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TÂNIA MARIA DA SILVA LIMA
DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL, TOXICIDADE, BIODEGRADABILIDADE E EFICÁCIA DE BIOSSURFACTANTES NA REMOÇÃO DE FENANTRENO E
CÁDMIO DE SOLO
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL JUNHO - 2008
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE CATALOGAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DA BIBLIOTECA CENTRAL DA UFV
TÂNIA MARIA DA SILVA LIMA
DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL, TOXICIDADE, BIODEGRADABILIDADE E EFICÁCIA DE BIOSSURFACTANTES NA REMOÇÃO DE FENANTRENO E CÁDMIO DE SOLO
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Doctor Scientiae.
APROVADA: 21 de fevereiro de 2008.
Profª Márcia Nitschke Universidade Estadual de São Paulo (USP)
Prof. Elson Santiago de Alvarenga Universidade federal de Viçosa (UFV)
(Co-orientador)
Prof. Arnaldo Chaer Borges Universidade federal de Viçosa (UFV)
(Co-orientador)
Prof. Antônio Nascimento Galvão Universidade federal de Viçosa (UFV)
(Co-orientador)
Prof. Marcos Rogério Tótola Universidade federal de Viçosa (UFV)
(Orientador)
i
Agradeço a Deus, por me permitir alcançar uma conquista a mais na minha carreira. Dedico: Aos meus pais Vicente (in memorium) e Maria, aos meus irmãos e aos meus sobrinhos, que compartilham os meus ideais e os alimentam, incentivando-me a prosseguir quaisquer que sejam os obstáculos. A Lorena Procópio, não só pela grande ajuda e colaboração no desenvolvimento deste trabalho, mas também pelo carinho, compreensão e principalmente por sua grande amizade. Minha eterna gratidão e reconhecimento de que nos méritos desta conquista há muito de sua presença.
Obrigada.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois não houve um só momento em minha vida que me sentisse abandonada por
ele.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Microbiologia, pela oportunidade
de realização do curso.
Ao Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da
bolsa de estudos.
Ao professor Marcos Rogério Tótola, meu orientador, cujos valiosos ensinamentos
transmitidos, a paciência, a dedicação e o apoio foram fundamentais para a transposição desta
etapa de minha vida.
Aos professores, Arnaldo Chaer Borges e Mauricio Dutra Costa, pelo apoio e ajuda que
nunca me foram negados.
Às professoras Maria Catarina Megumi Kasuya e Elza Fernandes de Araújo, pelos
aconselhamentos e por serem tão amigas e prestativas.
Ao professor Elson S. de Alvarenga pelo importante auxílio e prestabilidade.
A todos os professores do Departamento de Microbiologia Agrícola, pelos ensinamentos
que me ajudaram, direta ou indiretamente, na conclusão deste trabalho.
Ao professor Antônio Galvão por nunca ter me deixado desistir.
A todos os funcionários do BIOAGRO, pela amizade e ajuda no bom funcionamento do
laboratório.
A todos os colegas do laboratório, pela ajuda na parte experimental para a conclusão deste
trabalho.
Ao André Carvalho por sua amizade e fundamental ajuda nas análises estatísticas.
À Lorena Procópio e ao Felipe Brandão, pela ajuda na condução dos experimentos,
amizade, compreensão, pelo apoio e pela força nos momentos difíceis.
Ao Marcelo Rodrigues pelo amor incondicional.
À minha mãe Maria Lima, pelo imenso amor dedicado e pelo apoio incansável.
Aos meus irmãos e sobrinhos, por alegrarem a minha vida com sua existência.
iii
À minha grande amiga, Bruna, que me motivou, para que minha fragilidade humana não me
fizesse desistir.
À Cássia Fernandes, Rose e Adélia pela amizade, paciência, compreensão e apoio nos
melhores e maus momentos que tive nessa etapa da minha vida.
A todos os colegas do curso, pela amizade, pelos momentos de descontração e pela ajuda
nos momentos mais críticos.
Aos verdadeiros amigos que aqui encontrei: Antônio Galvão, Péricles Fernandes, Patrícia
Pimentel, Patrícia Leal, Maike Rosmman, Fabiane Mesquita, André Carvalho, Irene e Marcela Reis.
iv
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS .............................................................................................. vii LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... viii RESUMO GERAL ................................................................................................... xi INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................... 1
CAPÍTULO 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1. SURFACTANTES: TIPOS, ESTRUTURAS E PROPRIEDADES ..................... 4 1.1.1. Tensão superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) ............................ 5 1.1.2. Emulsões e Surfactantes............................................................................... 10 1.1.3. Balanço Hidrofílico/Lipofílico (HLB) ............................................................... 11 1.1.4. Estabilidade de Uma Emulsão....................................................................... 13 1.2.BIOSSURFACTANTES: CLASSIFICAÇÃO E ORIGEM MICROBIANA ............ 13 1.2.1. Glicolipídeos .................................................................................................. 15 1.2.2. Lipopeptídeos e Lipoproteínas....................................................................... 17 1.2.3. Ácidos graxos, fosfolipídeos e lipídeos neutros ............................................. 19 1.2.4. Biossurfactantes Poliméricos......................................................................... 20 1.2.5. Biossurfactantes Particulados........................................................................ 21 1.3. PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES......................................................... 21 1.4. RECUPERAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE BIOSSURFACTANTES 23 1.5. BIODEGRADABILIDADE E TOXICIDADE DE BIOSSURFACTANTES ........... 25 1.5.1. Biodegradação............................................................................................... 25 1.5.2. Efeitos tóxicos................................................................................................ 28 1.6. APLICAÇÃO DE SURFACTANTES NA REMOÇÃO DE METAIS PESADOS E
HIDROCARBONETOS POLIAROMÁTICOS (PAH’s) ..................................... 30 1.6.1. Agentes de Remediação para Metais Pesados ............................................. 32 1.6.2. Agentes de Remediação para Hidrocarbonetos Poliaromáticos (PAH’s)....... 33 1.6.3. Mecanismos de Remoção por Surfactantes .................................................. 34 1.6.4. Complexação de Metais na Solução de Surfactante-ligante.......................... 35 1.6.5. Aplicações de complexo Surfactante-ligante ................................................. 36 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 38
CAPÍTULO 2. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FÍSICO-QUÍMICA DE SURFACTANTES BACTERIANOS
2.1. RESUMO.......................................................................................................... 50 2.2. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 52 2.3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 54 2.3.1. Microrganismos ............................................................................................. 54 2.3.2. Condições de Cultivo e Produção dos Biossurfactantes................................ 54 2.3.3. Extração e Purificação dos Biossurfactantes................................................. 55 2.3.4. Análise da Composição Química dos Biossurfactantes................................. 56 2.3.4.1. Espectroscopia de Infravermelho (FT-IR) ................................................... 56
v
2.3.4.2. Espectrometria de Massa - Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz com Tempo de Vôo- (MALDI-TOF-MS)................................................ 56
2.3.4.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ...................... 56 2.3.5. Interpretação dos Dados Espectrométricos e Espectroscópicos ................... 56 2.3.6. Caracterização Físico-Química dos Biossurfactantes Purificados................. 57 2.3.6.1. Concentração Micelar Crítica (CMC) .......................................................... 57 2.3.6.2. Atividade de Emulsificação e Estabilidade da Emulsão.............................. 57 2.3.6.3. Determinação do Efeito da Salinidade na Atividade dos Biossurfactantes . 58 2.3.6.4. Determinação do Efeito da Temperatura na Atividade dos Biossurfactantes 58 2.3.6.5. Determinação do Efeito do pH na Atividade dos Biossurfactantes ............. 58 2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 59 2.4.1. Caracterização Estrutural dos Biossurfactantes ............................................ 59 2.4.1.1. Caracterização Quanto à Composição Química do Biossurfactante
Produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A ........................................................ 59 2.4.1.2. Caracterização da Composição Química do Biossurfactante Produzido por
Bacillus subtilis LBBMA 155............................................................................ 66 2.4.1.3. Caracterização da Composição Química do Biossurfactante Produzido por
Arthrobacter oxydans LBBMA 201.................................................................. 70 2.4.1.4. Análise de Cromatografia de Camada Delgada Comparativa (CCDC) dos
Biossurfactantes Produzidos por Dietzia maris LBBMA 191 e Flavobacterium sp. LBBMA 168 ............................................................................................... 73
2.4.2. Tensão superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) dos Biossurfactantes Purificados ...................................................................................................... 74
2.4.3. Atividade Emulsificante e Estabilidade da Emulsão ...................................... 76 2.4.4. Efeito do pH, da Temperatura e da Força Iônica na Atividade dos
Biossurfactantes Purificados........................................................................... 79 2.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 86 2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 87
CAPÍTULO 3. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE SURFACTANTES BACTERIANOS PARA MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PETRÓLEO
3.1. RESUMO .......................................................................................................... 92 3.2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 94 3.3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 96 3.3.1. Surfactantes................................................................................................... 96 3.3.2. Avaliação da Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria
Luminescente Vibrio fischeri ........................................................................... 98 3.3.3. Avaliação da Toxicidade de Biossurfactantes Para Isolados Bacterianos ..... 99 3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 101 3.4.1. Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria Luminescente Vibrio
fischeri............................................................................................................. 101 3.4.2. Efeitos de surfactantes no Crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA
04, Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 em meio mineral com glicose ........... 104
3.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 110 3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 111
vi
CAPÍTULO 4. AVALIAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANOS
4.1. RESUMO .......................................................................................................... 113 4.2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 115 4.3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 117 4.3.1. Surfactantes................................................................................................... 117 4.3.2. Microrganismos utilizados nos testes de degradação ................................... 118 4.3.3. Avaliação da biodegradabilidade de surfactantes bacterianos ...................... 119 4.3.3.1. Ensaio de Biodegradabilidade em Fase Líquida......................................... 119 4.3.3.2. Ensaio de Biodegradabilidade em Microcosmos de Solo ........................... 120 4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 122 4.4.1. Potencial de Culturas Puras em Degradar os Biossurfactantes .................... 122 4.4.2.Degradação de Biossurfactantes por Cultura Bacteriana Mista em Solo........ 126 4.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 131 4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 132
CAPÍTULO 5. REMOÇÃO SIMULTÂNEA DE FENANTRENO E CÁDMIO DE SOLO CONTAMINADO POR UMA SOLUÇÃO LIGANTE/BIOSSURFACTANTE
5.1. RESUMO .......................................................................................................... 134 5.2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 136 5.3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 138 5.3.1. Surfactantes................................................................................................... 138 5.3.2. Solo ............................................................................................................... 139 5.3.3. Procedimento de Contaminação do Solo....................................................... 141 5.3.4. Procedimento de Lavagem do Solo............................................................... 141 5.3.5. Análise de Fenantreno Residual.................................................................... 142 5.3.6. Análises Estatísticas...................................................................................... 142 5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 143 5.4.1. Remoção de Cd2+ de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-Ligante .. 143 5.4.2. Remoção de Fenantreno de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-
Ligante ............................................................................................................ 150 5.4.3. Eficiência de Soluções Surfactantes-Ligante na Remoção Simultânea de Cd2+
e Fenantreno................................................................................................... 153 5.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 154 5.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 155
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1. Comparação da tensão superficial e Concentração Micelar Critica (CMC) de biossurfactantes e surfactantes sintéticos
6
Tabela 1.2. Valores de HLB de surfactantes e suas respectivas aplicações 12 Tabela 1.3. Classes de biossurfactantes e microrganismos produtores 14 Tabela 1.4. Toxicidade de biossurfactantes comparada aos surfactantes sintéticos 29 Tabela 1.5. Técnicas para remediação de áreas contaminadas 31 Tabela 2.1. Caracterização por espectrometria de massas MALDI-TOF dos principais
homólogos dos biossurfactantes (surfactina, iturina e fengicina) produzidos por B. subtilis LBBMA 111A, após separação por CCDP
64
Tabela 3.1. Tensão superficial (γ) e concentração micelar crítica (CMC) dos surfactantes utilizados neste estudo
96
Tabela 3.2. Concentrações dos surfactantes utilizados no ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri
98
Tabela 3.3. Isolados microbianos utilizados para a avaliação da toxicidade de surfactantes 99 Tabela 4.1. Tensão superficial (γ) e concentração micelar crítica (CMC) dos surfactantes
utilizados neste estudo 117
Tabela 4.2. Produção de CO2 durante o cultivo de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53, Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B em meio mineral suplementado com biossurfactantes e com o surfactante sintético SDS.
124
Tabela 4.3. Tensão superficial (γ) nos sobrenadantes dos meios de cultura inoculados e suplementados com surfactantes, após cultivo de 166 horas, a 30 ºC
125
Tabela 4.4. Emissão de CO2 e tensão superficial (γ) em microcosmos de solos estéreis e inoculados com uma cultura bacteriana mista, na presença de surfactantes, após 166 horas de incubação, a 30°C
129
Tabela 5.1. Caracterização dos surfactantes utilizados neste estudo 138 Tabela 5.2. Caracterização físico-química do solo experimental 140 Tabela 5.3. Remoção de Cd2+ de um latossolo vermelho-amarelo por surfactantes
combinados com diferentes concentrações do ligante iodeto (I-) 145
Tabela 5.4. Eficiência de remoção de fenantreno, após tratamento do solo com surfactantes, na presença/ausência do ligante
151
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Tipos de estruturas de associação de surfactantes em solução 7 Figura 1.2. Diagrama esquemático da variação da tensão superficial e solubilidade em
função da concentração de surfactante (CMC representa a concentração micelar crítica)
8
Figura 1.3. Modelo de Stigter para a formação de micela iônica normal com estrutura esférica
9
Figura 1.4. Duas Formas de Emulsão: (A) Óleo-em-água; (B) Água-em-óleo 10 Figura 1.5. Estrutura de ramnolipídeo de Pseudomona aeruginosa 15 Figura 1.6. Estrutura do trealolipídeo produzido por Rhodococcus erythropolis 16 Figura 1.7. Estrutura molecular de soforolipídeo de Candida (Torulopsis) bombicola 17 Figura 1.8. Lipopeptídeos produzidos por linhagens de Bacillus subtilis: (A) Surfactina (B)
Iturina A e (C) Fengicina 18
Figura 1.9. Estrutura de Fosfatidiletanolamina de Acinetobacter sp.. R1 e R2 são cadeias de hidrocarbonetos
19
Figura 1.10. Ácido corinomicólico de Corynebacterium sp. R1 e R2 são grupamentos alquílicos
20
Figura 1.11. Estrutura de Emulsan de Acinetobacter calcoaceticus 20 Figura 1.12. Mecanismo de oxidação (A) ω e (B) β da cadeia alquílica durante a
degradação de surfactante aniônico 27
Figura 1.13 Mecanismos de remoção de metal pelo biossurfactante Surfactina 35 Figura 2.1. Cromatografia de camada delgada (CCD) realizada em placa de sílica gel 60
F254 e eluido com CHCl3/CH3OH (60:40 v/v) 59
Figura 2.2. Espectro de IR do biossurfactante LBBMA 111A produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A
60
Figura 2.3. Espectro de RMN-H1 (300 MHz, CDCl3) da (A) mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A e da (B) amostra padrão de surfactina (SIGMA)
62
Figura 2.4. Estrutura de (A) surfacina, (B) iturina e (C) fengicina produzidos por diversas linhagens de Bacillus.
65
Figura 2.5. Espectro de IR da amostra contendo o biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155
67
Figura 2.6. Espectro de ressonância Magnética nuclear (RMN) de H1 da (A) amostra contendo o surfactante LBBMA 155 produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155 à 30°C e da (B) amostra padrão de surfactina (SIGMA)
68
Figura 2.7. Espectro de MALDI-TOF-MS da amostra de surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155
69
Figura 2.8. Espectro de IR do biossurfactante LBBMA 201 produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201
71
Figura 2.9. Espectro de ressonância Magnética nuclear (RMN) de H1 da amostra contendo o surfactante LBBMA 201 produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201 à 30°C
72
Figura 2.10. Estrutura de artrofactina de Arhrobacter sp. MIS38 73 Figura 2.11. Variação da tensão superficial (γ) com a concentração do (A) LBBMA 111A, 75
ix
(B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, em solução aquosa à 28°C em pH 6.8. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
Figura 2.12. Atividade de emulsificação de vários hidrocarbonetos com os biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
78
Figura 2.13. O efeito do pH sobre a atividade tensoativa do biossurfactante (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
81
Figura 2.14. Efeito da temperatura sobre a atividade tensoativa do biossurfactante (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
83
Figura 2.15. Efeito da força iônica sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS.. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
85
Figura 3.1. Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri após exposição de diferentes concentrações dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®. Dados relativos à média de três repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão
102
Figura 3.2. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA 04, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições
106
Figura 3.3. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições
107
Figura 3.4. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Pseudomonas sp. LBBMA 101B, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições
108
Figura 3.5. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Acinetobacter junni LBBMA 36, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições
109
x
Figura 5.1a. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente
146
Figura 5.1b. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente
147
Figura 5.1c. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente
148
Figura 5.2. Efeito da concentração do ligante (I-) na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.
149
Figura 5.3. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de fenantreno de solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1% de probabilidade, respectivamente
150
Figura 5.4. Efeito da concentração de ligante (I-) na remoção de fenantreno de solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente. S1= sem modelo, pois o coeficiente angular da reta é igual a zero, ou seja, não varia com a concentração do ligante
152
xi
RESUMO GERAL
LIMA, Tânia Maria da Silva, M.S., Universidade Federal de Viçosa, Fevereiro de 2008. Determinação Estrutural, Toxicidade, Biodegradabilidade e Eficácia de Biossurfactantes na Remoção de Fenantreno e Cádmio de Solo. Orientador: Marcos Rogério Tótola. Conselheiros: Arnaldo Chaer Borges, Maurício Dutra Costa e Elson Santiago de Alvarenga.
Neste trabalho, foi avaliada a hipótese de que biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA
111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e
Arthrobacter oxydans LBBMA 201, pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de
Biotecnologia e Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) do Departamento de Microbiologia
da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, são menos tóxicos a microrganismos do solo e
aquáticos, mais facilmente biodegradáveis que os surfactantes sintéticos e que, combinados ao
ligante iodeto, propiciam a mobilização simultânea do metal pesado Cádmio e do hidrocarboneto
poliaromático Fenantreno, presentes como contaminantes de solo. Os biossurfactantes produzidos
por Bacillus sp. LBBMA 111A (mistura de surfactina, fengicina e iturina), Bacillus subtilis LBBMA
155 (surfactina) e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 (artrofactina) foram purificados e
quimicamente caracterizados com o uso de técnicas de Espectrometria de Massas, Infravermelho e
Ressonância Magnética Nuclear. Os biossurfactantes produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA
168 e Dietzia maris LBBMA 191 foram purificados, mas não puderam ser quimicamente
caracterizados. A atividade de redução da tensão superficial foi avaliada e os valores de
concentração micelar crítica (CMC) apresentados pelos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA
155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 foram de 150 mg L-1, 180 mg L-1, 200 mg L-1, 150 mg
L-1 e 200 mg L-1, respectivamente. Os biossurfactantes apresentaram alta capacidade para
formarem emulsões consideradas estáveis com petróleo, tolueno, hexano, querosene e
Resumo Geral
xii
hexadecano e mostraram-se termo-estáveis na faixa de 20-70°C, estáveis em valores de pH acima
de 5,0 e resistentes à presença de até 5% de NaCl.
Os biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 não
apresentam toxicidade para V. fischeri em concentração próxima de 2CMC. A CE50 (concentração
em que ocorre redução de 50% da emissão de luz por V. fischeri) do surfactante sintético SDS,
após 30 minutos de exposição, foi de 450 mg L-1, equivalente a 0,21 CMC. Além disso, a inibição
do crescimento de culturas puras de Acinetobacter baumannii LBBMA 04, Acinetobacter junni
LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 em meios de
cultura contendo diferentes concentrações (2CMC, 4CMC e 8CMC) dos surfactantes biológicos foi
menor do que a causada pelas mesmas concentrações do surfactante sintético SDS®.
A biodegradabilidade dos biossurfactantes por culturas puras e por uma cultura mista foi avaliada
por meio da evolução de CO2. Em fase líquida, a capacidade de degradação dos biossurfactantes
por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi cerca de 54 vezes superior à de A. baumanni LBBMA ES11
e de 60 vezes à de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53. Em solo, uma cultura mista composta
dos isolados A. baumannii LBBMA 04, A. junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A.
baumanni LBBMA ES11 foi capaz de utilizar os biossurfactantes como substrato.
A eficiência de combinações do ligante iodeto (I-) com os surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155,
LBBMA 168, LBBMA 201 e Triton X-100® na remoção simultânea de cádmio (Cd2+) e fenantreno de
um latossolo vermelho-amarelo foi avaliada. A remoção de Cd2+ aumentou com o aumento da
concentração do ligante. As máximas eficiências de remoção de Cd2+ foram de 99,20% para o
biossurfactante produzido por LBBMA 201 e de 99,23% para o produzido por LBBMA 111A, na
presença de 0,336 mol L-1 de I-. Já a eficiência máxima de remoção do Cd2+ pelo surfactante
sintético Triton X-100® foi de 65,04%. As soluções de biossurfactantes removeram entre 80% e 88%
do fenantreno presente no solo, não sendo a remoção influenciada pela presença do ligante. A
solução do surfactante Triton X-100® removeu entre 73% e 88% do fenantreno. Diferentemente do
observado com os biossurfactantes, a presença do ligante I- influenciou significativamente a
eficiência de remoção do contaminante hidrofóbico.
Introdução Geral
1
INTRODUÇÃO GERAL
Surfactantes são compostos com propriedades tensoativas que possuem grupos
hidrofílicos e hidrofóbicos. Eles podem ser produzidos por síntese química (surfactantes sintéticos)
ou biológica (biossurfactantes). Em decorrência de sua natureza anfifílica, são compostos
caracterizados pela capacidade de alterar as propriedades interfaciais de um líquido. Outra
propriedade dos surfactantes é a capacidade de formarem, em meio aquoso, agregados
denominados micelas. A concentração mínima na qual se inicia o processo de formação de micelas
é chamada de concentração micelar crítica (CMC), uma propriedade intrínseca e característica do
surfactante. Essas propriedades tornam os surfactantes adequados para uma ampla gama de
aplicações industriais, envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade
espumante, capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases (WOODS, 2004).
Os surfactantes têm um papel fundamental em processos como emulsificação. O tipo de
emulsão formada - água/óleo ou óleo/água - depende não só da razão entre os volumes da fase
dispersa e contínua, mas também da proporção entre a parte hidrofílica e lipofílica do surfactante.
Esta proporção pode ser descrita pelo valor do balanço hidrofílico-lipofílico (HLB), introduzido por
Griffin em 1949 (ADAMSON & GAST, 1997). Surfactantes com altos valores HLB são solúveis em
meio aquoso, e os que apresentam baixo HLB são solúveis em solvente orgânico (SABATINI et al.,
1995).
A maioria dos surfactantes comercialmente disponíveis é sintetizada a partir de derivados
de petróleo e são tóxicos para diferentes organismos, além de não serem prontamente
biodegradáveis. Entretanto, a amplitude de aplicações desses compostos resultou no aumento da
Introdução Geral
2
demanda por surfactantes e maior interesse em se desenvolverem novas formas de obtenção dos
mesmos. Assim, surfactantes naturais, principalmente os biossurfactantes, estão sendo
amplamente explorados também como forma de acompanhar a tendência de substituição dos
produtos sintéticos por biológicos em aplicações industriais e ambientais (SINGH et al., 2006). Os
biossurfactantes são produzidos por uma ampla variedade de microrganismos e são genericamente
classificados como sendo de baixo ou alto peso molecular (revisado por DESAI & BANAT, 1997;
CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). Os biossurfactantes de baixo peso molecular são geralmente
glicolipídeos ou lipopeptídeos e os de alto peso molecular são polissacarídeos, proteínas,
lipopolissacarídeos e lipoproteínas (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).
Os biossurfactantes apresentam vantagens sobre os surfactantes sintéticos, como baixa
toxicidade, biodegradabilidade, a possibilidade de produção a partir de substratos renováveis e
efetividade em uma ampla faixa de temperatura, pH e salinidade (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Esses compostos ainda não são utilizados pela indústria de forma mais ampla em razão do alto
custo de produção (MUKHERJEE et al., 2006). O desenvolvimento de processos de produção mais
eficientes e baseados no uso de substratos de fontes renováveis e de baixo custo pode resultar
numa redução de 10-30 % do custo total (MUKHERJEE et al., 2006). Uma possível alternativa para
a produção de biossurfactantes em escala comercial é o uso de subprodutos agrícolas ou de
processamento industrial. Atualmente, o aproveitamento de resíduos vem sendo incentivado por
contribuir para a redução da poluição ambiental, bem como por permitir a valorização dos resíduos
que seriam descartados. Os processos de produção requerem ainda um método eficiente de
recuperação do composto produzido. Diferentes métodos têm sido usados nos processos de
extração, como a ultracentrifugação (MUKHERJEE et al., 2006), ultra-filtração (SEN &
SWAMINATHAN, 2005), precipitação com ácido ou sal (SEN & SWAMINATHAN, 2004), extração
por solvente e adsorção por cromatografia (DUBEY, 2005).
Além da aplicação industrial, os surfactantes são de grande importância em aplicações
ambientais, especialmente na biorremediação de ambientes contaminados com poluentes
orgânicos persistentes (POPs) e com metais pesados. Metais pesados e POPs exibem
características químicas divergentes, o que dificulta o uso de um único reagente para
Introdução Geral
3
dessorver/mobilizar, simultaneamente, os dois grupos de contaminantes (SHIN et al., 2005). O uso
de surfactantes em combinação com um ligante inorgânico, a exemplo do íon iodeto (I-) ou do
tiocianato (SCN-), pode favorecer a dessorção simultânea de metais pesados e POPs. Isto ocorre
porque o íon ligante forma um complexo com o íon metálico na solução de surfactante, reduzindo
seu caráter hidrofílico e permitindo que ele seja adsorvido dentro da micela do surfactante (SHIN et
al., 2000). Em estudo anterior, o surfactante não-iônico Triton X-100, em combinação com um
ligante inorgânico, iodeto (I-) ou tiocianato (SCN-), foi capaz de dessorver cádmio, cobre e zinco de
um solo que fora contaminado com metais pesados e bifenilas policloradas (PCB’s) (SHIN et al.,
2000).
Neste trabalho, foi avaliada a hipótese de que biossurfactantes produzidos por Bacillus sp.
LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA
191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 são menos tóxicos a microrganismos do solo e aquáticos,
mais facilmente biodegradáveis que os surfactantes sintéticos e que, combinados ao ligante iodeto,
propiciam a mobilização simultânea do metal pesado Cádmio e do hidrocarboneto poliaromático
Fenantreno, presentes como contaminantes de solo.
Introdução Geral
4
CAPÍTULO 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. SURFACTANTES: TIPOS, ESTRUTURAS E PROPRIEDADES
Surfactantes são moléculas com propriedades tensoativas que possuem grupos hidrofílicos
e hidrofóbicos, os quais determinam propriedades como adsorção, formação de micelas, formação
de macro e micro-emulsões, lubrificação, ação espumante ou antiespumante, capacidade
molhante, solubilização e detergência. Essas moléculas podem ser produzidas por síntese química
(surfactantes sintéticos) ou biológica (biossurfactantes). Os surfactantes são categorizados em
catiônicos, aniônicos, não-iônicos e zwiteriônicos, de acordo com a carga exibida pelo grupo
hidrofílico da molécula, já que o grupo hidrofóbico pouco varia (CRISTOFI & IVSHINA, 2002).
O grupo hidrofóbico de um surfactante é uma longa cadeia hidrocarbônica alifática com 10
a 20 átomos de carbono. Nos aniônicos, a parte hidrofílica é constituída por grupo carboxilato,
hidróxi, sulfato ou fosfato, enquanto que os catiônicos são constituídos por sais de amônio.
Surfactantes não-iônicos não contêm grupos com carga e, nos denominados anfotéricos, a parte
hidrofílica é constituída por grupos que contêm uma carga negativa e uma positiva, o que lhes
confere propriedades zwiteriônicas ou anfotéricas, dependendo do pH (WOODS, 2004).
Substâncias tensoativas são moléculas que, em baixas concentrações, têm a capacidade
de serem adsorvidas na interface de dispersões líquidas, reduzindo a tensão entre as fases que as
compõem. A adsorção na interface dos líquidos é conseqüência da estrutura molecular dos
surfactantes, ou seja: a parte polar ou iônica interage fortemente com a fase aquosa por meio de
forças do tipo dipolo-dipolo e a outra, a parte alifática apolar, interage com a fase orgânica. Esta
dupla solubilidade faz com que a região de maior estabilidade para a molécula tensoativa seja na
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
5
interface entre os dois líquidos. Assim, as moléculas tendem a se arranjar de modo a minimizar a
repulsão entre os grupos hidrofóbicos e a água: os grupos polares ficam na solução aquosa,
próximos à superfície, e os grupos apolares na interface água-óleo, minimizando o contato com a
água. Esse fato gera uma diminuição na tensão superficial da água, pois provoca um desarranjo de
sua superfície (WOODS, 2004).
1.1.1. Tensão Superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC)
Os líquidos tendem a assumir a forma em que a área de sua superfície seja a maior
possível, para manter as moléculas com um elevado número de vizinhos semelhantes, a exemplo
da forma esférica, em que a razão superfície/volume é maximizada. As forças coesivas entre as
moléculas no interior de um líquido são compartilhadas com os átomos vizinhos. Aquelas da
superfície não têm átomos vizinhos acima delas e exibem uma força atrativa mais forte sobre suas
vizinhas mais próximas na superfície. Este aumento das forças atrativas intermoleculares na
superfície é chamado tensão superficial (MINATTI, 2005). Tanto os surfactantes sintéticos como os
biossurfactantes são capazes de reduzir a tensão superficial da água (72 mN m-1) para valores na
faixa entre 40 e 26 mN m-1 (Tabela 1.1) (MULLIGAN, 2005).
A molécula de um surfactante possui uma parte lipofílica, a cauda, e uma parte hidrofílica, a
cabeça, o que lhe confere a propriedade de interagir com as fases aquosa e orgânica em uma
mistura. Essa dupla solubilidade faz com que a região de maior estabilidade para essa molécula
seja a interface entre os dois líquidos. Quando um surfactante é adicionado à água, as suas
moléculas tendem a se arranjar de modo a minimizar a repulsão entre os grupos hidrofóbicos e a
água: os grupos polares ficam na solução aquosa, próximo à superfície, e os grupos apolares ficam
na interface água-ar, minimizando o contato com a água. Esse fato gera uma diminuição na tensão
superficial da água ao provocar um desarranjo em sua superfície, o mesmo ocorrendo para
surfactantes solúveis em óleo (FILIPE, 1996).
A tensão superficial da água é de 72 mN m-1 a 25°C, e a adição de um surfactante pode
reduzi-la para valores abaixo de 40 mN m-1. Quando um surfactante é adicionado à água em
concentrações crescentes, observa-se uma redução na tensão superficial até um valor crítico, a
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
6
partir do qual as moléculas de surfactantes se associam e formam estruturas supramoleculares,
como micelas, bicamadas e vesículas (PIRÔLLO, 2006).
Tabela 1.1. Comparação da tensão superficial e Concentração Micelar Critica (CMC) de biossurfactantes e surfactantes sintéticos.
Natureza do surfactante
Surfactante Tensão superficial (mN m-1)
CMC (mg L-1)
Biológico Rhodococcus rubber - glicolipídeo 26,8 54 Biológico Rhodococcus erythropolis - trealose tetraester 26,0 15 Biológico Pseudomonas aeruginosa - ramnolipídeo 29,0 50-200 Biológico Candida bombicola - soforolipídeo 33,0 82 Biológico Bacillus subtilis - surfactina 27,0 23
Sintético 1Dodecil Sulfato de Sódio (SDS®) 37,0 2120 Sintético Brometo de Cetiltrimetilamônio 30,0 1300 Sintético Triton X-100 35,0 268
Adaptada de IVSHINA et al. (1998) 1Fonte de Referência: BRAMWELL & LAHA, 2000.
Processo de Micelização
Uma das características comuns a todos os surfactantes é a capacidade de formarem
pequenos agregados em solução aquosa ou oleosa, a partir de uma determinada concentração.
Esses agregados são denominados micelas e a concentração em que se inicia o processo de
formação dessas micelas, a micelização, é denominada de concentração micelar crítica (CMC),
uma propriedade intrínseca e característica do surfactante (SAICHEK & REDDY, 2005). Numa
micela em meio polar, como a água, a parte lipofílica da molécula orienta-se para o interior e a
hidrofílica para o exterior da micela. As micelas mais simples são esferas, mas à medida que a
concentração do surfactante aumenta, elas crescem formando estruturas cilíndricas (Figuras 1.1 e
1.2) (SAICHEK & REDDY, 2005). Um aumento adicional da concentração leva as estruturas
cilíndricas a se empacotarem em estruturas geralmente hexagonais ou em camadas (Figura 1.1) e,
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
7
à medida que essas estruturas crescem, por aumento de concentração, mais ordenadas elas se
tornam e as maiores podem adquirir propriedades de cristais líquidos (ROSEN, 2004).
O tipo de associação coloidal formada por um surfactante depende da estrutura do
tensoativo (tamanho da cadeia hidrocarbônica) e das condições experimentais (força iônica, pH,
contra-íons, temperatura, etc) (MANIASSO, 2001). As micelas são termodinamicamente estáveis e
facilmente reproduzíveis, mas são destruídas pela diluição com água quando a concentração do
tensoativo estiver abaixo da CMC (MANIASSO, 2001).
Figura 1.1. Tipos de estruturas de associação de surfactantes em solução (Adaptada de ROSEN, 2004).
A principal razão que leva os monômeros de surfactantes a se associarem na forma de
micelas é a diminuição da área de contato entre as cadeias hidrocarbônicas apolares do
surfactante e a água, ou entre as frações polares e a fase oleosa (WOODS, 2004). Porém, a
formação dos agregados em solução aquosa leva o surfactante a uma situação de maior
proximidade dos grupos hidrofílicos polares, e a geração de uma repulsão eletrostática que se opõe
ao processo de micelização. Nessa circunstância, os contra-íons desempenham um papel
fundamental: quando em concentração suficiente, proveniente da própria ionização do surfactante
ou mesmo como aditivos à solução, eles blindam a carga do agregado e diminuem o potencial
Estrutura empacotada em camadas
Estrutura empacotada hexagonalmente
Esfera
Estrutura cilíndrica
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
8
elétrico e a repulsão entre os grupos hidrofílicos dos monômeros. O mesmo efeito se observa na
formação de emulsões inversas, onde as cabeças polares do surfactante estão mais próximas no
interior das gotículas da fase oleosa dispersa.
As micelas, ao contrário dos monômeros, ficam dispersas em toda a solução e não
apresentam efeito sobre a tensão superficial da água. Esse comportamento da interface água/ar
em função da concentração de surfactante utilizada encontra-se ilustrado na Figura 1.2.
Figura 1.2. Diagrama esquemático da variação da tensão superficial e solubilidade em função da
concentração de surfactante (CMC representa a concentração micelar crítica).
Adaptada de MULLIGAN (2005).
Em solução aquosa, o surfactante iônico se dissocia, dando origem a duas espécies
hidratadas: um cátion e um ânion, ou seja, o monômero do surfactante e o seu respectivo contra-
íon. O Dodecil Sulfato de Sódio (SDS®), por exemplo, é um surfactante aniônico em que o contra-
íon é o cátion Na+.
O Modelo de Stigter
Diversos são os modelos que tentam ilustrar a forma e o comportamento de uma micela,
destacando-se o de Stigter entre os mais aceitos (Figura 1.3) (ROSEN, 2004). Segundo esse
Concentração do surfactante
CMC
Solubilidade
Grandeza Física
Tensão superficial
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
9
modelo, os monômeros se organizam em forma esférica em solução aquosa e todas as porções
hidrofóbicas do surfactante estariam voltadas para o centro, formando o núcleo, e os grupamentos
hidrofílicos estariam orientados para a superfície da esfera, formando a interface com a água
(ROSEN, 2004).
O diâmetro do núcleo micelar varia com o tamanho da cauda do surfactante, sendo de
cerca de 3 nm para o SDS®. A camada de Stern é formada pelos grupos iônicos do surfactante e
seus respectivos contra-íons não-dissociados (ROSEN, 2004). A camada de Stern compreende a
parte da dupla camada elétrica que circunda a superfície externa da esfera micelar; a outra
camada, mais difusa e que contém os ânions remanescentes, é a denominada camada de Gouy-
Chapmman (GOODWIN, 2004). Nessa camada, a micela exerce uma atração eletrostática sobre
os contra-íons em solução e criam um gradiente de concentração de contra-íons à sua volta (Figura
1.3) (GOODWIN, 2004).
Figura 1.3. Modelo de Stigter para a formação de micela iônica normal com estrutura esférica
(Adaptada de MANIASSO, 2001).
Interface Micelar
Fase aquosa Contra-íon
Stern Gouy-Chapmman Núcleo Micelar
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
10
1.1.2. Emulsões e Surfactantes
Uma emulsão líquido/líquido pode ser conceituada como resultado da dispersão de um
determinado líquido em um meio contínuo constituído de outro líquido, quando a solubilidade entre
os dois é baixa (ROSEN, 2004). Geralmente a emulsão envolve uma fase aquosa, constituída por
água ou uma solução aquosa, e uma fase insolúvel em água, geralmente hidrocarbonetos e
aditivos. De acordo com o caráter hidrofílico ou lipofílico da fase dispersante, este sistema pode ser
classificado como água-em-óleo (A/O), que é quando a água está dispersa na fase oleosa da
emulsão, ou como óleo-em-água (O/A), quando o óleo encontra-se disperso sob a forma de
pequenas gotículas na fase aquosa (AZZINI et al., 1999). Os dois tipos de emulsão encontram-se
ilustrados na Figura 1.4.
Na descrição das características da emulsão é importante indicar a fração, ou a razão,
entre o volume da fase dispersa e o da fase contínua. Geralmente, o líquido em maior proporção na
mistura forma a fase contínua na qual estão dispersas as microfases do outro líquido que forma a
fase dispersa (ROSEN, 2004).
Figura 1.4. Duas Formas de Emulsão: (A) Óleo-em-água e (B) Água-em-óleo. Adaptada de
ROSEN (2004).
Quando dois líquidos insolúveis e com diferentes densidades são colocados em contato, na
ausência de agitação, observa-se a formação de duas camadas bem distintas e que representam a
água
Água
óleo
Controle do tipo de emulsão: Estrutura do emulsificante, pH,
salinidade, temperatura, etc. A B
água
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
11
forma mais estável desse sistema, ou seja, a com menor área interfacial. Durante a formação da
emulsão ocorre um expressivo aumento na área interfacial entre os líquidos, com conseqüente
consumo de energia. Sendo assim, muitos dos métodos de formação de emulsões requerem a
agitação para fornecer energia suficiente para sobrepor à tensão superficial e formar as microfases.
Uma vez cessada a agitação, as micro-gotículas tendem a se aproximar em razão das forças de
atração, principalmente as do tipo Van Der Walls (ROSEN, 2004).
O aumento na energia interfacial durante a emulsificação é diretamente proporcional ao
aumento na área interfacial e pode ser amenizado pelo uso de um surfactante. Esse composto
facilita a formação e a manutenção da emulsão, isto é, impede a coalescência das fases. Mesmo
em baixas concentrações, os surfactantes podem se posicionar na interface de dispersões líquidas
e contribuir para a redução da tensão superficial. O posicionamento na interface dos líquidos é
conseqüência da estrutura molecular dos surfactantes: a parte polar ou iônica interage fortemente
com a fase aquosa por meio de forças do tipo dipolo-dipolo ou íon-dipolo e a parte alifática apolar
interage com a fase orgânica (CREVECOEUR, 1997; ADAMSON & GAST, 1997).
1.1.3. Balanço Hidrofílico/Lipofílico (HLB)
O tipo de emulsão formada, A/O ou O/A, depende não só da razão entre os volumes das
fases, dispersa e contínua, mas também da composição das partes hidrofílica e lipofílica do
surfactante. Esta composição determina o valor de HLB do surfactante, valor introduzido por
GRIFFIN em 1949 para representar o balanço do tamanho e força das regiões hidrofílicas e
lipofílicas de um composto anfifílico, em uma escala numérica (ADAMSON & GAST, 1997;
CREVECOEUR, 1997). Os valores de HLB aumentam à medida que a substância se torna mais
hidrofílica (SILVA & SOARES, 1996).
O valor HLB de um surfactante aumenta de forma proporcional aos acréscimos na
polaridade da molécula, ou seja, ao aumento da solubilidade do surfactante em meio aquoso
(CREVECOEUR, 1997). Os valores de HLB esperados para emulsões A/O e suas respectivas
aplicações situam-se entre 4 e 6 (Tabela 1.2) (ADAMSON & GAST, 1997). O intervalo de valores
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
12
de HLB para cada aplicação pode variar de acordo com as características e afinidades entre as
fases e o surfactante (RENKEN & HUNKELER, 1999).
Tabela 1.2. Valores de HLB de surfactantes e suas respectivas aplicações
Comportamento da Solubilidade do Surfactante em Água
Número HLB Aplicação
0
2
Pouca dispersibilidade
Dispersão leitosa; instável
4
6
8
Dispersão leitosa; estável
Solução translúcida a transparente
10
12
Solução transparente
14
16
18
Adaptado de NEVES (2002).
A determinação do valor HLB pode ser feita por método empírico, atribuindo-se valores de
hidrofilicidade ou lipofilicidade para os principais grupos constituintes das moléculas de surfactantes
(ADAMSON & GAST, 1997). O HLB da molécula pode ser calculado adicionando-se 7 à soma
algébrica dos valores atribuídos aos grupos constituintes. Misturas de surfactantes podem ter o
HLB calculado da mesma forma, porém cada constituinte deve ter o seu HLB calculado pelo
método descrito e o valor final do HLB da mistura corresponderá à média ponderada pela massa
dos HLB’s de cada surfactante presente (ADAMSON & GAST, 1997).
A maior limitação do conceito de HLB é a de não considerar o fato de que as propriedades
funcionais da molécula de surfactante são alteradas significativamente pelas mudanças de
temperatura ou pelas condições da solução (DAVIS, 1994). Como exemplo, um surfactante pode
Solubilizante
Agente de molhamento
Emulsificante A/O
Emulsificante O/A
Sem dispersibilidade
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
13
ser capaz de estabilizar uma emulsão de óleo em água a uma dada temperatura e, em outra,
estabilizar uma emulsão de água em óleo, mesmo que tenha a mesma estrutura química.
1.1.4. Estabilidade de Uma Emulsão
A estabilidade de uma emulsão pode ser afetada por fatores diversos. Porém, todos
aqueles que causam instabilidade conduzem aos mesmos fenômenos: quebra da emulsão ou
inversão de fases.
A quebra da emulsão é geralmente quantificada pela taxa com que ocorre o processo de
coalescência, resultando no aumento do diâmetro médio e diminuição do número de microfases
presentes. Além disso, em casos extremos pode haver coalescência completa entre as gotículas,
forçando a separação de fases em duas camadas distintas de líquido.
Já o fenômeno de inversão consiste na troca entre as fases, ou seja, a fase dispersa torna-
se contínua e a fase contínua torna-se dispersa. Esse efeito é uma instabilidade observada apenas
em emulsões concentradas, onde o volume da fase dispersa encontra-se próximo ou superior ao
volume da fase contínua (ADAMSON & GAST, 1997). Essa inversão de fases pode ser provocada
pela perda de água e conseqüente variação da relação entre as fases, dispersa e contínua (SILVA
& SOARES, 1996).
1.2. BIOSSURFACTANTES: CLASSIFICAÇÃO E ORIGEM MICROBIANA
Alguns tensoativos são conhecidos como biossurfactantes, uma classe de surfactantes
produzidos por uma grande variedade de microrganismos (Tabela 1.3). Os biossurfactantes são
classificados como de baixo ou alto peso molecular (DESAI & BANAT, 1997; CAMEOTRA &
MAKKAR, 1998). Os biossurfactantes de baixo peso molecular são geralmente glicolipídeos ou
lipopeptídeos, são os mais efetivos na redução da tensão superficial (LIN, 1996). Os
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
14
biossurfactantes de alto peso molecular, como polissacarídeos, proteínas, lipopolissacarídeos e
lipoproteínas, são mais efetivos em estabilizar emulsões O/A (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).
Tabela 1.3. Classes de biossurfactantes e microrganismos produtores
Classe Biossurfactante Microrganismo Referência
Baixo Glicolipídeos: Peso Ramnolipídeos Pseudomonas aeruginosa BENINCASA et al. (2004) Molecular Soforolipídeos Candida bombicola,
Candida apicola HOMMEL et al. (1994)
Trealolipídeos Rhodococcus erythropolis UCHIDA et al. (1989) Flavolipídeos: Flavobacterium sp MTN11 BODOUR et al. (2004)
Lipopeptídeos e lipoproteínas:
Peptídeo-lipídeo Bacillus licheniformis YAKIMOV et al. (1998) Viscosina Pseudomonas fluorescens NEU et al. (1990) Surfactina Bacillus subtilis, Bacillus
pumilus CARILLO et al. (2003)
Gramicidina S Bacillus brevis AZUMA & DEMAIN (1996) Polimixina Bacillus polymyxa FALAGAS et al. (2005)
Ácidos graxos, lipídeos neutros e fosfolipídeos:
Ácidos graxos Corynebacterium lepus, Arthrobacter parafineus
MAKKAR & CAMEOTRA (2002)
Lipídeos neutros Nocardia erythropolis MAKKAR & CAMEOTRA (2002)
Fosfolipídeos Thiobacillus thiooxidans LEMKE et al. (1995)
Alto Surfactantes poliméricos:
Peso Emulsan Acinetobacter calcoaceticus ROSENBERG et al. (1993) molecular Biodispersan Acinetobacter calcoaceticus ROSENBERG et al. (1988) Liposan Candida lipolytica CIRIGLIANO & CARMAN
(1984) Manoproteína Saccharomyces cerevisiae CAMERON et al. (1988) Alasan Acinetobacter
radioresistens NAVON-VENEZIA et al. (1995)
Surfatantes particulados: Vesículas Acinetobacter calcoaceticus DESAI & BANAT (1997)
A massa molecular de biossurfactantes geralmente encontra-se entre 500-1500 Daltons e
os valores de CMC entre 1-200 mg L-1. Novas moléculas de biossurfactantes estão sendo
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
15
descritas, como a da classe denominada de flavolipídeos produzidos por Flavobacterium sp.
MIN11. (BODOUR et al. 2004), cujas massas variam entre 584 e 646 Daltons. Os flavolipídeos
apresentam uma CMC de 300 mg L-1 e podem promover a redução da tensão superficial para 26
mN m-1, formar emulsões estáveis, melhorar a mineralização do hexadecano e formar complexo
com Cd2+.
1.2.1. Glicolipídeos
Biossurfactantes da classe dos glicolipídeos têm na sua constituição moléculas de
carboidratos (glicose, manose, galactose, ou ramnose) em combinação com ácidos alifáticos de
cadeias longas (HOLMBERG, 2001). Entre os glicolipídeos, os mais conhecidos são os
ramnolipídeos, os trealolipídeos e os soforolipídeos.
Ramnolipídeos
Os ramnolipídeos, surfactantes pertencentes à classe dos glicolipídeos produzidos por
diversas estirpes de Pseudomonas aeruginosa, são os mais bem estudados. Eles possuem em sua
estrutura uma ou duas moléculas de ramnose ligadas a uma ou duas moléculas de ácido β-
hidroxidecanóico, sendo que sete homólogos já foram estruturalmente identificados (ABALOS et
al., 2001) (Figura 1.5). Pseudomonas aeruginosa pode produzir ramnolipídeos a partir de diversos
substratos, incluindo alcanos, succinato, piruvato, citrato, frutose, glicerol, óleo de oliva, glicose e
manitol (HOLMBERG, 2001).
Figura 1.5. Estrutura de ramnolipídeo de Pseudomona aeruginosa.
H
HO
CH3
O
O O
C
O
H O
H
CH3
(CH2)6
CH3
(CH2)6
O
CH3
O O
O
CH CH2 C
O
O CH CH2 COOH
CH CH (CH2)6 CH3
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
16
Trealolipídeos
Nos biossurfactantes trealolipídeos produzidos por espécies de Mycobacterium, Nocardia e
de Corynebacterium a molécula do dissacarídeo trealose encontra-se ligada aos carbonos 6 e 6’ de
ácidos micólicos (GAUTAM & TAYAGI, 2006). Trealolipídeos de diferentes organismos diferem no
tamanho e estrutura do ácido micólico, no número de átomos de carbono e no grau de insaturação
(ASSELINEAU & ASSELINEAU, 1978). Trealolipídeos de Rhodococcus erythropolis (Figura 1.6) e
Arthrobacter sp. reduzem a tensão superficial do meio aquoso de 72 para valores abaixo de 40 mN
m-1 (KRETSCHMER et al., 1982).
Figura 1.6. Estrutura do trealolipídeo produzido por Rhodococcus erythropolis.
Soforolipídeos
Estruturalmente, os soforolipídeos consistem de um carboidrato dimérico (soforose) ligado
glicosidicamente ao grupo hidroxil do penúltimo carbono do ácido graxo de cadeia longa (C16-C18)
(Figura 1.7). Eles são produzidos por leveduras, como Candida bombicola, Candida magnoliae
Candida petrophilum, Candida bogoriensis e Candida apicola (GORIN et al., 1961; TULLOCH et al.,
1968; COOPER & PADDOCK, 1984; GOBBERT et al., 1984; HOMMEL et al., 1987; HOMME &
HUSE, 1993). C. bombicola pode produzir soforolipídeo (Figura 1.7) utilizando carboidratos
(KLEKNER et al., 1991), óleos vegetais (ZHOU et al., 1992), ácido oléico (RAU et al., 1996) e
O
CH2O CO CH CHOH (CH2)m
OH
O O OOH
OH
OH
(CH2)n
CH3
CH3
H
CHCC
O (CH2)n
CH3
H(CH2)
CH3
m n = 27 a 31+
Hm O OCH2
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
17
alcanos (DAVILA et al, 1994) como substratos. Dependendo das condições de cultivo e da fonte de
carbono, até doze diferentes soforolipídeos podem ser produzidos (ASMER et al., 1988).
Soforolipídeos têm suas propriedades tensoativas mantidas em condições extremas de pH, NaCl e
temperatura (COOPER & PADDOCK, 1984). Além das propriedades tensoativas, os soforolipídeos
apresentam um grande potencial como agentes terapêuticos e podem funcionar como
antibacterianos (SHAH et al., 2007), anticancerígenos (SCHOLZ et al., 1998; CHEN et al., 2006),
antivirais (SHAH et al., 2005), e antifungícos (SHAH et al., 2007).
Figura 1.7. Estrutura molecular de soforolipídeo de Candida (Torulopsis) bombicola.
1.2.2. Lipopeptídeos e Lipoproteínas
Os surfactantes lipoprotéicos são talvez os mais conhecidos por suas atividades
antibióticas, sendo mais bem caracterizados os produzidos por Bacillus spp., incluindo surfactina,
iturina, fengicina, liquenisina (VATER et al., 2002), micosubtilisina (PEYPOUX et al., 1976) e
bacilomicina (PEYPOUX et al., 1984) que são surfactantes e antibióticos com potencial atividade
antimicrobiana. Esse tipo de composto se caracteriza pela existência de peptídeos ligados a ácidos
graxos, sendo que a porção protéica da molécula pode ser neutra ou aniônica e os aminoácidos
estão freqüentemente dispostos em uma estrutura cíclica (VATER et al., 2002). Os compostos
surfactina e iturina são ciclolipoheptapeptídeos que contêm um ácido graxo β-hidroxi e um ácido
graxo β-amino respectivamente, como componentes lipofílicos (Figura 1.8). Fengicina é um
lipodecapeptídeo com um ácido graxo β-hidroxi ligado à sua cadeia lateral (Figura 1.8).
O
CH2OR
OH
O
O
OO
O
CO
OHH
(CH2)15
COOH
CH3
HROH2
H
C
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
18
Já foram relatadas na literatura 20 linhagens diferentes de Bacillus subtilis produtoras de
surfactina. Ela reduz a tensão superficial de 72 para 27,9 mN m-1 numa concentração de 0,005 %
(ARIMA et al., 1968). Bacillus licheniformis produz biossurfactantes similares à surfactina e que
atuam sinergicamente, exibindo excelente estabilidade em condições extremas de temperatura, pH
e salinidade (MCINERNEY et al., 1990). O surfactante produzido por B. licheniformis é capaz de
reduzir a tensão superficial entre água/ar para 27,0 mN m-1.
Figura 1.8. Lipopeptídeos produzidos por linhagens de Bacillus subtilis: (A) Surfactina (B) Iturina A
e (C) Fengicina. Adaptada de VATER et al. (2002).
L Gln
L
L
Asn D
Pro D
Tyr L Asn C O
CH2
H CH2 n CH3
B
NH
C CH2 5 CH
CH3Asn L Ser
L
Asp D
Leu L
Leu L
Leu L
Leu O
Glu C
CH2
O
CH2 n CH3 AVal
L
D
CH2 5 CH
CH3
CH
CAla L
Pro LL
D Glu D
Gln L
aThr
Tyr L
D
Ile O
Tyr D Orn L Glu C
O
CH2
CO C11HH -13
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
19
1.2.3. Ácidos Graxos, Fosfolipídeos e Lipídeos Neutros
Bactérias e leveduras produzem grandes quantidades de ácidos graxos e fosfolipídeos
surfactantes quando utilizam alcanos como fonte de carbono e de energia (CIRIGLIANO &
GARMAN, 1985). O HLB desses biossurfactantes é diretamente relacionado ao comprimento da
cadeia hidrocarbônica em suas estruturas. Acinetobacter sp. produz vesículas de cadeias duplas
com áreas de cabeça polar pequenas, denominadas fosfatidiletanolamina (KAPPELI & FINNERTY,
1979) (Figura 1.9), as quais são capazes de promover a formação de microemulsões de alcanos
em água (DESAI & BANAT, 1997). Fosfatidiletanolamina, produzida por Rhodococcus erythropolis
durante o crescimento em meio de cultura contendo alcano como fonte de carbono e energia, leva
a uma redução da tensão superficial entre água e hexadecano para valores abaixo de 1 mN m-1 e
apresenta uma CMC de 30 mg L-1 (KRETSCHMER et al., 1982).
Figura 1.9. Estrutura de Fosfatidiletanolamina de Acinetobacter sp.. R1 e R2 são cadeias de
hidrocarbonetos.
Os lipídeos neutros compreendem os ácidos graxos, triacilgliceróis e ácidos micólicos. A
maioria dos lipídeos neutros, como os triacilgliceróis e seus ácidos graxos constituintes, mostram
algum grau de atividade tensoativa (COOPER & ZAJIC, 1980). Assim como os ácidos micólicos,
eles consitituem ácidos graxos mais complexos. Estes compostos, por sua vez, são sintetizados
por espécies de Mycobacterium spp. e por alguns espécies dos gêneros de Nocardia,
Corynebacterium e Rhodococcus; possuem misturas de ácidos graxos α e β-hidroxilados ligados a
longas cadeias hidrocarbônicas. A Figura 1.10 mostra um exemplo de ácido corinomicólico.
R2 C
O
O CH
C
C
O
O
C
P
O
O
CH2CH2NH3
R1
O
H2
H2
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
20
Figura 1.10. Ácido corinomicólico de Corynebacterium sp. R1 e R2 são grupamentos alquílicos.
1.2.4. Biossurfactantes Poliméricos
Biossurfactantes poliméricos ou lipopolissacarídeos são ácidos graxos ligados
covalentemente a polissacarídeos. Os biossurfactantes poliméricos mais bem estudados são o
Emulsan, o Liposan, a Manoproteína e outros complexos de proteínas-polissacarídeos. Emulsan é
um bioemulsificante extracelular produzido por A. calcoaceticus RAG-1 e foi o primeiro surfactante
microbiano a ser produzido e comercializado em larga escala e é um dos mais efetivos
emulsificantes (ROSENBERG & RON, 1999) (Figura 1.11). É caracterizado como um
heteropolissacarídeo polianiônico (FERRAREZZO, 1998).
Figura 1.11. Estrutura de Emulsan de Acinetobacter calcoaceticus.
O
CH2
OH NH
C
CH3
O
O
C O
CHOH
CH2)9
CH3
O
OOC
NH
C O
O O
OH NH
OCH2
O
C
CH2
CHOH
CH2)8
CH3
O
(
H
(CH2)12
CH3
C O
CH3
(
OO
n
O
R2 OH
OOH
R1
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
21
Liposan é um emulsificante extracelular sintetizado por C. lipolytica, sendo composto de
83% de carboidrato e 17% de proteínas (CIRIGLIANO & GARMAN, 1985). Manoproteína é uma
proteína produzida por S. cerevisiae, possuindo excelente atividade emulsificante com vários óleos,
alcanos e solventes orgânicos (CAMERON et al., 1988). É produzida através de um processo
biotecnológico simples, de larga escala e baixo custo (BARROS et al., 2007).
1.2.5. Biossurfactantes Particulados
As células microbianas e vesículas extracelulares com atividades tensoativas são
classificadas como biossurfactantes particulados. Algumas células microbianas apresentam
elevada hidrofobicidade superficial, sendo consideradas por si só como biossurfactantes, a
exemplo de algumas espécies de cianobactérias e patógenos, como S. aureus e Serratia sp.
Bactérias do gênero Acinetobacter sp., quando crescem em meio contendo hexadecano, produzem
vesículas extracelulares que têm função importante na captação de alcanos para a célula,
possuindo elevada atividade surfactante (GAUTAM & TAYAGI, 1979).
Um grande número de microrganismos tem se mostrado capaz de produzir compostos com
atividade superficial variada, cujas funções ainda não foram totalmente elucidadas. A Tabela 1.3
mostra as principais classes de biossurfactantes e os organismos envolvidos na sua produção.
1.3. PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES
Vários seres vivos produzem biossurfactantes, incluindo os animais, as plantas e os
microrganismos. Em decorrência do curto tempo de geração dos microrganismos,
comparativamente ao crescimento de animais e de plantas, a produção de biossurfactantes por
estes seres é considerada como a forma mais promissora de se produzir esses compostos (LANG,
2002).
Microrganismos produtores de biossurfactantes têm sido isolados de vários ambientes,
como solo, água do mar, sedimentos marinhos, entre outros. A presença de microrganismos
produtores de biossurfactantes é usual em solos, como demonstrado pela constatação de que pelo
menos um microrganismo produtor foi encontrado em 20 dos 21 tipos de solo estudados, entre os
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
22
quais encontravam-se solos não-contaminados, solos contaminados com hidrocarbonetos, solos
contaminados com metais ou contaminados com metais e hidrocarbonetos (BODOUR et al., 2003).
É grande a variedade de microrganismos com capacidade de síntese de biossurfactantes,
sendo que o tipo, a quantidade e a qualidade dos biossurfactantes produzidos por um
microrganismo são influenciados pela natureza do substrato e pela concentração de nutrientes
como fósforo (P), nitrogênio (N), magnésio (Mg) e ferro (Fe) no meio de cultivo (GEORGIOU et al.,
1992). As condições de crescimento como pH, temperatura, agitação e disponibilidade de oxigênio
também afetam a produção de biossurfactantes, dado o seu efeito sobre o crescimento e atividade
celulares (DESAI & BANAT, 1997).
A fonte de carbono é fator de importância no processo de produção de biossurfactantes. Os
microrganismos utilizam uma grande variedade dessas fontes, a exemplo de hidrocarbonetos
(BANAT, 1995), óleos vegetais e resíduos agro-industriais (NITSCHKE & PASTORE, 2003).
Segundo a fonte de carbono utilizada, os produtores de compostos tensoativos podem produzir
surfactantes tanto com hidrocarbonetos quanto com substratos hidrossolúveis, como Pseudomonas
spp. (HAFERBURG et al.,1986). A modificação do substrato de crescimento freqüentemente altera
a estrutura do biossurfactante produzido e, conseqüentemente, suas propriedades (REISER et al.,
1989). Na produção de surfactina por B. subtilis a transferência de oxigênio é também parâmetro
chave para a otimização e ampliação de escala de produção do composto (SHEPPARD &
COOPER, 1990).
Os biossurfactantes que são produzidos em substratos miscíveis em água são
considerados como os de uso mais provável, em termos de custo de produção. Há uma grande
variedade de substratos miscíveis alternativos que podem ser utilizados, como soro de leite ou
resíduos de destilarias (MUKHERJEE et al., 2006).
A maioria das moléculas de biossurfactantes sintetizadas é liberada no meio de cultura na
fase exponencial de crescimento dos microrganismos; em certos casos, as moléculas podem ser
mantidas no interior das células ou permanecer aderidas às membranas (DESAI & BANAT, 1997).
Dependendo da espécie microbiana e das condições de cultivo, o biossurfactante é produzido
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
23
durante uma parte do ciclo de crescimento e, a seguir, é desativado ou incorporado em outro
metabólito, como ocorre quando B. licheniformes é cultivado em meio mineral.
Diferentes fontes de carbono podem influenciar não só a composição do biossurfactante,
mas também a maneira como é produzido. Isolados de Arthrobacter retêm 75% do biossurfactante
produzido no ambiente intracelular quando crescem em etanol ou acetato; porém, com
hidrocarbonetos, a totalidade produzida é liberada para o meio extracelular (REISER et al., 1989).
Várias patentes já foram requeridas para processos de produção de biossurfactantes. Em
2001, no Japão, a empresa Showa Denko K. K. (SDK) melhorou a produção e venda de um
biossurfactante inovador para aplicações cosméticas, denominado de “Aminofect”, um análogo da
surfactina. A avaliação de resultados confirmou que é altamente ativo como agente de superfície,
mostrando uma alta estabilidade de emulsificação e dispersão, mesmo em baixas concentrações.
Também foi confirmado que o “Aminofect” provê um grau de irritação de pele substancialmente
mais baixo que o grau de "irritação convencional", sendo altamente biodegradável e seguro
(KITAMOTO et al., 2002).
1.4. RECUPERAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE BIOSSURFACTANTES
A recuperação de moléculas biossurfactantes depende principalmente de sua carga iônica,
solubilidade e localização - intracelular, extracelular ou ligadas à parede celular (DESAI & BANAT,
1997). Em geral, compostos intracelulares requerem maiores custos na recuperação, pois as
células devem ser primeiramente rompidas, por meios mecânicos ou enzimáticos, antes da
purificação, requerendo-se, assim, mais uma etapa no processo de produção (MULLIGAN &
GIBBS, 1993). O isolamento de biossurfactantes hidrossolúveis extracelulares geralmente envolve
várias etapas de concentração, enquanto que o de biossurfactantes associados a paredes
celulares, ou dos insolúveis em água, é relativamente mais fácil (LIN, 1996).
A recuperação e concentração do biossurfactante dos meios de cultura é que irão
determinar a viabilidade da produção em larga escala. Geralmente, a baixa concentração e a
estrutura do biossurfactante limitam a extração. Diferentes métodos são usados nos processos de
extração, como a ultra-centrifugação (MUKHERJEE et al., 2006), ultra-filtração (SEN &
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
24
SWAMINATHAN, 2005), precipitação com ácido ou sal (SEN & SWAMINATHAN, 2004; SHABTAI &
GUTNICK, 1986), extração por solvente (REILING et al., 1986; DUBEY, 2005) e cromatografia de
troca iônica (REILING et al, 1986). Uma grande variedade de solventes, a exemplo de compostos
orgânicos como hexano, etanol, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetona e metanol, tem
sido usada na forma pura ou combinada em processos de extração. As misturas mais efetivas são
aquelas que utilizam clorofórmio e metanol, pois facilitam o ajuste de polaridade ao da molécula
que se pretende extrair (MESQUITA, 2004).
A precipitação com sulfato de amônio é utilizada para a extração de emulsan e
biodispersan. A surfactina e outros biossurfactantes produzidos por Bacillus podem ser extraídos
por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para o ponto isoelétrico do composto desejado,
enquanto que biossurfactantes produzidos por espécies de Pseudomonas e por Candida tropicalis
são extraídos por precipitação com acetona (MULLIGAN & GIBBS, 1990).
A ultra-filtração tem sido utilizada para a separação de biossurfactantes do meio de
fermentação, como no caso de glicolipídeos, utilizando-se a capacidade de formarem micelas ou
agregados acima da CMC, que podem ser retidos em membranas de exclusão de alto peso
molecular (LIN & JIANG, 1997).
A elucidação estrutural de biossurfactantes é baseada em espectroscopia de ressonância
magnética nuclear (NMR) e espectrometria de massa (MS). Atualmente, os progressos em técnicas
de purificação, como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com fase reversa e a
disponibilidade de técnicas espectroscópicas melhoradas, como NMR, MS com Bombardeamento
de Átomos Rápidos (FAB-MS) e, mais recentemente, Ionização/Dessorção a Laser Assistida por
Matriz com Tempo de Vôo (MALDI-TOF), têm demonstrado que novas estruturas de
biossurfactantes podem ser determinadas em tempos relativamente curtos e com uma quantidade
muito pequena de amostras (BODOUR et al., 2004).
Várias estruturas de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies microbianas vêm
sendo elucidadas. Bioemulsificantes de P. putida ML2 foram purificados com uso da cromatografia
de filtração gélica e cromatografia de camada fina (TLC) e suas estruturas foram determinadas por
meio de técnicas bidimensionais de NMR (BONILA et al., 2005). Lipopeptídeos também já foram
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
25
separados com uso de HPLC e TLC e suas estruturas determinadas por espectroscopia de NMR
(1H e 13C) (KALINOVSKAYA et al., 2002). Para a descrição da nova classe de biossurfactantes,
flavolipídeos, produzidos por Flavobacterium sp. MTN11, os autores fizeram uso de técnicas de MS
(FAB e MALDI) e NMR para a demonstração de que o novo biossurfactante é uma mistura de 37
flavolipídeos, com massa molecular variando entre 584 e 686 Daltons (BODOUR et al., 2004).
1.5. BIODEGRADABILIDADE E TOXICIDADE DE SURFACTANTES
A ampliação do uso de surfactantes em processos de remediação de águas e de solos
contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos tem sido limitada pela falta de conhecimento
sobre o destino desses compostos no ambiente - biodegradação das moléculas e dos metabólitos
intermediários - e, também, sobre a toxicidade quando aplicados in situ (HAIGH, 1996; DI GIOIA et
al., 2004).
1.5.1. Biodegradação
A biodegradabilidade de surfactantes é um atributo que pode ter efeitos positivos e
negativos no seu uso para biorremediação. Os efeitos negativos podem ser causados pelo
esgotamento de minerais e oxigênio, pela toxicidade de seus intermediários ou pela degradação
preferencial do surfactante, em detrimento da degradação do poluente-alvo (TIEHM, 1994). O efeito
positivo mais óbvio da degradação do surfactante é a sua remoção do local onde foi aplicado.
Muitos dos surfactantes podem ser degradados pelos microrganismos. Contudo, a
degradação de alguns surfactantes sintéticos por atividade microbiana pode levar à geração de
metabólitos tóxicos (VAN GINKEL et al., 1996). Além disso, alguns surfactantes sintéticos aplicados
em processos de remediação podem ser persistentes sob condições anaeróbias, como os
sulfonatos alquilbenzenos lineares (LAS). O LAS é um tensoativo aniônico constituído de uma
mistura de homólogos e isômeros de posição de cadeias alquiladas lineares variando de C10 a C16
com predominância de C10 a C13 (PENTEADO et al., 2006). Entre os fatores que afetam a
biodegradação de LAS está sua estrutura. O tamanho da cadeia linear e a posição do grupo fenil
na cadeia alquílica interfere na constante de biodegradação (k) (PENTEADO et al., 2006).
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
26
O principal mecanismo de biodegradação aeróbio dos surfactantes aniônicos envolve a
degradação da cadeia alquílica, seguida do grupo hidrofílico. A quebra da cadeia alquílica é
iniciada com a oxidação do grupo metil terminal, o qual, por meio de oxidação enzimática (oxidação
ω), é transformado em álcool, aldeído e, posteriormente, em ácido carboxílico (Figura 1.12A). Por
sua vez, o ácido carboxílico é submetido à oxidação que é catalisada por enzimas do tipo alcano
monooxigenase e deidrogenases (Figura 1.12B). Esse mecanismo de degradação ocorre
predominantemente na natureza (Figura 1.12) (SCHLEHECK, 2003).
Estudo sobre a biodegradabilidade de surfactantes, um biológico (ramnolipídeo) e um
sintético (Triton X-100), sob condições aeróbias, de redução de nitrato, de redução de sulfato e em
condições de fermentação, indica que o ramnolipídeo é superior ao Triton X-100 em termos de
biodegradabilidade, pois ele é biodegradável em todas as condições, enquanto que o Triton X-100
é parcialmente biodegradável sob condição aeróbia e não-biodegradável nas demais condições
(MOHAN et al., 2006).
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
27
Figura 1.12. Mecanismo de oxidação (A) ω e (B) β da cadeia alquílica durante a degradação de
surfactante aniônico. Adaptada de SCHLEHECK (2003).
C C C R XH
H
H
H
H
H
H
NADH O2
NAD+ H2O
C C C R XO
H
H
H
H
H
H
H
C C C R XH
H
H
H
H
O
C C C R XO
H
H
H
H
O
H
C C C R XA
H
H
H
H
O
CoS
Acildesidrogenase
SH CoA
C CA
H
O
C R X
H
CoS
Acilhidrolase H2O
C CA
H
O H
C R X
H
OH
CoS
Acildesidrogenase
C CA
H
O H
C R X
O
CoS
SH CoA
S CoA C
O
CH3 S CoA C
O
R X
(A)
(B)
ω-oxidação β-oxidação
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
28
1.5.2. Efeitos Tóxicos
Em análises comparativas, os tensoativos biológicos geralmente apresentam toxicidade
inferior à dos sintéticos (POREMBA et al., 1991; MAKKAR & ROCKNE, 2003; MULLIGAN, 2005)
(Tabela 1.4). Essa baixa toxicidade dos tensoativos biológicos às bactérias e a outros organismos
unicelulares é uma das principais características que levam os biossurfactantes a estimularem a
decomposição bacteriana de substâncias orgânicas hidrofóbicas (MORAN et al., 2000; HUA et al.,
2003). Nos surfactantes sintéticos, como os Alquilbenzenos Sulfonados Lineares (LAS), a
toxicidade a bactérias é atribuída ao efeito tóxico sobre as membranas (BRANDT et al., 2001), o
que, em alguns casos, pode inibir a decomposição bacteriana de substâncias orgânicas
hidrofóbicas (LINDSTROM & BRADDOCK, 2002).
Os biossurfactantes distinguem-se dos surfactantes sintéticos pelas suas propriedades
tensoativas extremamente suaves. Isso significa que apresentam uma alta compatibilidade com as
membranas biológicas. Essa característica é atribuída geralmente à sua estrutura polimérica e ao
seu conteúdo de grupos polifuncionais, que fazem com que essas substâncias apresentem, em
regra, uma menor polaridade que os surfactantes sintéticos. Uma das conseqüências dessas
características estruturais é o fato dos tensoativos biológicos formarem agregados, as micelas, com
uma menor carga eletrostática. Como resultado dessa propriedade, os biossurfactantes
apresentam uma maior compatibilidade com membranas biológicas quando comparados com
muitos dos tensoativos sintéticos utilizados para tratamento de ambientes contaminados com
compostos orgânicos hidrofóbicos (AL-TAHHAN et al., 2000; HUA et al., 2003). Nesses processos,
a presença de biossurfactantes propicia uma interação entre os compostos orgânicos hidrofóbicos
e a superfície celular dos microrganismos. Este fato não surpreende, dado que muitos dos
surfactantes sintetizados pelas bactérias, mesmo sob condições naturais, têm como função a de
regular a adesão de células bacterianas às superfícies de substratos lipofílicos (VAN HAMME et al.,
2006).
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
29
Tabela 1.4. Toxicidade de biossurfactantes comparada aos surfactantes sintéticos
Natureza do surfactante
Surfactante CE50 (mg L-1)
Biológico Rhodococcus ruber - Glicolipídeo 650 Biológico Rhodococcus erytrhropolis - Trealose tetraéster 49 Biológico Pseudomonas aeruginosa -Ramnolipídeo 1000
Sintético Finasol OSR-5® 7 Sintético Coretix 9597® 5
*CE50= Concentração efetiva que causa mortalidade a 50% dos organismos-teste, num determinado período de exposição. Adaptada de IVSHINA et al. (1998).
A toxicidade de surfactantes é avaliada considerando-se a estrutura química e outros
fatores que determinam o comportamento dessa classe de compostos. O principal dentre esses
fatores é a estrutura química. A toxicidade de surfactantes aniônicos e não-iônicos é uma função do
comprimento da cadeia alquil. Um aumento no comprimento da cadeia alquil corresponde a um
aumento na toxicidade do surfactante aniônico LAS e de outros surfactantes aniônicos (MANN,
2000). A toxicidade de uma substância depende, além de sua própria natureza, de fatores físico-
químicos (pH, temperatura e salinidade), do organismo-teste, da concentração da substância e das
condições impostas para o teste (KOZLOVA et al., 2004).
A proposta geral dos testes de toxicidade é estabelecer o impacto potencial de substâncias
químicas sobre a biota de um dado ambiente. A informação adquirida pode ser usada para se
administrar o tratamento ou para a liberação do uso de substâncias químicas.
Microrganismos são úteis nos testes de ecotoxicidade, pois podem ser avaliados em um
curto tempo e ocupam níveis tróficos onde a bioacumulação é problema potencial (VAN BEELEN &
DOELMAN, 1997). Os testes de toxicidade bacteriana medem uma ampla variedade de “endpoints”
e incluem testes de mutagenicidade (AMES et al., 1988 citado por LAYTON et al., 1999),
crescimento populacional (NENZDA & SEYDEL, 1988), produção de CO2 (JARDIN et al., 1990),
biossíntese enzimática, mineralização da glicose (RETEUNA et al., 1989) e a inibição da
bioluminescência (RIBO & KAISER, 1987 citado por LAYTON et al., 1999). Entre os bancos de
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
30
dados de toxicidade bacteriana, o mais amplo refere-se à inibição da bioluminescência em Vibrio
fischeri ou ao ensaio MICROTOX (KAISER & DEVILLERS citados por LAYTON et al., 1994).
A falta de maior compreensão dos mecanismos que envolvem a interação de surfactantes
com poluentes orgânicos hidrofóbicos, organismos e componentes do solo, leva a muitas
controvérsias com respeito à aplicação de surfactantes em biorremediação de solos contaminados
com compostos orgânicos hidrofóbicos (ZIQING OU, 2000). Isto também é indicativo da
necessidade de pesquisas sobre biodegradabilidade e toxicidade de surfactantes antes da sua
aplicação em processo de biorremediação de ambientes contaminados. Idealmente, os
surfactantes não devem causar uma poluição secundária, como resultado de sua aplicação em
processo de remediação.
1.6. APLICAÇÃO DE SURFACTANTES NA REMOÇÃO DE METAIS PESADOS E HIDROCARBONETOS POLIAROMÁTICOS (PAH’s)
A escolha da técnica para descontaminação de solos e sedimentos é determinada por
características do local contaminado e do(s) tipo(s) e concentração(s) do(s) poluente(s) presente(s).
Os hidrocarbonetos poliaromáticos (PAH’s) constituem um dos principais grupos de contaminantes
freqüentemente encontrados, juntamente com os hidrocarbonetos não-voláteis, hidrocarbonetos
voláteis, pesticidas orgânicos, bifenilas policloradas (PCB’s) e metais pesados (CASTELO-
GRANDE & BARBOSA, 2003). Os tratamentos de remediação para esses grupos, em solos e
sedimentos, podem ser denominados em função do local de aplicação, “in situ” ou “ex situ”. Podem
também ser baseados na ação usada na remediação do solo, sendo classificados em: térmicos,
biológicos, físico-químicos e métodos especiais, a exemplo da eletrocinese, que não se enquadra
nas classes anteriores (BOULDING, 1995) (Tabela 1.5). Esses métodos podem ser utilizados como
tratamentos únicos ou combinados, e cada tecnologia é específica para uma faixa de
contaminantes.
Dentre os processos físico-químicos, os métodos atualmente mais usados baseiam-se na
lavagem do solo (“Soil washing” e “Soil flushing”) (Tabela 1.5) (DENNIS et al., 1992). Esses
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
31
processos fundamentam-se na transferência de um contaminante do solo para um receptor de fase
líquida ou gasosa. Os principais produtos desses processos são os solos tratados e os
contaminantes concentrados. O processo específico de tratamento depende do(s) tipo(s) de
contaminante(s), especialmente no que se refere ao tipo de ligação que o(s) mesmo(s) estabelece
com as partículas do solo.
Tabela 1.5. Técnicas para remediação de áreas contaminadas
Método Tratamento Resíduo
Físico-químico:
Soil washing Ex situ (In)orgânicos; materiais radioativos Soil flushing In situ (In)orgânicos; materiais radioativos Solidificação /Estabilização In situ Cátion metálico; termoplásticos
Biológico:
Biorremediação aeróbia In situ; ex situ Resíduos orgânicos biodegradáveis Biorremediação anaeróbia In situ; ex situ Resíduos orgânicos halogenados Compostagem Ex situ Resíduos orgânicos biodegradáveis
Térmico:
Incineração In situ; ex situ Resíduos orgânicos Vitrificação In situ; ex situ Resíduos inorgânicos e alguns orgânicos Dessorção térmica In situ; ex situ Orgânicos voláteis e semi-voláteis
Adaptada de BOULDING (1995).
“Soil washing” é um processo ex situ em que se usa a água para a extração e a separação
de contaminantes. As etapas envolvidas no processo incluem a escavação, a fragmentação, a
separação granulométrica, a lavagem das diferentes frações e a solução sobre o destino a se dar
aos resíduos finais (GRIFFITHS, 1995).
“Soil flushing” é uma técnica de lavagem in situ que utiliza água ou agentes de extração
para mobilizar os contaminantes presentes (WASAY et al., 2000). O processo de “Soil flushing”
pode ser dividido em três etapas, a saber: caracterização do local, injeção de fluido e a utilização
de técnicas para mobilizar e recuperar o contaminante. Trata-se de uma técnica em que se
preenche o solo com uma solução que direciona o contaminante para uma área em que ele possa
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
32
ser removido. Características específicas do meio físico e do contaminante vão determinar o tipo de
solução flushing necessária. A solução flushing é utilizada de dois modos: somente água ou água
mais aditivo, ácidos orgânicos ou inorgânicos, agentes quelantes ou surfactantes.
“Soil washing” e “soil flushing” são técnicas utilizadas para se remover do solo uma ampla
faixa de contaminantes, incluindo orgânicos, inorgânicos e radioativos. O uso da água é o mais
econômico; contudo, a água tem uma baixa capacidade de complexar e é ineficaz em solos
contaminados com concentrações elevadas de metais e contaminantes orgânicos hidrofóbicos.
Solos contaminados com metais pesados e PAH’s requerem lavagem com água contendo agentes
de remediação. No entanto, por se tratar de classes de contaminantes que apresentam
comportamento químico distinto, há geralmente a necessidade de se utilizarem diferentes aditivos,
os quais permitem a mobilização simultânea dos metais e dos compostos hidrofóbicos.
Normalmente, metais pesados são mobilizados com a utilização de ácidos e agentes quelantes
(PETERS, 1999; REDDY & CHINTHAMREDDY, 2000), enquanto que os compostos hidrofóbicos
são removidos com o uso de surfactantes (FAVA & DI GIOIA, 1998; CHU & KWAN, 2003).
1.6.1. Agentes de Remediação para Metais Pesados
Em processos de remediação aplicados a metais pesados, são utilizados agentes de
extração como ácidos orgânicos ou inorgânicos, agentes quelantes e surfactantes (ABUMAIZAR &
SMITH, 1999; REDDY & CHINTHAMREDDY, 2000; NEILSON et al., 2003). Como os metais
pesados são relativamente móveis no solo, principalmente em condições de pH abaixo de 6,0, os
ácidos fortes têm sido utilizados como agentes de extração eficientes na remoção desses
contaminantes. Em um estudo envolvendo sete solos contaminados, o percentual de remoção de
chumbo (Pb2+) com o uso de ácidos fortes variou de 22 a 93%, variação atribuída ao possível fato
do íon Pb2+ ligar-se mais fortemente em alguns tipos de solos do que em outros (VAN
BENSCHOTEN et al., 1997). Ácidos orgânicos de baixo peso molecular, como citrato ou tartarato,
também são efetivos na solubilização de metais pesados ligados a frações minerais pouco solúveis
do solo, por formarem complexos estáveis com os íons metálicos. A avaliação do efeito de ácidos
orgânicos de baixo peso molecular, em comparação com sais inorgânicos, CaCl2 e NaNO3, no
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
33
tempo de residência e na dessorção de Cu, Cd e Pb de solos, demonstrou que os ligantes
orgânicos desempenharam papel dominante na dessorção dos metais (QIN et al., 2004). Agentes
quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ácido nitrilitriacético (NTA) também são
usados para lixiviar metais de solos, por serem capazes de se complexar fortemente com metais
(WASAY et al., 1998).
Embora os ácidos fortes e os agentes quelantes sejam eficazes como agentes de
remediação de metais pesados de solo, estes não são ambientalmente aceitos por serem tóxicos e
por causarem distúrbios nas propriedades físicas, químicas e biológicas do solo. Agentes
quelantes, como EDTA, podem extrair, além dos metais pesados, importantes elementos do solo,
como Ca, Mg e Fe (WASAY et al., 1998).
Alguns surfactantes, sintéticos ou biológicos, possuem elevada eficácia para remover
metais do solo, com efeitos tóxicos menores que os causados por ácidos e agentes quelantes. A
adição de surfactantes aniônicos e não-iônicos pode melhorar a eficiência de extração de Cd, Pb e
Zn, enquanto que a adição de surfactantes catiônicos diminui a eficiência de extração de metais
pesados (DOONG et al., 1998).
Estudos demonstram que o biossurfactante ramnolipídeo, produzido por várias linhagens
de Pseudomonas aeruginosa, é capaz de complexar preferencialmente com metais pesados. Os
cátions de maior a menor afinidade com ramnolipídeo são Cu2+ > Pb2+ > Cd2+ > Zn2+ > Fe3+ > Hg2+ >
Ca2+ > Co2+ > Ni2+ > Mn2+ > Mg2+ > K+. A afinidade do ramnolipídeo com metais pesados é superior
à de cátions que são comuns no solo como Ca2+, Mg2+ e K+. Isto mostra o potencial do
ramnolipídeo na remoção de metais pesados presentes como contaminantes de solos (MULLIGAN,
2005).
1.6.2. Agentes de Remediação para Hidrocarbonetos Poliaromáticos (PAH’s)
Os agentes de remediação mais usados para solos contaminados com compostos
orgânicos hidrofóbicos são os solventes, os agentes complexantes e os surfactantes. Por serem
compostos lipofílicos com baixa solubilidade em água, os PAH’s tendem a se ligar à matéria
orgânica do solo. Além disso, PAH’s são relativamente persistentes em solos e apresentam baixa
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
34
biodegradabilidade sob condições naturais, comparativamente a outros contaminantes orgânicos
(ZHAO et al., 2005).
O processo de lavagem de solo contaminado com 4,4’-diclorobifenil pode ser realizado com
soluções de agentes de extração constituídas por combinações de solventes e surfactantes, a
exemplo das preparadas com três solventes, acetona, trietilamina e esqualeno, e três surfactantes,
Brij 35, Tween 80 e SDS® (CHU & KWAN, 2003). A combinação acetona/Brij 35 mostrou-se como
a melhor, promovendo a remoção de 82-95% do contaminante.
Surfactantes são um dos mais populares agentes de extração para solos contaminados
com PAH’s. Visto que as moléculas de surfactantes possuem um grupo hidrofílico e um grupo
hidrofóbico, os PAH’s podem ser solubilizados, em fase aquosa, na fase hidrofóbica das micelas.
Em um estudo de mobilidade de contaminantes em solos, diferentes agentes de lixiviação, como
água destilada, ácido húmico, fosfolipídeos e dodecil sulfato de sódio (SDS®) foram utilizados para
se avaliar a mobilização de PAH’s e PCB’s (HIRNER et al., 1998). Dentre eles, o SDS® foi
considerado como o agente lixiviante mais adequado para a mobilização dos contaminantes
orgânicos, sugerindo que a solubilização dos contaminantes foi causada pela interação entre os
contaminantes hidrofóbicos e a cadeia de hidrocarboneto do SDS®.
1.6.3. Mecanismos de Remoção por Surfactantes
Em operações de remoção de PAH’s de solos e sedimentos, têm sido extensivamente
empregados os surfactantes como agentes de lavagem nos processos “Soil washing” e “Soil
flushing (BILLINGSLEY et al., 2002; CHU & KWAN, 2003). Somente tipos especiais de surfactantes
podem remover metais, mas os mesmos não são muito efetivos na remoção simultânea de PAH’s.
Entre os mecanismos de ação de surfactantes avaliados em processos de dessorção de PCB’s,
PAH’s, hexaclorobenzeno e tetraclorofenol (PARK & BOYD, 1999; CHU & CHAN, 2003), o principal
mecanismo de dessorção foi o da partição dos contaminantes orgânicos nas micelas, por meio de
interações hidrofóbicas.
Os mecanismos envolvidos na remoção de metais são diferentes dos envolvidos na
dessorção de PAH’s, e também dependem dos tipos de metais e surfactantes. A remoção de
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
35
metais do solo com o uso de uma solução contendo surfactina, produzida por B. subtilis, removeu
os metais pesados Cd, Cu, Pb e Zn após sua sorção a superfícies do solo, seguida pela
solubilização do metal causada pela redução da tensão superficial e atração eletrostática e,
finalmente, incorporação do metal nas micelas do biossurfactante (Figura 1.13) (MULLIGAN et al.,
1999).
Figura 1.13. Mecanismos de remoção de metal pelo biossurfactante Surfactina. Adaptada de
MULLIGAN et al., 1999.
1.6.4. Complexação de Metais na Solução de Surfactante-ligante
Complexação de metais é a reação que leva à ligação de um íon metálico e um ligante,
pelo compartilhamento de elétrons. O íon metálico serve como aceptor de elétrons e o ligante como
doador (SHIN et al, 2000).
Os estudos do comportamento de complexação de metal em micelas de surfactantes têm
mostrado que a complexação de metais em solução micelar é diferente da que ocorre em solução
aquosa (UMEBAYASHI et al., 1997; SHIN et al, 2000; UMEBAYASHI et al., 2001). A interação
grupo aniônico
micela
metal adsorvido
Monômero de surfactante
Solo contaminado com metal
metal
1. Acumulação de surfactante como hemimicelas na interface do solo. 2. Remoção de metal pela redução da tensão interfacial e atração eletrostática. 3. Incorporação de metal na micela.
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
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entre o íon tiocianato (SCN-) e uma série de íons metálicos em solução micelar mostra que
[Co(NCS)4]2- e [Zn(NCS)4]2- são comumente formados em solução micelar, enquanto que estas
espécies são raramente formadas em solução aquosa (UMEBAYASHI et al., 1997). Em um estudo
da complexação de Cd2+ com o I-, foi observada a formação de [CdI3]2- e [CdI4]2- em ambas as
fases, micelar e aquosa, e a formação dos complexos foi melhorada na fase micelar (SHIN et al.,
2000). A complexação em micelas obteve um valor de entalpia (-15 kJ mol-1) superior ao valor
obtido em fase aquosa (-5 kJ mol-1).
1.6.5. Aplicações de complexo Surfactante-ligante
Atualmente, técnicas de extração mediada por micela de surfactante, particularmente
aquelas em que se utilizam vários ligantes, têm sido aplicadas para a remoção de íons metálicos
como os de Cd, Cu, Zn, Co e Ni (AKITA et al., 1999; UDIN & KATHIRESAN, 2000). O uso de
surfactantes em combinação com um ligante inorgânico, a exemplo do iodeto ou tiocianato, pode
melhorar a complexação dos surfactantes com os íons metálicos. O íon ligante forma um complexo
com o íon metálico na solução de surfactante, reduzindo seu caráter hidrofílico e permitindo a sua
adsorção dentro da micela. A formação do complexo metálico em pseudo-fase micelar de
surfactante não-iônico foi demonstrada por SHIN et al. (2000).
O uso do ligante hidrofóbico 1-fenil-3-isoetil-1,3-propanodiona, combinado com o
surfactante catiônico CTAB (brometo de n-hexadeciltrimetilamônio), promoveu a remoção de Cu
(FILLIPI et al. (1997). Com a técnica de ultra-filtração, AKITA et al. (1999) usaram um surfactante
não-iônico com um ligante hidrofóbico para efetivamente separar Co e Ni de uma solução aquosa.
A remoção de contaminantes de ambientes com uso de surfactantes, especialmente de
metais pesados e poluentes orgânicos hidrofóbicos, é uma técnica considerada como de eficácia
comprovada (MULLIGAN, 2005) e à adição de ligantes a solução de surfactantes pode melhorar a
sua eficiência. Atualmente, as pesquisas que envolvem a utilização de ligantes em combinação
com surfactantes, têm sido limitadas ao uso de surfactantes sintéticos e à descontaminação de
soluções (SHIN et al., 2000). O comportamento de complexação de metal com íons ligantes, como
o iodeto e o tiocianato em solução de biossurfactante, pode ser aplicado a solos contaminados.
Capítulo 1. Revisão Bibliográfica
37
Íons ligantes específicos podem extrair metais pesados de solos, reduzindo seu caráter hidrofílico e
permitindo a sua adsorção dentro da micela de surfactante. Em razão desse comportamento,
infere-se a possibilidade de remoção simultânea de metais pesados e compostos orgânicos
hidrofóbicos de solos com a utilização de uma solução de surfactante contendo um íon ligante.
Com isso, infere-se como inovadora e factível a idéia de se utilizar de soluções contendo
biossurfactantes e um íon ligante para remover simultaneamente metais pesados e PAH’s de solos
contaminados.
O presente trabalho focaliza o estudo de biossurfactantes produzidos por isolados de
Bacillus subtilis LBBMA 155, Bacillus sp. LBBMA 111A, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia
maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201, previamente selecionados como produtores
de biossurfactantes e pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Biotecnologia e
Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) do Departamento de Microbiologia da Universidade
Federal de Viçosa, Minas Gerais, quanto às características estruturais das moléculas, bem como as
propriedades físico-químicas desses compostos. Além disso, as características de
biodegradabilidade e toxicidade dos biossurfactantes são também determinadas, com vistas à sua
aplicação em processos biotecnológicos, a exemplo da mobilização simultânea de fenantreno e
cádmio de solo.
Capítulo 1. Referências Bibliográficas
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Capítulo 1. Referências Bibliográficas
50
CAPÍTULO 2 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FÍSICO-QUÍMICA DE
SURFACTANTES BACTERIANOS
2.1. RESUMO
Surfactantes são compostos com propriedades tensoativas que possuem grupos
hidrofílicos e hidrofóbicos. Os biossurfactantes têm sido amplamente pesquisados, dada a
tendência de substituição dos produtos sintéticos por biológicos em aplicações industriais e
ambientais. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e físico-química de
biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas de ambientes contaminadas com petróleo e
derivados. Os biossurfactantes produzidos pelos isolados Bacillus sp. LBBMA 111A (mistura de
surfactina, fengicina e iturina), Bacillus subtilus LBBMA 155 (surfactina) e Arthrobacter oxydans
LBBMA 201 (artrofactina) foram purificados e quimicamente caracterizados com o uso de técnicas
de Espectrometria de Massas, Infravermelho e Ressonância Magnética Nuclear. Os
biossurfactantes produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 e Dietzia maris LBBMA 191 foram
purificados, mas não puderam ser quimicamente caracterizados. A atividade interfacial dos
surfactantes purificados foi avaliada e a concentração micelar crítica (CMC) foi estimada por
quantificação da tensão superficial pelo método de du Nouy. Os valores de CMC apresentados
pelos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 foram
de 150 mg L-1, 180 mg L-1, 200 mg L-1, 150 mg L-1 e 200 mg L-1, respectivamente. Os
biossurfactantes apresentaram alta capacidade para formarem emulsões consideradas estáveis
com petróleo, tolueno, hexano, querosene e hexadecano, uma vez que seus volumes, 24 horas
após a formação, ainda correspondiam a 50 % ou mais do volume original. A avaliação da
estabilidade dos biossurfactantes purificados foi realizada frente a variações de pH, temperatura e
Capítulo 1. Referências Bibliográficas
51
força iônica (NaCl), quanto à estabilidade da emulsão formada e à variação da atividade interfacial,
utilizando-se o parâmetro tensão superficial referente à CMC. Os surfactantes LBBMA 111A,
LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 mostraram-se termo-estáveis na faixa de 20-
70°C, estáveis em valores de pH acima de 5,0 e resistentes à presença de até 5% de NaCl.
Quando comparados a alguns surfactantes sintéticos, como o SDS®, os biossurfactantes obtidos
neste trabalho apresentaram excelentes propriedades tensoativas, pois além de reduzirem a
tensão superficial para valores abaixo de 40 mN m-1, foram capazes de promover a emulsificação
de petróleo, querosene e hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos puros. Estas propriedades tornam
esses biossurfactantes adequados para uma ampla gama de aplicações industriais e em processos
de remediação de ambientes contaminados com poluentes orgânicos.
Palavras-chave: Surfactante; SDS; Purificação; CMC; Estabilidade de emulsão.
Capítulo 2. Introdução
52
2.2. INTRODUÇÃO
A maioria dos surfactantes disponíveis comercialmente é sintetizada a partir de derivados
de petróleo. Com o aumento da preocupação entre os consumidores, combinada com novas
legislações de controle ambiental, o interesse em biossurfactantes tem aumentado
significativamente em decorrência de serem naturalmente biodegradáveis e de baixa toxicidade,
diminuindo assim o impacto ambiental (BARROS et al., 2007).
Os surfactantes possuem estruturas moleculares com grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, os
quais determinam propriedades como detergência, emulsificação, lubrificação, ação espumante,
capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases. Estas moléculas são categorizadas em
quatro grupos: catiônicos, aniônicos, não-iônicos e zwiteriônicos (anfotéricos). Esta classificação é
baseada na natureza do grupo hidrofílico. A estrutura do grupo polar tem sido usada para
subcategorizar os biossurfactantes nas seguintes classes: glicolipídeos, lipopeptídeos,
fosfolipídeos, ácidos graxos, além de surfactantes poliméricos e surfactantes particulados
(CHRISTOFI & IVSHINA, 2002). Tensão superficial, estabilização de emulsão e balanço lipofílico-
hidrofílico (HLB) são usados como indicadores para atividade de surfactantes (MANEERAT, 2005).
Os biossurfactantes apresentam a vantagem de possuírem grande diversidade química,
possibilitando aplicações específicas para cada caso particular. Além disso, possuem
características estruturais e propriedades físicas distintas, que os tornam compatíveis ou superiores
aos surfactantes sintéticos, em termos de eficiência e efetividade. Outra vantagem reside no fato de
não serem compostos derivados de petróleo, fator importante à medida que aumentam os preços
desse produto. Além disso, a possibilidade de modificação da estrutura química e das propriedades
físicas dos biossurfactantes, através de manipulações genéticas, biológicas ou químicas, permite o
desenvolvimento de produtos para necessidade especificas (MULLIGAN, 2005).
A recuperação e concentração do biossurfactante dos meios de cultura é que irão
determinar a viabilidade da produção em larga escala. Geralmente, a baixa concentração e a
estrutura do biossurfactante limitam a extração. Diferentes métodos são usados nos processos de
extração, como a ultra-centrifugação, ultra-filtração, precipitação com ácido ou sal, extração por
solvente e adsorção em cromatografia. Uma grande variedade de solventes, a exemplo de hexano,
Capítulo 2. Introdução
53
etanol, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetona e metanol tem sido usada na forma pura ou
combinada nos processos de extração. As misturas mais efetivas são aquelas que utilizam
clorofórmio e metanol, que facilitam o ajuste de polaridade da molécula de biossurfactante que se
pretende extrair (MESQUITA, 2004).
A elucidação estrutural de biossurfactantes é baseada em espectroscopia de ressonância
magnética nuclear (NMR) e espectrometria de massa (MS). Atualmente, os progressos em técnicas
de purificação, como cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) com fase reversa e a
disponibilidade de técnicas espectroscópicas melhoradas, como NMR, MS com bombardeamento
de átomos rápidos (FAB-MS) e, mais recentemente, MS - tempo de vôo – ionização/dessorção a
laser assistida por matriz (MALDI-TOF-MS), têm demonstrado que novas estruturas de
biossurfactantes podem ser determinadas em tempos relativamente curtos e com o uso de
amostras muito pequenas (BODOUR et al., 2004).
As estruturas de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies microbianas vêm
sendo elucidadas com o uso das técnicas atualmente disponíveis. Assim, compostos
bioemulsificadores produzidos por Pseudomonas putida ML2 foram purificados por cromatografia
de filtração gélica e cromatografia de camada fina (TLC) e, a seguir, as estruturas determinadas por
meio de técnicas bidimensionais de NMR (BONILA et al., 2005). Outros autores isolaram
flavolipídeos de culturas de Flavobacterium sp. MTN11 com o uso de cromatografia líquida (LC) e
TLC e identificaram as estruturas por técnicas de FAB-MS e MALDI-TOF-MS e NMR (BODOUR et
al., 2004). Soforolipídeos podem ser purificados em HPLC e TLC e as estruturas determinadas por
espectroscopia de NMR (1H e 13C) e cromatografia gasosa (GC) acoplada a MS (ASMER et al.,
1988).
Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e físico-química de
biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas de ambientes contaminadas com petróleo e
derivados, visando à obtenção de estruturas moleculares promissoras a serem aplicadas em
processos industriais e biotecnológicos.
Capítulo 2. Material e Métodos
54
2.3. MATERIAL E MÉTODOS
2.3.1. Microrganismos
Cinco isolados bacterianos previamente selecionados como produtores de biossurfactantes
entre os pertencentes à coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de Biotecnologia e
Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) foram utilizados em estudo das características
estruturais e das propriedades físico-químicas das moléculas de biossurfactantes por eles
produzidos no meio de crescimento.
Os isolados Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilus LBBMA 155, Dietzia maris LBBMA
191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 foram cultivados no meio mineral (MM) M1 (LIMA, 2003)
(ANEXO 1), enquanto que o isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168 foi cultivado no meio mineral
(MM) descrito por BODOUR & MAIER (1998) (ANEXO 1).
2.3.2. Condições de Cultivo e Produção dos Biossurfactantes
Os isolados foram reativados em meio R2A (REASONER & GELDREICH, 1985) por 18
horas. Frascos erlenmeyer de 1,0 L contendo 500 mL do meio mineral suplementado com glicose a
2% (p v-1) e hexadecano a 2% (v v-1) (adicionado após o esgotamento da glicose), foram inoculados
com um volume de inóculo suficiente para se obter uma densidade ótica a 600 nm correspondente
a 0,02. Os frascos foram incubados sob temperatura de 30 °C e agitação constante de 200 rpm,
por sete dias. O consumo da glicose disponível foi avaliado a cada 3 horas pelo reagente GOD-
PAP (Merck System, Darmstadt, Germany). O isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168 foi cultivado
em meio contendo somente a glicose como fonte de carbono, sob as mesmas condições de
incubação dos demais isolados.
A produção de biossurfactantes foi avaliada no sobrenadante, obtido após centrifugação a
12.000g por 20 minutos, pelo método do anel de du Nouy (COOPER et al., 1979), utilizando-se um
tensiômetro (Fisher Surface Tensiomat, Modelo 21, Pittsburgh, EUA).
Capítulo 2. Material e Métodos
55
2.3.3. Extração e Purificação dos Biossurfactantes
A purificação e o isolamento dos biossurfactantes produzidos foram realizados após a
remoção das células do meio por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 25 °C), seguida de filtração
em membrana de 0,45 μm. A extração primária dos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e
LBBMA 201 foi realizada por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para 2,0 com HCl 12
mol L-1, seguindo-se incubação a 4°C “overnight”. Os biossurfactantes precipitados foram
recuperados por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 20°C) (VATER et al., 2002) e dissolvidos em
água pH 7,0. O biossurfactante LBBMA 168 foi recuperado com o uso de célula de ultra-filtração
(modelo Amicon), munida de membrana com limite de exclusão de 1.000 Daltons (LIN et al. 1998).
Os biossurfactantes nos extratos semi-purificados foram extraídos utilizando-se
combinação de clorofórmio e metanol (CHCl3:CH3OH:extrato 2:1:3). Após evaporação dos
solventes em evaporador rotativo, os extratos foram submetidos à cromatografia de camada
delgada (CCD) em placas de sílica gel 60 F254 (VETEC). As moléculas de biossurfactantes foram
eluídas com os sistemas CHCl3/CH3OH/H2O (65:15:1 v v-1) ou CHCl3/CH3OH (60:40 v v-1), para
verificação da pureza dos compostos presentes nos extratos brutos. Os componentes plotados nas
placas de CCD foram visualizados sob lâmpada UV (254 nm) e revelados pela aplicação de
ninhidrina a 0,2% (p v -1) (Riedel de Haen, Seelze, Germany) ou H2SO4 a 3 mol L-1 (v v-1), seguida
do aquecimento das placas a 100°C por 5 minutos (HOROWITZ et al., 1990). A ninhidrina foi
utilizada como revelador específico para grupos amino e o ácido sulfúrico para verificar a presença
de outros componentes possivelmente presentes nos extratos brutos (HOROWITZ et al., 1990).
As frações impuras foram fracionadas em cromatografia de camada delgada preparativa
(CCDP) e eluídas com o sistema CHCl3/CH3OH/H2O (65:15:1 v v-1), para separação dos compostos
presentes nas misturas. Para isso, utilizou-se placa de sílica gel 60 F254 (VETEC), com revelação
sob luz UV. As bandas correspondentes aos biossurfactantes foram coletadas, ressuspendidas
com a mesma fase móvel e submetidas à evaporação em evaporador rotativo. A separação dos
biossurfactantes foi confirmada por CCD, nas condições descritas acima. Os biossurfactantes
purificados foram devidamente pesados, quantificados e submetidos às análises para determinação
de sua composição química.
Capítulo 2. Material e Métodos
56
2.3.4. Análise da Composição Química dos Biossurfactantes
2.3.4.1. Espectroscopia de Infravermelho (FT-IR)
Amostras dos biossurfatantes purificados foram submetidas à espectroscopia de
infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), utilizando um espectrômetro Perkin Elmer FT-
IR modelo Spectrum One. As amostras foram solubilizadas em um pequeno volume de clorofórmio
e aplicadas em pastilha de cloreto de sódio. Após evaporação do solvente em ambiente livre de
umidade, o espectro foi gerado entre 500-4000 cm-1 com resolução de 4 cm-1.
2.3.4.2. Espectrometria de Massa - Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz
com Tempo de Vôo- (MALDI-TOF-MS)
Um espectrômetro de massas MALDI-TOF (Bruker Daltonics Reflex) equipado com um
laser de nitrogênio (λ: 337 nm) foi usado para determinação do peso molecular dos
biossurfactantes purificados. Para análise, a amostra de biossurfactante purificado foi eluída com
10 μL de solução matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico em acetonitrila 70% contendo 0,1% de
TFA). A mistura resultante (1 μL) foi adicionada à placa alvo de alumínio MTP 384 (Bruker
Daltonics), seca ao ar e submetida à análise para obtenção dos espectros (VATER et al., 2002).
2.3.4.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
As amostras de biossurfactantes purificados (20,0 mg) foram solubilizadas em 0,4 mL de
clorofórmio deuterado (CDCl3) e acondicionadas em tubos de vidro de 5 mm de diâmetro externo
(BODOUR et al., 2004). Os espectros convencionais de uma dimensão, RMN de 1H e 13C, foram
adquiridos em espectrômetro Varian Mercury modelo 300 (Palo Alto, Califórnia, USA), operando na
freqüência de 300 MHz FT-NMR.
2.3.5. Interpretação dos Dados Espectrométricos e Espectroscópicos
Com base nas informações estruturais obtidas pelos métodos espectrométricos e
espectroscópicos, foi definida a classe de grupo funcional à qual o biossurfactante pertence e a
Capítulo 2. Material e Métodos
57
estrutura total ou parcial do composto. Após uma pesquisa na literatura, as propriedades do
composto foram comparadas com compilações existentes de dados publicados para todos os
compostos de biossurfactantes já estudados. Os dados espectrais foram comparados com
espectros-referência obtidos de compostos conhecidos.
2.3.6. Caracterização Físico-Química dos Biossurfactantes Purificados
2.3.6.1. Concentração Micelar Crítica (CMC)
A CMC dos biossurfactantes purificados foi estimada pela medição da tensão superficial
pelo método do anel de du Nouy (COOPER et al., 1979). As diluições do biossurfactante foram
preparadas em água deionizada, sendo a tensão superficial das diluições do biossurfactante
quantificada em tensiômetro (Fisher Scientific, Pittsburgh, EUA). A CMC foi estimada após a
elaboração de gráficos de tensão superficial versus diluição do biossurfactante, como o recíproco
da diluição micelar crítica, na qual a tensão superficial começa a aumentar (COOPER et al., 1979).
Essa avaliação foi realizada com duas repetições para cada biossurfactante, sendo que cada
repetição foi avaliada em duplicata.
2.3.6.2. Atividade de Emulsificação e Estabilidade da Emulsão
A avaliação da capacidade de emulsificação de hidrocarbonetos líquidos, puros ou em
misturas (querosene, petróleo, hexadecano, hexano ou benzeno), foi realizada utilizando-se os
biossurfactantes purificados e segundo a metodologia descrita por COOPER & GOLDENBERG
(1987). Soluções dos biossurfactantes (2 mL) em concentração equivalente a 2CMC foram
misturadas a 2 mL do hidrocarboneto em um tubo de vidro de 100 mm X 15 mm. A mistura foi
agitada por dois minutos em tubo vedado com Parafilm (American National Can TM) e deixada em
repouso por dois minutos, medindo-se a seguir o volume da emulsão formada. A estabilidade da
emulsão foi avaliada em intervalos de tempo até 48 h após o início do ensaio. O índice de
emulsificação (E %) foi determinado medindo-se a altura da camada emulsionada (cm), dividindo-
se a mesma pela altura total do líquido e multiplicando-se o valor obtido por 100.
Capítulo 2. Material e Métodos
58
A emulsão foi considerada estável se seu volume, 24 horas após a sua formação,
correspondesse a 50 % ou mais de seu volume original (WILLUMSEM & KARLSON, 1997).
As emulsões formadas pelos biossurfactantes foram comparadas às formadas pelo
surfactante sintético SDS®, a uma concentração de 0,5% (p v-1) em água deionizada. Essa
concentração de SDS® foi escolhida por ser maior do que a sua concentração micelar crítica,
estimada em 0,18% (BODOUR & MAIER 1998). As avaliações foram realizadas com duas
repetições para cada biossurfactante.
2.3.6.3. Determinação do Efeito da Salinidade na Atividade dos Biossurfactantes
O efeito da salinidade sobre a atividade dos biossurfactantes foi investigado. Os
biossurfactantes foram dissolvidos em água deionizada contendo concentração de NaCl variando
entre 0,5 a 20% p v-1 (ILORI et al., 2005), seguindo-se avaliação da CMC e obtenção do índice de
emulsificação.
2.3.6.4. Determinação do Efeito da Temperatura na Atividade dos Biossurfactantes
A atividade dos biossurfactantes foi avaliada em temperaturas variando de 20 a 80°C, a fim
de se determinar a influência dessa variável sobre as características CMC e emulsificação.
Amostras dos biossurfactantes foram diluídas em água deionizada e mantidas em diferentes
temperaturas (ILORI et al., 2005), seguindo-se avaliação da CMC e obtenção do índice de
emulsificação.
2.3.6.5. Determinação do Efeito do pH na Atividade dos Biossurfactantes
O efeito do pH na atividade dos biossurfactantes foi avaliado por meio da mudança do pH
(5,0-9,0) da solução de biossurfactante, segundo o protocolo de ILORI et al. (2005), seguida da
realização da medida da CMC e do ensaio de emulsificação.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
59
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.4.1. Caracterização Estrutural dos Biossurfactantes
2.4.1.1. Caracterização da Composição Química dos Surfactantes Produzidos por
Bacillus sp. LBBMA 111A
O extrato bruto (140 mg L-1) contendo os surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA
111A, obtido após extração líquido-líquido, foi submetido à cromatografia de camada delgada
(CCD). Sob lâmpada UV, a placa de CCD apresentou três manchas que foram reveladas com
ninhidrina, indicando a presença de grupos aminos nos compostos presentes na amostra. A
amostra foi submetida a análises de IV, RMN de H1 e Espectrometria de Massas por MALDI-TOF
para determinação da composição química dessas moléculas.
Após confirmação da mistura de compostos, a fração impura foi fracionada por
cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) e eluída em misturas de clorofórmio e
metanol. Após recuperação das amostras da placa de CCDP, realizou-se a CCD. A revelação sob
luz UV permitiu a visualização de três manchas na placa de CCD, amostra 1 (Rf=0,61), amostra 2
(Rf=0,66) e amostra 3 (Rf=0,72), correspondentes a diferentes compostos e que foram analisadas
em MS-MALDI-TOF para determinação de suas respectivas massas moleculares (Figura 2.1).
P 1 2 3
Figura 2.1. Cromatografia de camada delgada (CCD)
realizada em placa de sílica gel 60 F254 e eluído com
CHCl3/CH3OH (60:40 v v-1). P= Surfactante padrão
Surfactina (SIGMA) (Rf=0,55).
Capítulo 2. Resultados e Discussão
60
N C
H O
N H
C H
A Figura 2.2 mostra o espectro no FT-IV da mistura de surfactantes produzidos por Bacillus
subtilus LBBMA 111A. Pode-se observar banda característica de peptídeos a 3304 cm-1 referente
ao estiramento da ligação N-H. Em 3071 cm-1 foi observada uma banda característica de OH de
ácido carboxílico. As bandas de absorção nas freqüências de 2956 a 2854 cm-1 são referentes a
cadeias alifáticas. A banda em 1722 cm-1 refere-se à absorção de grupo carbonila de anel lactona.
Em 1644 cm-1, observa-se o estiramento da ligação C=O e em 1538 cm-1 a deformação angular de
NH combinado com o estiramento da ligação C-N. Estes resultados indicam que a amostra
analisada contém cadeia alifática bem como uma porção peptídica. O espectro no IR obtido da
amostra analisada mostrou-se muito semelhante ao obtido com a surfactina padrão (SIGMA) por
NITSCHKE (2004).
Figura 2.2. Espectro no IR da mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A.
1644
1538
2956
2854
3071
1722
3304 CO
O
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
120
Abso
rvân
cia
Comprimento de onda (cm-1)
Capítulo 2. Resultados e Discussão
61
A análise por RMN de H1 (300 MHz, CDCl3) confirmou que as moléculas em estudo são
lipopeptídeos (Figura 2.3). O espectro mostrou um dupleto em δ=0,8 referente ao grupo (CH3)2-
CH, indicando a ligação terminal no componente de ácido graxo (SØRENSEN, 2002). O sinal entre
δ1,2-1,6 referente a CH2 indica presença de cadeia alifática longa. Os sinais em δ 7,2 a 8,0 ppm
são devidos aos grupos amida (N-H). Os sinais de hidrogênios α de aminoácidos podem ser
observados entre 4-5 ppm.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
62
Figura 2.3. Espectro de RMN de H1 da (A) mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp.
LBBMA 111A (este trabalho) e (B) da amostra padrão de surfactina (SIGMA). Fonte: WEI & CHU
(1998).
(B)
C H CH 2 9
CαH2C CH2 CO
C OHNHs de aminoácidos Hα s de aminoácidosC CH O
O
C
H3C
H3C
Capítulo 2. Resultados e Discussão
63
O espectro de massas da mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A,
obtido por MALDI-TOF, revelou a presença de grupos de sinais com valores de m/z entre 1030-
1060, 1070-1150 e 1450-1550. Os grupos de sinais podem ser atribuídos às formas protonadas
dos biossurfactantes surfactina, iturina e fengicina, além de seus adutos de Na+ e K+ (Tabela 2.1).
Após eluição da mistura de surfactantes em CCDP, três frações foram obtidas e
submetidas à análise de EM por MALDI-TOF. As moléculas com m/z 1036,11, 1044,19 e 1058,2
foram predominantes na fração 01 de biossurfactante (Tabela 2.1), sendo que a forma mais
abundante foi a com m/z 1058,2, correspondente à surfactina de massa molecular 1035 Da. Esta
molécula apresenta em sua composição um heptapeptídeo, uma cadeia alifática contendo 15
átomos de carbono, juntamente com um íon Na+. Além deste sinal, a molécula 1036,11 Da
apresenta-se na sua forma protonada (H+) e adicionada do íon K+ = 1074,2. A presença dos adutos
de sódio e potássio predomina na amostra, enquanto que as espécies protonadas aparecem em
menor intensidade, dado similar ao obtido por KOUMOUTSI et al. (2004).
O espectro de massas MALDI-TOF da fração 02 mostrou que as espécies com massa
1093,15, 1105,80 e 1121,10 foram os íons predominantes, os quais correspondem às massas de
íons [M+Na]+ do lipopeptídeo iturina, com cadeias de ácidos graxos de 16 ou 17 átomos de carbono
na cadeia lipídica. Os picos predominantes no EM são similares aos obtidos por VATER et al.
(2002).
As espécies com m/z 1461,80, 1475,8, 1485,28, 1499,8 e 1515,8 foram os íons
predominantes na fração 03 e podem ser atribuídos a homólogos de fengicina contendo uma
cadeia de ácidos graxos de 16 e 17 átomos de carbono. A forma mais abundante foi a de m/z
1485,28, correspondente a um aduto de Na+ de uma isoforma de 16 átomos de carbono. O outro
íon com m/z 1475,8 é uma forma protonada de uma isoforma de 17 átomos de carbono. Os picos
predominantes no EM são similares aos obtidos por VATER et al. (2002).
Capítulo 2. Resultados e Discussão
64
Tabela 2.1. Dados obtidos por espectrometria de massas MALDI-TOF dos principais
homólogos dos surfactantes (surfactina, iturina e fengicina) produzidos
por B. subtilis LBBMA 111A, após separação por CCDP.
FRAÇÃO SINAL PRINCIPAL (m/z) (Da) HOMÓLOGO
01 1036,11 C15 surfactina, [M+H]+
1044,19 C14 surfactina, [M+Na]+
1058,20 C15 surfactina, [M+Na]+
1074,20 C15 surfactina, [M+K]+
02 1070,50 C16 iturina, [M+H]+
1093,15 C16 iturina, [M+Na]+
1105,80 C17 iturina, [M+Na]+
1122,10 C17 iturina, [M+K]+
03 1461,80 C16 fengicina, [M+H]+
1475,80 C17 fengicina, [M+H]+
1485,28 C16 fengicina, [M+Na]+
1499,80 C17 fengicina, [M+Na]+
1514,90 C17 fengicina, [M+K]+
A partir dos resultados obtidos com as análises de IV, RMN de H1 e da comparação dos
dados de massas resumidos na Tabela 2.1 com os dados de massa molecular de outros
lipopeptídeos obtidos de outras linhagens de Bacillus (KAKINUMA et al., 1969; KOWALL et al.,
1998; LEENDERS et al., 1999; SCHNEIDER et al., 1999), os produtos lipopeptídicos de Bacillus sp.
LBBMA 111A puderam ser identificados como surfactinas, iturinas e fengicinas (Figura 2.4). Esses
compostos são peptídeos cíclicos anfifílicos contendo sete α-aminoácidos (surfactinas e iturinas) ou
dez α-aminoácidos (fengicinas) ligados a um ácido graxo β-hidroxi (surfactinas e fengicinas) ou um
ácido graxo β-amino (iturinas). O comprimento da cadeia de ácido graxo pode variar de C13 a C16
para surfactinas, de C14 a C17 para iturinas e de C14 a C18 para fengicinas, permitindo a existência
de diferentes compostos homólogos (AKPA et al., 2001; JACQUES et al., 1999).
Capítulo 2. Resultados e Discussão
65
L TyrL Ile
D Tyr
L
L Pro
L Glu
D Ala
D Allo ThrD Orm
HC
C
C
O
NHC
C
CNH NHC
C
N
C
C
NH
NH
C
NHOH
OH
NHC
H2N
CONH2
O
O
O
O
H
H
O
O
O
O
O
O OH
H
OHC13 C14
L Glu
O
H
Gln
OH
O
NHCNH
CC
C
OHC
CH
C
CH2
NH C
C
NH
C C
C
NH
C
NH
CNH
NH
NH
O
O
OO
O
O
OO
O
CH2 5CH2 n CHCH3
CH3
L Glu L Leu
D Leu
L Val
Asp
D LeuLeu
OOH
OHO
LL
A
Figura 2.4. Estrutura de (A) surfactina, (B) iturina e (C) fengicina produzidos por diversas linhagens
de Bacillus.
L Gln
L
L
Asn D
Pro D
Tyr L Asn C O
CH2
H CH2 n CH3
B
NH
C CH2 5 CH
CH3Asn L Ser
Capítulo 2. Resultados e Discussão
66
2.4.1.2. Caracterização da Composição Química do Surfactante Produzido por
Bacillus subtilis LBBMA 155
Para caracterização preliminar do surfactante LBBMA 155, foram realizados ensaios em
cromatografia de camada delgada (CCD) do extrato obtido (215 mg L-1). Dois sistemas eluentes
foram testados na CCD: um com caráter mais apolar, composto por CHCl3/CH3OH/H2O (65:15:1 v
v-1) e outro com caráter mais polar, composto por CHCl3/CH3OH (60:40 v v-1). Com o sistema
eluente mais polar, conseguiu-se o deslocamente da amostra e sua pureza foi constatada pela
presença de uma mancha com fator de retenção (Rf) de 0,56, enquanto que o padrão de surfactina
(SIGMA) apresentou um Rf de 0,55.
Analisando-se o espectro no IV da amostra contendo o biossurfactante LBBMA 155,
observa-se banda característica de peptídeos a 3309 cm-1 referente ao estiramento da ligação N-H.
Em 3069 cm-1 foi observada uma banda característica de OH de ácido carboxílico. A presença de
cadeia alifática (-CH3, -CH2) foi indicada pelas bandas de absorção nas freqüências de 2956 a 2854
cm-1. A banda em 1724 cm-1 refere-se à absorção de grupo carbonila de anel lactona. Em 1645 cm-
1 observa-se o estiramento da ligação C=O e em 1540 cm-1 a deformação angular de NH
combinado com o estiramento da ligação C-N. Estes resultados indicam que o biossurfactante
presente na amostra analisada contém cadeia alifática, bem como uma porção peptídica.
Comparando-se o espectro de IV do biossurfactante LBBMA 155 com o obtido com a surfactina
padrão (SIGMA) por NITSCHKE (2004), observam-se várias bandas em regiões semelhantes,
como na região 3300, 2900, 2800, 1700, 1600 e 1500 cm-1 (Figura 2.5).
Capítulo 2. Resultados e Discussão
67
Figura 2.5. Espectro no IR da amostra contendo o surfactante produzido por Bacillus subtilis
LBBMA 155.
A análise por RMN de H1 (300 MHz, CDCl3) confirmou que a molécula em estudo é um
lipopeptídeo (Figura 2.6). O espectro mostrou um dupleto em δ=0,8 para o grupo (CH3)2-CH,
indicando a ligação terminal no componente de ácido graxo. O sinal entre δ1,2-1,6 referente a CH2
indica a presença de uma cadeia alifática longa. Os sinais em δ 7,2 a 8,0 ppm são referentes aos
grupos amida (N-H). Os sinais de hidrogênios α de aminoácidos podem ser observados entre 4,3-
5,2 ppm. O espectro de RMN de H1 do surfactante produzido pelo isolado Bacillus subtilis LBBMA
155 mostrou-se muito semelhante ao obtido com a surfactina-padrão (SIGMA) por WEI & CHU
(1998) (Figura 2.6).
1645
1540
1724
CO
O
N C
H O
2854
3069
3309
2956
N H
C H
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
A
bsor
vânc
ia
Comprimento de onda (cm-1)
Capítulo 2. Resultados e Discussão
68
Figura 2.6. Espectro de RMN de H1 da (A) mistura de surfactantes produzidos por Bacillus subtilis
LBBMA 155 (este trabalho) e (B) da amostra padrão de surfactina (SIGMA). Fonte: WEI & CHU
(1998).
(B)
(A)
ppm
C H CH 2 9
C OHNHs de aminoácidosHα s de aminoácidos
C CH O
O
C
H3C
H3C
CαH2C CH2 CO
Capítulo 2. Resultados e Discussão
69
1060.277
1074.5591046.195
1030.115
1097.4021112.726
0
2
4
6
4x10
Inte
ns. [a.
u.]
950 1000 1050 1100 1150 1200 1250m/z
O EM determinado por MALDI-TOF da amostra contendo o biossurfactante produzido por
Bacillus subtilis LBBMA 155 apresenta como sinais predominantes os de m/z 1030,11, 1046,19,
1060,27 e 1074,45, indicando que as massas correspondem a moléculas homólogas de surfactina,
com ácidos graxos β-hidroxi C13, C14 e C15. A forma mais abundante foi a de m/z 1060,27,
corresponde à surfactina com massa molecular de 1035 Da e com cadeia alifática de C15
adicionada de seu aduto de Na+. Além deste sinal, a molécula aparece adicionada do íon K+ =
1074,2. O íon com m/z 1030,11 corresponde a um homólogo de surfactina com cadeia de ácido
graxo C13, juntamente com o seu aduto de Na+. O pico m/z 1046,19 corresponde à surfactina cuja
composição tem um heptapeptídeo e uma cadeia alifática contendo 14 átomos de carbono
adicionado de seu aduto de Na+ (Figura 2.7).
Figura 2.7. Espectro de MALDI-TOF-MS da amostra de surfactante produzido por Bacillus subtilis
LBBMA 155.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
70
A co-produção de outros tipos de lipopeptídeos (iturinas, fengicinas) não foi detectada,
sugerindo que B. subtilis LBBMA 155 produz apenas um tipo de lipopeptídeo nas condições de
cultivo mantidas neste trabalho. Este fato pode representar uma vantagem, por reduzir os
problemas relacionados à purificação do biossurfactante.
2.4.1.3. Caracterização da Composição Química do Surfactante Produzido por
Arthrobacter oxydans LBBMA 201
A amostra de 142 mg L-1 do surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201 foi
caracterizada preliminarmente por cromatografia de camada delgada (CCD). Após revelação da
placa com ninhidrina, apresentou uma banda com fator de retenção (Rf) 0,73, indicando a presença
de grupos amino no composto presente na amostra.
O espectro no infravermelho (IV) evidenciou a presença de banda característica de
peptídeo a 3310 cm-1, resultantes do estiramento da ligação N-H. Em 3050 cm-1, foi observada uma
banda característica de ácido carboxílico. A presença de bandas de absorção nas freqüências de
2970 a 2850 cm-1 e 1450 a 1380 cm-1, resultantes do estiramento de C-H, indica a presença de
cadeia alifática na molécula. A banda em 1730 cm-1 refere-se à absorção de grupo carbonila de
anel lactona. Em 1650 cm-1, observa-se o estiramento da ligação CO-N e em 1540 cm-1 a
deformação angular de NH, combinado com o estiramento da ligação C-N. Estes resultados
indicam que a amostra analisada contém cadeia alifática, bem como uma porção peptídica. O
espectro de IV obtido da amostra analisada (Figura 2.8) se revelou muito semelhante ao obtido
com o surfactante produzido por Arthrobacter sp. MIS38, o qual foi isolado e caracterizado por
MORIKAWA et al. (1993).
Capítulo 2. Resultados e Discussão
71
Figura 2.8. Espectro no IR da amostra contendo o surfactante produzido por Arthrobacter oxydans
LBBMA 201.
A análise por RMN de H1 (300 MHz, CDCl3) revelou inequivocamente que a molécula em
estudo é um lipopeptídeo (Figura 2.8). O espectro mostrou um dupleto em δ=0,8 para o grupo
(CH3)2-CH, indicando a ligação terminal no componente de ácido graxo. O sinal entre δ1,2-1,6,
referente a CH2, indica a presença de uma cadeia alifática longa. Os sinais em δ 7,2 a 8,0 ppm são
referentes aos grupos amida (N-H). Os sinais de hidrogênios α de aminoácidos podem ser
observados entre 4,3-5,2 ppm.
1650
N C
H O
3050
1730
3310 1540
1450 1380
2970
CO
O
N H
C H
C H
2850
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
Abs
orvâ
ncia
Comprimento de onda (cm-1)
Capítulo 2. Resultados e Discussão
72
Figura 2.9. Espectro de RMN de H1 da amostra contendo o surfactante LBBMA 201 produzido por
Arthrobacter oxydans LBBMA 201 à 30°C.
O EM determinado por MALDI-TOF obtido da amostra de surfactante produzido por
Arthrobacter oxydans LBBMA 201 demonstrou a predominância de uma molécula protonada de m/z
1355,11, o qual representa um lipopeptídeo que corresponde a uma molécula de peso molecular
1354 adicionada de sua forma protonada [H]+. Em comparação ao lipopeptídeo produzido por
Arthrobacter sp. MIS38 (MORIKAWA et al., 1993), conclui-se que o biossurfatante produzido por
Arthrobacter oxydans LBBMA 201 é o lipopeptídeo artrofactina (Figura 2.10).
ppm
C H CH 2 9
C OHNHs de aminoácidosHα s de aminoácidos
C CH O
O
C
H3C
H3C
CαH2C CH2 CO
Capítulo 2. Resultados e Discussão
73
Figura 2.10. Estrutura de artrofactina de Arhrobacter sp. MIS38. Adaptada de MORIKAWA et al.
(1993).
2.4.1.4. Análise de CCD dos Surfactantes Produzidos por Dietzia maris LBBMA 191
e Flavobacterium sp. LBBMA 168
As amostras dos compostos produzidos por Dietzia maris LBBMA 191 e Flavobacterium sp.
LBBMA 168 foram recuperadas a partir da CCDP e a pureza dos compostos ficou evidenciada
após análise dessas amostras em placas de CCD. A revelação da placa que continha a amostra
dos biossurfactantes produzidos por Dietzia maris LBBMA 191 apresentou duas manchas intensas
com Rf diferentes (0,4 e 0,18), enquanto que a placa que continha a amostra com os
biossurfactantes produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 apresentou apenas uma mancha
intensa com Rf=0,37. Porém, os compostos presentes nas placas não foram detectados quando
submetidos à revelação com ninhidrina (revelador utilizado para detectar a presença de grupos
amino). Com isso, podemos afirmar que os compostos produzidos Dietzia maris LBBMA 191 e os
produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 não pertecem à classe dos lipopeptídeos, pois os
mesmos foram revelados apenas quando utilizou-se o ácido sulfúrico-fenol.
HN
N
N
N
NH
NH
NH
O
O
O
OH
O
H
H
O
OH O
O
OH
O
O
O
Capítulo 2. Resultados e Discussão
74
2.4.2. Tensão superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) dos
Biossurfactantes Purificados
Segundo MULLIGAN & GIBBS (1993), a CMC dos biossurfactantes mais eficazes varia
entre 1-200 mg L-1. Os baixos valores de CMC dos biossurfactantes LBBMA 111A (150 mg L-1),
LBBMA 155 (180 mg L-1), LBBMA 168 (200 mg L-1), LBBMA 191(150 mg L-1) e LBBMA 201 (200 mg
L-1) indicam que esses biossurfactantes têm potencial para diversas aplicações biotecnológicas
(Figura 2.11).
O valor de CMC apresentado pelo biossurfactante LBBMA 168 (200 mg L-1) (Figura 2.10C)
é baixo, comparativamente ao obtido pelos flavolipídeos produzidos por Flavobacterium sp.
MTN11, que foi de 300 mg L-1 (BODOUR et al., 2004). Os flavolipídeos constituem uma nova
classe de biossurfactantes, relatada pela primeira vez por BODOUR et al. (2004) .
Os biossurfactantes LBBMA 191 e LBBMA 201 apresentam excelentes propriedades
tensoativas, pois os seus valores de CMC (150 e 200 mg L-1, respectivamente) estão na faixa dos
considerados como biossurfactantes potentes (Figura 2.11D e E). Dados referentes a valores de
CMCs de biossurfactantes produzidos por espécies de Dietzia maris e Arthrobacter oxydans são
relatados aqui pela primeira vez. HABA et al. (2000) estudaram a produção de biossurfactantes por
Arthrobacter oxydans e NAZINA et al. (2003) pelos isolados Dietzia sp. 263 e Arthrobacter oxydans
32C. Apesar dos biossurfactantes produzidos por aqueles isolados promoverem a redução da
tensão superficial para valores abaixo de 40 mN m-1, os valores de suas CMCs não foram
determinados).
Comparativamente ao surfactante sintético SDS® (Figura 2.11F), os biossurfactantes
obtidos neste trabalho possuem um alto poder de redução da tensão superficial e apresentam
valores de CMCs 10 vezes menores (Figura 2.11). Estas propriedades tornam esses
biossurfactantes adequados para aplicações ambientais, como a biorremediação e a dispersão de
manchas de óleo.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
75
Arthrobacter oxydans LBBMA 201
0 100 200 300 400 500 600
25303540455055606570
Dietzia maris LBBMA 191
Concentração do Surfactante (mg L-1)0 100 200 300 400 500 600
Tens
ão S
uper
ficial
(mN
m-1
)
25303540455055606570
Bacillus sp. LBBMA 111A
Concentração do Surfactante (mg L-1)0 100 200 300 400 500 600
Tens
ão S
uper
ficial
(mN
m-1
)
25303540455055606570
0 100 200 300 400 500 600
Tens
ão S
uper
ficial
(mN
m-1
)
283338434853586368
SDS
Concentração de Surfactante mg L-1)1200 1500 1800 2100 2400 2700
Tens
ão S
uper
ficial
(mN
m-1
)
25303540455055606570
0 100 200 300 400 500 600
27
33
39
45
51
57
63
69
Concentração do Surfactante (mg L-1)
Bacillus subtilis LBBMA 155
Flavobacterium sp. LBBMA 168
Tens
ão S
uper
ficial
(mN
m-1
)
Concentração do Surfactante (mg L-1)
Concentração do Surfactante (mg L-1)
Tens
ão S
uper
ficial
(mN
m-1
)
Figura 2.11. Variação da tensão superficial (γ) com a concentração do biossurfactante LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191, LBBMA 201 e o surfactante sintético SDS®, em soluções aquosas a 28°C em pH 6,8. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
76
2.4.3. Atividade Emulsificante e Estabilidade da Emulsão
Os biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 201 e LBBMA 191
foram capazes de formar emulsões estáveis com petróleo, querosene e hidrocarbonetos alifáticos e
aromáticos puros. Essa também é uma característica específica de moléculas que possuem caráter
anfifílico (ILORI et al., 2005). A resposta, porém, foi dependente do tipo de substrato utilizado para
emulsificação (Figura 2.12). Todos os biossurfactantes formaram emulsões consideradas estáveis,
uma vez que seus volumes, 24 horas após a formação, ainda correspondiam a 50% ou mais do
seu volume original (WILLUMSEN e KARLSON, 1979). É importante ressaltar que emulsões
recém-preparadas não devem ser submetidas a testes de estabilidade, pois durante seu
desenvolvimento pode não ter havido oportunidade de equilibrarem-se plenamente, o que pode ser
explicado quando se considera a instabilidade intrínseca das emulsões, ou seja, a dispersão pode
não ter adquirido estabilidade logo após o preparo. É desejável um período inicial de espera para
que haja a estabilização, sendo usualmente aceito um período entre 24 e 48 horas após o preparo
(DI MAMBRO, 2001; MASSON, 2005).
Os biossurfactantes apresentaram alta capacidade para estabilizar emulsões com petróleo
e querosene ao longo de 48 horas, comprovada pelos altos índices de emulsificação obtidos pelos
biossurfactantes LBBMA 111A (96,4 e 74,63%), LBBMA 155 (82,74 e 74,00%), LBBMA 168 (73,55
e 72,73%), LBBMA 191 (85,77 e 78,70%) e LBBMA 201 (87,78 e 79,80%), respectivamente (Figura
2.12). Os resultados foram superiores aos obtidos por ILORI et al. (2005), que apresentaram
índices de emulsificação inferiores (E=58% com petróleo e 40% com querosene) ao utilizarem o
surfactante produzido por Aeromonas sp.
Em geral, o petróleo foi o substrato com que se obtiveram os maiores índices de
emulsificação, exceto pelo biossurfactante LBBMA 168, que apresentou um valor (73,55%) inferior
aos obtidos pelos outros biossurfactantes, porém superior ao obtido pelo surfactante sintético SDS®
(70,34%) (Figura 2.12). Isto indica que os biossurfactantes, com exceção do LBBMA 168, atuam
com maior eficiência quando o substrato de hidrocarbonetos é composto por misturas de
componentes alifáticos e cíclicos. Isto também foi comprovado por ROSENBERG et al. (1979), ao
avaliarem a emulsificação de misturas de substratos oleosos pelo emulsificante de Arthrobacter
Capítulo 2. Resultados e Discussão
77
RAG-1. Os biossurfactantes apresentaram maior estabilidade de emulsão do que o surfactante
sintético SDS® (Figura 2.12) quando o substrato foi o petróleo ou querosene, pois o SDS®
estabilizou apenas 70,34 e 52,07% da emulsão após 48 horas, respectivamente. Os dados
mostram que a habilidade dos biossurfactantes em emulsificar misturas de hidrocarbonetos é
superior à do surfactante sintético SDS®.
Os biossurfactantes também foram capazes de emulsificar eficientemente os
hidrocarbonetos hexano, tolueno e hexadecano. A formação de emulsões estáveis dos
biossurfactantes com os diferentes hidrocarbonetos puros é refletida pelos altos valores de E%
obtidos 48 horas após sua formação (Figura 2.12). Em geral, os menores índices de emulsificação
foram os obtidos quando se utilizou como substrato o hexadecano, exceto quando o
biossurfactante utilizado foi o LBBMA 168, com o qual se obteve um E% de 77,5%, o maior valor
dentre os obtidos com esse biossurfactante (Figura 2.12C).
Os biossurfactantes LBBMA 191 e LBBMA 201 exibiram uma alta atividade emulsificante,
formando emulsões consideradas estáveis com todos os substratos testados (Figura 2.12 D e E).
HABA et al. (2000) estudaram a produção de biossurfactantes por Arthrobacter oxydans e NAZINA
et al. (2003) pelos isolados Dietzia sp. 263 e Arthrobacter oxydans 32C. Apesar de promoverem a
redução da tensão superficial para valores abaixo de 40 mN m-1, os índices de emulsificação
obtidos pelos isolados Arthrobacter oxydans, Dietzia sp. 263 e Arthrobacter oxydans 32C foram de
apenas 1,9%, 35% e 10%, respectivamente.
Esses resultados são relevantes para várias aplicações dos biossurfactantes, visto que a
capacidade de emulsificação é importante na solubilização de compostos hidrofóbicos em
processos de biorremediação (MIHELCIC et al., 1993, VOLKERING et al., 1995), na recuperação
avançada de petróleo (BANAT et al., 1995), na remoção do óleo retido em borras oleosas (BANAT
et al., 1991), entre outros.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
78
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Esta
bilid
ade d
a Em
ulsã
o (%
)
50556065707580859095
100
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Esta
bilid
ade d
a Em
ulsã
o (%
)
50556065707580859095
100
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Esta
bilid
ade d
a Em
ulsã
o (%
)
50556065707580859095
100
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Esta
bilid
ade d
a Em
ulsã
o (%
)
50556065707580859095
100
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Esta
bilid
ade d
a Em
ulsã
o (%
)
50556065707580859095
100
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Esta
bilid
ade d
a Em
ulsã
o (%
)
50556065707580859095
100
Bacillus subtilis LBBMA 155
SDS
Petróleo Tolueno Hexano Querosene Hexadecano
Bacillus sp. LBBMA 111A
Dietzia maris LBBMA 191Flavobacterium sp. LBBMA 168
Arthrobacter oxydans LBBMA 201
Figura 2.12. Atividade de emulsificação de vários hidrocarbonetos com os biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
A B
C D
E F
Capítulo 2. Resultados e Discussão
79
2.4.4. Efeito do pH, da Temperatura e da Força Iônica na Atividade dos
Biossurfactantes Purificados
A estabilidade e a efetividade dos biossurfactantes purificados foram avaliadas frente a
variações de pH, temperatura e força iônica, por meio da análise da estabilidade da emulsão
formada e da variação da atividade interfacial, utilizando-se o parâmetro tensão superficial (TS). O
estudo foi realizado com soluções contendo biossurfactantes em concentração correspondente a
2CMC.
A estabilidade de uma emulsão pode ser afetada por diversos fatores. Porém, todo fator
que causa instabilidade conduz aos mesmos fenômenos: quebra da emulsão ou inversão de fases
(ROSEN, 2004). A preservação da estabilidade sob condições adversas é um importante atributo
para os surfactantes, pois a maioria das áreas de aplicações de surfactantes requer um
comportamento constante.
A estabilidade dos biossurfactantes purificados e do surfactante sintético SDS®, em relação
à variação do pH, é mostrada na Figura 2.13. A atividade tensoativa dos biossurfactantes foi
mantida na faixa de pH de 5 a 9, com pequenas variações nos valores de γCMC e nos índices de
emulsificação (E%). Porém, houve um aumento gradual do valor de tensão superficial nas soluções
dos biossurfactantes à medida que o pH foi elevado para valores acima de 7,0. As atividades
tensoativas - tensão superficial referente à 2CMC e estabilidade de emulsão - dos biossurfactantes
LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 191 foram afetadas quando os mesmos foram mantidos em
pH 6,5 e 7,0. A atividade emulsificante e a γCMC do biossurfactante LBBMA 168 foram levemente
reduzidas quando o pH foi mantido na faixa de 6,0 a 7,0. Na faixa de pH variando entre 5,0 e 7,5, o
biossurfactante LBBMA 201 manteve excelente estabilidade de emulsão e um aumento não-
significativo na tensão superficial referente à CMC em pH superior a 7,0.
Alterações de pH na faixa de 7,0 a 9,0 levaram a variações de tensão superficial dos
surfactantes; na faixa de pH entre 5,0 e 6,5, a tensão superficial referente a 2CMC e a estabilidade
da emulsão se mantiveram estáveis (Figura 2.13). Nota-se uma ligeira variação da γCMC, mas não
ultrapassando 35 mN m-1, característica considerada eficiente para um bom surfactante. Em pH 5,0
e 5,5, ocorre a desemulsificão do biossurfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168 no
Capítulo 2. Resultados e Discussão
80
meio, resultando na instabilidade da emulsão. No entanto, a tensão superficial não foi afetada. Em
pH superior a 7,0, houve um aumento substancial nos valores de tensão superficial, mas os índices
de emulsificação se mantiveram estáveis, com exceção do biossurfactante LBBMA 168, cujos
índices de emulsificação apresentaram redução significativa nessa faixa de pH (Figura 2.13C).
Em comparação com os biossurfactantes, a estabilidade da emulsão formada pelo
surfactante SDS® foi pouco afetada quando o pH foi mantido na faixa de 4,5 a 6,0 e 7,0 a 9,0. Em
pH 6,5, a sua atividade tensoativa foi elevada substancialmente (Figura 2.13F).
Capítulo 2. Resultados e Discussão
81
pH
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
3031323334353637383940
Esta
bilid
ade d
e Em
ulsã
o (%
)
50
55
60
65
70
75
80
pH
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
3031323334353637383940
Esta
bilid
ade d
e Em
ulsã
o (%
)
50
55
60
65
70
75
80
pH
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
3031323334353637383940
Esta
bilid
ade d
e Em
ulsã
o (%
)
50
55
60
65
70
75
80
pH
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
3031323334353637383940
Esta
bilid
ade d
e Em
ulsã
o (%
)
50
55
60
65
70
75
80
pH
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
3032343638404244464850
Esta
bilid
ade d
e Em
ulsã
o (%
)
50
55
60
65
70
75
80
pH
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
3031323334353637383940
Esta
bilid
ade d
e Em
ulsã
o (%
)
50
55
60
65
70
75
80
Estabilidade de Emulsão (%) Tensão Superficial (mN m-1)
Bacillus sp. LBBMA 111A
SDS
Bacillus subtilis LBBMA 155
Flavobacterium sp. LBBMA 168 Dietzia maris LBBMA 191
Arthrobacter oxydans LBBMA 201
Figura 2.13. Efeito do pH sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
A B
C D
E F
Capítulo 2. Resultados e Discussão
82
Mudança na temperatura causa alterações consideráveis na estabilidade de emulsões; a
temperatura pode causar a inversão ou a quebra de emulsões. Para se verificar o efeito da
temperatura na estabilidade das emulsões formadas pelos biossurfactantes purificados, o volume
relativo de emulsão (E48) foi determinado em temperaturas na faixa de 20 a 80°C (intervalos de
10°C). O E48 dos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 191 se manteve estável em
temperaturas na faixa de 20-70°C, nas quais o índice de emulsificação se manteve acima de 65%
(Figura 2.14).
O efeito da temperatura na γCMC de surfactantes, em meio aquoso, é complexo. A variação
da temperatura de 20 para 30°C resultou em aumento não-significativo na γCMC dos
biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 191. Porém; o aumento da γCMC dos
biossurfactantes produzidos por LBBMA 168 e LBBMA 201 e do surfactante sintético SDS® foi
bastante significativo (Figura 2.14C e E). Um aumento na temperatura de 30 para 40°C e de 40
para 50°C provocou aumento pouco ou não-significativo na γCMC dos biossurfactantes, porém
elevou significativamente a γCMC do surfactante SDS® (Figura 2.14F).
Em temperaturas de 50 a 80°C (intervalos de 10°C), a atividade superficial do
biossurfactante LBBMA 201 (Figura 2.14E) foi mantida. Porém, a atividade superficial dos outros
biossurfactantes sofreu alteração significativa, sendo observado aumento da γCMC a 50°C dos
biossurfactantes LBBMA 111A (34,2 mN m-1), LBBMA 155 (33,2 mN m-1), LBBMA 168 (34,1 mN
m-1), LBBMA 191 (35,1 mN m-1) e LBBMA 201 (36,8 mN m-1) para 36,4, 35,8, 37,0, 42,0 e 37,5
mN m-1, respectivamente (Figura 2.14). A γCMC do surfactante SDS® (43,2 mN m-1) aumentou para
45,2 mN m-1 com o aumento da temperatura de 50 para 80°C. Essas elevações nas γCMC dos
biossurfactantes e do SDS® em resposta à elevação da temperatura podem ser atribuídas ao
enfraquecimento das interações eletrostáticas entre as moleculas, o que desestabiliza as micelas
formadas por esses compostos.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
83
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80
Tens
ão S
uper
ficial
(m
N m
-1)
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Temperatura (°C)
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Temperatura (°C)
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Tensão Superficial (mN m-1)Estabilidade de Emulsão (%)
Bacillus sp. LBBMA 111A
SDS
Bacillus subtilis LBBMA 155
Flavobacterium sp. LBBMA 168 Dietzia maris LBBMA 191
Arthrobacter oxydans LBBMA 201
Figura 2.14. Efeito da temperatura sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
A B
C D
E F
Capítulo 2. Resultados e Discussão
84
O efeito da adição de NaCl, em concentrações variando de 0,5 a 20%, na estabilidade de
emulsão e na CMC dos biossurfactantes purificados foi também estudado (Figura 2.15). Os E48 dos
biossurfactantes permaneceram estáveis em soluções de até 5% de NaCl, com exceção do
biossurfactante produzido pelo isolado LBBMA 191, que teve uma pequena redução no E48 com a
adição de 5% de NaCl (Figura 2.15 D) .
De forma mais abrupta, concentrações de NaCl superiores a 10% promoveram alteração no
E48 de todos os biossurfactantes e do SDS® (Figura 2.15 F).
Uma emulsão instável pode ser eventualmente destruída, levando à separação completa
das duas fases. Nesse caso, não há estabilização no caso de emulsão do tipo água-em-óleo (A/O)
com uma concentração salina relativamente alta (>5,0%). Para se entender essa observação,
podemos considerar as mudanças das características na emulsão A/O como resultado da adição
de sal (NaCl). Pela teoria de difusão do íon, quando a concentração de sal aumenta, a energia
interna do sistema também aumenta (MOHAMED et al., 2003). Consequentemente, as emulsões
não são estáveis termodinamicamente e as gotas de água fundem-se umas com as outras para
produzir gotas maiores e aumentar a taxa de coalescência. Coalescência é um dos possíveis
mecanismos de destruição de emulsões, o qual ocorre quando a energia de adesão entre duas
gotas é maior que a energia de turbulência que causa a dispersão (CALDERON & POULIN, 1999).
A tensão superficial das soluções de surfactantes foi reduzida em concentrações de NaCl
na faixa de 0,0 a 5,0% (Figura 2.15). Resultados semelhantes foram obtidos por NOUR & YUNUS
(2006), que investigaram a influência da concentração de NaCl (0,0-5,5 %) em emulsões do tipo
água-óleo cru. Os autores argumentam que esse efeito ocorre porque o aumento da concentração
de NaCl aumenta a chance das moléculas dos surfactantes colidirem umas com as outras.
Capítulo 2. Resultados e Discussão
85
Concentração de NaCl (%)0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Tens
ão S
uper
ficial
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Concentração de NaCl (%)0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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Concentração de NaCl (%)0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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Concentração de NaCl (%) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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Concentração de NaCl (%) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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Concentração de NaCl (%) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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Tensão Superficial (mN m-1)Estabilidade de Emulsão (%)
Bacillus sp. LBBMA 111A
SDS
Bacillus subtilis LBBMA 155
Flavobacterium sp. LBBMA 168 Dietzia maris LBBMA 191
Arthrobacter oxydans LBBMA 201
Figura 2.15. Efeito da força iônica sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
BA
C D
E F
Capítulo 2. Conclusões
86
2.5. CONCLUSÕES
Os biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155,
Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201
foram caracterizados como sendo pertencentes à classe dos lipopeptídeos (LBBMA 111A, LBBMA
155 e LBBMA 201), dos glicolipídeos (LBBMA 191) e dos flavolipídeos (LBBMA 168).
Quando comparados ao surfactante sintético SDS®, os biossurfactantes obtidos nesse
trabalho possuem um alto poder de redução da tensão superficial em meio aquoso e apresentam
valores de concentração micelar crítica cerca de 10 vezes menores.
Os biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 201 e LBBMA 191
foram capazes de formar emulsões estáveis com petróleo, querosene e hidrocarbonetos alifáticos e
aromáticos puros.
Os surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201
mostraram serem termoestáveis na faixa de 20-70°C, estáveis em valores de pH acima de 5,0 e
resistentes à presença de até 5% de NaCl.
Os baixos valores de tensão superficial e a capacidade para estabilizar emulsões em
condições extremas de pH, temperatura e salinidade, tornam esses biossurfactantes adequados
para uma ampla gama de aplicações biotecnológicas e industriais envolvendo detergência,
emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilização e
dispersão de fases.
Capítulo 2. Referências Bibliográficas
87
2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo 3. Resumo
92
CAPÍTULO 3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE SURFACTANTES BACTERIANOS PARA
MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PETRÓLEO
3.1. RESUMO
Além de serem úteis em diversas aplicações industriais, os surfactantes são de grande importância em
processos de remediação de águas e de solos contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos. A
aplicação ambiental desses compostos tem sido limitada pela falta de conhecimento sobre o destino
desses compostos no ambiente e sobre a toxicidade dos mesmos quando aplicados in situ. Há indícios
na literatura de que os biossurfactantes são menos tóxicos do que os surfactantes sintéticos. Neste
trabalho, a toxicidade de biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas de ambientes
contaminados com hidrocarbonetos foi avaliada. A toxicidade aguda dos surfactantes bacterianos
produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A, B. subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168,
Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 e do sintético Dodecil Sulfato de Sódio
(SDS®) sobre a bactéria bioluminescente Vibrio fischeri foi avaliada por meio da medida da redução da
luz emitida por este microrganismo quando exposto a diferentes concentrações dos surfactantes. Além
disso, foram avaliados os efeitos tóxicos de diferentes concentrações (2CMC, 4CMC e 8CMC) dos
surfactantes sobre o crescimento de culturas puras de Acinetobacter baumannii LBBMA 04,
Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA
ES11, em meio mineral suplementado com glicose. Com base na avaliação da CE50 (concentração
efetiva em que ocorre redução de 50% na emissão de luz por Vibrio fischeri), é demonstrado que os
biossurfactantes não são tóxicos ao organismo-teste. A máxima inibição da emissão de luz (32%) foi
obtida com o biossurfactante produzido por A. oxydans LBBMA 201, em concentração equivalente a
2,2 CMC. A emissão de luz pela bactéria foi quase que completamente inibida (84,5 %) pelo SDS® na
Capítulo 3. Resumo
93
concentração de 4.710 mg L-1 (equivalente a 2,2CMC). A redução do crescimento de culturas
bacterianas puras, causada pela adição dos biossurfactantes ao meio de crescimento, foi menor do
que a causada pelo surfactante sintético SDS®. Em relação ao surfactante sintético SDS®, os dados
permitem concluir que os biossurfactantes avaliados são menos tóxicos, característica que lhes
confere potencial para aplicação em processos de remediação in situ de ambientes contaminados e
em outras aplicações ambientais onde a manutenção das populações microbianas autóctones é
desejável.
Palavras-chave: Biorremediação; descontaminação; bioluminescência; poluentes.
Capítulo 3. Introdução
94
3.2. INTRODUÇÃO
Dadas as suas propriedades físico-químicas favoráveis, os surfactantes ou biossurfactantes
são usados em processos de remediação de solos e de ambientes aquáticos para melhorar a taxa de
degradação de poluentes orgânicos hidrofóbicos. Uma das principais limitações à ampliação do uso de
surfactantes em remediação é a falta de conhecimento sobre o destino ambiental e a toxicidade
desses surfactantes, principalmente para aplicações in situ (HAIGH, 1996).
A freqüente presença de surfactantes sintéticos no ambiente aquático, principalmente como
resultado do uso de detergentes e produtos de limpeza, tem resultado numa toxicidade extensiva
durante os últimos 30 anos. Conseqüentemente, dispõe-se de um extenso banco de dados de testes
de toxicidade em laboratório e publicações de avaliações de riscos de vários surfactantes comerciais.
Por outro lado, a toxicidade de biossurfactantes no ambiente é pouco conhecida. EDWARDS et al.
(2003), ao compararem os dados de toxicidade de três surfactantes sintéticos e três surfactantes
microbianos, concluíram que os biossurfactantes são menos tóxicos que os surfactantes sintéticos
para algumas espécies de invertebrados. Contudo, os riscos ambientais dos biossurfactantes,
avaliados por meio de análise da composição de comunidades microbianas, não foram
suficientemente explorados.
A proposta geral dos testes de toxicidade é estabelecer o impacto potencial de substâncias
químicas sobre a biota de um dado ambiente. A informação adquirida pode ser usada para administrar
o tratamento ou a liberação do uso de substâncias químicas.
Para interpretar os dados de toxicidade de surfactantes, é necessário um entendimento dos
fatores que contribuem para a toxicidade dessa classe de compostos. O principal dentre esses fatores
é a estrutura química. A toxicidade de surfactantes aniônicos e não-iônicos é uma função do
comprimento da cadeia alquil. Um aumento no comprimento da cadeia alquil corresponde a uma maior
toxicidade do surfactante aniônico Alquilbenzeno Sulfonado Linear (LAS) (MORENO-DANVILLA, 1983;
KIMERLE & SWISHER, 1977 citados por MANN, 2000).
Microrganismos são úteis nos testes de ecotoxicidade, pois podem ser avaliados em um curto
tempo e ocupam níveis tróficos onde a bioacumulação e/ou a bioconcentração são problemas
potenciais (VAN BEELEN & DOELMAN, 1997). Os testes bacterianos de toxicidade medem uma
Capítulo 3. Introdução
95
ampla variedade de “endpoints” e incluem testes de mutagenicidade (AMES et al., 1988 citado por
LAYTON et al., 1999), crescimento populacional (NENZDA & SEYDEL, 1988), produção de CO2
(JARDIN et al., 1990), biossíntese enzimática, mineralização da glicose (RETEUNA et al., 1989) e a
inibição da bioluminescência (RIBO & KAISER, 1987 citado por LAYTON et al., 1999). Entre os bancos
de dados de toxicidade bacteriana, o mais amplo refere-se à inibição da bioluminescência em Vibrio
fischeri ou ao ensaio MICROTOX (KAISER & DEVILLERS, citados por LAYTON et al., 1999).
Neste trabalho, foi avaliada a toxicidade de biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas
de ambientes contaminados com hidrocarbonetos.
Capítulo 3. Resultados e Discussão
96
3.3. MATERIAL E MÉTODOS
3.3.1. Surfactantes
Foram testados seis tipos de surfactantes, sendo um sintético (SDS®) e cinco microbianos,
produzidos pelos isolados bacterianos Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155,
Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201. Os
biossurfactantes foram produzidos no laboratório de Biotecnologia e Biodiversidade para o Meio
Ambiente (LBBMA) e o isolamento foi realizado utilizando-se as técnicas de precipitação ácida,
ultra-filtração e cromatografia de camada fina (TLC). As propriedades ativas de superfície de cada
surfactante estão descritas na Tabela 3.1.
Tabela 3.1. Tensão superficial (γ) e concentração micelar crítica (CMC) dos surfactantes utilizados neste estudo
SURFACTANTE γCMC (mN m-1) CMC (mg L-1)
LBBMA 111A 33,9 150
LBBMA 155 34,6 180
LBBMA 168 38,8 200
LBBMA 191 35,0 150
LBBMA 201 36,6 200
SDS® 39,0 2120
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante Sintético Dodecil Sulfato de Sódio.
Surfactina, Iturina e Fengicina de Bacillus sp. LBBMA 111A, Surfactina de B. subtilis
LBBMA 155 e Artrofactina de A. oxydans LBBMA 201 foram produzidos em meio mineral
suplementado com glicose a 2% (p v-1) e hexadecano a 2% (v v-1) (adicionado após o esgotamento
da glicose). Flavolipídeos de Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram produzidos no meio mineral
Capítulo 3. Resultados e Discussão
97
descrito por BODOUR & MILLER-MAIER (1998) contendo somente glicose a 2% (p v-1) como fonte
de carbono. O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyer a 30°C em agitador orbital (New
Brunswick Scientific) com agitação de 200 rpm, por sete dias.
A purificação e o isolamento dos biossurfactantes produzidos foram realizados após a
remoção das células do meio por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 25 °C), seguida de filtração
em membrana de 0,45 ·μm. A extração primária dos surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e
LBBMA 201 foi realizada por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para 2,0 com HCl a 12
mol L-1. Os biossurfactantes precipitados foram recuperados por centrifugação (12.000 g, 20
minutos, 20 °C) (VATER et al., 2002) e dissolvidos em água pH 7,0. Os produtos foram extraídos
com clorofórmio e metanol, filtrados em papel de filtro comum e, após evaporação dos solventes,
submetidos à cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC) em placas de sílica gel 60
F254 (VETEC) e quantificados. O biossurfactante LBBMA 168 foi recuperado com o uso de célula de
ultra-filtração (modelo Amicon) munida de membrana com limite de exclusão de 500 e 1000
Daltons (LIN et al. 1998), seguido da CCDC e quantificação. Os componentes plotados nas placas
de CCDC foram visualizados sob lâmpada UV (254 nm) e revelados pela aplicação de ninhidrina a
0,2% ou H2SO4 a 3 mol L-1, seguida do aquecimento das placas a 100°C por 5 minutos
(HOROWITZ et al., 1990). As frações impuras foram fracionadas em cromatografia de camada
delgada preparativa (CCDP) e eluídas em misturas de clorofórmio e metanol, para separação dos
compostos presentes nas misturas. Para isso, utilizou-se placa de sílica gel 60 F254 (VETEC), com
revelação sob luz UV.
As soluções de surfactantes foram preparadas com o uso de água ultra-pura milliQ
Millipore®, sendo o pH da solução ajustado para 6,8 com solução de NaOH a 1 mol L-1. As
concentrações testadas estão listadas na Tabela 3.2.
Capítulo 3. Resultados e Discussão
98
Tabela 3.2. Concentrações dos surfactantes utilizados no ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri
SURFACTANTE Concentração (mg L-1)
LBBMA 111A *330
LBBMA 155 *400
LBBMA 168 **500
LBBMA 191 ***440
LBBMA 201 *440
SDS® *4710
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante Sintético Dodecil Sulfato de Sódio.
*Concentração equivalente a 2,22 CMC.
**Concentração equivalente a 2,5 CMC.
***Concentração equivalente a 2,9 CMC.
3.3.2. Avaliação da Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria
Luminescente Vibrio fischeri
Os ensaios de toxicidade aguda dos surfactantes foram executados segundo o protocolo
Microtox (Azur Environmental Corp.) para o teste básico. As medidas de resposta bioluminescente
foram realizadas em um analisador Microtox M500®.
O organismo-teste foi a bactéria bioluminescente Vibrio fischeri. Para realização do teste,
foram usadas culturas liofilizadas contendo 108 células da bactéria por ampola.
Para o teste de Toxicidade Aguda, a rehidratação da bactéria liofilizada foi efetuada com
água ultra-pura. A solução usada como diluente, cloreto de sódio (NaCl) a 2%, também foi
preparada com água ultra-pura, para fornecer proteção osmótica ao microrganismo-teste.
A solução de ajuste osmótico (OAS) foi uma solução de NaCl a 22%, também preparada
com água ultra-pura para o ajuste da osmolaridade das amostras em teste.
Capítulo 3. Resultados e Discussão
99
- Determinação da CE50 dos biossurfactantes
A determinação da concentração efetiva em que ocorre a inibição de 50% da emissão de luz
por V. fischeri (CE20) foi determinada com o uso do software OmniTM (Azur Corp.), acoplado ao
equipamento Microtox M500®.
Não sendo observada inibição na emissão de luz pelo microrganismo-teste, o resultado foi
relatado como ausência de efeito tóxico da amostra analisada, nas condições do teste.
3.3.3. Avaliação da Toxicidade de Biossurfactantes Para Isolados Bacterianos
Foram utilizados quatro isolados bacterianos (Tabela 3.3) pertencentes à coleção de
culturas do LBBMA, previamente selecionados quanto ao potencial de degradação de petróleo.
Tabela 3.3. Isolados microbianos utilizados para a avaliação da toxicidade de surfactantes
Isolado Tipo de Isolamento Origem
Acinetobacter baumannii LBBMA 04 Plaqueamento direto solo de “landfarming” – REGAP1
Acinetobacter junni LBBMA 36 Cultura de enriquecimento em petróleo
solo de “landfarming” – REGAP
Pseudomonas sp. LBBMA 101B Plaqueamento direto solo contaminado com óleo de motor da oficina da UFV2
Acinetobacter baumanni LBBMA ES11
Cultura de enriquecimento em petróleo
solo de “landfarming” – REGAP
1REGAP – Refinaria de Gabriel Passos, Betim, Minas Gerais. 2UFV – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais.
Os efeitos tóxicos dos surfactantes biológicos LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168,
LBBMA 191 e LBBMA 201 sobre culturas puras de A. baumanniii LBBMA 04, A. junni LBBMA 36,
Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A. baumannii LBBMA ES11 (Tabela 3.3), foram avaliados mediante
o acompanhamento do crescimento dos isolados na presença dos biossurfactantes, em
concentrações equivalentes a 2, 4 ou 8 vezes a concentração micelar crítica (CMC). Um volume de
inóculo suficiente para se obter uma densidade ótica a 600 nm correspondente a 0,05 foi
Capítulo 3. Resultados e Discussão
100
adicionado a poços de microplacas contendo 150 µL de meio mineral (NMP) suplementado com
glicose (2%) e o surfactante sob avaliação. As microplacas foram incubadas a 30 °C, sem agitação.
O crescimento microbiano foi acompanhado por meio da medida da densidade ótica a 560nm. Como
controle, foi utilizado frasco contendo meio mineral NMP inoculado sem a adição do biossurfactante
e suplementado com glicose.
Capítulo 3. Resultados e Discussão
101
3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.4.1. Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria Luminescente Vibrio
fischeri
Vibrio fischeri é uma bactéria Gram negativa marinha e sua luminescência é a base para
vários bioensaios de toxicidade, onde é utilizada para avaliar desde água contaminada, sedimentos
de solo, água pluvial, entre outros. Em todos esses sistemas, a toxicidade é avaliada medindo-se
até que ponto a substância causa inibição da emissão de luz pela bactéria (JENNINGS, 2001). A
produção de luz é diretamente proporcional à atividade metabólica da bactéria e a inibição da
atividade enzimática causa uma diminuição na quantidade de luz emitida.
A bioluminescência de V. fischeri é um fenômeno cuja regulação é complexa. Existem
vários circuitos de regulação da quantidade de luz emitida, sendo que três principais fatores são
conhecidos: toda luminescência é dependente do status de energia da célula, o qual está
relacionado com a disponibilidade de ATP e de FMNH2; a bioluminescência, sendo um processo
catalítico enzimático, é dependente do processo biossintético; a bioluminescência é regulada pela
concentração externa de uma pequena molécula orgânica, o autoindutor (BACKHAUS et al., 1997
citados por HARMEL, 2004). A emissão de luz pelas bactérias é influenciada pelo fenômeno
chamado de “quorum sensing”, que se traduz em um sinal de concentração celular. Muitas
bactérias são capazes de monitorar suas densidades populacionais utilizando-se para isso de
moléculas sinalizadoras, como por exemplo a N-acilhomoserina lactona. Essas moléculas
sinalizadoras são responsáveis por induzir a emissão da biolumenescência por V. fischeri (ZHANG,
2002, citado por HARMEL, 2004).
CE50 foi definida como a concentração da amostra-teste que causa uma redução de 50%
na quantidade de luz emitida pela suspensão bacteriana utilizada no ensaio. Nas concentrações
testadas, nenhum dos biossurfactantes foi tóxico a V. fischeri (Figura 3.1). No maior tempo de
exposição (30 minutos), a máxima inibição foi obtida com o biossurfactante produzido por
Arthrobacter oxydans LBBMA 201, que na maior concentração avaliada (440 mg L-1, equivalente a
2,2 CMC) foi de apenas 32% (Figura 3.1 E).
Capítulo 3. Resultados e Discussão
102
Concentração de Surfactante (mg L-1)0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Inib
ição
de L
umin
escê
ncia
(%)
5
10
15
20
25
30
35
40
Concentração de Surfactante (mg L-1)0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Inib
ição
de L
umin
escê
ncia
(%)
5
10
15
20
25
30
35
40
LBBMA 111A
Concentração de Surfactante (mg L-1)0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Inib
ição
de L
umin
escê
ncia
(%)
5
10
15
20
25
30
35
40
Concentração de Surfactante (mg L-1)0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Inib
ição
de L
umin
escê
ncia
(%)
0102030405060708090
100
Concentração de Surfactante (mg L-1)0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Inib
ição
de L
umin
escê
ncia
(%)
5
10
15
20
25
30
35
40
Concentração de Surfactante (mg L-1)0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Inib
ição
de L
umin
escê
ncia
(%)
5
10
15
20
25
30
35
40LBBMA 155
LBBMA 168 LBBMA 191
LBBMA 201 SDS
5 min 15 min 30 minTempo de exposição:
Figura 3.1. Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri após exposição de diferentes
concentrações dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D)
LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. Dados relativos à média de três
repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.
A
C
E
D
F
B
Capítulo 3. Resultados e Discussão
103
SDS® foi tóxico para V. fischeri. Como mostrado na Figura 3.1, a inibição na emissão de luz
ou a toxicidade de SDS® para a bactéria, aumentou com o aumento de sua concentração. A CE50
aos 5 minutos de exposição foi alcançada com uma concentração em torno de 560 mg L-1,
equivalente a apenas 0,27 CMC (Figura 3.1 F). Aos 30 minutos de exposição, a CE50 foi obtida na
concentração de 450 mg L-1, equivalente a 0,21 CMC. Nesse mesmo tempo de exposição, a
emissão de luz pela bactéria foi altamente inibida (inibição= 84,52 %) pelo SDS® na concentração
de 4.710 mg L-1, equivalente a 2,2 CMC. Comparativamente, os biossurfactantes, em
concentrações equivalentes a 2,2 CMC (LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 201), 2,5 CMC
(LBBMA 168) ou 2,9 CMC (LBBMA 191) (Tabela 3.2) não provocaram efeito tóxico.
Os efeitos tóxicos de surfactantes sobre bactérias podem ser explicados por dois principais
fatores: (1) rompimento da membrana celular pela interação do surfactante com os componentes
lipídicos e (2) reação da molécula de surfactante com proteínas essenciais para o funcionamento
da célula (JENSEN, 1999). Em pH igual ou superior a 7,0, surfactantes catiônicos são mais tóxicos,
enquanto que os aniônicos demonstram um comportamento mais tóxico em valores de pH abaixo
de 7,0. Em geral, surfactantes não-iônicos são menos ativos contra bactéria que surfactantes
iônicos (VOLKERING et al., 1998).
Os resultados obtidos neste trabalho confirmam que os biossurfactantes aniônicos LBBMA
111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 não apreesentam toxicidade significava
a V. fischeri, comparativamente ao SDS.
Capítulo 3. Resultados e Discussão
104
3.4.2. Efeitos de surfactantes no Crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA
04, Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e
Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 em meio mineral com glicose
As Figuras 3.2 a 3.5 ilustram os efeitos de diferentes concentrações (2CMC, 4CMC e
8CMC) dos surfactantes bacterianos LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191, LBBMA
201 e do sintético SDS® no crescimento de culturas puras de A. baumanniii LBBMA 04, A. junni
LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A. baumannii LBBMA ES11, em meio mineral
suplementado com glicose.
Na concentração equivalente a 2CMC, não houve mudança significativa no crescimento
dos isolados bacterianos na presença dos biossurfactantes, indicando que esses compostos não
causaram efeitos de toxicidade para as bactérias utilizadas (Figuras 3.2 a 3.5).
Na concentração equivalente a 8CMC, todos os surfactantes avaliados causaram inibição
total no crescimento dos isolados bacterianos utilizados, comprovando a toxicidade desses
surfactantes em altas concentrações. Esses dados dão suporte a estudos que sugerem maior
efetividade de surfactantes em promover a degradação de compostos orgânicos hidrofóbicos
quando em baixas concentrações (ARONSTEIN et al., 1991; HERMAN et al., 1997).
Os surfactantes LBBMA 155, LBBMA 191 e SDS®, em concentração referente a 4CMC,
afetaram o crescimento do isolado A. junni LBBMA 36 em meio mineral com glicose, causando
inibição total do seu crescimento (Figuras 3.5). GRIMBERG & AITKEN (1995) e GUHA & JEFFE
(1996), ao avaliarem o efeito da concentração de surfactante sobre adegradação de fenantreno por
culturas puras, em meio líquido, observaram que os surfactantes, em concentrações acima da sua
CMC, inibiram completamente a degradação do composto.
O SDS® causou inibição parcial do crescimento de A. baumannii LBBMA 04, A. junni
LBBMA 36 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B, quando presente na concentração equivalente a
2CMC (Figuras 3.2 a 3.4). Esse resultado é coerente com a observada redução de emissão de luz
por V. fischeri, quando na presença de igual concentração desse surfactante (Figura 3.1). Em altas
concentrações (4CMC e 8CMC), o SDS® causou inibição total do crescimento bacteriano. A
Capítulo 3. Resultados e Discussão
105
observada toxicidade de surfactantes, em altas concentrações, é atribuída ao efeito tóxico sobre as
membranas bacterianas (BRANDT et al., 2001).
Os resultados mostram que, na presença de glicose, a redução da atividade microbiana de
A. baumannii LBBMA 04, A. junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A.baumanni
LBBMA ES11, na presença de biossurfactantes, foi muito menos significativa do que na presença
do surfactante sintético SDS® (Figuras 3.2-3.5).
Em estudos que avaliaram o efeito do surfactante sintético TRITON X-100 na mineralização
de glicose por duas linhagens de Sphingomonas sp., demonstrou-se que o surfactante causou
efeitos negativos no seu crescimento (WILLUMSEN et al., 1998). Em outros estudos, foi
demonstrado que a presença dos surfactantes LAS, TWEEN-80 e TDTMA resultou em inibição
significativa do crescimento de Mycobacterium sp. em meio R2A (REASONER & GELDREICH,
1985), sendo o seu crescimento inibido somente em altas concentrações (ZIQING OU, 2000).
Capítulo 3. Resultados e Discussão
106
Figura 3.2. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA 04, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
LBBMA 111A LBBMA 155
LBBMA 191LBBMA 168
LBBMA 201 SDS
ausência de surfactante 2CMC 4CMC
A B
C D
E F
Capítulo 3. Resultados e Discussão
107
Figura 3.3. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
LBBMA 111A LBBMA 155
LBBMA 191LBBMA 168
LBBMA 201 SDS
ausência de surfactante 2CMC 4CMC
A B
C D
E F
Capítulo 3. Resultados e Discussão
108
Figura 3.4. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Pseudomonas sp. LBBMA 101B, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
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Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
DO60
0 nm
0,0
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0,8
1,0
1,2
2CMC 4CMC
LBBMA 111A LBBMA 155
LBBMA 168 LBBMA 191
SDSLBBMA 201
ausência de surfactante
A B
C D
E F
Capítulo 3. Resultados e Discussão
109
Figura 3.5. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Acinetobacter junni LBBMA 36, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
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1,2
Tempo (horas)
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
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1,2
Tempo (horas)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
DO60
0 nm
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0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
ausência de surfactante 2CMC 4CMC
LBBMA 111A
LBBMA 168 LBBMA 191
LBBMA 155
LBBMA 201 SDS
A B
C D
E F
Capítulo 3. Conclusões
110
3.5. CONCLUSÕES
Os biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201
não apresentam toxicidade significativa para V. fischeri em concentrações próximas a 2 CMC.
Nessa concentração, o surfactante sintético SDS® inibe em cerca de 84% a emissão de luz por
essa bactéria.
Quando presentes em altas concentrações (8CMC), todos os surfactantes demonstraram
efeitos negativos no crescimento dos isolados Acinetobacter baumannii LBBMA 04, A. junni LBBMA
36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A. baumanni LBBMA ES11.
Os biossurfactantes, em concentrações de 2CMC e 4CMC, não provocaram alteração no
crescimento dos isolados bacterianos.
Em concentração de 2CMC, o surfactante sintético SDS® é parcialmente tóxico aos
isolados bacterianos; em concentração acima de 4CMC, esse surfactante sintético inibe
completamente o crescimento dos isolados.
Capítulo 3. Referências Bibliográficas
111
3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARONSTEIN, B.N., CALVILLO, Y.M. & ALEXANDER, M. 1991. Effects of surfactants at low concentrations on the desorption and biodegradation of sorbed aromatic compounds in soils. Environmental Science and Technology, 25, 1728-1731.
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Capítulo 3. Referências Bibliográficas
112
LAYTON, A.C., GREGORY, B, SCHULTZ, T.W., SAYLER, G.S. 1999. Validation of genetically engineered bioluminescent surfactant resistant bacteria as toxicity assessment tools. Ecotoxicology
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Capítulo 4. Resumo
113
CAPÍTULO 4 AVALIAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE DE BIOSSURFACTANTES
BACTERIANOS
4.1. RESUMO
Os surfactantes de origem biológica, biossurfactantes, têm sido intensamente estudados para
aplicações em diferentes segmentos industriais e em processos de remediação de ambientes
contaminados. As principais vantagens atribuídas aos biossurfactantes, comparativamente aos
surfactantes sintéticos, são a sua menor toxicidade, maior degradabilidade, produção a partir de
substratos renováveis e estabilidade em condições extremas de pH, salinidade e temperatura.
Neste trabalho, foi avaliada a biodegradabilidade de diferentes surfactantes bacterianos, em meio
líquido e em microcosmos de solo. A biodegradabilidade dos biossurfactantes por culturas puras e
por uma cultura mista foi avaliada por meio da evolução de CO2. Em fase líquida, a capacidade de
utilização dos biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A, B. subtilis LBBMA 155,
Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201
como fonte de carbono, foi demonstrada por todos os isolados testados (Acinetobacter baumanni
LBBMA ES11, Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B). A
capacidade de degradação dos biossurfactantes por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi cerca de
54 vezes superior à de A. baumanni LBBMA ES11 e de 60 vezes à de A. haemolyticus LBBMA 53.
A capacidade de degradação do surfactante sintético SDS® por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi
também maior do que a obtida com A. baumanni LBBMA ES11 (12 vezes) e A. haemolyticus
LBBMA 53 (9 vezes). A produção de CO2 nos microcosmos de solos contaminados com os
biossurfactantes LBBMA 111A (2,31 μmol de CO2), LBBMA 155 (2,16 μmol de CO2), LBBMA 168
(1,48 μmol de CO2), LBBMA 191 (1,48 μmol de CO2) e LBBMA 201 (1,96 μmol de CO2) foi superior
Capítulo 4. Resumo
114
à obtida no microcosmo que continha o surfactante sintético SDS® (0,63 μmol de CO2). Após 166
horas de incubação, a cultura mista formada pelos isolados Acinetobacter baumannii LBBMA 04,
Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA
ES11A, presente nos microcosmos de solo, foi capaz de utilizar 68,3% do biossurfactante LBBMA
111A, 69,1% do biossurfactante LBBMA 155, 42,5% do biossurfactante LBBMA 168, 59,6% do
biossurfactante LBBMA 191, 73,4% do biossurfactante LBBMA 201 e 24,8% do surfactante
sintético SDS®, indicando que a cultura mista foi capaz de mineralizar os biossurfactantes. A
mineralização dos biossurfactantes, em fase líquida e em solo, foi confirmada pelo aumento da
tensão superficial nas soluções, comparativamente aos valores obtidos no início da incubação.
Palavras-chave: Biossurfactante; biodegradação; respirometria; biorremediação.
Capítulo 4. Intordução
115
4.2. INTRODUÇÃO
Surfactantes são compostos orgânicos que possuem comportamento anfifílico, isto é,
possuem duas regiões, hidrofóbica e hidrofílica. A parte hidrofóbica do tensoativo geralmente é
composta de cadeias alquílicas ou alquilfenílicas, contendo de 10 a 18 átomos de carbono. A
região hidrofílica é constituída por grupos iônicos ou não-iônicos ligados à cadeia carbônica
(ZIQING OU, 2000).
A degradação biológica de surfactantes é o mais importante mecanismo para a remoção
irreversível destas substâncias de ambientes aquáticos e terrestres e, por isso, a
biodegradabilidade é considerada como uma característica importante em processo de avaliação
quanto ao risco ambiental associado ao seu uso. A biodegradacão de moléculas tensoativas ocorre
quando microrganismos utilizam esses compostos como fonte de carbono e energia e envolve duas
etapas. Na primeira, ocorre a quebra da cadeia hidrocarbônica da molécula, causando modificação
estrutural do surfactante e perda imediata da sua anfifilicidade. Na segunda etapa, os produtos
resultantes da degradação primária são transformados em CO2, água e sais minerais
(SCHLEHECK, 2003).
A característica de biodegradabilidade de surfactantes pode ter efeitos positivos e
negativos no seu uso em processos de biorremediação. Os efeitos negativos podem ser causados
pelo esgotamento de minerais e oxigênio, pela potencial toxicidade dos intermediários da via de
degradação ou pela degradação preferencial do surfactante, em detrimento da degradação do
poluente (TIEHM, 1994). O efeito positivo mais óbvio da degradação de um surfactante é a sua
remoção do local tratado com o composto.
Embora muitos destes compostos possam ser degradados por microrganismos, alguns
surfactantes sintéticos aplicados em processos de remediação, como os sulfonatos alquilbenzenos
lineares (LAS), são persistentes sob condições anaeróbias. Em um estudo sobre a
biodegradabilidade de surfactantes, um biodegradável (Ramnolipídeo) e um recalcitrante (Triton X-
100®), sob condições aeróbias, de redução de nitrato, de redução de sulfato e em condições de
fermentação, demonstrou-se que o ramnolipídeo é biodegradável em todas as condições, enquanto
Capítulo 4. Intordução
116
que o Triton X-100 é parcialmente biodegradável sob condição aeróbia e não-biodegradável nas
demais condições (MOHAN et al., 2006).
Os biossurfactantes são considerados, de modo geral, como compostos menos tóxicos e
mais biodegradáveis que os surfactantes sintéticos. Contudo, na literatura disponível, os dados de
biodegradação para biossurfactantes são limitados (TIEHM, 1994). Neste trabalho, foi avaliada a
biodegradabilidade de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies bacterianas em fase
líquida e em solo, em condições aeróbias.
Capítulo 4. Material e Métodos
117
4.3. MATERIAL E MÉTODOS
4.3.1. Surfactantes
Foram avaliados seis tipos de surfactantes, sendo um sintético (SDS®) (MERCK) e cinco
microbianos, produzidos pelos isolados bacterianos Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis
LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans
LBBMA 201. Os biossurfactantes foram produzidos no Laboratório de Biotecnologia e
Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) e o isolamento foi realizado utilizando-se as
técnicas de precipitação ácida, ultra-filtração e cromatografia de camada fina (TLC). As
propriedades ativas de superfície de cada surfactante estão descritas na Tabela 4.1.
Tabela 4.1. Tensão superficial (γ) e concentração micelar crítica (CMC) dos surfactantes utilizados neste estudo
SURFACTANTE γCMC (mN m-1) CMC (mg L-1) EQUAÇÕES*
LBBMA 111A 33,9 150 26,53**e (94,28*/(x+79,6*))
LBBMA 155 34,6 180 27,69**e (86,04*/(x+77,1*))
LBBMA 168 38,8 200 37,98 – 2290,15o/x + 599127,5**/x2 - 22386626**/x3
LBBMA 191 35,0 150 29,75**e (52,2*/(x+45,76*))
LBBMA 201 36,6 200 27,25**e (118,18*/(x+110,08*))
SDS® 39,0 2120 29,26**e (397,4**/(x-703,13**))
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante Sintético Dodecil Sulfato de Sódio.
* significativo a *5% e a **1%.
Surfactina, Iturina e Fengicina de Bacillus sp. LBBMA 111A, Surfactina de B. subtilis
LBBMA 155 e Artrofactina de A. oxydans LBBMA 201 foram produzidos em meio mineral
suplementado com glicose a 2% (p v-1) e hexadecano a 2% (v v-1) (adicionado após o esgotamento
da glicose). Flavolipídeos de Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram produzidos em meio mineral
Capítulo 4. Material e Métodos
118
utilizado por BODOUR & MILLER-MAIER (1998) contendo somente a glicose a 2% (p v-1) como
fonte de carbono. O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyer a 30°C em agitador orbital (New
Brunswick Scientific), com agitação constante de 200 rpm por sete dias.
A purificação e o isolamento dos biossurfactantes produzidos foram realizados após a
remoção das células do meio por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 25 °C), seguida de filtração
em membrana de 0,45 ·μm. A extração primária dos surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e
LBBMA 201 foi realizada por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para 2,0 com HCl a 12
mol L-1. Os biossurfactantes precipitados foram recuperados por centrifugação (12.000 g, 20
minutos, 20 °C) (VATER et al., 2002) e dissolvidos em água pH 7,0. Os produtos foram extraídos
com clorofórmio e metanol, filtrados em papel de filtro comum e, após evaporação dos solventes,
submetidos à cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC) em placas de sílica gel 60
F254 (VETEC) e quantificados. O biossurfactante LBBMA 168 foi recuperado com o uso de célula de
ultra-filtração (modelo Amicon) munida de membrana com limite de exclusão de 500 e 1000
Daltons (LIN et al. 1998), seguido da CCDC e quantificação. Os componentes plotados nas placas
de CCDC foram visualizados sob lâmpada UV (254 nm) e revelados pela aplicação de ninhidrina a
0,2% ou H2SO4 a 3 mol L-1, seguida do aquecimento das placas a 100°C por 5 minutos
(HOROWITZ et al., 1990). As frações impuras foram fracionadas em cromatografia de camada
delgada preparativa (CCDP) e eluídas em misturas de clorofórmio e metanol, para separação dos
compostos presentes nas misturas. Para isso, utilizou-se placa de sílica gel 60 F254 (VETEC), com
revelação sob luz UV.
As soluções de surfactantes foram preparadas com o uso de água ultra-pura milliQplus
(MILLIPORE), sendo o pH da solução ajustado para 6,8 com solução de NaOH a 1 mol L-1. A
concentração dos surfactantes nos ensaios de degradação foi a equivalente a 2 vezes sua
concentração micelar crítica (CMC) (Tabela 4.1).
4.3.2. Microrganismos Utilizados nos Ensaios de Degradação
As culturas puras de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53, Acinetobacter baumanni
LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B, isoladas de amostras de solo e água coletadas
Capítulo 4. Material e Métodos
119
em diferentes áreas com histórico de contaminação por petróleo e derivados e com reconhecida
capacidade de degradação de hidrocarbonetos de petróleo, foram utilizadas nos ensaios de
degradação de surfactantes em fase líquida.
Os estudos de degradabilidade dos surfactantes em microcosmos de solo foram
conduzidos com o uso de uma cultura mista contendo os isolados bacterianos Acinetobacter
baumannii LBBMA 04, Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e
Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, obtidos de amostras de solo e água coletadas em
diferentes áreas com histórico de contaminação por petróleo e derivados. Esses isolados, em
estudos anteriores de caracterização de isolados pertencentes ao banco de culturas do Laboratório
de Biotecnologia e Biodiversidade Aplicada ao Meio Ambiente (LBBMA), demonstraram habilidade
em degradar distintos hidrocarbonetos de petróleo.
4.3.3. Avaliação da biodegradabilidade de surfactantes bacterianos
4.3.3.1. Ensaio de Biodegradabilidade em Fase Líquida
A degradabilidade dos biossurfactantes em fase líquida por culturas puras de bactérias foi
determinada por meio de técnica de respirometria (FRANZETTI et al., 2006). O volume de inóculo
do isolado em teste, suficiente para se obter DO600 correspondente a 0,05, foi adicionado a frascos
respirométricos de 125 mL (GibcoBRL, Life Technologies) contendo 10 mL de uma solução de
biossurfactante (2CMC) em meio mineral NMP (MARGESIN & SCHINNER, 1997). Os frascos
foram acoplados a um respirômetro dotado de um leitor de infravermelho (Sable Systems
International, NE, USA). A liberação do CO2 produzido pelas células bacterianas foi registrada ao
longo de 7 dias. Como controle, foi utilizado frasco contendo o meio mineral sem a adição de
biossurfactante, porém inoculado com as bactérias em estudo.
Ao final do período de incubação, a concentração de biossurfactante residual em solução
foi determinada após a centrifugação das amostras a 10.000 g por 20 minutos. O extrato foi
submetido à medição da tensão superficial pelo método do anel de du Nouy em tensiômetro (Fisher
Scientific, Pittsburgh, EUA) (COOPER et al., 1979).
Capítulo 4. Material e Métodos
120
O experimento foi conduzido segundo um esquema fatorial (7 X 3) correspondente a sete
surfactantes e a três bactérias, com duas repetições. Foi realizada uma análise de variância
(ANOVA), a 5% de probabilidade. Posteriormente, as médias foram comparadas pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade.
4.3.3.2. Ensaio de Biodegradabilidade em Microcosmos de Solo
Um volume de inóculo de cada isolado bacteriano componente da cultura mista, suficiente
para se obter uma concentração final de 106 UFC g-1 de solo, foi adicionado a frascos
respirométricos com capacidade para 125 mL (GibcoBRL, Life Technologies). Os frascos
continham 10g de solo seco previamente peneirado a 2 mm de diâmetro e esterilizado por radiação
gama. A umidade foi ajustada para 60% da capacidade máxima de retenção pela adição de 4,06
mL de uma solução de surfactante cuja concentração final, nas 10 g de solo, foi de 2CMC. Os
frascos foram acoplados a um respirômetro dotado de um leitor de infravermelho (Sable Systems
International, NE, USA). A liberação do CO2 produzido pelas células bacterianas foi registrada ao
longo de 166 horas. Como controle foi utilizado frasco contendo solo esterilizado sem a adição de
biossurfactante, porém inoculado com a bactéria em estudo (FRANZETTI et al., 2006). Como
controle foi utilizado frasco contendo solo esterilizado sem a adição de biossurfactante inoculado e
frasco contendo solo esterilizado com a adição de surfactante e não-inoculado.
Ao final do período de incubação, o biossurfactante residual foi recuperado adicionando-se
25 mL de água destilada aos frascos, seguindo-se agitação a 200 rpm por uma hora e
centrifugação a 10.000 g. por 20 minutos, JOUAN modelo B4i. O sobrenadante foi filtrado através
de membrana Millipore 0,45µm, para medição da tensão superficial pelo método do anel de du
Nouy em tensiômetro (Fisher Scientific, Pittsburgh, EUA) (COOPER et al., 1979). O valor
encontrado foi usado para calcular a concentração do surfactante relativa à sua CMC, utilizando-se
equações de regressão da concentração do surfactante e tensão superficial. Estimou-se, então, a
concentração de cada surfactante no solo, nos tempos inicial e final do período de incubação. A
redução na concentração de cada surfactante foi calculada e expressa em %/100 da CMC.
Capítulo 4. Material e Métodos
121
Foi realizada uma análise de variância (ANOVA), a 5% de probabilidade. Posteriormente, as
médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Capítulo 4. Resultados e Discussão
122
4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.4.1. Potencial de Culturas Puras em Degradar os Biossurfactantes
Os isolados bacterianos A. haemolyticus LBBMA 53, A. baumanni LBBMA ES11 e
Pseudomonas sp. LBBMA 101B foram capazes de utilizar todos os surfactantes avaliados no
metabolismo respiratório, quando cultivados em meio mineral (Tabela 4.2).
Os isolados A. haemolyticus LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11 não diferiram quanto
à degradação dos biossurfactantes aniônicos e do surfactante sintético SDS®. A capacidade de
degradação dos biossurfactantes por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi cerca de 54 vezes
superior à de A. baumanni LBBMA ES11 e de 60 vezes superior à de A. haemolyticus LBBMA 53.
A capacidade de degradação do surfactante sintético SDS® por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi
também maior do que a obtida com A. baumanni LBBMA ES11 (12 vezes) e A. haemolyticus
LBBMA 53 (9 vezes) (Tabela 4.2).
Não houve diferença significativa entre a intensidade de degradação dos diferentes
biossurfactantes pelos três isolados bacterianos avaliados. Também não houve diferença
significativa entre a intensidade de degradação dos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155,
LBBMA 168 E LBBMA 201 e a do surfactante sintético SDS® pelos isolados A. haemolyticus
LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11 (Tabela 4.2). Por outro lado, trealolipídeo produzido por
Dietzia maris LBBMA 191 propiciou uma atividade respiratória desses isolados significativamente
maior do a obtida com o SDS®.
A intensidade de degradação do SDS® por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi
significativamente menor (cerca de 10 vezes) do que a dos biossurfactantes. Esse efeito pode estar
relacionado a um efeito tóxico do composto ou de algum intermediário formado durante sua
degradação. Segundo VAN GINKEL (1996), a degradação de alguns surfactantes sintéticos por
atividade microbiana leva à geração de metabólitos tóxicos. Ao avaliarem a degradação de SDS®
por culturas puras, SINGH et al. (1998) relataram que o crescimento de Pseudomonas aeruginosa
foi completamente inibido pela presença do SDS®, mesmo em concentrações abaixo da CMC.
Capítulo 4. Resultados e Discussão
123
Em trabalhos recentes realizados no LBBMA, foi avaliado o efeito de diferentes
concentrações de SDS® (2CMC, 4CMC e 8CMC) sobre o crescimento dos isolados A. baumanni
LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B em meio mineral adicionado de glicose. A
presença de SDS® na concentração de 2CMC inibiu parcialmente o crescimento dessas bactérias e
totalmente nas concentrações de 4CMC e 8CMC, confirmando o efeito tóxico do composto.
A atividade respiratória nos tratamentos com surfactantes foi significativamente maior do
que em meio mineral sem surfactantes (Tabela 4.2). Esse resultado indica que a atividade
respiratória naqueles tratamentos está ligada à utilização dos surfactantes no metabolismo
respiratório, e não ao consumo de reservas celulares (metabolismo endógeno). Embora a
confirmação de que o CO2 emitido nos tratamentos com surfactantes é originado da degradação de
suas moléculas requeira o uso de outras técnicas, como a de marcação dos surfactantes com 14C,
a maior atividade respiratória na sua presença é um indício de que esses compostos são
efetivamente a fonte do CO2 emitido.
Capítulo 4. Resultados e Discussão
124
Tabela 4.2. Produção de CO2 durante o cultivo de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53,
Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B em meio
mineral suplementado com biossurfactantes e com o surfactante sintético SDS®
A. haemolyticus LBBMA 53
A. baumanni LBBMA ES11
Pseudomonas sp. LBBMA 101B TRATAMENTO
CO2 (μmol mL-1)*
1: LBBMA 111A 3,31 ABb 3,99 ABb 226,71 A
2: LBBMA 155 3,15 ABb 4,22 ABb 233,67 A
3: LBBMA 168 3,24 ABb 4,04 ABb 208,19 A
4: LBBMA 191 5,12 Ab 4,40 Ab 209,15 A
5: LBBMA 201 3,68 ABb 4,09 ABb 234,73 A
6: SDS® 2,86 Bb 2,09 Bb 24,78 B
7: Controle 0,16 Ca 0,12 Ca 2,00 C
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante sintético SDS®. Os dados representam a média de duas repetições. Médias seguidas da mesma letra maiúscula, na coluna, e minúscula, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. *Os dados referem-se ao CO2 acumulado durante 166 horas de incubação estática a 30oC.
A elevação da tensão superficial dos meios contendo os surfactantes, após 166 horas de
incubação na presença dos isolados A. haemolyticus LBBMA 53, A. baumanni LBBMA ES11 e
Pseudomonas sp. LBBMA 101B (tabela 4.3), consubstancia a indicação de que as moléculas de
surfactantes foram metabolizadas e convertidas, em parte, a CO2. Os surfactantes foram
acrescentados ao meio em uma concentração equivalente a 2CMC. Quando a concentração de
surfactantes em uma solução aquosa atinge valores acima de sua CMC, a maior parte das
moléculas se encontra na forma de micelas, e o valor de tensão superficial não varia com o
aumento da concentração (ROSEN, 2004). Porém, à medida que a concentração diminui numa
faixa abaixo da CMC, a tensão superficial entre o meio aquoso e o ar aumenta, até um valor-limite
Capítulo 4. Resultados e Discussão
125
que, da água pura a 25oC, está em torno de 72 mN m-1 (ROSEN, 2004). Conclui-se, portanto, que a
elevação dos valores de tensão superficial dos meios, após a incubação, está necessariamente
relacionada à redução da concentração dos surfactantes para valores abaixo da CMC.
Tabela 4.3. Tensão superficial (γ) nos sobrenadantes dos meios de cultura inoculados e
suplementados com surfactantes, após cultivo de 166 horas, a 30 ºC
A. haemolyticus LBBMA 53
A. baumanni LBBMA ES11
Pseudomonas sp. LBBMA 101B SURFACTANTE (γCMC Inicial )*
γ FINAL (mN m-1)
LBBMA 111A / 32,7 47,7 C 48,8 B 60,6 A
LBBMA 155 / 33,1 42,6 C 46,2 B 62,6 A
LBBMA 168 / 34,2 45,7 C 47,6 B 62,3 A
LBBMA 191 / 34,4 50,6 B 50,9 B 61,2 A
LBBMA 201 / 36,5 49,9 C 51,2 B 64,1 A
SDS® / 37,9 42,4 C 49,0 B 52,6 A
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante sintético Dodecil Sulfato de Sódio. Os dados representam a média de duas repetições. Médias seguidas da mesma letra, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. * Tensão superficial nos meios de cultura no início do cultivo. O valor corresponde à tensão superficial na CMC.
A tensão superficial nos meios de cultura inoculados com Pseudomonas sp. LBBMA 101B
foi significativamente mais elevada do que nos meios em que foram cultivados os isolados A.
haemolyticus LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11 (4.3), o que representa uma menor
concentração dos surfactantes ao final do período de incubação. Esses resultados são condizentes
com a maior atividade respiratória nos tratamentos inoculados com Pseudomonas sp. LBBMA 101B
(Tabela 4.2), o que mais uma vez sugere que a atividade respiratória está ligada à degradação dos
surfactantes presentes no meio de crescimento. As tensões superficiais nos meios inoculados com
Capítulo 4. Resultados e Discussão
126
A. baumannii LBBMA ES11 foram significativamente mais elevadas do que as obtidas nos meios
inoculados com A. haemolyticus LBBMA 53, exceto na presença do biossurfactante produzido por
Dietzia maris LBBMA 191 (Tabela 4.3). Embora estatisticamente diferentes, as médias das tensões
superficiais nos meios inoculados com esses dois isolados foram muito próximas. Como exemplo, a
diferença entre a tensão superficial nos meios que continham o biossurfactante LBBMA 111A e
inoculados com A. haemoliticus ou A. baumannii foi de 1,1 mN m-1. Essa diferença representa uma
variação de apenas 2%, e é coerente com a observação de que não houve diferenças significativas
entre esses dois isolados quanto à atividade respiratória (Tabela 4.2).
4.4.2. Degradação de Biossurfactantes por Cultura Bacteriana Mista em Solo
Os biossurfactantes introduzidos em amostras de solo inoculado com uma cultura
bacteriana mista estimularam a emissão de CO2 (Tabela 4.4). Nos microcosmos de solo contendo
biossurfactantes, a emissão de CO2 foi significativamente maior (P<0,05) do que a obtida nos
microcosmos que não receberam esses compostos (Tabela 4.4).
Não houve diferença significativa entre a atividade respiratória nos microcosmos que
receberam os diferentes biossurfactantes (Tabela 4.4). Esse resultado é condizente com os obtidos
nos ensaios conduzidos em meio mineral inoculado com culturas puras (Tabela 4.2), e indicam que
os biossurfactantes avaliados são igualmente biodegradáveis pelas culturas bacterianas utilizadas
neste trabalho.
A evolução de CO2 nos microcosmos de solos contendo os biossurfactantes foi
significativamente superior à do microcosmo que continha o surfactante sintético SDS® (Tabela
4.4). Nas avaliações em meio mineral, foi demonstrado que diferenças significativas entre a
emissão de CO2 nos tratamentos com biossurfactantes e com SDS® foram encontradas,
invariavelmente, apenas nos inoculados com Pseudomonas sp. LBBMA 101B (Tabela 4.2).
Demonstrou-se, ainda, que a emissão de CO2 nos meios inoculados com essa bactéria foi quase
duas ordens de magnitude superior à obtida com os dois isolados de Acinetobacter. Com base nos
dados obtidos em meio líquido, especula-se que a maior parte do CO2 emitido pelos microcosmos
Capítulo 4. Resultados e Discussão
127
de solos contendo surfactantes tenha se originado da atividade de Pseudomonas sp. LBBMA 101B,
um dos componentes da cultura mista utilizada como inóculo. Isso explicaria a diferença
significativa entre os tratamentos com biossurfactantes e o tratamento que recebeu o surfactante
sintético SDS® (Tabela 4.4), uma vez que essa diferença é similar ao resultado obtido em meio
líquido.
Uma comparação entre atividade respiratória nos microcosmos de solo (Tabela 4.4) e em
meio líquido (Tabela 4.2) demonstra que a atividade microbiana, em solo, foi similar à observada
nos meios líquidos inoculados com os isolados de Acinetobacter. Porém, comparativamente ao
resultado obtido em meio líquido inoculado com Pseudomonas sp. LBBMA 101B, a atividade
respiratória, em solo, foi quase duas ordens de magnitude mais baixa. Esse resultado poderia
indicar que esse isolado, adicionado ao solo juntamente com outros isolados constituintes da
cultura mista, não se estabeleceu eficientemente. No entanto, dada a elevada capacidade das
Pseudomônades de habitarem o solo e diversos outros ambientes (OTENIO et al., 2005), a menor
atividade respiratória nessa matriz, comparativamente ao obtido em meio líquido, parece ser
atribuída a outra causa.
Os valores (calculados) de tensão superficial nas soluções dos solos contendo
surfactantes, ao final do período de incubação, foram apenas ligeiramente mais elevados do que os
de tensão ao início do período de incubação (Tabela 4.4). Esse aumento foi bem menos expressivo
do que o observado em meio líquido, o que representa uma concentração residual maior nas
soluções dos microcosmos de solo. Esse resultado pode indicar que tanto os biossurfactantes
quanto o surfactante sintético SDS foram adsorvidos às partículas do solo, o que pode lhes conferir
uma maior resistência à degradação pelas populações microbianas (URUM & TURGAY et al.,
2004). A menor diferença entre a tensão superficial ao início e ao final do período de incubação foi
obtida no tratamento que continha o SDS®, o que é condizente com a menor atividade respiratória
nesse tratamento e aponta para a baixa biodegradabilidade desse surfactante sintético no solo
(24,8%). Altos valores de tensão superficial final foram obtidos nas soluções dos solos contendo
biossurfactantes, o que resultou da degradação, pela cultura mista, de 68,33% do biossurfactante
Capítulo 4. Resultados e Discussão
128
LBBMA 111A, 69,1% do biossurfactante LBBMA 155, 42,5% do biossurfactante LBBMA 168, 59,6%
do biossurfactante LBBMA 191 e 73,4% do biossurfactante LBBMA 201.
Os surfactantes utilizados neste estudo são aniônicos e categorizados como de alto peso
molecular. Em função de sua estrutura, as vias de degradação desses compostos podem ser
divididas em duas etapas. Na primeira, ocorre a quebra da cadeia hidrofóbica do surfactante,
provocando um aumento na concentração micelar crítica (CMC). Essa modificação estrutural do
surfactante altera suas propriedades tensoativas, diminuindo alguns de seus efeitos indesejáveis
no meio, tais como a formação de espumas. Na segunda etapa, os produtos resultantes da
degradação primária são transformados em CO2, água e sais minerais, representando assim a
degradação completa do surfactante (mineralização). O principal mecanismo de biodegradação
aeróbia de surfactantes envolve a degradação da cadeia alquílica, seguida do grupo hidrofílico. A
quebra da cadeia alquílica é iniciada com a oxidação do grupo metil terminal, transformando-se
através da oxidação enzimática (ω-oxidação) em álcool, aldeído e, posteriormente, em ácido
carboxílico. Por sua vez, o ácido carboxílico é submetido à β-oxidação, a qual é catalisada por
enzimas alcano monooxigenase e desidrogenases. Esse mecanismo de degradação ocorre
predominantemente na natureza. Em decorrência de efeitos estéricos, a biodegradação aeróbia é
mais rápida quanto mais linear for o surfactante (SCHLEHECK, 2003).
Capítulo 4. Resultados e Discussão
129
Tabela 4.4. Emissão de CO2 e tensão superficial (γ) em microcosmos de solos estéreis e
inoculados com uma cultura bacteriana mista, na presença de surfactantes, após 166
horas de incubação estática a 30°C
γCMC (m Jm-2) Nº
MICROCOSMO
EVOLUÇÃO DE CO2 (μmol g-1)
*γCMC INICIAL γCMC FINAL
Redução do surfactante (%)
1 LBBMA 111A 2,31 A 37,9 54,3 68,33 A
2 LBBMA 155 2,16 A 36,7 52,6 69,07 A
3 LBBMA 168 2,15 A 37,3 51,4 42,5 C
4 LBBMA 191 1,97 A 37,7 52,6 59,6 B
5 LBBMA 201 1,49 A 36,8 51,2 73,4 A
6 SDS® 0,63 B 39,5 48,9 24,8 D
7 Controle 0,18 B - - -
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante sintético Dodecil Sulfato de Sódio. Os dados representam a média de duas repetições. * Tensão superficial na solução do solo, no início do cultivo. O valor corresponde à tensão superficial na CMC.
Conquanto a biodegradação de quaisquer compostos utilizados nos ambientes seja
desejável do ponto de vista da segurança ambiental, uma degradação muito intensa pode resultar
em problemas potenciais para sua aplicação. Os surfactantes, incluindo os de origem biológica, são
amplamente utilizados em aplicações industriais e ambientais (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Dentre as aplicações ambientais mais relevantes, mencionam-se seu papel como dispersantes de
manchas de óleo em ambientes aquáticos, como componentes de soluções de lavagem de
resíduos sólidos, incluindo solos, contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos e metais
pesados e em vários processos de biorremediação, com o propósito de aumentar a solubilidade de
moléculas hidrofóbicas e, consequentemente, sua biodisponibilidade para as populações
microbianas responsáveis por sua biodegradação (DESAI & BANAT, 1997; SINGH et al., 2006).
Capítulo 4. Resultados e Discussão
130
Nesses casos, uma certa estabilidade dos surfactantes é desejável, para que os mesmos possam
desempenhar a atividade para a qual foram introduzidos. Neste contexto, os biossurfactantes
avaliados neste trabalho apresentaram uma característica que lhes confere um elevado potencial
para aplicações ambientais, uma vez que conciliam um grau aparentemente razoável de
estabilidade com a possibilidade de serem degradados pelas populações microbianas, tanto em
meio líquido quanto em solo.
Capítulo 4. Conclusões
131
4.5. CONCLUSÕES
Os biossurfactantes Surfactina, Iturina e Fengicina produzidos por Bacillus sp. LBBMA
111A, Surfactina produzida por B. subtilis LBBMA 155, trealolipídeo produzido por Dietzia maris
LBBMA 191, Artrofactina produzida por Arthrobacter oxydans LBBMA 201 e Flavolipídeos
produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram utilizados como substrato por culturas puras
de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53, Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 e Pseudomonas
sp. LBBMA 101B em meio mineral.
Em meio líquido, Pseudomonas sp. LBBMA 101B apresentou uma capacidade de
degradação dos biossurfactantes cerca de duas ordens de magnitude maior do que A.
haemolyticus LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11.
A intensidade de biodegradação do surfactante sintético SDS em meio líquido, por
Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53 e Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, não difere da
intensidade de biodegradação dos biossurfactantes, mas é uma ordem de magnitude menor do que
a degradação dos biossurfactantes por Pseudomonas sp. LBBMA 101B.
Em solo, uma cultura mista composta dos isolados Acinetobacter baumannii LBBMA 04,
Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA
ES11 foi capaz de utilizar os biossurfactantes como substrato. Os biossurfactantes não diferiram
entre si quanto à capacidade de estimular a atividade respiratória da cultura mista.
Não houve degradação significativa do surfactante sintético SDS® em solo inoculado com a
cultura mista, durante sete dias de incubação.
Em análise comparativa, os surfactantes biológicos apresentaram um potencial de
degradabilidade superior ao do surfactante sintético. Em solo, apresentaram uma estabilidade que
pode ser compatível com aplicações ambientais, e ao mesmo tempo, uma biodegradabilidade que
reduz o risco de acumularem-se no ambiente indefinidamente. Conclui-se assim que, do ponto de
vista da biodegradabilidade e da segurança ambiental, esses compostos são mais indicados para
aplicações ambientais do que o surfactante sintético SDS®.
Capítulo 4. Referências Bibliográficas
132
4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BODOUR, A.A. & MAIER, R.M. 1998. Application of a modified drop-collapse technique for
surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microrganisms. Journal of
Microbiological Methods, 32, 273-280.
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DESAI, J. D. & BANAT, I. M. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial
potential. Microbiology Molecular Biology Reviews, 61, 47-64.
FRANZETTI, A., DI GENNARO, P., BEVILACQUA, A., PAPACCHINI, M. & BESTETTI, G. 2006.
Environmental features of two commercial surfactants widely used in soil remediation
Chemosphere, 62, 1474–1480.
HOROWITZ, S., GILBERT, J. N. & GRILFIN, W.M. 1990. Isolation and characterization of a
surfactant produced by Bacillus licheniformis 86. Journal of Industrial Microbiology, 6, 243-248.
LIN, S.-C., CHEN, Y.-C., LIN, Y.M. 1998. General approach for the development of high-
performance liquid chromatography methods for biosurfactant analysis and purification. Journal of
Chromatografy A, 859, 149-159.
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NITSCHKE, M. & PASTORE, G. 2002. Biossurfactantes: Propriedades e Aplicações. Química
Nova, 25, 772-776.
OTÊNIO, M.H., SILVA, M.T.L., MARQUES, M.L.O., ROSEIRO, J.C., BIDOIA, E.D. 2005. Benzene,
toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida CCMI 852. Brazilian Journal of
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Capítulo 4. Referências Bibliográficas
133
SCHLEHECK, D. 2003. Biodegradation of synthetic surfactants: linear alkylbenzenesulfonates
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SINGH, A., VAN HAMME, J.D. & WARD, O.P. 2006. Surfactants in icrobiology and biotechnology:
Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances, 25, 99–121.
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aromatic hydrocarbons (PAH’s). Tese de Doutorado. Institute of Ecological Chemistry, GSF-
Research Center for Environment and Health, Neuherberg, Germany.
Capítulo 4. Referências Bibliográficas
134
CAPÍTULO 5 REMOÇÃO SIMULTÂNEA DE FENANTRENO E CÁDMIO DE SOLO
CONTAMINADO POR UMA SOLUÇÃO LIGANTE/BIOSSURFACTANTE
5.1. RESUMO
Surfactantes são eficientes como agentes de remediação de solos e sedimentos contaminados
com alguns tipos de metais pesados e de poluentes orgânicos hidrofóbicos. No entanto, dada a
distinta natureza desses contaminantes, sua remoção simultânea por soluções de surfactantes não
é eficiente. Neste trabalho, foi investigada a eficiência de combinações do ligante iodeto (I-) e
surfactantes produzidos por diferentes espécies de bactérias na remoção simultânea de cádmio
(Cd2+) e fenantreno de um latossolo vermelho-amarelo. Foram testados quatro surfactantes
microbianos produzidos pelos isolados Arthrobacter oxydans LBBMA 201, Bacillus sp. LBBMA
111A, Bacillus subtilis LBBMA 155 e Flavobacterium sp. LBBMA 168 e o sintético Triton X-100®,
com diferentes concentrações do ligante. Amostras de solo contaminadas com Cd2+ e fenantreno
foram agitadas durante 24 horas com uma solução de lavagem contendo surfactante/ligante. Após
cinco lavagens consecutivas, os teores de Cd2+ removido foram determinados por
espectrofotometria de absorção atômica e os de fenantreno por espectrofotometria UV. A remoção
de Cd2+ aumentou com o aumento da concentração do ligante, principalmente nas soluções
contendo os biossurfactantes produzidos pelos isolados LBBMA 155 e LBBMA 168 e o surfactante
Triton X-100®. As máximas eficiências de remoção de Cd2+ foram de 99,2% para os
biossurfactantes produzidos por LBBMA 201 e por LBBMA 111A, na presença de 0,336 mol L-1 de
I-. Já a eficiência máxima de remoção do Cd2+ pelo surfactante sintético Triton X-100® foi de 65,0%.
As soluções de biossurfactantes removeram entre 80% a 88% do fenantreno presente no solo, não
Capítulo 4. Referências Bibliográficas
135
sendo a remoção influenciada pela presença do ligante. A solução do surfactante Triton X-100®,
removeu entre 73% e 88% do fenantreno e, diferentemente do observado com os biossurfactantes,
a presença do ligante I- influenciou significativamente a eficiência de remoção do contaminante
hidrofóbico. O trabalho permite concluir que o uso de um único reagente de lavagem, denominado
de surfactante-ligante, propicia a remoção simultânea de um metal pesado e de um composto
orgânico hidrofóbico.
Palavras-chave: Poluentes; remediação; descontaminação; metais pesados; PAH’s.
Capítulo 5. Introdução
136
5.2. INTRODUÇÃO
Metais pesados e poluentes orgânicos hidrofóbicos, como os hidrocarbonetos
poliaromáticos (PAH’s), são dois dos mais importantes e freqüentes contaminantes de sedimentos
e solos. Quantidades significativas de metais pesados, incluindo zinco (Zn), chumbo (Pb), cádmio
(Cd), cromo (Cr) e cobalto (Co), juntamente com PAH’s e hidrocarbonetos clorados, são
encontrados em sedimentos marinhos (JAFFE et al., 2003) e em áreas urbanas industrializadas
(HO & HUI, 2001). A existência de correlações positivas entre Cd e Pb e bifenilas policloradas
(PCB’s) e PAH’s pode ser atribuída à existência de uma fonte comum de poluição do solo em áreas
de indústrias químicas e siderúrgicas (WEISS et al., 1994).
Metais pesados e compostos orgânicos hidrofóbicos exibem características químicas
distintas. Os metais pesados são relativamente móveis no solo, principalmente em condições de
pH baixo, onde encontram-se na forma iônica (SHIN et al., 2005). Os compostos orgânicos
hidrofóbicos, como os PAH’s, são relativamente insensíveis a mudanças de pH e exibem
propriedades lipofílicas (SHIN et al., 2005). Essas diferenças nas características químicas tornam
difícil o uso de um único reagente para remover, simultaneamente, os dois grupos de
contaminantes.
Em processos de remediação de solos, normalmente se utilizam ácidos orgânicos ou
inorgânicos e agentes quelantes para remover metais pesados (PETER et al., 1999; REDDY et al.,
2000; WASAY et al., 2000) e solventes ou surfactantes como agentes mais apropriados para a
remediação de poluentes orgânicos hidrofóbicos (FAVA et al., 1998; CHU et al., 2003).
Atualmente, a estratégia para remover simultaneamente os metais pesados e
contaminantes orgânicos hidrofóbicos em solo utiliza como agentes lixiviantes, entre outros, a água
destilada, ácido húmico, fosfolipídeos e dodecil sulfato de sódio (SDS®) (SCHMELLING et al., 1998;
HIRNER et al., 1998; ABRAMOVITCH et al., 2003). De todos eles, o SDS® é considerado como o
mais adequado para a solubilização dos contaminantes orgânicos, dada sua habilidade para
interagir com compostos hidrofóbicos e cadeias de hidrocarbonetos. Contudo, a capacidade do
SDS® de remover metais pesados (contaminantes hidrofílicos) não foi demonstrada (HIRNER et al.,
1998).
Capítulo 5. Introdução
137
SHIN et al. (2000) demonstraram que o surfactante não-iônico Triton X-100®, em
combinação com um ligante inorgânico [iodeto (I-) ou tiocianato (SCN-)], propiciou a remoção de
Cd, Cu e Zn de um solo contaminado com metais pesados e PCB’s. Os autores propuseram que o
ligante forma um complexo com o íon metálico na solução de surfactante, reduzindo seu caráter
hidrofílico e permitindo sua adsorção no interior da micela do surfactante. Esse comportamento
pode levar à dessorção simultânea de metais pesados e compostos orgânicos hidrofóbicos
adsorvidos às partículas de solos e sedimentos.
Biossurfactantes e ligantes são potencialmente menos tóxicos a organismos do solo,
comparativamente a outros agentes químicos, como surfactantes sintéticos, ácidos fortes e agentes
quelantes. Contudo, não há relatos na literatura consultada de avaliação da eficiência da
combinação de biossurfactantes e ligantes na mobilização simultânea de compostos orgânicos
hidrofóbicos e metais pesados. Neste trabalho, combinações do ligante (I-) e biossurfactantes
produzidos por diferentes espécies bacterianas foram avaliadas quanto à eficiência de remoção
simultânea de fenantreno e cádmio de solo.
Capítulo 5. Material e Métodos
138
5.3. MATERIAL E MÉTODOS
5.3.1. Surfactantes
Foram testados cinco tipos de surfactantes, sendo um sintético não-iônico Triton X-100®
(C8H17C6H4(OC2H4)10OH) e quatro biológicos produzidos pelos isolados bacterianos Bacillus sp.
LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168 e Arthrobacter oxydans
LBBMA 201. Os biossurfactantes foram produzidos no laboratório de Biotecnologia e
Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) e o isolamento foi realizado utilizando as técnicas
de precipitação ácida, ultra-filtração e cromatografia de camada fina. As propriedades ativas de
superfície de cada surfactante estão descritas na Tabela 5.1.
Tabela 5.1. Caracterização dos surfactantes utilizados neste estudo
SURFACTANTE 1γCMC (mN m-1) CMC (mg L-1)
LBBMA 111A 33,9 150
LBBMA 155 34,6 180
LBBMA 168 38,8 200
LBBMA 201 36,6 200
Triton X-100® 39,0 268
Água 72,0 -
LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201. 1Tensão superficial referente à Concentração Micelar Crítica (CMC)
Surfactina, Iturina e Fengicina de Bacillus sp. LBBMA 111A, Surfactina de B. subtilis
LBBMA 155 e Artrofactina de A. oxydans LBBMA 201 foram produzidos em meio mineral
suplementado com glicose a 2% (p v-1) e hexadecano a 2% (v v-1) (adicionado após o esgotamento
da glicose). Flavolipídeos de Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram produzidos em meio mineral
descrito por BODOUR & MILLER-MAIER (1998) contendo somente a glicose a 2% (p v-1) como
Capítulo 5. Material e Métodos
139
fonte de carbono. O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyer a 30°C em agitador orbital (New
Brunswick Scientific), com agitação constante de 200 rpm por sete dias.
A purificação e o isolamento dos biossurfactantes produzidos foram realizados após a
remoção das células do meio por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 25 °C), seguida de filtração
em membrana de 0,45 ·μm. A extração primária dos surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e
LBBMA 201 foi realizada por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para 2,0 com HCl a 12
mol L-1. Os biossurfactantes precipitados foram recuperados por centrifugação (12.000 g, 20
minutos, 20 °C) (VATER et al., 2002) e dissolvidos em água pH 7,0. Os produtos foram extraídos
com clorofórmio e metanol, filtrados em papel de filtro comum e, após evaporação dos solventes,
submetidos à cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC) em placas de sílica gel 60
F254 (VETEC) e quantificados. O biossurfactante LBBMA 168 foi recuperado com o uso de célula de
ultra-filtração (modelo Amicon) munida de membrana com limite de exclusão de 500 e 1000
Daltons (LIN et al. 1998), seguido da CCDC e quantificação. Os componentes plotados nas placas
de CCDC foram visualizados sob lâmpada UV (254 nm) e revelados pela aplicação de ninhidrina a
0,2% ou H2SO4 a 3 mol L-1, seguida do aquecimento das placas a 100°C por 5 minutos
(HOROWITZ et al., 1990). As frações impuras foram fracionadas em cromatografia de camada
delgada preparativa (CCDP) e eluídas em misturas de clorofórmio e metanol, para separação dos
compostos presentes nas misturas. Para isso, utilizou-se placa de sílica gel 60 F254 (VETEC), com
revelação sob luz UV.
A concentração de surfactantes nas soluções de lavagem foi equivalente a 2CMC (Tabela
5.1), exceto para o surfactante Triton X-100®, que foi utilizado numa concentração (0,05 mol L-1)
muito acima da sua CMC (Tabela 5.1). O Iodeto de Potássio (KI) foi o composto utilizado como
fonte do ligante I- e o fenantreno como composto modelo de PAH. Os agentes de lavagem,
incluindo o surfactante e o ligante, foram preparados em água destilada.
5.3.2. Solo
O solo utilizado neste estudo foi coletado da camada de 0 a 20 cm de profundidade, no
município de Viçosa, MG e é classificado como Latosolo Vermelho-amarelo. A sua caracterização
Capítulo 5. Material e Métodos
140
físico-química foi realizada no Laboratório de Análises de Rotina do Departamento de Solos da
Universidade Federal de Viçosa (UFV). O conteúdo de carbono orgânico foi quantificado por
oxidação úmida da matéria orgânica, empregando-se solução de dicromato de potássio em meio
ácido (YEOMANS & BREMNER, 1988). A capacidade de troca catiônica (CTC) foi determinada
pela quantificação de Ca2+, Mg2+ e Al3+ dessorvidos do solo, após saturação com uma solução de
BaCl2 a 0,1 mol L-1 (HENDERSHOT et al., 1993). Este solo apresenta elevado teor de argila, teor
médio de matéria orgânica e elevada acidez (Tabela 5.2). Solos caracterizados por teores elevados
de argila tendem a reter mais fortemente contaminantes como metais pesados e PAH’s, o que
dificulta sua remoção pelos tratamentos físico-químicos atualmente em uso (DENNIS et al., 1992).
Além da argila, o teor de matéria orgânica é outra característica associada à retenção de
contaminantes (MULLIGAN et al., 2001).
Tabela 5.2. Caracterização físico-química do solo experimental
Parâmetro Valor
Areia grossa (%) 18,00
Areia fina (%) 17,00
Silte (%) 3,00
Argila (%) 62,00
pH (H2O) 4,30
Al3+ (Cmolc dm-3) 1,24
Ca2+ (Cmolc dm-3) 0,10
Mg2+ (Cmolc dm-3) 0,10
Matéria orgânica (dag kg-1) 3,32
P (mehlich-1) (mg dm-3) 2,00
K (mehlich-1) (mg dm-3) 29,00
P remanescente (mg L-1) 11,00
Capítulo 5. Material e Métodos
141
5.3.3. Procedimento de Contaminação do Solo
Amostras de 2,5 g de solo foram contaminadas com Cd2+ e fenantreno. A contaminação do
solo com Cd2+ foi realizada conforme protocolo descrito por MULLIGAN et al. (1999). O
procedimento de contaminação consistiu na agitação das amostras de solo durante 72 horas, após
adição de 10 mL g-1 de solo de uma solução contendo 1 mmol L-1 de nitrato de cádmio
tetrahidratado (Cd(NO3)2.4H2O). O solo foi removido da solução por centrifugação (1350 g, 30
minutos). Em seguida, as amostras de solo foram contaminadas com fenantreno dissolvido em
acetona a 1 mg mL-1 ( YANG et al., 2006). O solo contaminado, com concentração final de 200 mg
kg-1 de fenantreno, foi revolvido vigorosamente por 30 minutos para promover uma distribuição
homogênea do fenantreno. Para eliminação da acetona, as amostras de solo foram deixadas em
repouso durante 48 horas, sob temperatura de 28°C.
5.3.4. Procedimento de Lavagem do Solo
O reagente de lavagem foi preparado pela mistura do surfactante com o iodeto (I-), para
formar uma pseudo-fase única e o pH foi ajustado entre 7,0 e 8,0. As concentrações do ligante (I-)
foram de 0, 0,168 ou 0,336 mol L-1. Como controle, foi utilizada água destilada.
Amostras de solo (2,5 g) foram saturadas com 25 mL de solução de lavagem (pH entre 7,0
e 8,0), e a mistura foi mantida sob agitação orbital a 150 rpm durante 24 horas. A amostra de solo
foi removida da solução por centrifugação a 1350 g por 30 minutos. Para se determinar a
quantidade de Cd2+ removido das amostras, a concentração de Cd2+ no sobrenadante foi analisada
por espectrofotometria de absorção atômica (AAS) (SHIN et al, 2005). O percentual de Cd2+
removido foi determinado com a seguinte equação:
Uma série de cinco lavagens consecutivas, em batelada, foi realizada em cada amostra de
solo, empregando-se novas soluções de lavagem. Em cada etapa de lavagem, a mistura solo-
(Quantidade de Cd2+ na solução)
Quantidade total de Cd2+ no solo % de remoção do Cd2+ = x 100
Capítulo 5. Material e Métodos
142
solução foi equilibrada durante 24 horas sob agitação, seguindo-se centrifugação (1350 g, 30
minutos) e análise da concentração de Cd2+ no sobrenadante.
5.3.5. Análise de Fenantreno Residual
Para se determinar a quantidade de fenantreno removido das amostras, a concentração de
fenantreno no sobrenadante foi analisada por espectrofotometria a 254 nm. O percentual de
fenantreno removido das amostras foi calculado com base no conteúdo inicial de fenantreno
aplicado ao solo e no conteúdo final removido após as cinco etapas de lavagem. Amostras de solo,
sem fenantreno e Cd2+, lavadas com as mesmas soluções de surfactante-ligante, foram utilizadas
como branco.
5.3.6. Análises Estatísticas
O experimento foi conduzido segundo um esquema fatorial [(5 X 3) + 1], em delineamento
inteiramente casualizado, correspondente a cinco surfactantes e a três concentrações do ligante
(KI), além de um controle (água destilada), com três repetições. Os dados foram submetidos à
análise de variância (ANOVA) a 5% de probabilidade. Posteriormente, as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
143
5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.4.1. Remoção de Cd2+ de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-Ligante
Soluções puras de biossurfactantes foram capazes de remover cerca de 70% do Cd2+
presente no solo, valor significativamente maior do que o obtido com a solução do surfactante
sintético Triton X-100®, que propiciou a remoção de apenas 28,7% do Cd2+ (Tabela 5.3). Os dados
demonstram que a eficiência do surfactante Triton X-100® em remover Cd2+, na ausência de um
ligante, é baixa, comparativamente à eficiência de remoção por soluções puras dos
biossurfactantes avaliados (Figura 5.1 e Tabela 5.3).
A remoção do Cd2+ aumentou significativamente com o número de lavagens e com a
concentração do ligante, para a maioria dos surfactantes avaliados (Figuras 5.1 e 5.2). Em
combinação com a maior concentração do ligante, a remoção total de Cd2+ obtida após as cinco
etapas de lavagem atingiu valores de 99,2% (LBBMA 111ª e LBBMA 201), 84,4% (LBBMA 155),
74,0% (LBBMA 168) e 65,0% (Triton X-100®) (Figura 5.1 e 5.2 e Tabela 5.3).
O mecanismo sugerido para o aumento da eficiência de remoção de Cd2+ pela presença do
I- na solução de lavagem é o da formação de uma molécula resultante da complexação do metal-
alvo com o ligante, seguida da sua solubilização na micela de surfactante (UMEBAYASHI et al.,
1997).
A presença do íon ligante aumentou a remoção do íon metálico do solo, exceto quando se
utilizaram os flavoliídeos produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168, cuja capacidade de
remoção não foi significativamente influenciada pelo ligante (Figuras 5.1 e 5.3 e Tabela 5.3).
BODOUR et al. (2004) reportam que os flavolipídeos são surfactantes com habilidade para
complexar cádmio.
Alta eficiência de remoção de Cd2+, após as cinco lavagens, foi obtida com os surfactantes
LBBMA 111A e LBBMA 201 (99,2%) (Figuras 5.1 e 5.2 e Tabela 5.3). O surfactante sintético Triton
X-100® atingiu valores de eficiência de remoção correspondentes a 59,0 e 65,0% quando em
combinação com 0,168 e 0,336 mol L-1 de I-, respectivamente (Figura 5.1 e Tabela 5.3).
Comparativamente, a remoção de Cd2+ por água pura foi menor que 15% (Tabela 5.3).
Capítulo 5. Resultados e Discussão
144
Quando o solo foi lavado com solução contendo Triton X-100, na presença de 0, 0,168 e
0,336 mol L-1 de ligante, a remoção total de Cd2+ foi de 28,7%, 59,0% e de 65,0%, respectivamente,
após cinco lavagens (Figura 5.1 e Tabela 5.3). Conclui-se que, na ausência do ligante, o Triton X-
100 não é efetivo em remover Cd2+ do solo. Porém, na presença do ligante, a remoção de Cd2+
aumentou significativamente (Figura 5.2 e Tabela 5.3). Este efeito também foi observado por SHIN
& BARRINGTON (2003). Naquele trabalho, a remoção de Cd2+ por Triton X-100 de um solo
contaminado, na ausência do ligante I-, foi de apenas 10% do Cd2+ presente no solo.
Biossurfactantes aniônicos têm alta habilidade para complexar-se com metais pesados, a
exemplo dos ramnolipídeos, que apresentam uma afinidade com Cd2+ superior à afinidade por
outros cátions comuns do solo, como Mg2+ e K+ (MULLIGAN, 2005). Essa característica é
importante para a aplicação desses compostos em processos de lavagem de solos contaminados
com metais pesados, porque preserva, em parte, nutrientes essenciais às plantas e aos
microrganismos do solo.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
145
Tabela 5.3. Remoção de Cd2+ de um latossolo vermelho-amarelo por surfactantes combinados com
diferentes concentrações do ligante iodeto (I-)
Cd2+ removido (mg g-1 de solo) Lavagem Surfactante
Ligante (mol L-1)
1 2 3 4 5
Cd2+
inicial (mg g-1)
Total de Cd2+
removido (mg g-1)
Total de Cd2+
removido (%)
111A1 0 0,076 0,276 0,156 0,148 0,156 1,124 0,808 cd 71, 9 111A 0,168 0,112 0,232 0,192 0,180 0,212 1,124 0,928 b 82, 6 111A 0,336 0,164 0,208 0,232 0,292 0,220 1,124 1,115 a 99,2
1551 0 0,088 0,184 0,168 0,168 0,184 1,124 0,793 cd 70,6 155 0,168 0,108 0,188 0,208 0,208 0,220 1,124 0,933 b 83,0
155 0,336 0,104 0,212 0,216 0,220 0,200 1,124 0,949 b 84,4
1681 0 0,064 0,216 0,212 0,140 0,120 1,124 0,752 cd 66,9 168 0,168 0,088 0,144 0,188 0,176 0,196 1,124 0,793 cd 70,6
168 0,336 0,076 0,160 0,216 0,184 0,196 1,124 0,832 c 74,0
2011 0 0,096 0,176 0,148 0,184 0,164 1,124 0,767 cd 68,2 201 0,168 0,192 0,168 0,232 0,236 0,236 1,124 1,067 a 94,9
201 0,336 0,188 0,232 0,244 0,216 0,236 1,124 1,116 a 99,2 Triton X-1002 0 0,040 0,064 0,060 0,096 0,064 1,124 0,323 f 28,7
Triton X-100 0,168 0,084 0,148 0,128 0,152 0,152 1,124 0,663 e 59,0
Triton X-100 0,336 0,104 0,168 0,132 0,168 0,160 1,124 0,731 de 65,0
Água - 0,024 0,036 0,024 0,036 0,044 1,124 0,162 g 14,4
1LBBMA 111A= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 201= Surfactante produzido pelo isolado Arthrobacter oxydans LBBMA 201; LBBMA 168= Surfactante produzido pelo isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168. 2Surfactante sintético Triton X-100®. Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
146
S1C2
1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
S2C1
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40S1C3
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
y = 0,2072**(1-0,3334**x) r2= 0,5580
y = 0,2527** (1-0,3694**x) r2= 0,6264
y = 0,1848** (1-0,4103**x) r2= 0,6894
S1C1Cd
rem
ovid
o (m
g g-1
)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
S2C3
Lavagens (no)1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
y= 0,4773 - 2,8875**/x + 7,4516**/x2 - 4,9653**/x3
r2= 0,9879
S2C2
Lavagens (no)1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg.
)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
y = 0,2265** (1-0,4720**x) r2= 0,9249
y = 0,2230** (1-0,4171**x) r2= 0,7845
Figura 5.1a. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
147
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
y = 0,2159** (1-0,5383**x) r2= 0,7977
y = 0,1747** (1-0,3732**x) r2= 0,7047
y = 0,2353** (1-0,1848**x) r2= 0,9182
y = 0,2337** (1-0,1828**x) r2= 0,7241
S3C1Cd
rem
ovid
o (m
g g-1
)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40 S3C2
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
y= -0,2056 + 2,2496**/x - 3,6298**/x2
+ 1,6497**/x3
r2
= 0,9564
y = 0,2051** (1-0,5421**x) r2 = 0,9284
S3C3 S4C1
S4C2 S4C3
Lavagem (nº) Lavagem (nº)
Figura 5.1b. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
148
S5C1
Lavagem (nº)1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Lavagem (nº)1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
S5C3
Lavagem (nº)1 2 3 4 5
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
y = 0,1527** (1-0,3937**x) r2= 0,7857
y = 0,1605** (1-0,3033**x)r2= 0,5889
S5C2
Figura 5.1c. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
149
S1
[I-, mol L-1]0.000 0.168 0.336
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
0.000 0.168 0.336
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
S3
[I-, mol L-1]0.000 0.168 0.336
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
S2
S4
0.000 0.168 0.336
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
S5
0.000 0.168 0.336
Cd re
mov
ido
(mg
g-1)
0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
[I-, mol L-1]
[I-, mol L-1]
[I-, mol L-1]
Y= 0,7994 + 0,9141**x r2=0,9816
Y= 0,7957 + 1,1781*x - 2,1466***x2
r2=0,7913
Y= 0,7526 + 0,2367**x r2= 0,7557
Y= 0,7693 + 2,5210**x - 4,4006**x2 r2=0,9847
Y= 0,3240 + 2,8564**x - 4,8849**x2 r2=0,9873
Figura 5.2. Efeito da concentração do ligante (I-) na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
150
5.4.2. Remoção de Fenantreno de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-
Ligante
Soluções puras de biossurfactantes removeram entre 79% e 87%% do fenantreno presente
no solo. Esses valores foram significativamente maiores do que a remoção pelo Triton X-100®, o
qual propiciou a remoção de cerca de 73% do contaminante (Tabela 5.4 e Figura 5.4). A maior
parte do fenantreno (acima de 92% do total removido) foi removida do solo na primeira etapa de
lavagem. O resultado indica que, em aplicações comerciais, uma única lavagem do solo com uma
solução de biossurfactantes, em concentração equivalente a 2CMC, é suficiente para remover a
maior parte do fenantreno contaminante e, possivelmente, de outros compostos orgânicos
hidrofóbicos.
A inclusão do ligante I- às soluções de surfactantes não influenciou significativamente a
remoção de fenantreno, exceto para o Triton X-100® (Tabela 5.4 e Figura 5.5). Não houve remoção
detectável de fenantreno pela água, enfatizando-se a necessidade da inclusão de surfactantes para
a remediação de solos contaminados com poluentes hidrofóbicos.
Figura 5.3. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de fenantreno de solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1% de probabilidade, respectivamente.
S1C1: y=11,5769* e (-3,3703**x); r2=0,9976 S1C2: y=9,0112** e (-2,9887**x); r2=0,9984 S1C3: y=8,0098** e (-2,9887**x); r2=0,9973 S2C1: y=15,2775** e (-3,6966**x); r2=0,9991 S2C2: y=12,7988* e (-3,5039**x); r2=0,9979 S2C3: y=15,2920 e (-3,6436**x); r2=0,9890 S3C1: y=15,8839 e (-3,6824**x); r2 =0,9840 S3C2: y=19,8482*** e (-3,8986**x); r2=0,9982 S3C3: y=17,6163* e (-3,7777**x); r2=0,9988 S4C1: y=14,3442 e (-3,5648**x); r2=0,9952 S4C2: y=9,3861* e (-3,1333**x); r2=0,9952 S4C3: y=7,4380** e (-2,8950**x); r2=0,9984 S5C1: y=3,9932** e (-2,4782**x); r2=0,9916 S5C2: y=9,2238** e (-3,1183**x); r2=0,9996 S5C3: y=7,0527** e (-2,8353**x); r2=0,9984
Lavagem(Nº)1 2 3 4 5
Fena
ntre
no re
mov
ido
(ug
g-1 d
e sol
o)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5200
160
120
80
40
0.0
Capítulo 5. Resultados e Discussão
151
Tabela 5.4. Eficiência de remoção de fenantreno, após tratamento do solo com surfactantes, na
presença/ausência do ligante
PHE removido (μg g-1) Lavagem
Surfactante Ligante (mol L-1)
1 2 3 4 5
PHE inicial (μg g-1)
Total de PHE removido
(μg g-1)
Total de PHE removido (%)
111A1 [0] 159,2 5,2 4,0 2,8 2,0 200 173,2 abc 86,6 111A [0,168] 160,4 6,8 4,0 1,6 0,0 200 174,0 abc 87,0 111A [0,336] 161,2 7,6 5,6 0,0 0,0 200 174,4 abc 87,2
1551 [0] 151,6 3,6 3,2 0,0 0,0 200 158,4 d 79,2 155 [0,168] 154,0 4,4 0,4 0,0 0,0 200 162,4 cd 81,2 155 [0,336] 160,0 4,0 3,6 1,2 0,0 200 168,8 abcd 84,4
1681 [0] 159,6 4,0 0,4 0,4 0,0 200 164,4 bcd 82,20 168 [0,168] 160,8 3,2 1,6 0,0 0,0 200 165,6 abcd 82,8 168 [0,336] 161,2 3,6 2,0 0,0 0,0 200 166,8 abcd 83,4
2011 [0] 162,4 4,4 3,6 0,0 0,0 200 170,4 abc 85,2 201 [0,168] 163,6 6,8 4,0 1,2 0,0 200 175,6 ab 87,8 201 [0,336] 164,4 8,8 3,2 0,0 0,0 200 176,4 ab 88,2
Triton X-1002 [0] 134,0 11,2 1,2 0,0 0,0 200 146,4 e 73,2 Triton X-100 [0,168] 163,2 7,2 0,4 0,0 0,0 200 170,8 abc 85,4 Triton X-100 [0,336] 165,6 9,6 1,6 0,0 0,0 200 176,8 a 88,4
Água - 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 200 0,000 f 0,00
1LBBMA 111A= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 201= Surfactante produzido pelo isolado Arthrobacter oxydans LBBMA 201; LBBMA 168= Surfactante produzido pelo isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168. 2Surfactante sintético Triton X-100®. Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
152
S2
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
Rem
oção
de P
he (u
g g-1
)
0.320.340.360.380.400.420.440.460.48
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
0.320.340.360.380.400.420.440.460.48
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
0.320.340.360.380.400.420.440.460.48
S3
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
0.320.340.360.380.400.420.440.460.48
[I-, mol L-1] [I-, mol L-1]
[I-, mol L-1] [I-, mol L-1]
Rem
oção
de P
he (u
g g-1
)
Rem
oção
de P
he (u
g g-1
)
Rem
oção
de P
he (u
g g-1
)
S4 S5
y=0,3956 + 0,753**x r2= 0,892
y=0,4092 + 0,0149***xr2= 0,6359
y= 0,4284 + 0,0426**xr2= 0,6493
y= 0,3675 + 0,2258**xr2=0,8903
Figura 5.4. Efeito da concentração de ligante (I-) na remoção de fenantreno de solo. S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente. S1(Surfactante LBBMA 111A)= sem modelo, pois o coeficiente angular da reta é igual a zero, ou seja, não varia com a concentração do ligante.
Capítulo 5. Resultados e Discussão
153
5.4.3. Eficiência de Soluções Surfactantes-Ligante na Remoção Simultânea de
Cd2+ e Fenantreno
O fenantreno foi removido com eficiência por soluções contendo apenas biossurfactantes
numa concentração equivalente a 2CMC (Tabela 5.4 e Figura 5.5). A adição do ligante I- às
soluções de biossurfactantes não afetou a sua capacidade de remover fenantreno. Se por um lado
a adição do ligante não resultou em maior eficiência de remoção do composto hidrofóbico,
tampouco a comprometeu. Para a remoção de Cd2+ e, possivelmente, de outros metais pesados,
uma elevada concentração do ligante aumenta a eficiência dos surfactantes, principalmente os
surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 168 e o surfactante Triton X-100® (Figura 5.3 e Tabela 5.3).
Com base nos resultados deste trabalho, pode-se concluir que soluções contendo uma
combinação surfactante-ligante removem eficientemente Cd2+ e fenantreno de solo contaminado.
Um esquema mecanístico plausível para o processo de remoção envolve uma complexação inicial
ligante-metal para formar espécies iônicas, seguida pela internalização do complexo Cd-I e do
fenantreno no núcleo hidrofóbico das micelas de surfactantes (SHIN et al., 2005). Propõe-se que
soluções de surfactantes-ligantes sejam igualmente capazes de remover simultaneamente outros
poluentes hidrofóbicos e metálicos de solos e de sedimentos contaminados.
Capítulo 5. Conclusões
154
5.5. CONCLUSÕES
A presença do ligante I- em soluções de biossurfactantes produzidos pelos isolados
bacterianos Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA
168 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 aumenta a remoção de Cd2+ de solo argiloso.
Soluções de biossurfactantes removem eficientemente fenantreno de solo argiloso, sendo o
efeito independente da presença do ligante I-.
Os biossurfactantes são mais eficientes na remoção de Cd2+ de solo argiloso do que o
surfactante sintético Triton X-100®. A eficiência de remoção do fenantreno é similar entre essas
duas classes de surfactantes.
Cd2+ e fenantreno podem ser removidos simultaneamente de solos empregando-se uma
solução de surfactante-ligante.
Apêndice 155
5.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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