa tanaman diukur berdasarkanberat basah dan berat keringnya. Pengukuranberat basah tanaman lebih mudah dilakukan, dapatmenunjukkan aktivitas metabolisme, namun nilainyatidak konstan sebab dipengaruhi kandungan airdalam sel.

Pengukuran pertumbuhan yang lebih akurat adalahdengan mengukur berat kering dengan caradikeringkan pada suhu 80oC selama 3 hari di dalamoven sehingga air yang terkandung dalam tanamanmenguap. Setelah kering didinginkan dan ditimbangberulang sampai diperoleh berat konstan. Jikadibandingkan antara berat kering mula-muladengan berat kering pada selang beberapa waktumaka dapat diketahui ada atau tidaknya per-tumbuhan. Hasil berat kering merupakan keseim-bangan antara fotosintesis dan respirasi.

Perlakuan Cr pada media tanam yang berbedamemberikan pengaruh secara nyata terhadapbiomassa basah dan kering pada akar dan pucukgulma Sonchus (Gambar 1 dan 2). Biomassabasah akar dan pucuk tanaman yang ditumbuhkanpada media pasir mengalami penurunan palingbesar pada perlakuan Cr6+. Pada media tanah dancampuran tanah:sludge tekstil (1:1) tanamansonchus menunjukkan biomassa basah akar danpucuk lebih tinggi dibandingkan yang ditumbuhkanpada media pasir, meskipun sama-sama diberi per-lakuan Cr dalam medianya. Bahkan pada mediacampuran tanah:sludge tekstil yang telah terdeteksimengandung polutan Cr6+ pun masih menunjukkanbiomassa akar dan pucuk lebih tinggi dibandingkanpada pasir. Hal ini menunjukkan bahwa padamedia pasir, toksisitas Cr lebih tinggi dibandingkandalam media tanah dan campuran tanah:sludge


88

tekstil. Kandungan dan komposisi nutrien tanahdan sludge tekstil lebih punya kemampuan menopangpertumbuhan tanaman sonchus dengan adanyaperlakuan Cr. Jumlah nutrien dan kebera-daanmikroorganisme yang bermanfaat bagi tanamandalam media tanah, sludge tekstil, maupuncampuran tanah:sludge tekstil mempunyai peranbesar dalam menekan toksisitas Cr terhadap gulmaS. oleraceus. Dibandingkan dengan pasir yangrelatif bersifat inert (tidak mengandung nutrien),

tanah dan sludge tekstil banyak mengandung nutrienyang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman.Kandungan unsur hara esensial seperti N, P, K,S, Bo, Cu, Zn dan lain-lain banyak ditemukan padamedia tanah dan sludge. Sludge tekstil selainmengandung beberapa jenis logam berat yang ter-golong B

3, dilaporkan mengandung unsur-unsur

yang dibutuhkan oleh tanaman diantaranya nitrogen,fosfor, kalium, dan sulfur dalam jumlah yangsangat besar (Herawati dkk., 2008).

Gambar 1.Efek interaksi antara jenis media tanam dan perlakuan Cr terhadap biomassa basahakar (A) dan pucuk (B) tanaman S. oleraceus

A.

B.

89


Media tanam dan Cr menunjukkan efek interaksiterhadap biomassa kering akar dan pucuk gulmasonchu. Gambar 2 menunjukkan pengaruh nyatakedua perlakuan tersebut terhadap biomassakering tanaman. Pengaruh Cr terhadap biomassakering akar dan pucuk menunjukkan pola yanghampir sama dengan biomassa basah, dimanatanaman sonchus yang ditumbuhkan pada media

pasir mengalami penurunan biomassa kering akardan pucuk paling besar pada perlakuan Cr6+

dibandingkan pada tanah dan campuran tanah:sludgetekstil. Biomassa kering pucuk pada semua per-lakuan Cr mengalami penurunan dibandingkankontrol, baik pada media pasir, tanah maupuncampuran tanah:sludge tekstil.

Gambar 2. Efek interaksi antara jenis media tanam dan perlakuan Cr terhadap biomassakering akar (A) dan pucuk (B) tanaman S. oleraceus

A.

B.


90

Seperti logam berat yang lain, krom yang ter-akumulasi di dalam jaringan tumbuhan ber-pengaruh terhadap pertumbuhan dan aktivitasfisiologis. Menurut Srivastava dan Gupta (1996)toksisitas krom umumnya menghambat pertum-buhan memanjang akar dan tunas, serta meng-induksi terjadinya klorosis pada daun. Sun dan Wu(1998) melaporkan bahwa Ipomoea aquaticaForsk. cv. Bamboo-Leaf mengalami klorosis padaperlakuan Cr6+ sebesar 1,25 ppm. Pada konsen-trasi lebih dari 1,25 ppm (5 dan 10 ppm), tanamanmengalami penghambatan pertumbuhan, akarmengalami nekrosis, daun layu dan jumlah tunasberkurang. Toksisitas krom terhadap tanamansangat ditentukan oleh bentuk species kimia dariunsur tersebut. Krom dalam bentuk Cr6+ bersifatlebih toksik terhadap tanaman dibandingkanbentuk Cr3+. Menurut Gundersen dkk. (1982)fitotoksisitas Cr6+ lebih besar dibanding Cr3+ danpenyerapan (uptake) Cr dari tanah meningkatsejalan dengan peningkatan konsentrasi Cr dalamtanah. Tanaka dkk. (1980) menyatakan bahwapada konsentrasi tertentu Cr6+ lebih membahaya-

kan dibanding Cr3+. Srivastava dkk. (1999)melaporkan bahwa pada dosis sebesar 150-300mg/ml, Cr6+ lebih toksik terhadap Allium cepadibanding Cr3+. Efek toksik krom terhadaptumbuhan tidak lepas dari akumulasi logam beratini di dalam jaringan.

Kandungan Cr6+ dan Cr total

Akumulasi Cr6+ dan Cr total di dalam jaringantanaman sonchus diukur untuk mengetahui se-berapa besar kemampuannya menyerap, mento-leransi dan mentraslokasi Cr yang diserap kebagian tanaman. Akumulasi Cr6+ di dalam jaringan/organ tanaman dapat juga menjadi indikatorkemampuan suatu tanaman untuk mendetoksifi-kasi logam Cr, karena apabila tanaman terdeteksimengakumulasi Cr6+ dalam tubuhnya dan tidakmengalami gangguan pertumbuhan, hal ini me-nunjukkan bahwa tanaman memiliki kemampuanuntuk medetoksifikasi atau mentoleransi logamCr6+ tersebut.

Gambar 3. Efek interaksi antara jenis media tanam dan perlakuan Cr terhadap konsentrasi Cr6+

dalam akar dan daun S. oleraceus

91


Gambar 3 menunjukkan bahwa perlakuan Cr danmedia tanam pada S. oleraceus memberikanpengaruh nyata terhadap akumulasi Cr6+ pada akardan pucuk. Akumulasi Cr6+ lebih banyakterdeteksi di bagian pucuk dibanding di dalam akar,terutama pada S. oleraceus yang ditumbuhkandalam media tanah dan campuran tanah:sludgetekstil. Sonchus yang ditumbuhkan pada mediapasir menunjukkan akumulasi Cr6+ lebih kecildibandingkan yang ditumbuhkan pada mediatanah dan campuran tanah:sludge tekstil terutamayang diberi perlakuan Cr6+. Rendahnya akumulasiCr6+ pada pucuk S. oleraceus yang ditanam padamedia pasir mengandung Cr6+ disebabkan olehketidakmampuan akar untuk mentoleransitoksisitas Cr6+, hal ini ditunjukkan dengan palingrendahnya biomassa basah dan kering dari akardan lebih lanjut berdampak pada biomassa pucuk.Selain itu, dengan aktifnya sistem antioksidan padatanaman sonchus yang ditanam pada media pasiruntuk merespon cekaman toksisitas Cr6+ jugadapat menghambat terjadinya translokasi Cr6+ kebagian pucuk. Hal ini ditunjukkan daun sonchusyang ditumbuhkan pada media pasir, cenderunglebih tinggi dibanding pada media tanah dancampuran tanah:sludge tekstil.

Berbeda dengan pola akumulasi Cr6+, akumulasiCr total dalam akar tanaman paling tinggi ditunjuk-kan pada tanaman yang ditumbuhkan pada mediapasir yang diberi perlakuan Cr3+ dan Cr6+

(Gambar 4). Hasil ini juga mendukung rendahnyaakumulasi Cr6+ di bagian pucuk dari tanamansonchus yang ditanam pada media pasir.

Terdeteksinya Cr6+ dalam akar dan pucuk tanamansonchus yang ditumbuhkan pada media pasir,menunjukkan bahwa meskipun Cr3+ dianggapkurang toksik dibanding Cr6+, namun di dalammedia dapat mengalami transformasi menjadi Cr6+

yang bersifat toksik. Reaksi oksidasi Cr di dalamtanah dan perairan alami tergantung padakeberadaan senyawa oksidan. Senyawa oksidanutama yang terdapat di dalam tanah yang dapatmengoksidasi Cr3+ menjadi Cr6+ adalah Mnoksida. Oksidasi Cr3+ menjadi Cr6+ mempunyaidampak yang tidak menguntungkan bagilingkungan. Proses oksidasi akan mengubah kromdari bentuk tidak larut, tidak toksik dan tidakberbahaya (Cr3+) menjadi bentuk krom yangterlarut, toksik dan berbahaya (Cr6+). James danBartlett (1983) melaporkan bahwa peningkatanpenyerapan krom oleh tanaman kacang kapri yangdiberi perlakuan Cr6+, disebabkan adanya

Gambar 4. Efek interaksi antara jenis media tanam dan perlakuan Cr terhadap konsentrasiCr total dalam akar dan daun S. oleraceus


92

peningkatan kelarutan Cr (OH)3 oleh sitrat dalam

tanah yang meningkatkan laju oksidasi Cr3+

menjadi Cr6+ oleh oksida mangan dalam tanah.

Deteksi dan penentuan radikal bebas

Spesies oksigen reaktif (ROS) umumnya dihasil-kan oleh sel melalui lintasan metabolisme aerobikdan merupakan respon terhadap berbagai cekamanabiotik maupun biotik. Berbagai spesies oksigenreaktif yang terbentuk sebagai salah satu ter-hadap adanya cekaman abiotik dan biotik antaralain *O-

2, H

2O

2, OH-, *OH, dan oksigen singlet

(1O2). Pembentukan ROS di dalam sel tumbuhan

mempunyai dua fungsi utama yaitu (1) sebagaisignal intrinsik untuk proses-proses pertumbuhandan perkembangan dan (2) sebagai molekul signaluntuk merespon adanya kondisi cekaman. *O-

2

dan H2O

2 merupakan spesies oksigen reaktif yang

dapat dijadikan sebagai indikator adanya kerusakansel atau toksisitas serta munculnya reaksi per-tahanan terhadap berbagai kondisi cekaman padatumbuhan.

Pada penelitian ini ditentukan dua spesies oksigenreaktif yaitu *O-

2 dan hidrogen H

2O

2 untuk

mendeteksi terjadinya toksisitas dan munculnyareaksi pertahanan terhadap cekaman perlakuanCr pada tanaman S. oleraceus. Salah satu

Tabel 1. Level *O-2 dan H

2O

2 daun S. oleraceus pada perlakuan Cr dan media tanam

Level anion superoksida (*O-2) (Aλ580/g BB)

Perlakuan Pasir Tanah Tanah:Sludge(1:1) Rata-rata

Kontrol 0.18 ± 0.018 cd 0.21 ± 0.028 c 0.09 ± 0.010 d 0.16 ± 0.038 C

CrCl3 250 mg Cr3+/L 0.53 ± 0.061 b 0.25 ± 0.023 c 0.21 ± 0.028 c 0.33 ± 0.100 B

K2Cr2O7 10 mg Cr6+/L 1.96 ± 0.059 a 0.22 ± 0.026 cd 0.25 ± 0.023 c 0.81 ± 0.575 A

Rata-rata 0.89 ± 0.542 A 0.23 ± 0.013 B 0.18 ± 0.048 B

Level H2O2 (µmol/g BB)

Perlakuan Pasir Tanah Tanah:Sludge(1:1) Rata-rata

CrCl3 250 mg Cr3+/L 1.80 ± 0.208 e 2.36 ± 0.092 c 2.20 ± 0.176 d 2.12 ± 0.167 C

K2Cr2O7 10 mg Cr6+/L 3.31 ± 0.331 b 2.07 ± 0.184 c 2.87 ± 0.089 c 2.75 ± 0.364 B

CrCl3 250 mg Cr3+/L 4.58 ± 0.212 a 1.89 ± 0.239 cd 2.90 ± 0.161 c 3.12 ± 0.787 A

Rata-rata 3.23 ± 0.804 A 2.11 ± 0.139 C 2.66 ± 0.277 B

pengaruh cekaman logam berat terhadap tumbuhanadalah menyebabkan terjadinya cekaman oksidatif,dan logam berat Cr merupakan salah satu logamyang bersifat redoks aktif dan dapat memacumunculnya cekaman oksidatif pada sel tumbuhan.Berdasarkan hasil penentuan level H

2O

2 dan *O-

2

ditunjukkan bahwa jenis media tanam danperlakuan Cr (Cr6+ 10 ppm dan Cr3+ 250 ppm)mempengaruhi level kedua spesies oksigen reaktiftersebut (Tabel 1). Tanaman S. oleraceus yangditumbuhkan pada media pasir memproduksi *O-

2

dan H2O

2 lebih tinggi berturut-turut (0.89 Aë

580/g

BB dan 3.23 µmol/g BB) dibandingkan padamedia tanah (0.23 Aë

580/g BB dan 2.11 µmol/g

BB) dan tanah mengandung sludge tekstil (0.18Aë

580/g BB dan 2.66 µmol/g BB).

Penambahan Cr6+ sebesar 10 mg Cr6+/L danCr3+ sebesar 250 mg Cr3+/L meningkatkansecara nyata pembentukan *O-

2dan H

2O

2 dalam

daun S. oleraceus dibandingkan dengan kontrol(tanpa perlakuan Cr). Hasil ini menunjukkanbahwa penambahan Cr dalam media tanammemberikan kondisi cekaman terhadap per-tumbuhan S. oleraceus sehingga spesiesoksigen reaktif (*O-

2dan H

2O

2) dibentuk sebagai

signal untuk memunculkan reaksi pertahananantioksidatif. Pengaktifan sistem pertahananantioksidatif dilakukan melalui pembentukan

93


kandungan antioksidan dan pengaktifan enzimantioksidatif dalam daun.

Gambar 5. Deteksi histokimia lokasi pembentukan *O-2pada jaringan daun S. oleraceus yang ditanam

pada media pasir (A. kontrol, B. Cr3+ 250 mg Cr3+/L, dan C. Cr6+ 10 mg Cr6+/L), tanah:sludgetekstil (1:1) (D. kontrol, E. Cr3+ 250 mg Cr3+/L, dan F. Cr6+ 10 mg Cr6+/L) dan tanah (G.kontrol, H. Cr3+ 250 mg Cr3+/L, dan I. Cr6+ 10 mg Cr6+/L). Tanda panah menunjukkan daerahreaksi positif dengan NBT (terjadi pembentukan *O-

2)

Pengaruh interaksi antar perlakuan terhadap level*O-

2dan H

2O

2 daun terlihat nyata hanya pada

penambahan Cr6+ sebesar 10 mg Cr6+/L baikpada media pasir, tanah maupun tanah mengan-dung sludge tekstil. Deteksi keberadaan *O-

2

dilakukan dengan reaksi histokimia menggunakansenyawa NBT (nitrotetrazolium blue chloride)sebagai substrat kromogenik. Teknik ini dapatditerapkan secara langsung untuk mendeteksipembentukan *O-

2 dalam jaringan, sel maupun

subseluler secara in vivo dan dideteksi secaramikroskopis. NBT akan bereaksi dengan *O-

2

endogen membentuk senyawa formazan tak

larut yang berwarna biru keunguan. Hasil deteksihistokimia *O-

2dalam jaringan daun S. oleraceus

pada perlakuan Cr dan media tanam ditunjukkanpada Gambar 5.

Berdasarkan hasil deteksi histokimia *O-2dalam

daun S. oleraceus menggunakan NBT, ditun-jukkan bahwa daun dari tanaman yang ditum-buhkan pada media pasir dan campuran tanah:sludgetekstil (1:1) yang diberi perlakuan Cr (Cr3+

maupun Cr6+) memberikan reaksi positif yanglebih tinggi dibandingkan pada tanah. Reaksipositif ditunjukkan oleh terbentuknya bercak-bercak biru-ungu (senyawa formazan tidak larut)sebagai akibat reaksi NBT dengan *O-

2. Ling-

karan biru yang terdapat tepi irisan daun sebelah


94

luar baik pada kontrol dan perlakuan Cr untukketiga jenis media tanam menunjukkan terben-tuknya *O-

2sebagai respon terhadap pelukaaan

saat pengirisan daun. Bercak biru gelap pada daunS. oleraceus belum terlihat jelas, diduga NBTyang digunakan kurang konsentrasinya ataukurang lama meredamnya sehingga reaksi oksidasiNBT oleh *O-

2belum sering terjadi. Menurut Lin

dkk. (2009) NBT dalam merupakan probe yangsesuai dan bernilai penting untuk memonitoringpembentukan O

2- pada tumbuhan.

Selain *O-2, deteksi H

2O

2 dalam jaringan/organ

juga dapat dilakukan dengan menggunakan pe-warna DAB sebagai probe dye-nya. MenurutKumar dkk. (2014) DAB akan dioksidasi olehH

2O

2 oleh adanya enzim peroksidase dan akan

menghasilkan warna coklat kemerahan (Gambar 6).

Gambar 6. Deteksi akumulasi H2O

2 (a) dan *O-

2(b) pada kecambah

Brassica juncea yang diberi perlakuan cekaman salinitas200 mM NaCl selama 3 hari. Kecambah yang ditumbuhkandalam media air digunakan sebagai kontrol (Kumar dkk., 2014)

Di dalam penelitian ini deteksi H2O

2 hanya

dilakukan melalui pengukuran secara spektro-fotometris jumlah H

2O

2 yang terbentuk di dalam

daun. H2O

2 dan *O-

2merupakan dua spesies

oksigen reaktif yang dapat digunakan sebagaiindikator adanya kerusakan atau toksisitas didalam sel, serta sebagai indikator munculnyareaksi pertahanan terhadap berbagai kondisicekaman lingkungan. Deteksi histokimia aku-mulasi H

2O

2 dan *O-

2menggunakan probe dye

DAB dan NBT pada jaringan tumbuhan sangatberpotensi dikembangkan untuk memonitoringterjadinya cekaman oksidatif pada tumbuhan baikyang diakibatkan oleh adanya cekaman abiotikmaupun biotik.

Metode deteksi histokimia ini dapat diterapkanpada semua jenis tumbuhan mulai pada tingkat

95


sel, jaringan maupun organ. Deteksi pembentukan*O-

2menggunakan NBT assay telah dilakukan

pada sel tunggal tembakau yang mengalamirespon hipersensitif (Adam dkk. 1989), pada daunArabidopsis yang diberi cekaman cahaya (Fryerdkk. 2002), pada daun tembakau yang dibericekaman ozon (Schraudner dkk., 1998), dan padadaun Pisum sativum yang diberi cekaman salinitas(Hernandez dkk. 2001). Malecka dkk. (2014)melaporkan juga penggunaan NBT assay untukmendeteksi pembentukan *O-

2pada akar Pisum

sativum yang diberi perlakuan kombinasicekaman 2 logam berat (Cu, Zn, Cd dan Pb). Lindkk. (2009) melaporkan penggunaan deteksihistokimia (NBT assay) untuk pengukuran *O-

2

secara lokalisasi in situ pada daun Alocasiamacrorrhiza yang diberi perlakuan berbagaifaktor stress antara lain fotooksidan (methylviologen dan riboflavin), polutan (sodium bisulfit,logam berat Pb dan Cd), serta kekeringan (PEG6000).

Korelasi antara Akumulasi Cr denganPertum-buhan dan Terbentuknya RadikalBebas

Analisis korelasi dilakukan untuk mengetahuisignifikansi hubungan antara parameter akumulasilogam berat Cr dalam media dan jaringan tanamansonchus dengan pertumbuhan dan pembentukanradikal bebas (H

2O

2 dan *O-

2) di bagian daun

tanaman. Berdasarkan hasil analisis korelasiPearson’s pada Tabel 2 ditunjukkan bahwakandungan Cr6+ dan Cr total dalam akar dan daunmenunjukan korelasi dengan pertumbuhan danpembentukan radikal bebas (H

2O

2 dan *O-

2).

Akumulasi Cr6+ dan Cr total di dalam akarberkorelasi positif dengan terbentuknya radikalbebas H

2O

2, sebaliknya akumulasi Cr (Cr6+ dan

total) di dalam pucuk berkorelasi negatif denganradikal bebas H

2O

2. Pembentukan *O-

2ber-

korelasi negatif dengan akumulasi Cr6+ baik di

Keterangan: H2O2 (konsentrasi H2O

2), *O-

2 (level anion superoksida), Cr6A (konsentrasi Cr6+ pada akar), Cr6P (konsentrasi

Cr6+ pada pucuk), CrTA (konsentrasi Cr total pada akar), CrTP (konsentrasi Cr total pada pucuk), BBA (Beratbasah akar), BBP (Berat basah pucuk), BKA (Berat kering akar), BKP (Berat kering pucuk).** Korelasi signifikan pada tingkat signifikansi 1%* Korelasi signifikan pada tingkat signifikansi 5%Listwise N= 45

Tabel 2. Korelasi (Pearson’s) antara akumulasi Cr dengan pertumbuhan dan terbentuknya radikalbebas pada gulma sonchus

H2O2 *O-2 Cr6A Cr6P CrTA CrTP BBA BBP BKA BKP

H2O2

1,000

*O-2 0,779** 1,000

Cr6A 0,069 -0,038 1,000

Cr6P -0,301* -0,572**

0,302* 1,000

CrTA

0,598** 0,402** 0,175 -0,057 1,000

CrTP -0,130 -0,280 0,084 0,393*

*0,210 1,000

BBA -0,269 -0,453**

0,791*

*0,373* 0,046 0,048 1,000

BBP -0,618**

-0,711**

0,271 0,541*

*-0,600**

-0,059

0,529*

*1,000

BKA -0,122 -0,276 0,633*

*0,151 0,018 0,002 0,714*

*0,416*

*1,000

BKP -0,566**

-0,650**

0,164 0,369* -0,572**

-0,059

0,521*

*0,868*

*0,501*

*1,000


96

dalam akar dan pucuk, serta Cr total dalam pucuk.Korelasi positif dijumpai antara akumulasi Cr totaldi dalam pucuk dengan *O-

2. Adanya korelasi baik

positif maupun negatif antara akumulasi Cr6+ danCr total di dalam akar dan pucuk gulma sonchusmenunjukkan bahwa Cr dalam organ tanamanpunya efek besar dalam memunculkan terjadinyastress oksidatif pada tanaman. Stress oksidatifakibat terbentuknya radikal bebas ini, selanjutnyaberdampak negatif terhadap pertumbuhan tanam-an, semakin tinggi radikal bebas terbentuk akansemakin menurunkan biomassa tanaman. Hal inididukung oleh hasil analisis korelasi Pearson yangmenunjukkan bahwa ada korelasi negatif antarapembentukan radikal bebas baik dalam bentuk *O-

2maupun H

2O

2 dengan biomassa basah dan

kering tanaman.

Akumulasi Cr6+ dalam akar dan pucuk berkorelasipositif terhadap berat basah dan berat keringtanaman (akar dan pucuk), hal ini menunjukkanbahwa semakin besar akumulasi Cr6+ di dalamakar dan daun, biomassa basah dan kering akarserta pucuk semakin meningkat pula. Peningkatanbiomassa diduga sebagai salah satu strategi untukdapat bertahan hidup dan mentoleransi toksisitasCr. Akumulasi Cr total dalam akar dan pucukberkorelasi positif dengan biomassa basah dankering akar, namun berkorelasi negatif denganbiomassa basah dan kering bagian pucuk.Banyaknya akumulasi Cr total di dalam akar danpucuk akan meningkatkan biomassa baik keringmaupun basah bagian akar tanaman, hal inibertujuan agar tanaman mampu bertahan hidup.Korelasi negatif secara nyata hanya ditunjukkanantara akumulasi Cr total akar dengan berat basahdan kering pucuk. Hasil ini menunjukkan bahwapenurunan pertumbuhan bagian pucuk gulmaSonchus secara nyata ditentukan oleh toksisitasCr dalam akar. Akumulasi Cr di dalam akar akanmempengaruhi pertumbuhan tanaman secarakeseluruhan apabila tidak ada proses detoksifikasi.Menurut Cobbett (2000) dan Liu & Kottke (2003)pada umumnya sel-sel tanaman merespon stresslogam berat menggunakan berbagai mekanisme

pertahanan, di antaranya eksklusi, immobilisasi,khelasi, dan kompartementalisasi ion logam.Tanaman memiliki kemampuan untuk mencegahion logam masuk secara berlebihan ke dalamsitosol dan mampu melokalisasi ion logam tersebutpada daerah tertentu. Kompartementasi ion didalam vakuola merupakan mekanisme yangberperan penting dalam proses detoksifikasi dantoleransi terhadap ion logam. Pada gulmaSonchus diduga mekanisme detoksifikasi Crmelalui khelasi oleh senyawa antioksidan sepertiglutathion atau senyawa thiol serta dengankompartementasi di dalam akar dan daun.

KESIMPULAN

Akumulasi Cr baik dalam bentuk Cr trivalenmaupun heksavalen dapat menyebabkan terjadinyacekaman oksidatif pada tanaman sonchus baikyang ditumbuhkan pada media pasir, tanahmaupun campuran tanah:sludge tekstil, hal iniditunjukkan dengan terdeteksinya peningkatanpembentukan H

2O

2 dan *O-

2 pada daun gulma

yang diberi perlakuan Cr. Pembentukan H2O

2

dan *O-2paling tinggi dijumpai pada daun gulma

S. oleraceus yang ditumbuhkan pada media pasirdengan perlakuan Cr6+. Akumulasi Cr6+ dan Crtotal di dalam akar dan pucuk menunjukkankorelasi dengan pembentukan radikal bebas H

2O

2

dan *O-2 pada daun gulma Sonchus. NBT

merupakan probe yang dapat digunakan untukmemonitoring pembentukan *O-

2 pada daun

gulma S. oleraceus. Stress oksidatif akibattoksisitas Cr mempengaruhi secara nyatabiomassa kering dan basah tanaman Sonchus.Perbedaan jenis media tanam mempengaruhicekaman oksidatif yang ditimbulkan oleh Cr padagulma Sonchus, terutama dalam hal pembentukanH

2O

2 dan *O-

2. Cekaman oksidatif paling tinggi

dijumpai pada gulma Sonchus yang ditumbuhkanpada media pasir steril.

97


UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian dan publikasi hasil penelitian initerlaksana atas bantuan pendanaan DIKTI melaluiprogram Hibah Bersaing Tahun 2014.

DAFTAR PUSTAKA

Adam, A., Farkas, T., Somlyai, G., Hevesi, M.,and Kiraly, Z. 1989. Consequence of O

2

generation during bacterialy inducedhypersensitive reaction in tobacco:deterioration of membrane lipids.Physiol. Mol. Plant Pathol. 34:13-26

Bouazizi, H., Jouili, H., and Ferjani, E.E. 2007.Effects of copper excess on growth, H

2O

2

production and peroxidase activities inmaize seedling (Zea mays). PakistanJournal of Biological Sciences. No.10, Vol.5:751-756. ISSN 1028-8880

Cobbett, C. S. 2000. Phytochelatins and theirroles in heavy metal detoxification. PlantPhysiology 123: 825–832.

Fryer, M.J., Oxborough, K., Mullineaux, P.M., andbaker, N.R. 2002. Imaging of photo-oxidative stress responses in leaves. J.Exp. Bot. 53:1249-1254

Gundersen, P., C.B. Gunse and J. Barcelo, 1982.Phytotoxicological Effects of Chromiumin Soil. Nordisk Jordbrugsforskning 64:4, 481.

Herawati, M.M, S. Kasmiyati., S., dan E.B.E.Kristiani, 2008. Pengelolaan Limbah PadatTekstil dengan metode Pengomposan danFitoremediasi. Laporan Hasil PenelitianProgram Penelitian Teknologi TepatTerpadu, Dinas Pendidikan dan KebudayaanProvinsi Jawa Tengah (tidak dipublikasikan).

Hernandez, J.A., Ferrer, M.A., Jimenez, A.,Barcelo, A.R., and Sevilla, F. 2001.Antioxidant systems and O

2-/H

2O

2

production in apoplast of pea leaves. PlantPhysiol. 127:817-831.

James, B. R. and R. J. Bartlett. 1983. Behaviorof chromium in soils: V. Fate of organicallycomplexed Cr(II) added to soil. J. Environ.Qual. 12:169-172.

Kumar, D., Yusuf, M.A., Singh, P., Sardar, M.And Sarin, N.B. 2014. Histochemicaldetection of superoxide and H

2O

2

accumulation in Brassica juncea seedlings.http://www.bio-protocol.org/. 12 Juli 2014

Lin, Z.F., Liu, N., Lin, G.Z. and Peng, C.L. 2009.In situ localisation of superoxide generatedin leaves of Alocasia macrorrhiza (L.)Shott under various stresses. J.Plant Biol.52:340-347. DOI 10.1007/s12374-009-9044-8.

Liu, D. and Kottke, I. 2003. Subcellularlocalization of chromium and nickel in rootcells of Allium cepa by EELS and ESI.Cell Biology and Toxicology 19: 299-311

Malecka, A., Piechalak, A., Zielinska, B.,Kutrowska, A., and Tomaszewska, B.2014. Response of the pea roots defensesystems to the two-element combinations ofmetals (Cu, Zn, Cd, Pb). Acta BiochimicaPolonica. No. 1, Vol. 61:23-28. Online at:www.actabp.pl

_____, Derba-Marceluch, A., Kaczorowska, M.,Piechalak, A ., and Tomaszewska, B. 2009.ROS production and antioxidativedefense system in pea root cells treatedwith lead ions. Part 2. Mitochondrial andperoxisomal level. Acta Physiol. Plant.31:1065-1075

Panda S.K. and Patra, H.K. 2000. Does Cr(III)produces oxidative damage in excisedwheat leaves. J. Plant Biol. 27(2):105-110

_____. 2003. Heavy metal phytotoxicity inducesoxidative stress in Taxithelium sp. Curr.Sci. 84: 631–633


98

Schraudner, M., Moeder, W., Wiese, C., vanCamp, W., Inze, D., Langebartels, C., andSandermann, H. Jr. 1998. Ozone-inducedoxidative burst in the ozone biomonitorplant, tobacco Bel W3. Plant J. 16:235-245.

Shulaev, V. and Oliver D.J. 2006. Metabolic andproteomic markers for oxidative stress.New tools for reactive oxygen speciesresearch. Plant Physiol. 141:367-372.

Srivastava, P.C. and U.C. Gupta, 1996. TraceElements In Crop Production. SciencePublisher Inc. USA. pp. 226-230.

Srivastava, S., S. Prakash and M.M. Srivastava,1999. Chromium Mobilization and PlantAvailability – The Impact of OrganicComplexing Ligands. Plant and Soil 212:203-208.

Sun, E. and Wu, F. 1998. Along-vein Necrosisas Indicator Symptom on Water SpinachCaused by Nickel in Water Culture. Bot.Bull. Acad. Sin. 39:255-259.

Tanaka, A., T. Tadano and O. Hayakawa, 1980.Comparison of Adaptability to HeavyMetals among Crop Plants (V)Adaptability to Chromium-Studies onComparative Plant Nutrition. Journal ofthe Science of Soil and Manure, Japan 51:2,113-118.

Vianello, A., Zancani, M., Peresson, C., Petrussa,E., Casolo, V., Krajnakova, J., Patui, S.,Braidot, E., and Marci, F. 2007. Plantmitochondrial pathway leading toprogrammed cell death. Physiol. Plant129:242-252.

***

Documents

DETEKSI CEKAMAN OKSIDATIF AKIBAT TOKSISITAS KROM