DETERMINACIÓN DE LINFOCITOS T CD4+CD25+ FOXP3+ EN …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20060412_3776.pdf · que se generan en el timo, que sobreviven en la periferia, y que controlan

SIP 20060412. Linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ en sangre periférica y líquido sinovial de pacientes con espondiloartropatías

1

DETERMINACIÓN DE LINFOCITOS T CD4+CD25+ FOXP3+ EN SANGRE PERIFÉRICA Y LIQUIDO SINOVIAL DE PACIENTES CON

ESPONDILOARTROPATÍAS

Directora: Ethel Awilda García Latorre. Proyecto: SIP20060412 RESUMEN Introducción: Las células T reguladoras naturales (Treg) son células T CD4+CD25+

que se generan en el timo, que sobreviven en la periferia, y que controlan a las

células auto-reactivas mediante el contacto célula a célula. Expresan

constitutivamente el receptor de alta afinidad (IL-2R) para la interleucina 2 (IL-2) y se

ha demostrado que un miembro de la familia Forkhead conocido como FoxP3 regula

el desarrollo y función de las Treg, distinguiéndolas de células T CD4+ recién

activadas. Existen otros dos subgrupos de células T reguladoras: las células T

reguladoras inducidas (Tr1) y las células T reguladoras inducidas cooperadoras tipo 3

(TH3) que ejercen su función supresora vía citocinas. La ausencia de las células Treg

se ha asociado al desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunes

en humanos. Por tal motivo tenemos interés en estudiar a estas células en las

espondiloartropatías (SpA), grupo de enfermedades reumáticas inflamatorias

crónicas que comparten características clínicas, radiográficas y patofisiológicas, y en

la artritis reumatoide (AR), enfermedad autoinmune reconocida como tal. La

naturaleza autoinmune de las SpA no ha sido confirmada debido a que no se ha

encontrado al autoantígeno, sin embargo se encuentra una fuerte asociación con el

antígeno HLA-B27, y con enterobacterias como Salmonella o Klebsiella pneumonie.

La alteración en los niveles de las células T reg en las SpA en comparación con los

sujetos sanos y semejante a la AR puede apoyar el carácter autoinmne de las SpA.

Objetivo: Determinar el porcentaje de células Treg CD4+CD25+FoxP3+, células

mononucleares (CM) de sangre periférica (SP) de sujetos sanos y en muestras

pareadas de CM de SP y de líquido sinovial (LS) de pacientes con

espondiloartropatías o con artritis reumatoide. Métodos: Las CMSP de sujetos sanos o de pacientes con SpA o con AR y las CMLS

de pacientes con SpA o con AR se obtuvieron por gradiente de densidad en Ficoll-


2

Paque. Se realizó una tinción de las moléculas de superficie con anti-CD4 PerCP y

con anti-CD25 PE, se permeabilizaron y se hizo una tinción intracelular con anti-

FoxP3 FITC. Las células se analizaron en un citómetro de flujo B-D FacsCalibur. Se

calcularon los porcentajes de células Treg en las muestras. Los resultados se

compararon usando la prueba estadística de Mann Whitney para datos no

paramétricos.

Resultados: Se analizaron CMSP de 30 sujetos sanos (10 mujeres y 20 hombres).

El valor de la media del porcentaje de linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ en mujeres y

hombres fue similar, (5.04% vs. 4.77%) sin diferencias estadísticas con una p ≥ 0.55,

datos congruentes con los reportado en la literatura. En las CMSP de los pacientes

con SpA o con AR el porcentaje de linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ fue similar, sin

diferencias estadísticas con los sujetos sanos. En las muestras pareadas de sangre

y líquido sinovial de los pacientes con SpA o con AR el porcentaje de células

reguladoras fue significativamente mayor en LS que en SP (SpA: 10.72 vs.4.08, p ≤

0.032; AR: 14.62 vs. 3.56, p ≤ 0.008. Estos resultados indican que en el sitio inflamado

hay un incremento en el número de las células T reguladoras en ambas patologías.

Esto apoya el carácter autoinmune de las SpA ya que el comportamiento es igual a lo

observado en la AR. En un futuro es necesario evaluar la función supresora de estas

células para entender mejor la patología de ambas enfermedades.


3

INTRODUCCIÓN

AUTOINMUNIDAD

El concepto de autoinmunidad fue descrito por Paul Ehrlich a finales del siglo

XIX. Él observó que mientras era fácil inmunizar a un animal adulto con las proteínas

de suero de un animal de otra especie, era prácticamente imposible lograrlo con

proteínas de otro animal de la misma especie y totalmente imposible con el suero

autólogo, y si así sucediera esto sería un horror autotoxicus (Rojas-Espinoza, 2003).

Sin embargo padecimientos como la anemia hemolítica autoinmune en el recién

nacido y el Lupus Eritematoso Sistémico hicieron pensar que el reconocimiento de lo

propio como extraño si ocurría.

En 1949 Mcfarlane Burnet desarrolló el modelo de selección clonal. Según su

modelo la manifestación de autoinmunidad es causada por la aparición de linfocitos

que reconocen antígenos propios, los cuales no fueron eliminados durante la

selección en la etapa embrionaria, debido quizás, a una condición patológica o por

mutación. (Ortiz, 1987).

Los linfocitos autoreactivos se encuentran normalmente en todos los

individuos, en otras palabras todos tenemos autoinmunidad, pero existen

mecanismos periféricos para completar el control de estas células autoreactivas. Si

dichos mecanismos de control fallan entonces se desarrolla la enfermedad

autoinmune (Picarillo, 2004).

En el timo las células T autoreactivas potenciales sufren deleción, lo que

resulta en la generación de una población de células T autotolerantes. De igual

manera un grupo de células presentadoras de antígeno tímicas, que expresan AIRE

(regulador autoinmune) están involucradas en la generación de tolerancia hacia

antígenos tejido específico (Ramsdell, 2003).

La tolerancia periférica se lleva a cabo por varios mecanismos como la

deleción o anergia, adicionalmente existe un mecanismo que opera mediante la

inmunorregulación por células T, estas son conocidas como células T reguladoras

(Treg).


4

A mediados de lo 90`s una subpoblación de células T que expresan al

receptor de alta afinidad para la IL-2 (IL-2R) se convirtió en el centro de atención

para inmunólogos interesados en la inmunoregulación, estas células T CD4+CD25+

llamadas reguladoras o supresoras, juegan un papel central en el mantenimiento de

la homeostasis inmunológica y la autotolerancia. Se han descrito dos poblaciones

diferentes:

a) Las Treg naturales que se desarrollan durante el proceso normal de

maduración de la célula T en el timo, y que sobreviven en la periferia

previniendo la potencial respuesta autoinmune por contacto célula a célula

b) Las células Treg inducidas Th3 y las Tr1, también tienen como precursor un

derivado tímico, el cual se desarrolla a consecuencia de la activación

periférica de células maduras CD4+CD25- bajo diferentes estímulos como, un

antígeno, vitamina D3, dexametasona o por células dendríticas inmaduras. Su

actividad supresora la realizan dependiente de citocinas IL-10 y TGF-B. (Hori,

2003; Fontenot, 2003; kattri, 2003; Piccirillo,2004)

Las células CD4+CD25+ Treg naturales.

La idea de células supresoras que limitará las respuestas autoinmunes fue

descrita por primera vez en 1970 por Gershon. Sin embargo, como no se pudo

identificar ningún tipo de marcador celular o factor soluble supresor el concepto fue

abandonado por mucho tiempo. El concepto volvió a la vida por estudios que

demostraron que la población de células T CD4+ las cuales co-expresan la cadena α

del receptor de la IL-2 (CD25) son necesarias para el control de las células T

autorreactivas in vitro. Mas recientemente experimentos realizados por Nishizuka y

Sakakura (1995), demostraron que en ratones timectomizados entre dos a cuatro

días después de nacidos desarrollan enfermedades autoinmunes órgano específicas,

las cuales pueden ser prevenidas por la administración de células T singénicas

obtenidas de timo o hígado de animales adultos. Sakaguchi caracterizó a estas

células como CD4+CD25+ Treg naturales que expresan Foxp3 (Schwartz, 2005).


5

Las células Treg naturales CD4+CD25+ son CD45RBlow, CD45RO+, tienen

telómeros cortos lo cual sugiere que sean células diferenciadas, expresan bajos

niveles de Bcl-2 y alta expresión del CD95 pero no son susceptibles a la muerte

celular inducida, esto sugiere que hay factores exógenos que previenen su apoptosis

(Arne,2003). Además estas células expresan marcadores celulares como el receptor

inhibitorio de células T (CTLA-4), el receptor de necrosis tumoral glucocorticoide

inducible (GITR), OX40, CD134 y L-selectina (Jonuleit y Schmitt, 2003).

La disminución en la población de células CD4+CD25+ Treg naturales o una

atenuación en su actividad supresora puede conducir a autoinmunidad,

inmunopatología o alergia. En contraste, un incremento en el número de células Treg

o aumento en su actividad supresora puede llevar a la incapacidad de responder a

agentes infecciosos o a la eliminación de células tumorales (Sakaguchi, 2005).

Características de las células T reguladoras naturales.

Se requieren para prevenir las condiciones de autoinmunidad Se distribuyen en timo, sangre periférica, ganglios linfáticos, hígado y sitios de

inflamación. Representan del 5 al 10 % de todas las CD4+ de la periferia Fueron identificadas por la expresión del a cadena α del receptor de IL-2 y la

expresión del factor de trascripción FoxP3. Las células Treg CD25+ en adultos muestran un fenotipo CD45RA-RO+,

CD45RBlow igual al de la células de memoria y expresan CD62L y CD38 con

baja intensidad. Las CD4+CD25+ no responden a estimulación antigénica in vitro (anérgicas) y

suprimen de manera fuerte la proliferación de célula T respondedoras en

cocultivo

Son activadas in vivo a través del TCR.

Una vez activadas su capacidad supresora hacia el antígeno no es específica

y solo depende del contacto célula a célula, es independiente de citocinas. La

supresión se puede deber a la inhibición en la trascripción de IL-2 en la célula


6

respondedora o a la disminución de la respuesta de las células CD8+, NK y de

la respuesta antígeno-específica llevada acabo por células CD4+ En estudios recientes se ha demostrado que las células reguladoras expresan

TLRs, Caramal encontró que la estimulación in vitro del TLR4 expresado por

las CD25+ con lipopolisacárido mejora su capacidad supresora (Beacher,

2006; Wing, 2005; Kronenbergand y Rudensky, 2005). Mecanismo por el cual se seleccionan las células CD4+CD25+ Treg de las células convencionales CD4+.

Las CD4+CD25+ Treg naturales se desarrollan directamente de precursores

celulares T CD4+ .El repertorio de células T generado por el rearreglo de los genes

da como resultado una gran diversidad de receptores que varían en su avidez en la

forma de interaccionar con su autoantígeno así se presentan tres casos (Jonuleit y

Schmitt, 2003)

1) Una afinidad baja da una selección positiva de células CD4+.

2) Una afinidad intermedia da una selección positiva de CD4+CD25+ T reg.

3) Una afinidad alta da lugar a la muerte por apoptosis del linfocito.


7

Modelo de generación de células T reguladoras

Modificación de Immunity, 2003

TIMO

PERI FERIA


8

Interrelación del receptor de interleucina 2 (IL-2) y las células T reg naturales CD25 es el marcador más usual para la diferenciación de las células Treg

naturales de otras células. Cada célula T sin embargo, expresa CD25 después de ser

activada. La evidencia sugiere que CD25 no es un marcador cronológico para el

estado de activación de las células Treg naturales pero si es una molécula crucial para

su generación, sobre vida y funcionamiento. Por ejemplo, la deficiencia de IL-2, IL-2α

(CD25) produce una enfermedad inflamatoria linfoproliferativa, el llamado síndrome

de deficiencia de IL-2. La deficiencia de esta citocina produce la disminución en el

número de células T CD4+CD25+ en el timo y la periferia, Por otro lado. en modelos

murinos se ha observado que la deficiencia de CD20 y B7 conllevan a la disminución

de las células Treg. El punto en común de éstas tres deficiencias es su papel en la

producción o coestimulación de la IL-2, por lo tanto se sugiere que la IL-2 está

involucrada en el mantenimiento de las Treg.

¿Pero como es que se lleva a cabo esta interrelación? La IL-2 media el control

de retroalimentación entre la célula T respondedora y la célula Treg, La IL-2 secretada

por la célula T respondedora mantiene y activa a las Treg (debido a que no producen

IL-2), la cual manda una señal de regreso e inhibe la producción de IL-2 en la célula

T respondedora (Sakaguchi,2005).

El receptor de alta afinidad de la interleucina 2 (IL-2R) en humanos es un

heterotrímero altamente específico para la IL-2 conformado por tres diferentes

subunidades: IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2γ. Las cadenas β y γ se expresan

constitutivamente en los linfocitos T (a estos se une IL-2 con moderada afinidad) y la

expresión de la cadena α se induce en las células T CD4+ que se activan por el

antígeno o se presenta en forma constitutiva en las fases tempranas del desarrollo

de las células Treg naturales en el timo (Minami, 1993).

Así pues esta alta dependencia de la IL-2 y la expresión de Foxp3 es un rasgo

importante que identifica a las células naturales Treg de otras células T e incluso de

otro tipo de células Treg. (Sakaguchi, 2005).


9

Foxp3 Factor especifico de células Treg naturales A través de la expresión del marcador CD25+ ha sido posible la definición de

células Treg en humanos, pero la diferenciación de las células Treg de aquellas células

T recién activadas que no son reguladoras, y que también expresan el marcador

CD25+ es casi imposible. Por lo tanto se necesita un marcador molecular único que

identifique a las células Treg naturales. Se ha demostrado la participación de Foxp3

en el desarrollo y función de las células CD4+CD25+ Treg naturales, lo que permite su

uso como marcador molecular de esta población celular (Sakaguchi, 2005).

A edad temprana los pacientes con síndromes autoinmunes como el IPEX

(inmune desregulación, poliendocrinopatía, enteropática ligada a X) presentan una

masiva linfoproliferación y desarrollo de patologías autoinmunes. Secuelas similares

se han observado en el ratón mutante “scurfy” que no expresa Foxp3. El análisis de

los ratones “scurfy” demuestra que la enfermedad es mediada por células T CD4+

con una producción incrementada de citocinas inflamatorias; y con cifras de células T

CD4+CD25+ disminuidas. Así pues, se ha propuesto el estudio de la función de

FoxP3 en la biología de las células Treg, y como marcador específico de las células

Treg naturales.

FoxP3 pertenece a una gran familia de factores de transcripción funcionales

que contienen un dominio de unión al DNA winged-helix Forkhead (Forkhead box

(Fox)). Estas proteínas han sido clasificadas dentro de familias con base en el

análisis filogenético de la homología en el dominio forkhead, y a cada una se le ha

asignado un número único (en la parte final del nombre). La proteína FoxP3 esta

formada por un dominio rico en prolina en la región N- Terminal, un dedo de zinc y un

zipper de leucina el la región central, y un dominio forkhead de unión al DNA en la

región C-Terminal en donde se encuentra la señal de localización nuclear. La

mayoría de las mutaciones se llevan acabo en el dominio forkhead, sin embargo

también hay mutaciones que afectan al zipper de leucina y al dominio rico en prolina

en la región N-terminal.

La secuencia forkhead esta unida adyacentemente al factor de transcripción

NF-AT que a su vez esta unido a los sitios promotores de varios genes de citocinas,

incluyendo las que codifican para IL-2, IL-4 y Factor de Necrosis Tumoral. El modelo


10

de transcripción mediada por FoxP3 es la inhibición o represión en la cual FoxP3

antagoniza la función del NF-AT por competición en los sitios de unión al DNA. Con

base en estos estudios también se ha propuesto que FoxP3 es inducido en una gran

variedad de tipos celulares como un mecanismo general de regulación inmune

negativa por la represión en la producción de citocinas inflamatorias (Fontenot y

Rudensky, 2005).

El factor de transcripción FoxP3 se expresa en altos niveles por las Treg,

CD4+CD25+ como RNAm y como proteína, sin embargo células T CD4+CD25- y CD8+

con cierta actividad supresora también lo expresan. (Garra, 2004, Fontenot, 2005).

Como FoxP3 es una proteína nuclear limita el poder aislar a la Treg (Roncador, 2005).

2. Las Células T reguladoras inducibles Tr1

Estas células T son supresoras secundarias y se desarrollan a partir de una

célula T convencional CD4+CD25- en la periferia.

Estas células producen IL-10, algunas IL-5, e IFN gamma, tienen propiedades

inmunosupresoras y pueden prevenir el desarrollo de células T que produzcan

enfermedad autoinmune. Pueden controlar la activación de células T de memoria y

vírgenes y suprimir la respuesta inmune mediada por Th1 y Th2.

3. Las Células T reguladoras inducibles cooperadoras tipo 3 (TH3)

Es la única población de células T inducidas por la administración de

antígenos in vivo .Los efectos supresores de estas células no son antígeno

específicas y son mediadas a través de la secreción del TGF-β (Jonuleit y Schmitt,

2003).

ESPONDILOARTROPATIAS Las espondiloartropatías (SpA,) constituyen un grupo de enfermedades

inflamatorias crónicas cuyo denominador común son las afectaciones de las

articulaciones periféricas, axiales y las entesis. Incluyen la espondilitis anquilosante (EA),

el síndrome de Reiter, artritis reactiva, espondilitis asociada a psoriasis, artropatías


11

enteropáticas, así como una variedad menor no bien definida denominada

espondiloartropatías indiferenciadas (González,1998).

La patogenia de estas enfermedades no esta claramente entendida, sin embargo,

el HLA-B27 parece desempeñar una función central en cada una. La espondilitis

anquilosante es el prototipo de las SpA y afecta las entesis, articulaciones sinoviales, de

la columna vertebral y de las extremidades, es progresiva y puede llagar a la fusión de la

columna vertebral (Burgos- Vargas, 2002). Tiene una alta asociación con el HLA-B27, el

90% de los pacientes son HLA-B27. Además hay asociación con infecciones por

enterobacterias. Los pacientes que han estado en contacto con bacterias como

Salmonella o Klebsiella pneumonie y que genéticamente son susceptibles pueden

desarrollar a largo plazo la EA.

Justificación: Las enfermedades autoinmunes son el resultado de la pérdida de la tolerancia a

lo propio por parte del sistema inmune. Uno de los mecanismos por los cuales el sistema

inmune regula la respuesta es a través de las células T reguladoras CD4+CD25+.

Recientemente se ha asociado a este tipo de células un nuevo marcador, denominado

Foxp3. Las células que expresan el fenotipo CD4+CD25+FoxP3+ (T reg naturales) se

encuentran disminuidas en enfermedades autoinmunes. Teniendo en cuenta que las

espondiloartropatías pueden ser consideradas de naturaleza autoinmune, a pesar de que

no se ha identificado el autoantígeno, nosotros proponemos que en pacientes con

espondiloartropatías estas células están en niveles bajos. En estudios anteriores en

nuestro grupo se encontró que las células T CD4+CD25+ están disminuidas en la sangre

periférica de los pacientes con SpA, pero no se precisó si estas células son Treg naturales

ya que no se buscó al marcador FoxP3.

Hipótesis: En pacientes con espondiloartropatías las células CD4+CD25+FoxP3+ en

sangre periférica se encuentran en igual porcentaje a los de los sujetos sanos y

aumentadas en líquido sinovial con respecto a su muestra pareada de sangre

periférica.


12

OBJETIVOS Objetivo general: Determinar la población de células T CD4+CD25+FoxP3+ en sangre periférica

de sujetos sanos y en muestras pareadas de sangre periférica y líquido sinovial de

pacientes con espondiloartropatías o con artritis reumatoide.

Objetivos específicos:

• Determinar la población de células T CD4+CD25+FoxP3+ en células

mononucleares de sangre periférica de sujetos sanos.

• Determinar la población de células T CD4+CD25+FoxP3+ en células

mononucleares de muestras pareadas de sangre periférica y líquido sinovial

de pacientes con espondiloartropatías y artritis reumatoide.

MATERIAL Y MÉTODOS Muestras Biológicas. Se analizaron 30 muestras de sangre periférica de sujetos

testigos sanos, 20 hombres y 10 mujeres sin ninguna relación con las enfermedades,

obtenidas de banco de sangre. Se estudiaron 5 muestras pareadas de sangre

periférica y de líquido sinovial de pacientes con espondiloartropatías (SpA y 5

muestras pareadas de pacientes con artritis reumatoide (AR). Todos los pacientes

fueron seleccionados y diagnosticados de acuerdo a los criterios de la fundación

Médica de New York (Bennet y Wood, 1968; Burgos-Vargas y Khan, 1990) en el

Hospital General de México. Todos los participantes dieron su consentimiento

informado en el protocolo bajo las normas éticas del Hospital General de México.

Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y de líquido sinovial (CMLS). Las muestras sangre periférica heparinizadas (Inepar, laboratorios

PISA) de los pacientes con SpA, de los sujetos sanos y de los pacientes con AR, se

estratificaron sobre Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway) en proporción


13

de un volumen por dos volúmenes de la muestra. Para las muestras de líquido

sinovial de los pacientes con SpA o con AR, estas se trataron previamente con

hialuronidasa (Sigma Aldrich St Louis MO, USA) a una concentración final de 10

U/mL y se incubaron por 30 minutos a 37°C. Posteriormente las CMLS se obtuvieron

por estratificación de la misma forma que las células de sangre periférica. Las CMSP

y las CMLS que se obtuvieron por diferencia de densidad, se centrifugaron a 3200

rpm durante 20 minutos a 4°C, y se lavaron tres veces, con solución salina de Hank’s

a 2200 rpm durante 15 minutos. Las células viables se contaron en una cámara de

Neubauer con azul de tripano (azul tripano al 0.1% en solución salina 0.85%) y se

ajustaron a 1 X 106 células/mL en medio AIM-V (GIBCO-BRL).

Tinción de marcadores de superficie.

Se utilizaron 3 µL de los siguientes anticuerpos monoclonales acoplados a

diferentes fluorocromos; anti-CD4-PerCP, anti-CD25-PE (Beckton Dickinson San

José CA, USA). Estos se colocaron en tubos de poliestireno de 12x75 mm (Falcon-

Becton Dickinson), a los cuales se les adicionó 100 µL de CMSP y CMLS,

respectivamente. Las muestras se agitaron en vortex durante 5 seg y se mantuvieron

en la oscuridad durante 20 min a 4º C, se lavaron dos veces por centrifugación a

1700 rpm por 10 minutos con PBA (PBS con ASB al 0.1% y NaN3 al 0.1%).

Tinción de FoxP3 intracelular. Las células marcadas en la superficie se

resuspendieron en 1 mL del amortiguador de fijación /Permeabilización

(eBioscience), se agitaron en el vortex por 5 seg y se incubaron a 4°C, 45 min en

oscuridad. Se lavaron por centrifugación a 1700 rpm, 10 min, con 2 mL del

amortiguador de permeabilización 1X (eBioscience). Se decantó el sobrenadante, se

agregaron 5µL del anticuerpo anti- FoxP3 FITC humano (eBioscience) y se incubó a

4° C, 35 min en la oscuridad, las muestras se lavaron por centrifugación a 1700 rpm

10 min con 2 mL del amortiguador de permeabilización 1X (eBioscience) y se

resuspendió con 0.5mL de paraformaldehído (Sigma Aldrich) al 0.5% en PBS, se


14

mantuvieron a temperatura de 4º C en oscuridad hasta su adquisición en el citómetro

de flujo.

Adquisición y análisis de los datos. Las muestras se adquirieron en el programa

CellQuest del citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) se adquirieron

como mínimo 10 000 eventos por muestra en la ventana de células T CD4+ en el

canal FL3 y se analizaron en el programa CellQuest para 3 colores del citómetro de

flujo FACS Calibur.

Los datos se compararon con la prueba U de Mann Whitney para datos no

paramétricos.

RESULTADOS Selección de la ventana de linfocitos T CD4 En la figura 1 se muestra un ejemplo de la gráfica de granularidad contra CD4 PerCP

que permite seleccionar a la población de linfocitos T CD4+ que se analizó en cada

caso.

Figura 1. Gráfica de granularidad contra CD4PerCP. La región marcada con el óvalo R2

corresponde a la población de linfocitos T CD4+.


15

Células reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ en sangre periférica de sujetos sanos. En la figura 2 se muestra un ejemplo del resultado del análisis de la muestra de

sangre periférica de un sujeto sano en la que se grafica a las células CD25+ vs.

FoxP3+ provenientes de la ventana R2.

Figura 2. Gráfica de la población CD25+ vs FoxP3+ provenientes de la ventana R2. Las

células reguladoras de un sujeto sano se encuentran en el cuadrante superior derecho y

corresponden a un 3.83%

En la tabla 1 se enlista el porcentaje de células reguladoras en sangre periférica que

se determinaron en CMSP de 30 sujetos sanos (10 mujeres y 20 hombres).

3.83%


16

Tabla 1. Porcentaje de células reguladoras en sangre periférica de sujetos sanos.

IDENTIFICACIÓN SEXO CD4+CD25+FOXP3+ (%) Donador 1 F 4.2 Donador 2 F 4.28 Donador 3 F 3.17 Donador 4 F 2.55 Donador 5 F 6.36 Donador 6 F 7.1 Donador 7 F 6.9 Donador 8 F 7.4 Donador 9 F 4.6 Donador 10 F 3.8 Donador 11 M 4.13 Donador 12 M 3.67 Donador 13 M 1.82 Donador 14 M 2.98 Donador 15 M 3.51 Donador 16 M 3.43 Donador 17 M 3.96 Donador 18 M 2.56 Donador 19 M 4.84 Donador 20 M 1.4 Donador 21 M 1.2 Donador 22 M 6.96 Donador 23 M 7.8 Donador 24 M 8.9 Donador 25 M 9.79 Donador 26 M 6.3 Donador 27 M 6.8 Donador 28 M 7 Donador 29 M 3.5 Donador 30 M 4.5

En la figura 3 se grafican las medias de los porcentajes encontradas en mujeres y

hombres donde el valor de la media de los linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ fue similar

(5.04% vs. 4.77%) con una p ≥ 0.55. Estos datos son congruentes con lo reportado

en la literatura.


17

Porcentaje de Linfocitos CD4+CD25+FoxP3+ en células mononucleares de sangre periférica de

sujetos sanos

5.04 4.77

02468

M H

% d

e Li

nfoc

itos

CD

4+C

D25

+Fox

P3+

SEXO

Figura 3. Porcentaje de células reguladoras en población de mujeres y hombres sanos.

Los valores son estadísticamente similares con una p≥ 0.55.

Células reguladoras en sangre periférica y líquido sinovial de pacientes con espondiloartropatías (SpA) o artritis reumatoide (AR).

En la figura 4 se ilustra un ejemplo de los resultados del análisis de las muestras

pareadas de sangre periférica y líquido sinovial de los pacientes con

espondiloartropatías o con artritis reumatoide.


18

Figura 4. Ejemplo de cuantificación de las células reguladoras en sangre periférica (SP) y líquido sinovial (LS) de pacientes con SpA o con AR. Se muestran las gráficas

correspondientes al análisis de las células reguladoras en muestras pareadas de SP y LS de

un paciente con SpA y otro con AR. Los porcentajes de células se indican en el cuadrante

superior derecho de cada gráfica.´

FoxP3 FITC FoxP3 FITC

CD2 5 PE

CD2 5 PE

5.25% 9.32%

SpA (SP) SpA (LS)

AR (SP) AR (LS)

CD2 5 PE

8.0789

FoxP3 FITC FoxP3 FITC

CD2 5 PE

8.07%

14.48%


19

En la tabla 2 se enlistan los porcentajes de las células reguladoras de cada paciente con

SpA estudiado.

Tabla 2. Porcentajes de células reguladoras en muestras pareadas de LS y SP de pacientes con SpA.

IDENTIFICACIÓN CD4+CD25+FOXP3+ en LS (%) CD4+CD25+FoxP3+ en SP (%)

Paciente 1 SpA 7.28 5.51 Paciente 2 SpA 7.5 3.82 Paciente 3 SpA 12.33 4.01 Paciente 4 SpA 14.41 7.74 Paciente 5 SpA 20.69 1.6

En la tabla 3 se enlistan los porcentajes de las células reguladoras de cada paciente con AR

estudiado.

Tabla 3. Porcentajes de células reguladoras en muestras pareadas de LS y SP de pacientes con AR.

IDENTIFICACIÓN CD4+CD25+FoxP3+ en LS (%) CD4+CD25+FoxP3+ en SP (%) Paciente 1 AR 9.13 5.3 Paciente 2 AR 15.22 2.57 Paciente 3 AR 29 5.33 Paciente 4 AR 5.83 1.2 Paciente 5 AR 13.93 3.42

En las muestras pareadas de sangre y líquido sinovial de los pacientes con

espondiloartropatías (SpA) y artritis Reumatoide (AR), la cual se utilizó como control

de enfermedad autoinmune bien caracterizada, el porcentaje de células T

CD4+CD25+FoxP3+ fue mayor en líquido sinovial que en sangre periférica. En la

figura 5 se grafican los porcentajes de las células reguladoras en LS y SP de los

pacientes con SpA.


20

Comparación del % de linfocitos CD25+FoxP3+ en CMSP y CMLS

10.7016667

4.082

0

5

10

15

20

LS SP% d

e lin

foci

tos

CD25

+Fox

P3+

Espondiloartropatías

Figura 5. Comparación del porcentaje de células reguladoras en LS y SP de pacientes con SpA. Se indica en cada barra la media del porcentaje de células reguladoras. Los

valores de la media son diferentes estadísticamente con una p ≤ 0.032:

En la figura 6 se grafican los porcentajes de las células reguladoras en LS y SP de

los pacientes con AR.

Comparción en el % de linfocitos CD25+FoxP3+ en CMSP y CMLS

14.622

3.564

0

5

10

15

20

25

LS SP

% d

e lin

foci

tos

CD2

5+Fo

xP3+

Artritis Reumatoide

Figura 6. Comparación del porcentaje de células reguladoras en LS y SP de pacientes con AR. Se indica en cada barra la media del porcentaje de células reguladoras. Los

valores de la media son diferentes estadísticamente con una p ≤ 0.008:

*

*


21

Por último se compararon los porcentajes de las células reguladoras en sangre periférica

entre los 30 sujetos sanos (hombres y mujeres) y los pacientes con SpA o con AR y los

resultados se muestran en la figura 7.

Comparación del % de linfocitos CD4+CD25+FoxP3+ en CMSP

4.864.08

3.56

012345678

SS SpA AR

% d

e lin

foci

tos

CD

25+F

oxP3

+

SANGRE PERIFÉRICA

Figura 7. Comparación del porcentaje de células reguladoras en sangre periférica de sujetos sanos y pacientes con SpA o con AR. Los valores de la media de sujetos sanos y

SpA o sujetos sanos y AR no muestran diferencias estadísticas (p ≥ 0.944, p ≥ 0.258,

respectivamente).

CONCLUSIONES

• En sangre periférica el porcentaje de células Treg de los pacientes con

espondiloartropatías o con artritis reumatoide es semejante al de los sujetos

sanos.

• Tanto en las espondiloartropatías como en la artritis reumatoide en el sitio

inflamado hay un incremento significativo en el número de células Treg.


22

PERSPECTIVAS

• Es necesario determinar la función supresora de las células Treg estudiadas en

este trabajo ya que estas células pueden estar presentes en los

compartimentos analizados pero no estar funcionales.

APORTACIÓN AL CONOCIMIENTO.

• Los resultados obtenidos aportan nuevos datos acerca de la inmunopatología

en las espondiloartropatías.

BIBLIOGRAFÍA Arne N, Tamss L, 2003 The peripheral generation of CD4+CD25+ regulatory T cell,

Immunology, 109:319-325. 99

Baecher-Allan C, Viglietta Vissia, Hafler DA. 2004. Human CD4+CD25+ regulatory T cell. Seminars in immunology 16:89-97

Burgos Vargas, 2002, Contribuciones de la reumatología mexicana al área de las

espondiloartropatías, Rev Mex Reumatol 17: 141-152.

Craig L, Brunkow M E, 2001, A rare polyadenylation signal mutation of the FOXP3 gene (AAUAAA----AAUGAA) leads to the IPEX syndrome, Immunogenetics, 53: 435-439. Fontenot JD, Rudensky AY. 2004. Molecular aspects of regulatory T cell develodment. Seminars in immunology 16:73-78

Fontenot D J y Rudensky Y A. 2005. A well adapted regulatory contrivance:

regulatory T cell development and the forkhed family transcription factor Foxp3,

Nature Immunol 6 (4): 335-.


23

Garra A y Vieira P,2004, Regulatory T cell and mechanisms of immune system

control, Nature Medicine 10 (8): 801-.

González Cortiñas M, 1998, Patogenia de las espondiloartropatias seronegativas,

Revista Cubana Médica 37: 28-35.

Hori S. Sakaguchi S, 2004, Foxp3: a critical regulator of the development and

function of regulatory T cell, Microbes and Infection 6:745-751

Jonuleit Helmut y Schmitt Edgar, 2003, The regulatory T cell family: Distinct subset

and their interrelations, The Journal of immunology XX: 6322-6327.

Kronenberg Mitchell y Rudensky Alexander, 2005 Regulation of immunity by self-

reactive T cell, Nature Insight 6 (4): 435.

Minami Y, Takesi K, Tadaak M y Taniguch T, 1993 The IL-2 receptor complex: it’s

structure, function and target genes, Review immunology 11: 245-267.

Nielsen J, Holm T L, 2004,CD4+CD25+ regulatory T cell: II. Origin, disease model and

clinical aspects, APMIS 112: 642-650.

Piccirillo AC, Shevach EM. 2004. Naturally-occurring CD4+CD25+ immunoregulatory T cell: central players in the arena of peripheral tolerance. Seminars in immunology 16:81-88

Ramsdell F, 2003, Foxp3 an natural regulatory T cell: Key to a cell linage?, Immunity,

19:165-168.

Rioux D. John y Abbas Abul K., 2005, Paths to understanding the genetic basis of

autoimmune disease, Nature Insight Autoimmunity 435 (7042): 584.


24

Roncador, G, Brown F.2005. Analysis of FOXP·protein expression in human

CD4+CD25+ regulatory cells at the single-cell level. European Journal Immunology

35: 1681-1691

Sakaguchi Simon, 2005, Naturally arising Foxp3 expressing CD25+CD4+regulatory

cell in immunological tolerance to self and non self. Nature Immunology 6 (4): 345-

352.

Schwartz Ronald H, 2005, Natural regulatory T cell and self-tolerance, Nature

Immunology 6 (4): 327.

Wing K, Suri-Payer E, Rudin A. 2005, CD4+CD25+ regulatory T cells from Mouse to Man. Scandinavian Journal of immunology. 62:1-15

Documents

DETERMINACIÓN DE LINFOCITOS T CD4+CD25+ FOXP3+ EN …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20060412_3776.pdf · que se generan en el timo, que sobreviven en la periferia, y que controlan