Upload
anantya-firda-athiana
View
13
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Deteksi DNA dan Protein
Deteksi DNADeteksi DNA (Elektroforesis gel agarosa)• Prinsip : migrasi partikel DNA pada medan
listrik• Pemisahan berdasarkan ukuran (massa
molekul) DNA atau compactness• Gel Agarosa digunakan sebagai media
pergerakan (running) DNA
gumilar
Parameter yang mempengaruhilaju migrasi DNA• Ukuran molekul : Mr ∼ 1/log (Mw) g ( )• Konsentrasi agarosa : log (Mr) ∼ 1/[gel]• Konformasi DNA :
l d i l DNA (f I) t i ll– closed circular DNA (form-I) - typically supercoiled (plg cepat)
– nicked circular (form-II) – linear DNA (form-III) (plg lambat)
• Voltase yang diterapkan (biasanya 5 volt per cm panjang gel
gumilar
panjang gel
Komponen elektroforesis gel agarosa• Sampel DNA
A ( l) li k id k l k di k t k• Agarosa (gel): polisakarida komplek yang diekstrakdari rumput laut. Konsentrasi: 0.5 sd 2%
• Etbr : agen pengkhelat DNAEtbr : agen pengkhelat DNA• Loading buffer, mengandung pemberat ex : gliserol• Running Buffer: memfasilitasi hantaran arus,
biasanya TAE atau TBE• Marker (penanda DNA)
gumilar
PerlengkapanPerlengkapan •Alat elektroforesis (chamber)( )
•Power suppy
•Gel casting trays
•Transilluminator (an ultraviolet lightbox),
gumilar
Prosedur elektroforesisProsedur elektroforesis• Simpan gel pada alat elektroforesis, lalu
tuangkan buffertuangkan buffer• Mix sampel dengan loading buffer, lalu
masukkan ke ‘sumur’ yang ada pada gel (hal y g p g (yg sama dilakukan untuk marker)
• Set voltase • Running • Periksa dibawah lampu uv
gumilar
p
Contoh hasil elektroforesis
Deteksi Protein
gumilar
PAGEPAGE• PolyAcrylamide Gel Electrophoresis• Cara termudah untuk menguji kemurnian protein• Pada PAGE protein dijaga dalam bentuk native dan
ktifaktif• Pemisahan didasarkan pada muatan dan ukuran
proteinprotein
gumilar
A lik i PAGEAplikasi PAGE• PAGE sangat sensitif thd proses-proses yangPAGE sangat sensitif thd proses proses yang
mempengaruhi konformasi dan muatan dari protein. Sehingga native PAGE dapat dimanfaatkan sbg alat
t k d t k iuntuk mendeteksi:– Perubahan muatan akibat degradasi kimia (ex: deaminasi)– Unfolded atau peristiwa perubahan konformasi lainnya– Oligomer atau agregat– Binding event (protein-protein atau protein ligan)
gumilar
SDS PAGESDS-PAGE• SDS:
• Protein terdenaturasi selama proseselektroforesis
gumilar• Pemisahan berdasarkan ukuran (BM)
Penentuan berat molekul protein dengan SDS-PAGE