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Universidad de Granada
Instituto de Biotecnología
Facultad de Medicina
Departamento de Fisiología
Determinación de los haplotipos de
anemia falciforme y su correlación con
los niveles de estrés oxidativo en
pacientes de 6 meses a 15 años de edad
en Panamá
Iryna Rusanova
Granada, 2010
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Iryna RusanovaD.L.: GR 830-2011ISBN: 978-84-694-0210-8
D. DARÍO ACUÑA CASTROVIEJO, Catedrático de Fisiología de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Granada,
CERTIFICA QUE Dña Iryna Rusanova, Licenciada en Bioquímica, ha realizado bajo
su dirección y en el Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, el trabajo
titulado: “Determinación de los haplotipos de anemia falciforme y su correlación
con los niveles de estrés oxidativo en pacientes de 6 meses a 15 años de edad en
Panamá”, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de
Doctor.
Granada, 20 de octubre de 2010
Vº Bº Director La interesada
Darío Acuña Castroviejo Iryna Rusanova
Dña. GERMAINE ESCAMES, Profesora Titular Fisiología de la Facultad de Medicina
de la Universidad de Granada,
CERTIFICA QUE Dña Iryna Rusanova, Licenciada en Bioquímica, ha realizado bajo
su dirección y en el Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, el trabajo
titulado: “Determinación de los haplotipos de anemia falciforme y su correlación
con los niveles de estrés oxidativo en pacientes de 6 meses a 15 años de edad en
Panamá”, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de
Doctor.
Granada, 20 de octubre de 2010
Vº Bº Director La interesada
Germaine Escames Iryna Rusanova
Beca y proyectos de investigación que han financiado este estudio:
Este trabajo se ha realizado en el Laboratorio del Grupo de Investigación CTS-
101: Comunicación Intercelular, del Instituto de Biotecnología de la Universidad de
Granada, en el Centro de Investigación Biomédica, Parque Tecnológico de Ciencias de
la Salud, Granada, y el Hospital del Niño de Panamá.
1. Becas disfrutadas
Beca SENACYT-IFARHU.
2. Proyectos de Investigación que han financiado la investigación:
1. Financiación del Grupo de Investigación CTS-101: Comunicación Intercelular.
2. Secretaría Nacional de Cencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) de Panamá,
proyecto FID08-124.
3. Publicaciones científicas:
Autores: Rusanova I, Escames G, Cossio G, de Borace R, Chahbouni M, López LC,
Díez T, Acuña-Castroviejo D
Título: Oxidative stress status, clinical outcome, and -globin haplotypes in sickle cell
anemic pediatric patients
Ref. Revista: Eur J Haematol 2010, in press: doi: 10.1111/j.1600-0609.2010.01528.x.
Financiación: CTS-101 - FID08-124
Áreas: Hematology
Posición/Áreas: 35/61
F. Impacto: 2.345 PMDI: 20846340 Clave: artículo
Autores: Rusanova I, Cossio G, Moreno B, Perea J, de Borace R, Perea M, Escames G,
Acuña-Castroviejo D
Título: β-Globin Gene Cluster Haplotypes in Sickle Cell Patients From Panamá
Ref. Revista: Am J Hum Biol 2010, submitted:
Financiación: CTS-101 - FID08-124
Áreas: Biology
Posición/Áreas: 23/76
F. Impacto: 2.121 PMDI: Clave: artículo
4. Congresos:
Comunicación oral en el XIII Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de
APANAC. Tema:
―Estrés Oxidativo, clínica y los haplotipos del custer globínico Beta en los pacientes
pediátricos panameños con Anemia Falciforme‖
Presentado el día viernes 8 de octubre, en la sala 102, en el horario de 14:00 a 14:15
horas en el Centro de Convenciones de la Ciudad del Saber, Panamá, República de
Panamá.
Comunicación en forma de poster titulada: ―BIOMARCADORES DEL ESTRÉS
OXIDATIVO, MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y LOS HAPLOTIPOS DEL
CLUSTER GLOBÍNICO BETA EN LOS PACIENTES PEDIÁTRICOS
PANAMEÑOS CON ANEMIA DREPANOCÍTICA―, dentro de la LII Reunión Nacional
de la Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia (SEHH) y XXVI Congreso
Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia (SETH), a celebrar en Las
Palmas de Gran Canaria, los días 28 al 30 de octubre de 2010.
Nº DE PÓSTER: PO-24.
“Hay dos formas de vivir la vida. Una es pensar que nada es un milagro.
La otra es pensar que todo es un milagro.” Albert Einstein
“Elige un trabajo que te guste y no tendrás que trabajar ni un día
de tu vida. “ Confucio
AGRADECIMIENTOS
Desde que inicié este programa de Doctorado en Biotecnología impartido entre
las dos universidades: Universidad de Panamá y Universidad de Granada, puedo mirar
hacía atrás y decir que se ha recorrido un camino muy interesante, lleno de experiencias.
Quiero agradecer en primer lugar a la Universidad de Panamá por haber abierto este
programa, por las clases, ricas en conocimientos impartidos por distintos profesores.
Quiero dar un agradecimiento especial al Doctor Tomas Díez como coordinador de este
programa y persona que me apoyó mucho en este camino.
Este tipo de experiencias en primer lugar abren camino para conocer gente, las
necesidades del país, y en este sentido quiero agradecer la suerte de haber conocido a la
Dra. Gradys Cossio, pediatra- genetista del Hospital del Niño, quién me presentó la
problemática de salud que existe en Panamá y la necesidad de realizar estudios
científicos. Sin este enlace entre el hospital y la universidad, no sería posible hacer
investigaciones biomédicas aplicadas, tan necesarias para los países como Panamá.
Gracias a todos los directivos del Hospital por abrirnos puertas y poder conseguir las
muestras de sangre requeridas para este estudio. Gracias a la doctora Gradys Cossio por
su positivismo y gran espíritu de luchadora constante por mejorar las condiciones de la
investigación en el hospital.
Sin el apoyo del Doctor Darío Acuña- Castroviejo de la Universidad de Granada
no sería posible hacer este estudio completo y novedoso. Gracias, Doctor Acuña, por
depositar su confianza en mí, por compartir sus conocimientos, por ofrecerme una
oportunidad de aprender las técnicas y poder realizar las determinaciones completas en
su laboratorio.
Agradezco a la Doctora Germaine Escames por su don de gente, su amabilidad y
apoyo en los momentos difíciles. Estos aspectos son sumamente valiosos cuando uno se
encuentra frente a nuevos retos. Muchas gracias, Germaine, por tu paciencia, de todo mi
corazón.
Sin la sonrisa y un trato tan amable de todos los miembros del laboratorio este
trabajo de día a día no sería nada fácil. Muchísimas gracias a Aracely, Ana, Anilla,
Carolina, Carmen, José Antonio, Francis, José Carlos, Mariam, Miquel, Alberto, Laura
y Luís Carlos.
Agradezco a mi esposo Antonio, por estar a mi lado, brindándome ánimo y
confianza. Gracias, mi amor, por saber escucharme y apoyarme en los momentos
difíciles.
Nada en mi vida sería posible sin el apoyo de mis padres, muchas gracias, papá y
mamá por darme sus consejos, ánimo y esperanza. Sin ustedes no podría lograr muchas
cosas en mi vida.
Finalmente, agradezco a la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología de
Panamá por haber financiado una parte de este proyecto que corresponde al estudio de
haplotipos del cluster beta en los pacientes panameños con anemia falciforme.
-Abreviaturas-
Iryna Rusanova
ABREVIATURAS
ADN: ácido desoxirribonucleico
ARN: ácido ribonucleico
BH4: tetrahidrobiopterina
b-NFkB
Ca2+
: calcio
ELAM-: molécula de adhesión
endotelial de leucocitos 1
eNOS: óxido nítrico sintasa endotelial
GPx: glutation peroxidasa
GRd: glutation reductasa
GSH: glutation reducido
GSSG: glutation oxidado
H2O2: peróxido de hidrógeno
HO•: radical hidroxilo
IL: interleuquina
iNOS: óxido nítrico sintasa inducible
LPO: peroxidación lipídica
NADPH: nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato
NOS: óxido nítrico sintasa
O2-•: anión superóxido
ONOO-: peroxinitritos
PCR: reacción en cadena de la
polimerasa
RFLP: fragmentos de restricción de
longitud variable
RNS: especies reactivas de nitrógeno
ROS: especies reactivas de oxígeno
SOD: superóxido dismutasa
SCD: sickle cell disease (anemia de
células falciforme, inglés)
TNF-: factor de necrosis tumoral
XO: xantina oxidasa
-Índice-
Iryna Rusanova
ÍNDICE
Introducción
1. Anemia falciforme……………………………………………………..….. 2
1.1. Historia……………………………………………………..……. 2
1.2. Epidemiología…………………………………………….…..….. 4
1.3. Diagnóstico…………………………………………………...….. 7
1.4. Clínica de la enfermedad……………………………………...….10
1.5. Fisiopatología de la anemia falciforme………………………..….12
1.5.1. Fisiología de la hemoglobina ……………………….…12
1.5.2. Polimorfismos de genes del cluster beta………….........15
1.5.3. Otros polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)…….17
1.5.4. La variaciones en la expresión de la hemoglobina fetal...19
1.5.5. Niveles del estrés oxidativo asociado a la hemólisis…….20
1.5.6. Reducción en la biodisponibilidad de óxido nítrico……..21
2. Haplotipos de anemia falciforme……………………………………………24
3. Anemia falciforme y estrés oxidativo………………………………………..29
3.1. Radicales libres y enzimas involucradas en su producción…………29
3.2. Sistemas antioxidantes………………………………………………32
3.3. Fuentes de radicales libres en la anemia falciforme……………….. 37
3.4. Consecuencias del estrés oxidativo en la anemia falciforme……….39
4. Estrategias terapéuticas en la anemia falciforme…………………………..39
4.1. Terapias tradicionales………………………………………………..39
4.2. Terapias alternativas…………………………………………………40
Hipótesis y Objetivos…………………………………………. 44
Material y métodos…………………………………………… 48
1. Pacientes y preparación de las muestras……………………………….….. 50
2. Métodos analíticos……………………………………………………………52
2.1. Estrés oxidativo…………………………………………………… 52
2.1.1. Determinación de la concentración de proteínas: método
de Lówry……………………………………………………….. 53
Iryna Rusanova
2.1.2. Determinación de glutatión oxidado y glutatión reducido……..53
2.1.3. Determinación de la actividad enzimática de la glutatión
peroxidasa (GPx)………………………………………….…………..55
2.1.4. Determinación de la actividad enzimática de la glutatión
reductasa (GRd)………………………………………….……………56
2.1.5. Lipoperoxidación……………………………………………….57
2.1.6. Determinación de nitritos……...………………………………..58
2.1.7. Determinación de la actividad enzimática de la superóxido
dismutasa……………………………………………………………...60
2.2. Parametros hematológicos………………………………………….62
3. Análisis de AND……………………………………………………………… 63
3.1. Extracción de AND………………………………………………….63
3.2. Análisis de haplotipos con la técnica de RFLP……………………..64
3.2.1. PCR……………………………………………………..64
3.2.2. RFLP……………………………………………………64
3.2.3. Electroforesis……………………………………………65
4. Análisis estadístico………………………………………………………….. 69
RESULTADOS……………………………………………………………………….72
1. Haplotipos del cluster globínico beta………………………………………. 74
1.1. Datos generales de los pacientes y del grupo control……………….74
1.2. Haplotipos del cluster globínico beta………………………………..75
1.3. Distribución geográfica de los haplotipos identificados…………….79
2. Correlación de los haplotipos de anemia falciforme identificados en
pacientes atendidos en el Hospital del Niño de Panamá con el fenotipo
clínico de la enfermedad (leve, moderada y severa) y los datos
hematológicos………………………………………………………………….80
Iryna Rusanova
2.1. Análisis de fenotipo clínico de acuerdo a los haplotipos del cluster
globínico beta…………………………………………………………81
2.2. Valores hematológicos de acuerdo a los haplotipos determinados..82
2.3. Análisis de los valores hematológicos de acuerdo a las
manifestaciones clínicas de los pacientes con anemia falciforme……82
3. Valoración del estrés oxidativo en el grupo de enfermos y el grupo
control…………………………………………………………………………84
4. Correlaciones entre el estrés oxidativo y los haplotipos del cluster globínico
beta, manifestaciones clínicas y los niveles de HbF expresados en los
pacientes con anemia falciforme…………………………………………….88
4.1. Resultados del estrés oxidativo de acuerdo a los grupos
haplotípicos………………………………………………………….88
4.2. La relación entre los biomarcadores del estrés oxidativo y el fenotipo
clínico de anemia falciforme en la población panameña…………...90
4.3. La relación entre los biomarcadores del estrés oxidativo y la expresión
de HbF en los pacientes falcémicos de Panamá…………………….92
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS……………………………………………...94
1. Haplotipos del cluster globínico beta………………………………………. 96
1.1. Datos generales de los pacientes y del grupo control………………..96
1.2. Haplotipos del cluster globínico beta…………………...…………...96
2. Correlación de los haplotipos de anemia falciforme identificados en
pacientes atendidos en el Hospital del Niño de Panamá con el fenotipo
clínico de la enfermedad (leve, moderada y severa) y los datos
hematológicos……………………………………………………………… 100
3. Valoración del estrés oxidativo en el grupo de enfermos y el grupo
control……………………………………………………………………….. 103
4. Correlación del estrés oxidativo con los haplotipos, fenotipo clínico de la
enfermedad y los niveles de HbF expresados……………………………... 108
CONCLUSIONES…………………………………………………………………...114
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….119
2
-Introducción-
Introducción
2
1. ANEMIA FALCIFORME.
1.1. Historia.
La primera observación de eritrocitos falciformes se realizó en 1910 por James
Herrick en un frotis de sangre periférica de un estudiante negro originario de la
Grenada, el cual murió a los 32 años a causa de neumonía. Debido a la forma anormal
de los eritrocitos, Herrick por primera vez utilizó el término de ―enfermedad
falciforme‖. Sin embargo, tuvieron que pasar 15 años antes de que esta enfermedad
fuera considerada como primaria y no debida a una infección u otra condición (Savitt
y colbs., 1989). En el año 1917 Víctor Emnel por primera vez usó el término ―anemia
de células falciformes‖, para establecer una entidad clínica definida, sobre la base del
descubrimiento de Herrick y referiendose a la peculiar y alargada forma de las células
falciformes.
Hann y Guillespie, en 1927, descubrieron que la deformación de los eritrocitos
estaba relacionada con el estado de oxigenación de la hemoglobina (Hb) en el
desempeño de su función, y que se podía provocar esta forma falciforme saturando de
dióxido de carbono una suspensión de eritrocitos. En 1947, el norteamericano James
Neel, en el artículo de revisión ―The Clinical Detection of the Genetic Carriers of
Inherited Disease‖ publicado en la revista Medicine (Neel, 1992), postuló la hipótesis
de herencia autosómica recesiva para la anemia falciforme.
Dos años después, James Neel confirmó la hipótesis en la revista Science (Nell,
1949) tras estudiar 21 familias de niños con anemia falciforme, de manera que los
individuos enfermos eran homocigóticos recesivos y los individuos aparentemente
sanos, que presentaban glóbulos rojos falciformes y normales, eran heterocigóticos y
portadores de la enfermedad. Por lo tanto, en cada pareja de padres portadores existe
un 25% de probabilidades de que nazca un hijo con anemia falciforme
independientemente del sexo (Chang y colbs., 1995).
Una gran aportación en el entendimiento de la base molecular de anemia
falciforme fue hecha por Pauling LC, Premio Nobel de Química en 1954. Pero años
antes, en 1949, Pauling, junto con Harvey Itano, S. J. Singer e Ibert Wells, publicó en
la revista Science la primera prueba de la relación entre una enfermedad humana y un
cambio en una proteína específica (Pauling y colbs., 1949). Utilizando la
Introducción
3
electroforesis, demostraron que la hemoglobina de los pacientes con anemia
falciforme tiene la carga eléctrica diferente a la de las moléculas de personas sanas.
Afirmó que la enfermedad puede ser provocada por alteración en una molécula
protéica, de manera que la herencia podía influir en las mutaciones de dicha proteína,
marcando así el inicio de la genética molecular.
Poco después, en el año 1959, Vernon M. Ingram (Ingram, 1959) demostró que
la hemoglobina S es el resultado de una mutación en el codón 6 del gen de la globina β
en la que la base adenina es sustituida por la timina (GAG GTG) lo que ocasiona
que el ácido glutámico en la posición 6 de la globina sea sustituido por la valina.
Como esta sustitución se lleva a cabo en una posición superficial de la molécula de
hemoglobina y la carga eléctrica es diferente, la movilidad electroforética de la HbS es
menor que la de la hemoglobina normal, pudiéndose ser fácilmente separada por
electroforesis.
El test de Murayama (Murayama M y Nalbandian RM, 1973) muestra que una
solución concentrada de HbS desoxigenada se convierte en gel, mientras que la Hb
adulta (HbA) desoxigenada sigue siendo soluble. Además, desde aquella época la
patología es considerada como una enfermedad relacionada con el rasgo racial, ya que
en su mayoría afecta a la raza negra.
Drepanocitosis (del griego drepanon=hoz, y kytos= células) es otro término que
determina la presencia en sangre de hematíes en forma de media luna; y es sinónimo al
término anemia falciforme.
La hemoglobinopatía S, o drepanocitosis, o SCD (sickle cell disease en
inglés). Puede existir bajo 4 formas diferentes:
Forma heterocigota o rasgo falciforme (HbAS). Aparece cuando la mutación se
encuentra en uno de los dos alelos que codifica para la proteína globina β (βA/ βS). En
este caso, el paciente tiene un 30-40% de HbS y no presenta manifestaciones clínicas.
Forma homocigota o anemia de células falciforme (HbSS). Aparece cuando la
mutación afecta a los 2 alelos del gen correspondiente a la cadena β (βS/βS). En estos
casos, prácticamente toda la Hb (75-95%) es HbS, siendo el resto (5-15%) la fetal
(HbF). Presenta una variedad de síntomas clínicos, desde ligeros hasta muy graves.
Forma doble heterocigota HbS-talasemia (HbS-Tal). Aparece cuando en el
mismo paciente coexisten 2 alelos anormales, uno para la HbS y otro para la β-
Introducción
4
talasemia (βS/βtal). Si la síntesis a nivel del gen talasémico es nula (β0-tal), la
cantidad de HbS será prácticamente la misma que en el estado homocigoto (70-90%).
Si, por el contrario, sólo presenta una disminución en el gen talasémico (β+- tal), se
observa la coexistencia de HbA (10-30%), HbS (60-85%), y una pequeña proporción
de HbF (5%). No son tan graves como las formas de herencia tipo homocigoto HbSS y
predominan en el área mediterránea más que en la raza negra.
Forma doble heterocigota HbS-HbC (HbSC). Se debe a la coexistencia de 2
alelos anormales. Un alelo codifica la síntesis de HbS y el otro, la síntesis de HbC
(βS/βC). No existe HbA mientras que existen cantidades similares de HbS y HbC
(50%). La expresión clínica suele ser menos severa.
Otras formas de asociación de HbS con distintas hemoglobinopatías (Ángeles,
G-Philadelphia, HbO Arab, etc) pueden tener una variabilidad clínica diversa.
1.2. Epidemiología.
La anemia falciforme y la beta-talasemia son las dos de las enfermedades
genéticas más frecuentes del mundo. Según los datos de la Organización Mundial de la
Salud (OMS) se estima, que un 7% de la población mundial porta genes de las
hemoglobinopatías, y el 50% de estas hemoglobinopatías viene dado por la anemia
falciforme o drepanocitosis (Cao y colbs., 1998). Cada año nacen alrededor de
300.000-400.000 niños con drepanocitosis, y la prevalencia de esta enfermedad oscila
entre 0,1/1.000 en los países no indémicos, hasta 20/1.000 en algunas partes del
continente Africano (Weatherall and Clegg, 2001). En todo el mundo, hay más
portadores de talasemias que de anemia falciforme, pero la elevada frecuencia del gen
de la drepanocitosis en ciertas áreas da lugar a elevadas tasas de recién nacidos
afectados por esta enfermedad.
La mayor concentración del gen para la drepanocitosis se da en la población
negra de África ecuatorial, donde hay grupos con el gen que afecta hasta a un 40% de
la población (Chang y colbs., 1995), y es aún más frecuente en Benín (Nigeria) y
África oeste central (Lukens y colbs., 1993).
También se presenta en países de la cuenca mediterránea, como Turquía, Grecia,
Italia, España y Oriente Medio, así como en los países árabes e India Oriental. En
Introducción
5
América se da en los Estados Unidos (en personas de origen africano o afroamericano)
y en el Caribe, América Central y del Sur (Brasil) (Lukens y colbs., 1993).
Esta distribución se debe a que la población con el rasgo falciforme es resistente
a la malaria, una enfermedad transmitida por un parásito, el Plasmodium falciparum,
que vive en el interior de los hematíes durante una etapa de su ciclo vital. En zonas
donde la malaria ha sido históricamente endémica, ha favorecido a la población
poseedora del rasgo falciforme, aumentando la prevalencia del alelo HbS (Thomas y
colbs., 2001).
El gen de la drepanocitosis se ha hecho frecuente en África porque el rasgo
heterocigoto confiere cierta resistencia al paludismo por Plasmodium falciparum
durante la infancia, favoreciendo así la supervivencia del huésped y la consiguiente
transmisión del gen de la hemoglobina anormal. Aunque la presencia de un único gen
anormal puede proteger del paludismo, la herencia de dos genes anormales produce
anemia falciforme y no confiere la mencionada protección, por lo que el paludismo
constituye una importante causa de enfermedad y muerte en niños con anemia
drepanocítica (Föller y colbs., 2009).
La anemia falciforme tiene importantes repercusiones en la salud pública. Sus
efectos en la salud humana se pueden evaluar en función de la mortalidad infantil. La
proporción de niños afectados que sobreviven más allá de los cinco años es cada vez
mayor, pero aun muchos niños corren el riesgo de muerte prematura. Cuando el
impacto en la salud se mide en función de la mortalidad de los menores de cinco años,
la anemia falciforme es la causa de la muerte de un 5% de este segmento de población
en el continente africano (Modella and Darlison, 2008); de más de un 9% en África
occidental y de hasta un 16% en determinados países como Nigeria. El 24% de la
población es portadora del gen mutante, y la prevalencia de la anemia falciforme es de
aproximadamente 20 casos por cada 1.000 nacidos. Esto significa que sólo en Nigeria
nacen anualmente unos 150.000 niños con esta hemoglobinopatía (Magaña y colbs.,
2002).
La detección masiva de anemia falciforme en Estados Unidos surgió en el año
1975. Un seguimiento en la evaluación de estos niños y la administración temprana de
penicilina redujo notablemente la morbilidad y la mortalidad en los niños
diagnosticados. La supervivencia media estimada en los Estados Unidos de América
en 1994 era de 42 años para los hombres y 48 años para las mujeres, mientras que en
Introducción
6
el año 2001 era de 53 años para los hombres y 58,5 años para las mujeres. En Jamaica,
donde existe una gran migración del continente africano, la mayor mortalidad se
registra entre los 6 y los 12 meses de vida, que es cuando fallece el 10% de los
pacientes, pese a la considerable experiencia en el diagnóstico y tratamiento de la
enfermedad y a la ausencia de paludismo.
En África subsahariana la mitad de los pacientes con anemia falciforme mueren
antes de los cinco años, generalmente por infecciones como el paludismo y la sepsis
neumocócica, o por la propia anemia. En general, en los últimos años, la esperanza de
vida ha mejorado notablemente estimándose que el 85% de los niños con anemia
falciforme sobreviven hasta los 18 años.
La anemia falciforme representa un importante problema para la salud pública
(Roberts and de Montalambert, 2007). Solo en Estados Unidos entre los años 1989 y
1992 se registraron 75.000 hospitalizaciones por año. En 1996 estas hospitalizaciones
supusieron un coste de $475 millones de dólares (Ashley-Koch y colbs., 2000).
Según los estudios de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) en el año
2004, la prevalencia de HbS en algunos países latinoamericanos es importante, aunque
las muestras de individuos estudiados varían entre 150 en Guatemala hasta más de
20.000 en Brasil (Tabla 1).
Tabla 1. Prevalencia de HbS en algunos países latinoamericanos, según los datos
de la OPS, 2004.
País No. De Individuos %
Brasil 21372 6,2
Colombia 1184 11,9
Costa Rica 1830 8,1
Cuba 6996 6,1
Guatemala 150 18,3
México - 11,2
Venezuela 2132 8,7
Panamá 7604 16,0
En Panamá, según algunos estudios realizados, existe un 8 % de la población
afectada por esta enfermedad (Schroeder y colbs., 1900). Sin embargo, no hay datos
Introducción
7
claros actualizados y publicados sobre la prevalencia de drepanocitosis en la
República de Panamá. Sólo recientemente y gracias a la aprobación de la ley nacional
de tamizaje neonatal en el año 2007, se va a poder a realizar un diagnóstico masivo y
determinar la prevalencia de anemia falciforme.
1.3. Diagnóstico.
Las técnicas para el diagnóstico de anemia falciforme han evolucionado al igual
que nuestro conocimiento sobre esta enfermedad. Existen varias técnicas de
laboratorio que permiten hacer una detección temprana de drepanocitosis y que luego
deben ser comprobados con las técnicas de biología molecular.
La HbS resulta de la sustitución de un aminoácido con carga (ácido glutámico),
situado en la sexta posición de la cadena ß, por otro neutro (valina). Esta modificación
de la carga superficial de la hemoglobina disminuye la solubilidad de la Hb,
especialmente en su estado reducido (deoxi-Hb), y facilita la formación de agregados
fibrilares o polímeros de molécula de Hb que alteran profundamente la morfología
eritrocitaria y aumentan su rigidez.
Las técnicas que se utilizan para el diagnóstico de drepanocitosis son las siguientes:
1. Inducción de drepanocitosis: En un medio carente de oxígeno (O2) la
hemoglobina S se hace menos soluble y forma agregados cristalinos con la
consiguiente formación de drepanocitos. Se coloca una gota de sangre en un
portaobjetos, se le agrega metabisulfito de sodio 2%, que es un reactivo consumidor de
O2, se tapa con un cubreobjetos y se sellan los bordes con petrolato; en pocos minutos
se puede observar el fenómeno (Winterbourn, 1974).
2. Prueba de solubilidad de la hemoglobina: Aquí también ocurre una
desoxigenación de la hemoglobina S, pero utilizando sustancias como el dithionato
sódico, que hace que la hemoglobina S se haga insoluble y precipite, observándose
turbia la solución (Huntsman y colbs., 1970). Esta prueba es más fácil y rápida de
realizar, pero puede dar falsos negativos en los pacientes con anemia severa, a menos
que se realice junto al hematocrito, y en casos de hemoglobina F aumentada. Los
Introducción
8
falsos positivos pueden estar dados por otras causas de turbidez como en las
disglobulinemias (Surve y colbs., 2000).
Figura 1. Inducción de drepanocitos en metabisulfito de sodio (aumento 100x).
3. Electroforesis de hemoglobina: Prueba diagnóstica principal que involucra
separación de las diferentes clases de hemoglobina por movilidad que difiere según su
carga molecular y tamaño. Sin embargo, algunas hemoglobinas migran juntas en un
medio alcalino (acetato de celulosa) (Figura 2) y es necesario repetirla a un pH ácido
(agar citrato) en que pueden migrar diferente (Figura 3). Por ejemplo, la hemoglobina
C y la A2 migran juntas en acetato de celulosa (Kohn J, 1969), pero separadas en el
agar citrato y, en este medio, la hemoglobina F se separa mejor. Entre las técnicas
complementarias utilizadas para identificar hemoglobinas anormales o
electroforéticamente ―silenciosas‖, se menciona la isoelectrofocalización como el
método de elección por su rapidez y facilidad, además de la seguridad de los
resultados (Dacie JV y Lewis SM, 1991).
4. HPLC (cromatografía líquida de alta presión) es un método automatizado de
alta precisión que permite detectar distintas moléculas de hemoglobina (F, A, S, C, E
Figura 2. Electroforesis de Hb en acetato
de celulosa a un pH 8.6, para mostrar el
sitio de migración de diferentes Hb.
Figura 3. Electroforesis de Hb en agar
citrato a un pH 6,2, para comparar con
la electroforesis en acetato de celulosa.
Introducción
9
y D). Es suficiente contar con la muestra de sangre en forma de frotis en papel filtro.
Además, esta técnica es un método útil para la cuantificación inicial de HbS y F en el
seguimiento de los tratamientos (Surve y colbs., 2000).
5. Diagnóstico molecular: basado en el uso de las enzimas de restricción
específicas que son capaces de detectar el cambio de un sólo nucleótido en la cadena
de ADN. La digestión con la enzima de restricción DdeI es para confirmación del
genotipo de la mutación A→T en el codón 6 (6 GAG→GTG), que permite salir de
la duda en caso de la talasemia beta, o HbD que puede alterar el análisis de los
haplotipos. La enzima reconoce el sitio 5’-C•TNAG-3’. Si la muestra tiene la
mutación S, la enzima no es capaz de realizar el corte (figuras 4 y 5) (Varawalla,
1992).
Figura 4. La enzima DdeI corta las secuencias en posiciones 27, 40, 62, 107,
488, 576. El nucleótido rojo indica el sitio mutado.
Figura 5. Uso de la enzima DdeI para confirmar el diagnóstico HbS.
5' 3'
A: CCT-GAG-GAG
S: CCT-GTG-GAG
Pro –Val – Glu
5 6 7
308 pb
-/- = SS
+/+ = AA
DdeI
Introducción
10
1.4. Clínica de la enfermedad.
Las manifestaciones clínicas de la anemia drepanocítica clásica han sido bien
definidas desde hace mucho tiempo y se han caracterizado por un conjunto de signos
y síntomas própios de una anemia hemolítica crónica grave, con incremento de la
susceptibilidad a las infecciones, retraso del crecimiento y desarrollo, crisis de dolor
por oclusión vascular, cuadro torácico agudo, síndrome de secuestro esplénico, daño
tisular, trastornos del sistema nervioso central, crisis aplásicas y hemolíticas y
asplenia funcional (Rodgers y Schetcher, 1991). La anemia falciforme tiene un
amplio espectro de manifestaciones clínicas. La mayoría de los afectados presentan
anemia crónica con una hemoglobinemia de alrededor de 8 g/dl.
De acuerdo al estudio cooperativo de SCD, se definen los siguientes síntomas
severos de anemia falciforme (Inati y colbs., 2003):
Accidente cerebro vascular: síndrome neurológico agudo vascular debido a la
oclusión o hemorragia. Los síntomas o signos neurológicos se prolongan más de 24
horas.
Síndrome torácico agudo: presencia de un nuevo infiltrado pulmonar en asociación
con una enfermedad aguda del tracto respiratorio.
Crisis de dolor: dolor en brazos y piernas, espalda, abdomen, pecho o cabeza que
dura al menos 2 horas, y que requiere atención médica. Existen dos tipos de crisis:
―crisis dolorosa o infártica‖, que se caracteriza por dolor óseo intenso y fiebre en la
que no se producen cambios en la concentración de Hb; y ―crisis de secuestro‖ que
suele afectar a los lactantes y niños pequeños en la que se produce un descenso
rápido de la concentración de Hb en sangre y puede producir ―crisis hemolítica‖ que
se caracteriza por una disminución de Hb e ictericia intensa (Ballas, 1991).
Dactilitis: sensibilidad o dolor con o sin hinchazón de las manos y pies.
Secuestro esplénico: atribuido a la ampliación esplénica de al menos 2 cm por debajo
del margen costal y una disminución de los niveles de hematocrito por debajo del
20%.
Introducción
11
La clínica de los pacientes con anemia falciforme varía inmensamente a pesar de
que existe la misma mutación genética. Algunos autores clasifican los cuadros
clínicos como grave o severo, moderado y suave, dependiendo de la presencia o
ausencia de los síntomas descritos anteriormente. Los distintos subfenotipos de la
clínica de anemia falciforme fueron sugeridos por Ballas en 1991, quién notó que los
pacientes con frecuentes crisis de dolor tenían una evolución distinta a los que tenían
ulceraciones en los píes (Ballas, 1991).
La variedad clínica de anemia falciforme sigue siendo el rompecabezas para los
científicos y clínicos, y se busca encontrar la explicación de ello en la fisiopatología de
esta enfermedad. La situación de anemia crónica produce daños, muchas veces
irreversibles a distintos órganos.
Órganos afectados:
Bazo: las células falciformes tienen una vida media más corta y, por tanto, son
atrapados en el bazo, para ser destruidos. El secuestro esplénico es causado por el
atrapamiento de las células rojas en la circulación del bazo, causando disminuciones
en los niveles de Hb y un rápido aumento del órgano. Inmediatamente se requiere
tratamiento con transfusiones, y un 50% requiere esplenectomía.
Sistema nervioso central: se producen pequeños infartos que pueden ser
clínicamente silenciosos, pero que a largo plazo producen defectos cognitivos que
pueden ser detectados con pruebas neuro-psiquiátricas. Pacientes adultos pueden
presentar aneurismas y hemorragias cerebrales. La mayoría de los pacientes con daños
cerebrales requieren terapia de transfusión, y en el caso de los niños, trasplante de la
médula ósea.
Huesos y articulaciones: los problemas óseos se inician en la infancia. En los
huesos y articulaciones se producen episodios de vaso oclusión, que conllevan a que
se desarrollen anormalidades en las vertebras. La necrosis en los hombros y las
caderas causan episodios de dolor que pueden requerir una intervención quirúrgica.
La enfermedad puede conllevar a que se desarrollen las infecciones de las
articulaciones, que acaba con la colocación de prótesis.
Ojos: curiosamente, los pacientes que llevan un cuadro clínico más suave y
tienen valores de hemoglobina más altos, son los que más sufren problemas
oftalmológicos. La mayoría de estos daños se revelan a una edad adulta y pueden
Introducción
12
consistir en hemorragias oculares, desprendimiento de la retina y oclusiones de la
arteria retinal central (Claster y Vichinsky, 2003).
Sistema genitourinario: los problemas del aparato genitourinario son bastante
frecuentes en pacientes con SCD. Se desarrolla esclerosis glomerular, que se
manifiesta con proteinuria, y más de 5% de los pacientes desarrollan daño renal
crónico. Otro gran problema es el priapismo: dolorosa y persistente erección debido a
la obstrucción vaso-oclusiva de drenajes venosos de pene. Aproximadamente el 89%
de los hombres desarrollan algún episodio de priapismo, que si llegan ser
prolongados pueden resultar en impotencia (Claster y Vichinsky, 2003).
Sistema pulmonar: el síndrome torácico agudo está en segundo lugar como
causa de admisión hospitalaria. La situación se agrava por infecciones y/o embolias de
grasa en las arterias pulmonares. Se desarrollan daños crónicos pulmonares que
resultan en hipoxia y fibrosis pulmonar. Uno de cada tres pacientes desarrolla
hipertensión pulmonar y esto disminuye significativamente la esperanza de vida de los
pacientes. La principal causa de muerte en mayores de cinco años suele ser el
síndrome torácico agudo, con fiebre, dolor torácico y leucocitosis. Se ha indicado que
hoy en día la supervivencia de los pacientes con anemia falciforme guarda relación
con la frecuencia de estas crisis (Claster y Vichinsky, 2003).
1.5. Fisiopatología de la anemia falciforme.
1.5.1. Fisiología de la hemoglobina.
La Hb es una molécula compleja presente en los eritrocitos; su función es
transportar el oxígeno a todos los tejidos del organismo. Se integra con cuatro
cadenas peptídicas (globinas), cada una unida a una molécula de protoporfirina
ferrosa (grupo hem), sitio donde se fija y se desplaza el oxígeno. En un hematíe hay
alrededor de 280 millones de moléculas de Hb, cada una con un peso molecular de
64.458 Dalton, forma elipsoide y dimensiones 64x55x60 Aº.
Introducción
13
Figura 6. Estructura del grupo hemo de Hb, de las cuatro cadenas globinicas que
forman un tetrámero conjugado, y del cromosoma 11, donde se codifica la estructura
de las cadenas globinicas , , , .
Existen varias formas de hemoglobinas normales: más de 95% de la hemoglobina
del adulto y de los niños mayores de 7 meses es la HbA1, compuesta por dos cadenas
α y dos cadenas (α2 2). La HbA2 es la hemoglobina que se encuentra en menor
concentración en los adultos (2,5%) y está compuesta por dos cadenas α y dos cadenas
. Se representa como α2 2. La HbF es el componente principal de la Hb de recién
nacido. Su concentración disminuye en los primeros meses de vida y está constituida
por dos cadenas α y dos .
Las hemoglobinas Gower I (z2ε2), Gower II (2ε2) y Portland (2z2) son
embrionarias y sólo aparecen durante el primer trimestre de gestación (Hoppe y colbs.,
2004). La Hb Gower II es la más importante y alcanza entre 50% y 60% de toda la Hb
embrionaria (Hardison, 1996). Al parecer, las cadenas polipeptídicas épsilon () y zeta
(z) se sintetizan en el saco vitelino, y la Hb embrionaria tiene mucha mayor afinidad
por el oxígeno.
Se han descrito más de 400 variantes anormales de hemoglobinas, que difieren
entre sí en uno o más nucleótidos, lo que puede traducirse en cambio de aminoácidos
que repercute en la función de la proteína. Las alteraciones en la estructura de Hb se
denominan hemoglobinopatías. Existen varias hemoglobinopatías: las más comunes
son α- y - talasemia, que se caracterizan por deficiencia en la síntesis de una de las
Introducción
14
dos globinas, y hemoglobinopatías estructurales producidas por una mutación puntual
en la estructura de la proteína. La alteración en la hemoglobina S (HbS) es la más
frecuente a nivel mundial, y conlleva a la producción de anemia hemolítica crónica
(Peñalosa-Espinosa y cols., 2008). Entre otras hemoglobinopatías estructurales
podemos mencionar las de HbC y HbE.
La HbC se caracteriza por la sustitución del ácido glutámico de la posición 6 de
la cadena beta por lisina. Es una hemoglobinopatía propia de África occidental, pero
puede encontrarse con cierta frecuencia en España. El estado homocigoto (CC) se
caracteriza por una ligera anemia hemolítica crónica con esplenomegalia. El estado
heterocigoto (AC) no produce trastorno alguno. Aunque la HbC tiende a
polimerizarse en condiciones de hipoxia, no produce crisis vaso oclusivas como las
de la HbS (Peñalosa-Espinosa y cols., 2008).
La HbE (26 GluLys) es más frecuente en el sur de Asia y se han hecho
estudios que sugieren que esta variante de Hb también ofrece cierta protección contra
la malaria (Steinberg, 1995).
La anemia falciforme es la primera enfermedad congénita en la cuál fue
identificado el error genético específico. Durante muchas décadas fue considerado que
la única causa de vaso-oclusión era la acumulación de eritrocitos falciformes en los
capilares que conllevaba a los daños orgánicos. El concepto cambió a finales del siglo
XX debido a las evidencias de interacción entre las células sanguíneas circulantes y el
endotelio, aumento de la adhesión celular, detección de los factores de inflamación,
biomarcadores de estrés oxidativo elevados y cambios en el equilibrio del sistema de
vasoconstricción-vasodilatación. Finalmente, Hebbel fue el primer científico quién
sugirió la presencia de la disfunción endotelial generalizada que afecta el curso clínico
de la enfermedad (Hebbel y colbs., 1985; Kaul y colbs., 1989).
La disfunción endotelial se define como un estado patológico caracterizado por
el desequilibrio entre la producción de factores vasodilatadores y vasoconstrictores,
entre las propiedades procoagulantes y anticoagulantes y por alteración de la
permeabilidad vascular. Entre los factores involucrados en la disfunción endotelial se
consideran los siguientes: hemolisis activado por el estrés oxidativo elevado, biología
de la producción de óxido nítrico (NO), adhesión celular e inflamación (Mack y
Kato, 2006).
Introducción
15
La vaso-oclusión, responsable de las crisis de dolor y daño multiorgánico, se
relaciona con la inflamación, un aumentado estrés oxidativo y la disfunción endotelial.
Además, se producen cambios en la disponibilidad de sustratos y cofactores para la
enzima óxido nítrico sintasa, que conlleva a la disminución de biodisponibilidad de
óxido nítrico y el aumento en la formación de las especies reactivas de nitrógeno.
Otros estudios también indican que aumenta la respuesta inflamatoria microvascular,
del mismo modo que durante la ateroesclerosis e hipertensión (Mack y Kato, 2006). Se
produce un desequilibrio en el funcionamiento de las células endoteliales que conlleva
al aumento de vasoconstricción y adhesión celular.
1.5.2. Polimorfismos de genes del clúster globínico beta.
Los aspectos genéticos más estudiados son los cambios de un solo nucleótido o
SNPs en el bloque o clúster de genes beta, denominados haplotipos del clúster beta.
El clúster globínico beta (HBB, gene ID: 3043), se localiza en cromosoma 11
(11p15.5) y contiene alrededor de 45 kb, incluyendo cinco genes funcionales y un
pseudogen (ver figura 7). El orden de ubicación de los genes en la dirección desde
terminal 5' hacía terminal 3' es: épsilon, gamma G, gamma A, beta 1 pseudogen, delta,
beta. Todos estos genes tienen una estructura similar (dos exones y tres intrones) que
lleva a concluir que se derivan de un solo gen ancestral. Los genes de las globinas son
regulados durante el desarrollo y se expresan en los momentos específicos de la vida
humana. El gen épsilon y los dos gamma se expresan en las etapas embrionaria y fetal,
en los tejidos eritroides, mientras que los genes delta y beta se expresan en la vida
adulta. Las cadenas globinicas , , , están compuestos por 146 aminoácidos y
poseen homología estructural. De la misma forma, las cadenas z y α son productos de
genes localizados en el extremo 5׳ del cromosoma 16, y están compuestos de 141
aminoácidos.
El análisis del ADN de diversos individuos en distintas poblaciones ha puesto de
manifiesto que existen mutaciones productoras de polipéptidos cuya secuencia de
aminoácidos está alterada (por ejemplo, variantes de la Hb), y también diferencias en
las secuencias nucleotídicas que no alteran la función del gen. Estas variantes
―silenciosas‖ se definen como polimorfismos del ADN. Se ha calculado que
aproximadamente una de cada 100 bases es polimórfica, ello significa que en esa
Introducción
16
posición puede haber nucleótidos distintos, y se ha demostrado que estas variaciones
se presentan casi exclusivamente en las regiones adyacentes a los genes y en los
intrones, mientras que las secuencias de los exones se mantienen prácticamente
constantes.
La introducción de técnicas de biología molecular, entre ellas, el uso de enzimas
de restricción obtenidas de bacteriófagos específicos, dió un nuevo impulso para el
estudio de la HbS al encontrar que existen distintos patrones de digestión o restricción
dentro del clúster beta y que además, se relaciona con sus orígenes geográficos. Las
técnicas de biología molecular hacen posible la determinación de los distintos
haplotipos del clúster S a través de los 11 sitios polimórficos (Nagel y Fabry, 1984).
La presencia o ausencia del sitio polimórfico produce los llamados fragmentos
de restricción de longitud variable (en inglés, restriction fragment length
polymorphisms, o RFLP). Ciertas enzimas ―cortadoras‖ o de restricción tienen
afinidad exclusiva por los distintos puntos polimórficos en la cadena de ADN y por lo
tanto se usan para dividirla en sus diferentes RFLP. Cuando se habla de haplotipos se
hace alusión a los diversos patrones o fragmentos polimórficos de ADN a lo largo de
una misma región cromosómica (Chang y colbs., 1995). La combinación o patrón
aleatorio de los sitios de restricción polimórficos en un cromosoma es lo que define el
haplotipo de un gen.
El clúster beta se divide en clúster 5' y 3'.
Desde la primera descripción de estos fragmentos por Kan y Dozy (Kan y Dozy,
1980), se ha demostrado que al menos hay 5 tipos de HbS: SS-Benín, SS-Bantú (CAR,
República Central Africana), SS-Senegal, SS- Camerún, SS-Árabe-Hindú (Peñuela,
Figura 7: Esquema de cluster
globínico beta.
Introducción
17
2005; Ofori-Acquah y colbs., 2002). Otros autores prefieren hacer la clasificación en
seis haplotipos, separando el haplotipo Árabe-Hindú en Arabé-Saudi y Asiático-Índio
(Rodríguez y Saénz, 1998).
La importancia de conocer los haplotipos radica en que los de tipo Bantú y
Benín acusan una gravedad mayor que los de tipo Senegal, Arabé-saudi y Asiático-
indio, en los cuales los pacientes pueden presentar síntomas diversos desde el segundo
mes de vida, razón por la que requieren mayor y mejor atención médica continua
(Peñalosa-Espinosa y colbs., 2008). Por ejemplo, se ha visto que los neonatos con
haplotipo Bantú (CAR) en su estado homocigoto tienen un mayor riesgo para
desarrollar accidentes cerebrovasculares (Schacter y colbs., 1988). También hay
estudios donde no se encuentra la correlación entre la gravedad clínica de la
enfermedad y los haplotipos (Inati y colbs., 2003).
1.5.3. Otros polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs).
Recientemente se han hecho estudios que asocian polimorfismos de un solo
nucleótido (SNPs) de varios genes con la gravedad clínica de la anemia falciforme. El
uso de técnicas modernas de biología molecular (cDNA microarrays, análisis de
polimorfismos, proteómica) permiten identificar polimorfismos (SNPs) de los genes
que potencialmente pueden influir en diferentes aspectos de la fisiopatología de la
anemia falciforme. En la tabla 2 citamos algunos de los genes posiblemente
involucrados en las manifestaciones clínicas de la anemia falciforme.
Como podemos observar, casi todos estos genes están relacionados con la
inflamación, proliferación celular, reactividad vascular y apoptosis, lo cuál apoya la
idea que drepanocitosis es una enfermedad que se caracteriza por la disfunción
endotelial e inflamación (Kutlar, 2007).
Introducción
18
Tabla.2. Genes que posiblemente impactan en la fisiopatología de anemia
falciforme.
Gen estudiado Asociado a Referencia
SNPs en los genes de fosfodiesterasa 7
(PDE7), proteína asociada a
microtubulo7 (MAP7), factor de
biogénesis peroxisomal7 (PEX7) y
proteína kinasa 5 mitogeno-activada
(MAP3K5).
Aumento en la
producción de HbF
Kutlar, 2007
Receptor de Interleucina-4 (IL-4R,
S503P), factor de necrosis tumoral
(TNFα,-308G) y receptor -
adrenergico-2 (ADRBP, Q27E).
Accidente cerebro-
vascular
Kutlar, 2007
Óxido nítrico sintasa 2 (NOS2A, T-
786C) y factor de crecimiento de
receptor beta tipo II (TGFBR2).
Hipertensión
pulmonar, priapismo,
úlceras en los pies,
síndrome torácico
agudo.
Sharan y colbs.,
2004; Ashley-
Koch y colbs,
2005.
Factor de crecimiento de receptor beta
tipo III (TGFBR3),
Aquaporina (AQP1)
Coagulación, adhesión
celular, priapismo
Ashley-Koch y
colbs, 2004,
Elliott y colbs.,
2007.
Gen methylenetetrahydrofolato
reductasa (MYHFR), la mutación
C677T
Necrosis avascular Milner y colbs.,
1991
Receptor de Interleucina-4 (IL-4R,
S503P), factor de necrosis tumoral
(TNFα,-308G), receptor beta
adrenérgico (ADRB2), molécula de
adhesión celular vascular (VCAM1,-
1594), receptor de lipoproteína de baja
densidad LDLR.
Accidente cerebro-
vascular
Hoppe y colbs.,
2004, Hoppe y
colbs., 2007.
Introducción
19
1.5.4. Las variaciones en la expresión de la hemoglobina fetal.
La hemoglobina fetal tiene mayor afinidad por el oxigeno e inhibe la
polimerización de HbS, permitiendo llevar cantidades suficientes de oxígeno a los
tejidos periféricos. La concentración de HbF al nacer es de 80% pero disminuye al
cumplir los seis meses de vida.
Varios factores influyen en las variaciones de HbF en los pacientes SCD: edad,
sexo, cantidad de las globinas alfa, haplotipos del cluster globínico beta y locus
ligado al cromosoma X, que regula la producción de los eritrocitos F (FCP). Cada
una de estas variables presenta asociación con los niveles de HbF, pero la
participación de FCP es de mayor prevalencia (40%) (Chang y colbs., 1995).
En los pacientes con anemia falciforme se ha observado que los niveles
elevados de hemoglobina fetal y los haplotipos Senegal y Árabe/Hindú se asocian
con el cuadro clínico menos grave (Ruiz Cruz y colbs., 2003). También, Nagel y
colaboradores (Nagel y colbs., 1991) demostraron que la presencia de por lo menos
un cromosoma con haplotipo Senegal, a diferencia de otros haplotipos africanos, se
asocia con altos niveles de HbF y un curso clínico mas leve. Los altos niveles de HbF
se relacionan a su vez con el polimorfismo en la región promotora del gen G (-158
(CT)) que regula la expresión de HbF (Lu y Steinberg, 1996).
Sin embargo, otros estudios sugieren que los niveles de hemoglobina fetal son
importantes, pero no son los únicos factores que afectan la gravedad de la
enfermedad. Por ejemplo, se encontraron altos niveles de HbF en pacientes con
haplotipos CAR en el Líbano que no parecen mejorar la severidad de síntomas, lo
que sugiere que existen otros factores y que los niveles de HbF no son los principales
determinantes de la gravedad de esta enfermedad (Inati y colbs., 2003).
La utilización de hidroxiurea es uno de los tratamientos más aceptados hasta
ahora. Se piensa que el principal mecanismo de acción es el aumento de los niveles
de HbF. Hidroxiurea es un citotóxico que causa la regeneración eritroide y también
su metabolismo da lugar a un aumento en Guanilil ciclasa soluble dependiente de
óxido nítrico, con una elevación de cGMP que aumenta la expresión de gen de
globina gamma (Cokic y colbs., 2003). A pesar su amplio uso en la práctica médica,
no todos los pacientes respondan al tratamiento con hidroxiurea. Además, se han
encontrado SNPs que participan en el metabolismo de hidroxiurea y en la respuesta a
Introducción
20
la misma (Steinberg, 2005). La predicción de cómo un individuo responde al
tratamiento con hidroxiurea, podría ayudar a una mejor selección de los pacientes
para este fin y reducir al mismo tiempo los efectos por su toxicidad.
Desafortunadamente, a pesar de algunas pistas interesantes, no es posible predecir
actualmente la respuesta al tratamiento con esta molécula.
1.5.5. Niveles del estrés oxidativo asociados a la hemólisis.
Los glóbulos rojos de los pacientes anémicos tienen una membrana mucho más
frágil y son mucho más vulnerables a producir hemolisis. La hemolisis supone un
aumento de la destrucción prematura de los eritrocitos. Si la vida media de los
eritrocitos normales es alrededor de 120 días, en un individuo con SCD los eritrocitos
tienen una vida media entre 4 y 21 días. Antes se pensaba que la hemolisis se debía al
contenido de HbS polimerizada y adherida a la membrana que la hace ser más rígida.
Hoy día se ha demostrado que estos eritrocitos se encuentran en condiciones de alto
estrés oxidativo, que provoca daño en la membrana celular.
Parece ser que la hemolisis es uno de los factores implicados en la
heterogeneidad de las complicaciones de esta enfermedad. Evidencias recientes
demuestran que los pacientes con las complicaciones agudas, tales como hipertensión
pulmonar y sistémica (Morris y colbs., 2005), priapismo (Nolan y colbs., 2005),
ulceraciones cutáneas (Nolan y colbs., 2006) y riesgo de muerte repentina en los niños,
se caracterizan por altos niveles de hemolisis, una vasculopatía proliferativa y
disfunción en el sistema vasomotor (Morris y colbs., 2005). Se puede estimar la
hemolisis a través del índice de reticulocitos. La otra forma de medir la hemolisis es a
través de lactato deshidrogenasa (LDH), arginasa I y ratio arginina/ornitina, en el
plasma.
A cambio, los pacientes con las manifestaciones clínicas clásicas de la
enfermedad, que incluyen crisis de dolor y síndrome torácico agudo, están más
asociados con la patogénesis que involucra vaso-oclusión, infartos e inflamación (Platt
y colbs., 1994, Kaul y Hebbel, 2000).
La patogénesis de la hemolisis incluye daños en la membrana debido al estrés
oxidativo. La producción de los radicales libres de oxigeno (ROS), disminución en la
Introducción
21
efectividad del sistema antioxidante, peroxidación de lípidos y proteínas de las
membranas eritrocitarias conllevan a la salida del contenido hacia el espacio
extracelular. El estrés oxidativo a su vez provoca activación de la iNOS (Escames G,
2006) y VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), que a su vez potencia
producción de las especies reactivas de nitrógeno, vasoconstricción y la producción de
la hipertensión arterial (Kato, 2007; Aslan, 2007).
Por tanto, la posibilidad de estudiar los niveles del estrés oxidativo como un
biomarcador de estado y avance de anemia falciforme y su posible relación con los
haplotipos, tiene una significancia clínica (Kato, 2007; Aslan, 2007; Wood y Granger,
2007). Además, las ROS pueden desactivar directamente a la proteína NOS endotelial
(Schulz y cols., 2004), responsable de producir NO, un importante vasodilatador.
Los eritrocitos poseen un sistema de defensa complejo y eficiente en el cual se
incluye el sistema glutatión y las enzimas como la superóxido dismutasa (SOD), la
catalasa (CAT), la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Glu-6PDH) y la NADH o
NADPH metahemoglobina reductasa. Se ha demostrado que en los eritrocitos SS se
generan cantidades excesivas de ROS debido a la presencia de la HbS inestable y la
oxidación espontánea del hierro en el grupo hemo. Por otra parte, la vaso-oclusión que
ocurre en la drepanocitosis provoca daños por isquemia-reperfusión y activación de
procesos inflamatorios tisulares que aumentan la producción y liberación de ROS, así
como la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (Aslan y cols., 2003;
Schulz y cols., 2004), que contribuye a la producción de las especies reactivas de
nitrógeno (RNS).
En los estudios con eritrocitos se ha demostrado que los niveles de anión
superóxido (O2-•), radical hidroxilo (OH
•) y peroxidación lipídica son
aproximadamente 2 veces mayores en pacientes con drepanocitosis que en donantes
voluntarios (Ren, 2008). Igualmente se encontró una disminución en la producción o
liberación de óxido nítrico durante las crisis vasooclusivas (Schulz y cols., 2004).
1.5.6. Reducción en la biodisponibilidad de óxido nítrico.
Al NO se atribuye una serie de funciones importantes que participan en el
mantenimiento del buen funcionamiento vascular. A parte de ser un vasodilatador,
Introducción
22
inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión de los leucocitos, la proliferación y la
migración de las células del músculo liso, y tiene efectos antioxidantes y
antiinflamatorios (Mack y Kato, 2006). El NO liberado del endotelio difunde hacia
las células musculares adyacentes, donde reacciona con hierro ferroso del grupo hemo
de guanilato ciclasa aumentando la síntesis de guanosín monofosfato cíclico (cGMP) a
través de guanosín trifosfato (GTP). A su vez, el cGMP activa la proteín kinasa G
(PKG), que estimula el bombeo activo de Ca++
hacía sus depósitos, disminuyendo los
niveles de Ca++
intracelular y, por tanto, produciendo una relajación muscular,
vasodilatación y aumento del flujo sanguíneo local (Ignarro y colbs., 1987; Lincoln y
Cornwell, 1993). El mismo mecanismo señalizado por el sistema cGMP/PKG a su vez
inhibe la agregación plaquetaria (Radomski y colbs., 1987). La reducción de Ca++
intracelular en plaquetas disminuye la expresión de P-selectina y suprime la expresión
de glicoproteína IIb/IIIa, requerida para las uniones de fibrinógeno y la activación de
coagulación (Loscalzo, 2001).
El NO también es un potente antagonista de la inflamación (De Caterina y
colbs., 1995). En parte este efecto se debe a que NO induce la expresión de IBα, un
importante inhibidor del factor NF-B (Peng y colbs., 1995). A su vez NF-B,
controla la expresión de varios genes involucrados en la inflamación y en la respuesta
inmune, tales como VCAM-1, ICAM-1, y E-selectina.
Actualmente se estudian las posibilidades de uso de NO para la prevención de
adhesión de las células rojas al endotelio. Por ejemplo, se ha demostrado que los
donadores exógenos de L-arginina y NO previenen la acción protrombótica causada
por la inhibición de la eNOS en las vénulas (Broeders y colbs., 1998).
El NO se sintetiza a partir de la L-arginina mediante la acción de la NOS y casi
enseguida adquiere un electrón no apareado, transformandose en radical de óxido
nítrico (NO) (Ghafourifar and Cadenas, 2005). En el medio extracelular NO
reacciona con el oxígeno y agua, formando aniones de nitratos (NO3-) y nitritos (NO2
-
), los cuáles conjuntamente se denominan como NOx. Se conocen tres isoformas de la
NOS cuyos nombres se deben al sitio donde primeramente fueron encontradas: NOS
neuronal (nNOS o NOS 1), inducible (iNOS o NOS 2), endotelial (eNOS o NOS 3).
La eNOS se expresa de forma constitutiva, se encuentra en las células
endoteliales, plaquetas y el cerebro y su actividad es calcio-calmodulina dependiente
(Gladwin y Kato, 2008). La inhibición de la eNOS conlleva a un efecto
Introducción
23
vasoconstrictor y provoca efectos secundarios graves, como la hipertensión pulmonar,
una de las causas de crisis y de muerte de individuos con anemia falciforme. Esta
hipótesis se apoya en algunos estudios que demuestran que aumentando la actividad
eNOS se mejora vasodilatación, mientras, en ratones SCD con eNOS inhibida se
produce una mayor vasoconstricción (Nath y colbs., 2000).
La iNOS se induce ante determinados estímulos, es capaz de sintetizar NO• en
cantidades mil veces superiores a las normales y es calcio-calmodulina independiente.
En ciertos procesos como la inflamación, hipoxia y el estrés oxidativo, la actividad y
la expresión de la iNOS aumentan (Crespo y colbs., 1999; Sullivan y colbs., 2008). El
NO• reacciona con O2
•-, produciendo grandes cantidades de peroxinitritos (ONOO
-),
tan tóxicos como el HO• (Cadenas y colbs., 1996). También se encuentra un
incremento de esta enzima en los pacientes hipertensos (Escames y colbs., 2004). Se
ha demostrado que la inhibición de la producción de los radicales libres mejora la
clínica de estas patologías (Crespo y colbs., 1999; Escames y colbs., 2004, López y
colbs., 2008). La expresión de la iNOS está aumentada en los riñones y el hígado de
los pacientes y/o ratones SCD (Mack y Kato, 2006; Diwan y colbs., 2002; Aslan y
colbs., 2003).
Desde los años noventa, los datos producidos en el laboratorio y con animales de
experimentación proporcionaron gran información para comenzar a establecer los
efectos de los eritrocitos falciformes y la hemolisis crónica sobre la disfunción
endotelial y el metabolismo de NO•. Por ej., French y colbs. (1997) demostraron que la
administración de las drogas inhibidoras de la eNOS en ratas provoca cambios en el
endotelio cerebral, disminuye el flujo sanguíneo cerebral y aumenta la mortalidad. En
los ratones SCD la reducción de concentración de NO• se asocia con el aumento en la
degradación de fibrina y en la producción de trombos (Ballas y colbs., 1988).
Las tres causas más importantes de la disminución de biodisponibilidad de NO•
son: disminución de L-arginina en el plasma, consumo de NO• mediante la
hemoglobina extracelular (Reiter y colbs., 2002) y a través de su reacción con ROS
(Mack y Kato, 2006).
Una de las consecuencias de la hemolisis es la liberación de la arginasa, que a su
vez degrada la L-arginina, precursor necesario para la síntesis de NO•. Se ha
observado que la actividad de la arginasa es dos veces mayor en pacientes con
Introducción
24
hipertensión pulmonar, dando como resultado un bajo ratio arginina/ ornitina, y una
menor disponibilidad de NO• (Morris y colbs., 2005).
Figura 8. Efectos de la hemolisis sobre la biodisponibilidad de óxido nítrico
(Gladwin y Kato, 2008).
El NO• reacciona con la desoxiHb y la oxiHb formando nitrosilHb (Hb(Fe
2+)-
NO) y metHb, respectivamente (Gibson y Roughton, 1957). Las constantes de estas
reacciones están en el orden de 3-5 x107M
-1·S
-1, que significa una vida media de 1
µseg para el NO•. Con esta vida tan corta, la concentración de NO
• no sería
suficiente para activar a la guanilato ciclasa y no produciría sus conocidos efectos
de vasodilatación (Peñuela, 2005; Herold y colbs., 2001). La reducción de
biodisponibilidad de NO• puede predisponer a la crisis vasooclusiva y/o los
procesos inflamatorios, ya que NO• inhibe la formación de las moléculas
inflamatorias: VCAM-1, ICAM-1 y ELAM-1 (Rother y colbs., 2005). Es más, en
los ratones con otras anemias, por ejemplo, con anemia hemolítica alloinmune, se
ha visto que se desarrolla la hipertensión pulmonar asociada a una disminución en
vasodilatación causada por una menor biodisponibilidad de NO•
(Dweik y colbs.,
1998).
2. HAPLOTIPOS DE ANEMIA FALCIFORME.
Los haplotipos que más se asocian con los diversos aspectos clínicos son los
haplotipos del extremo 5׳ del clúster beta.
Introducción
25
Figura 9. El patrón de digestión del clúster con distintas enzimas de restricción
(Zago y colbs., 2000).
Los primeros estudios de distribución geográfica de los β haplotipos
demostraron que la mutación ocurrió independientemente, al menos en tres
ocasiones en África, en la Península Arábica y la India Central (El-Hazmi y colbs.,
1999; Ruiz y colbs., 2003; Ofori-Acquah y colbs., 2004).
En estos grupos étnicos existen varios haplotipos, pero hay un haplotipo más
predominante que es el que se denomina de acuerdo al sitio. Por ejemplo, el
haplotipo Senegal es más común en Senegal, donde también está presente el
haplotipo Benín. El haplotipo Benín es mas común (92%) en Yoruba, Nigeria, pero
también es común en Jamaica (aprox. 71%), aunque Bantú y Senegal también están
presentes en Jamaica. La distribución geográfica de los s haplotipos clásicos se
atribuye a los sitios de origenes independientes (Hanchard y colbs., 2007).
La mutación βS apareció hace aproximadamente 30.000 años, es mucho más
reciente que la separación de los genes β y α (hace mas de 450 millones de años
atrás) y está relacionada con la aparición del sedentarismo humano y seleccionada
bajo la presión ejercida por la malaria (Rodríguez y Saénz, 1998). Se ha
demostrado que los haplotipos s clásicos son altamente conservados a lo largo de
cientos de bases (Hanchard y colbs. 2007), pero también existen otros haplotipos
menos frecuentes. Basándonos en el uso de las cinco enzimas de restricción dentro
del clúster , tales como ε-HincII, G-HindIII, A-HindIII, 5'ψ-HincII, 3'ψ-
Introducción
26
HincII, podemos distinguir los haplotipos 5' mas comunes, denominados de
acuerdo al sitio de su origen, y otros haplotipos encontrados, pero menos frecuentes
(Shimitzu y colbs., 2001).
Tabla 3. Patrón de digestión de los haplotipos 5' del clúster globínico beta.
Haplotipo ε-Hinc G-HindIII A-HindIII 5'ψ-HincII 3'ψ-HincII
Benin - - - - +
Bantu (CAR) - + - - -
Senegal - + - + +
Cameron - + + - +
Arabe- Hindu
+ + - + +
1 + - - - -
2 + - - - +
3 + - + - -
Haplotipo ε-Hinc G-HindIII A-HindIII 5'ψ-HincII 3'ψ-HincII
4 - + - + +
5 - + - - +
6 - + - - -
7 - + - + -
8 - + + - +
9 - + + + +
10 - + + - -
11 - - - - +
12 - - - - -
13 + + - - -
14 + + + - +
15 - - - + +
16 - - + - +
17 + + - + +
18 + - - + +
19 + + - - +
20 - - + - -
21 + - - + -
22 - - - + -
23 + + - + -
El signo mas (+) significa corte de una región específica de ADN con la enzima de
restricción mencionada, y el signo menos (-) significa no corte.
Se ha observado que el principal beneficio conferido por algunos de estos
haplotipos en relación con la gravedad de la drepanocitosis se explica en términos de
su relación directa con las concentraciones sintéticas de Hb fetal, que suele
considerarse ―antifalciforme‖ porque no copolimeriza con la HbS, a la que torna más
soluble. Los diferentes polimorfismos del gen de la HbS estimulan una mayor o
Introducción
27
menor síntesis de HbF, además, modifican la proporción de las cadenas G y A de
la HbF en el adulto drepanocítico (Powars, 1991; Rodríguez y colbs., 1994; Powars y
colbs.). Los haplotipos Sen y Árabe-hindú se asocian con mayor producción de las
cadenas G, y por ende mayor porcentaje de la HbF.
En el neonato y en el niño de pocos meses hay más cadenas G que cadenas A
(razón 6:4). En la medida en que se inactiva la síntesis de HbF en años posteriores, se
activa un mecanismo genético que favorece un descenso más acelerado de la
producción de cadenas G en relación con cadenas A (Powars y colbs., 1990;
Nagel, 1991), por lo que después del cuarto o quinto mes de edad la razón G:A
empieza a ser 4:6, como en el adulto (Nagel, 1991).
Los haplotipos Senegal y Árabe-hindú se asocian con mayores concentraciones
de HbF y con la conservación de razón G:A del período neonatal normal, 6:4, lo
que posiblemente contribuye a la clínica más leve. Además, los estudios del clúster
globínico beta permiten hacer conclusiones de orígenes antropológicos de las
poblaciones. En las Américas, los haplotipos βs permiten entender mejor las raíces
ancestrales africanas de las poblaciones de raza negra. Por ejemplo, varios estudios
hechos en América Central apuntan que allí predenomina el haplotipo CAR.
Tabla 4. Los parámetros de HbF, ratio G: A y la clínica de acuerdo al haplotipo del
clúster beta.
Haplo-
tipo
Conc. de
HbF
Ratio
G: A
Clínica Ubicación
geográfica
Benín
(Ben)
Intermedia
5-15%
1:1 Gravedad intermedia,
más leve que CAR, las
principales
complicaciones son
uremia y la
insuficiencia o
disfunción de órganos
importantes, tales como
cerebro, riñón e hígado.
De estos pacientes, 90%
presentan crisis de
osteonecrosis
importantes después de
los 20 o 25 años de
edad.
Occidente
centroafricano
Introducción
28
En la zona Mediterránea el haplotipo más frecuente es el Benín, que llegó a
Grecia y Sicilia por medio de las invasiones musulmanas y a Portugal, por el tráfico
de los esclavos (Rodríguez y Sáenz, 1998). Los haplotipos βs árabe-saudí y el indio o
asiático han tenido un origen distinto del de los haplotipos africanos, estando
estrechamente relacionados entre sí por las corrientes migratorias que se
establecieron entre territorios cercanos al río Indo (cuna de la civilización de
Harappa en el subcontinente indio) y pueblos originarios del Oasis del Este en la
península arábica, y de manera más concreta entre indios, árabes chiítas e iraníes.
Fue aparentemente a orillas del río sagrado de la India donde se originó la mutación
asiática de la HbS, lo que sugiere, a diferencia de lo sucedido en África, que el origen
del gen βs en la India fue de carácter unicéntrico (Labie y colbs., 1989). Por ejemplo,
los estudios en la población iraní demostraron que el haplotipo que más pre
denomina es el Árabe-hindú. En segundo lugar se encuentra haplotipo Bantú A2
(Rahimi y colbs., 2003).
Desde los primeros análisis de haplotipo beta en los años ochenta, se han hecho
varios estudios epidemiológicos que relacionan distintos haplotipos con el curso
clínico de la enfermedad. Por ejemplo, Powars, en varios estudios hechos en África y
América, encontró que el haplotipo CAR incrementa el riesgo de desarrollar
complicaciones desde una edad temprana, además se relaciona con la
Haplo-
tipo
Conc. de
HbF
Ratio
G: A
Clínica Ubicación
geográfica
Rep.
Centro-
africana
(CAR) o
Bantú
Muy baja,
<5%
Muy
baja
La clínica más grave,
presenta daño en alguno
de sus órganos vitales
en los primeros 40 años
de vida.
África central
Senegal
(Sen)
Altas,
20%
6:4 Más leve, por su parte,
se vincula con un
menor número de
episodios
―drepanocitémicos‖, de
síndrome torácico
agudo y de infarto
esplénico y óseo.
África
atlántica
Camerún
(Cam)
Intermedia
, 5-15%
1:1 Curso clínico más leve. Zona de
Camerún
Arabé-
hindú
Altas,
20%
6:4 Curso clínico más
inocuo.
India, países
árabe
Introducción
29
microvasculopatía que lleva a los daños orgánicos durante tres primeras décadas de
la vida, y sugiere aplicar una terapia de trasplante desde una edad temprana (Powars
e Hiti, 1993). El haplotipo Benín tiene síntomas menos severos que el CAR pero más
severos que el haplotipo Senegal (Powars e Hiti, 1993; Powars, 1991). Los
CAR/CAR tienen mayor riesgo de padecer accidente cerebro vascular que el resto de
los haplotipos (Sarnaik y Ballas, 2001).
3. ANEMIA FALCIFORME Y ESTRES OXIDATIVO.
3.1. Radicales libres y enzimas involucrados en su producción.
Los radicales libres son producidos en el organismo como parte de sus
funciones bioquímicas y fisiológicas. El radical libre se define como una especie
química cargada con uno o más electrones desapareados en su orbital electrónico
externo y que es capaz de existir independientemente (Halliwell y Gutteridge, 1989).
Pero el peligro de contener una gran cantidad de radicales libres consiste en que estas
especies son sumamente inestables y reaccionan con otras moléculas a su alrededor,
provocando paso de electrones libres y alterando el funcionamiento correcto de estas
moléculas.
La formación de los radicales libres en el organismo es inevitable (López y
colbs., 2008), pero estas especies no causan daño oxidativo en condiciones normales
debido a que la célula está prevista de un efectivo sistema antioxidante. Los
antioxidantes se definen como aquellas sustancias que a bajas concentraciones
respecto a las de un sustrato oxidable, retardan o previenen la oxidación. Este
proceso consiste, básicamente, en el hecho de que un antioxidante cede un electrón al
radical libre, neutralizándolo, y transformándolo en una molécula inocua.
Existen fuentes externas e internas de los radicales libres; al igual que existen
dos tipos de antioxidantes: los exógenos tomados en la dieta y los endógenos,
dotados por el propio sistema biológico. Otra forma de clasificar a los agentes
antioxidantes es de acuerdo al nivel de su acción: primario, secundario y terciario
(ver Tabla 5).
Introducción
30
Tabla 5. Tipos de antioxidantes.
Primarios Secundarios Terciarios
Neutralizan los RL recién
formados
Capturan los RL
evitando la reacción
en cadena
Reparan las
biomoléculas dañadas
por los RL
Glutation peroxidasa (GPx),
glutation reductasa (GRd),
glutation S- transferasa,
catalasa (CAT), superóxido
dismutasa (SOD)
Melatonina,
vitamina E, C, beta-
caroteno, ácido
úrico, estrógenos.
Ej.; enzimas
reparadoras de ADN
(endonucleasas,
exonucleasas), la
metionina sulfóxido
reductasa.
El grupo de ROS incluye la formación de anión superóxido O2-•, peróxido de
hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (HO•):
O2 + e- O2
-•
O2-•+ e- + 2H+
H2O2
H2O2 + e- 2OH•
O2- + H2O2 → OH- + OH• + O2
Entre las RNS se incluyen los radicales libres óxido nítrico (NO•), dióxido de
nitrógeno (NO2•) y el potente oxidante peroxinitrito (ONOO
-).
Entre los enzimas que contribuyen a la formación de los radicales libres
podemos destacar el papel de NADPH oxidasa, xantina oxidasa e iNOS. Las enzimas
intracelulares tales como, SOD y CAT, al igual que el sistema de glutatión, actúan
como la primera línea de defensa frente a los radicales libres (Bradley y Nathan,
1984).
Sólo cuando se produce un desequilibrio entre sustancias prooxidantes y
antioxidantes a favor de las primeras, el resultado es un daño oxidativo que puede
afectar varias moléculas alterando su funcionamiento y llevando el organismo entero
a un envejecimiento prematuro, enfermedades cardiovasculares, cáncer, diabetes,
afecciones a nivel genético y otras patologías. Este daño oxidativo producido por un
desequilibrio entre la producción de radicales libres y el funcionamiento del sistema
antioxidante, se denomina estrés oxidativo.
Introducción
31
Figura 10. Balance de procesos prooxidantes y antioxidantes que debe existir
en el organismo.
La NADPH oxidasa cataliza la reducción de oxígeno a O2-•, lo que resulta en
la producción de H2O2. Este enzima se encuentra en la membrana de los leucocitos
polimorfonucleares, es mejor caracterizada en los neutrófilos, y se activa en
condiciones de inflamación, en respuesta a la presencia del organismo microbiano
(Market y colbs., 1984; Elsbach y Weiss, 1985).
La xantina oxidorreductasa (XOR) es un molibdenoflavoenzima complejo,
que existe en dos formas funcionalmente distintas: xantina deshidrogenasa (XDH),
que produce NADH y urato; y puede ser transformada en xantina oxidasa (XO),
oxígeno dependiente, que origina radical anión superóxido y/o peróxido de
hidrógeno y urato. En condiciones normales la XDH representa 80% de la XOR
funcional in vivo, y la XO constituye un 20% restantes. Pero en las condiciones de
injuria por isquemia- reperfusión la enzima XO aumenta notablemente su actividad y
contribuye a la formación de ROS (McCord, 1985; Chambers y colbs., 1985).
Tanto la XDH, como la XO catalizan la degradación de la hipoxantina (HX) en
xantina (X), y subsecuentemente en urato. Sin embargo, sólo XO produce O2•- en el
último paso de esta reacción (McCord, 1985), ver figura 11.
Factores prooxidantes: Externos Internos: NADPH oxidasa Xantina oxidasa eNOS
Factores
antioxidantes:
Sistema glutation Enzimas: SOD, CAT, GPx
Introducción
32
Figura 11. Esquema de producción de RL por la enzima xantino oxidasa.
El enzima iNOS participa en la producción de RNS en condiciones de
inflamación y el estrés oxidativo (Escames y colbs., 2004).
3.2. Sistemas antioxidantes.
Superoxido dismutasa (SOD)
La SOD fue la primera enzima de la cuál se conoció que actuaba sobre un
radical libre y fue descubierta en 1968 (McCord y Fridovich, 1969). La familia de las
superóxido dismutasas está integrada por tres tipos de métalo enzimas, Cu/Zn-SOD,
Mn-SOD, y Fe-SOD. La Cu/Zn-SOD es la más abundante, se encuentra en la fracción
soluble celular, y en los líquidos extracelulares. La SOD dependiente de Mn++
se
encuentra en procariotas y eucariotas y se localiza en la matriz mitocondial. En las
bacterias se ha descrito una tercera forma de la SOD, dependiente de Fe++
.
Adenosina
AMP
ATP
Adenosina
Inosina
Hipoxantina
Xantina
Acido úrico
Xantino
deshidrogenasa (i)
Xantino oxidasa (a)
O2-• H2O2
Introducción
33
La SOD neutraliza el anión superóxido, convirtiéndolo en agua oxigenada, por
lo cual forma una primera línea de defensa ante la producción de ROS generados en
numerosos procesos oxidativos:
O2•- + O2
•- + 2H+ → H2O2 + O2
La actividad de la enzima aumenta en situaciones de estrés oxidativo
prolongado, normalizándose sus valores cuando la producción de ROS disminuye. No
obstante, el agua oxigenada producida por la SOD es, a su vez, fuente de ROS, como
el radical hidroxilo, mucho más agresivo que el radical superóxido. Por ello, es muy
importante disponer de otros sistemas de defensa, tales como la catalasa, para evitar
que el agua oxigenada se transforme en radicales hidroxilo.
Catalasa (CAT)
La catalasa se una proteína compuesta de cuatro subunidades, cada una de las
cuáles contiene grupo heme y la molécula de NADPH. En los mamíferos la CAT se
sintetiza en la mayoría de las células. A nivel subcelular, el 80% de la actividad de la
CAT se localiza en los peroxisomas y el 20% restante en el citosol.
Catalasa elimina el peróxido de hidrógeno sin necesidad de un agente reductor:
2H2O2 →2H2O + O2
Sistema del Glutatión
El glutatión (L--glutamyl-L-cysteinylglycine) es un tripéptido involucrado en
la defensa antioxidante de casi todas las células. Su capacidad antioxidante se debe a
la presencia de un residuo de cisteína (grupo tiol –SH), capaz de formar el puente de
disulfuro entre las dos moléculas de glutatión, proceso acompañado con la liberación
de dos electrones y dos protones.
El glutatión puede existir en su forma reducida (GSH) y oxidada (GSSG) o
unido a las proteínas. Cuando la forma reducida de glutatión pasa a su forma
oxidada, se liberan protones y dos electrones, los cuáles pueden utilizarse para
Introducción
34
reducir el efecto dañino de los radicales libres. El enzima que participa en este
proceso es la glutatión peroxidasa (GPx), y a su vez, la vía de recuperación del
glutatión reducido a partir del GSSG es catalizada por el enzima glutatión reductasa
(GRd). Este último es dependiente del NADPH proveniente del ciclo de las pentosas
fosfato.
GSSG + NADPH + H + → 2 GSH + NADP+
Las enzimas GRd y GPx juntos forman la maquinaria antioxidante dependiente
de glutatión. Ambas enzimas se encuentran tanto en el citosol, como en la
mitocondria, aun que predomina el componente citosólico (Kim y colbs., 2003).
El sistema de glutatión es un indicador de la funcionalidad celular y puede ser
medido a través del ratio GSH/GSSG. En condiciones normales la forma reducida
debe predominar la forma oxidada y el ratio oscila entre 1 y 10 (Pastore y colbs.,
2003).
Figura 12. Sistema del glutation.
En algunas patologías el estrés oxidativo tiene una contribución significativa en
su desarrollo, como en la enfermedad de Parkinson, Alzheimer, artritis reumatoide y
el fenómeno llamado "paradoja del oxígeno" que se presenta posterior a un fenómeno
de isquemia, durante la reperfusión, cuando el aporte de oxígeno no disminuye el
daño sino que lo incrementa participando en reacciones de oxidación de proteínas y
Introducción
35
lipoperoxidación. (Halliwell y Gutteridge, 1999). El fenómeno isquemia-reperfusión
es bastante común en los pacientes con anemia falciforme.
Según los datos epidemiológicos, los niveles de hemolisis crónica se asocian,
con las complicaciones, tales como la hipertensión pulmonar y las ulceraciones
cutáneas (Wood y colbs., 2008). Los últimos estudios demuestran que una
característica común de la anemia falciforme es la hemólisis crónica provocada por
el estrés oxidativo.
Sobre la participación del estrés oxidativo en anemia falciforme se han hecho
varios estudios en animales que revelan, por ejemplo, que los ratones con
sobreexpresión de la SOD, tienen una atenuada adhesión de las células sanguíneas en
las paredes de los vasos sanguíneos (Wood y colbs., 2005). Por otro lado, la
utilización de allopurinol, inhibidor de XO, y por lo tanto, de ROS, mejora la
dilatación arteriolar y reduce la acumulación de leucocitos en las vénulas (Kaul y
colbs., 2004; Kaul y colbs., 2006).
Al exponer los eritrocitos normales a un tratamiento con phenazin
methosulfato, un fuerte productor de radicales libres, aparecen las características
propias de eritrocitos SS, tales como, rigidez de las membranas, inestabilidad
mecánica, lisis y el tiempo de vida más corto (Hebbel y colbs., 1990).
Existen varias causas del estrés oxidativo en anemia falciforme. Por un lado, la
hemólisis de las células falciforme conlleva a la liberación de la Hb y la arginasa. El
grupo hemo de la Hb liberada se oxida y el mismo Fe en su estado elemental
contribuye a la formación de ROS a través de la reacción de Fenton. Por otro lado, la
vasooclusión intermitente provoca daños por isquemia-reperfusión y activación de
los procesos inflamatorios tisulares que aumentan la producción de radicales libres
activando la iNOS (Aslan y colbs., 2003; Schulz y colbs., 2004), y otras enzimas
prooxidantes, como la XO y la NADPH oxidasa.
3.3. Fuentes de los radicales libres en la anemia falciforme.
1. Autooxidación de la hemoglobina falcémica
Hebbel y colbs. (1988) por primera vez demostraron que la HbS tiene una
velocidad de autooxidación mucho más alta que la de HbA, en presencia de oxígeno.
Introducción
36
Por lo tanto, es implicada en una mayor producción de superóxido y radical hidroxilo
detectados en los pacientes con SCD (Hebbel y colbs., 1988).
La autooxidación de Hb conduce a la formación de superóxido y
subsecuentemente, a la formación de peróxido (reacción de Fenton):
2. Xantina oxidasa
Se ha demostrado, que la enzima XO tiene una mayor actividad en el
endotelio aórtico (Kaul y colbs., 2006) y si los ratones SCD son tratados con
allopurinol, inhibidor de XO, y por lo tanto de las ROS, mejora la dilatación
arteriolar y se reduce la acumulación de leucocitos (Kaul y colbs., 2004).
Las fuentes principales de XO son dos: células endoteliales y el hígado. Se
propone que en condiciones de la crisis vaso-oclusiva el hígado libera la XO soluble,
cuál se une a la superficie de las células endoteliales de los vasos sanguíneos de
distintos órganos (Aslan y olbs., 2001). Se ha observado que la actividad de la XO en
plasma de los pacientes con SCD es significativamente mayor que en el grupo
control (Aslan y colbs., 2001).
3. NADPH oxidasa
En los pacientes con SCD la cantidad de leucocitos está aumentada, y los
leucocitos contienen la enzima NADPH oxidasa, implicada en la producción del
radical superóxido. Además, estudios recientes demuestran que los aniones
superóxido producidos por la NADPH oxidasa endotelial están implicados en la
adhesión leucocitaria y plaquetaria en las vénulas del cerebro de ratones SCD (Wood
y colbs., 2005).
4. Otras fuentes
Fe2+
+ O2 Fe3+
+ O2-•
O2-•+ O2
-• + 2H
+ H2O2
Introducción
37
La enzima eNOS está compuesta por dos subunidades monoméricas:
oxygenasa y reductasa, trabaja en presencia de oxigeno, y requiere de cofactores
NADPH y tetrahidropterina (BH4). En condiciones normales, la eNOS transforma la
L-arginina en NO, produciendo pequeñas cantidades de NO necesarias para
mantener homeostasis vascular. En ausencia o baja concentración de la BH4, la
enzima NOS se desacopla y en vez de producir NO, puede producir superóxido y sus
derivados (H2O2, OH•, ONOO-) (Aslan y colbs., 2003). Esta situación se ha
observado en los estudios de la diabetes, hipertensión y ateroesclerosis. Pero hay
estudios que apuntan que una situación similar se presenta en el caso de anemia
falciforme también.
Las experimentaciones en los ratones SCD en condiciones de hipoxia-
reperfusión estimulada, han demostrado una adhesión anormal de las células rojas a
las paredes de las vénulas del cerebro, y esta situación fue normalizada con una
deleción genética de la eNOS, o con tratamiento con eNOS inhibidor- L-NAME
(Wood y colbs., 2006).
En condiciones de hiperhomocistenemia, presente en SCD, se promueve la
formación de dimetilarginina asimétrica (ADMA), que compite con la L-arginina
como sustrato de la NOS. En los ratones transgénicos SCD bajo estas condiciones la
eNOS se desacopla y se evidencia un aumento en las cantidades de ROS y RNS
(Forstermann y Munzel, 2006).
3.4. Consecuencias del estrés oxidativo en la anemia falciforme.
1. Hemolisis: La membrana es uno de los componentes que más se afecta en
condiciones de sobreproducción de ROS, se produce la lipoperoxidación, la
membrana se hace más rígida e inestable a cualquier toque mecánico.
2. Adhesión de las células rojas: En los estudios de cultivos de células
endoteliales de venas del cordón umbilical humano de los pacientes con SCD, se ha
observado un aumento de concentración de ácido tiobarbiturico, activación de NF-
kB y una expresión elevada de las moléculas de adhesión celular. La adhesión se
disminuye luego de tratar las células con la SOD, catalasa y antioxidante probucol
(Sultana y colbs., 1998).
Introducción
38
3. Adhesión de las células plaquetarias y los leucocitos: La adhesión
plaquetaria en microcirculación de los ratones SCD es 4-5 veces mayor que en los
ratones normales, hecho que se relaciona con el aumento en la expresión de P-
selectina en condiciones del estrés oxidativo, lo que a su vez motiva el
reclutamiento de las plaquetas y los leucocitos (Wood y colbs., 2004). Además, se
ha demostrado que en los ratones con deficiencia genética de NADPH oxidasa
(gp92phox) y sobreexpresión de SOD citosólica (SOD1), la adhesión de los
leucocitos disminuye (Wood y colbs., 2005).
Figura 13. Consecuencias del estrés oxidativo en anemia falciforme.
Entonces, la enfermedad de células falciforme es compleja, y el proceso de
oclusión de los vasos sanguíneos y los daños en los órganos internos puede ser
Introducción
39
explicado a través de los procesos de adhesión celular, inflamación y un desequilibrio
en la función vaso motora.
4. ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS EN LA ANEMIA FALCIFORME.
4.1. Terapias tradicionales.
Hidroxiurea: La hidroxiurea es una droga citotóxica y citostática que la ―Food
and Drug Adminitration‖ (FDA) estadounidense ha aprobado como tratamiento
preventivo de anemia falciforme. Varios estudios indican que su uso reduce la
frecuencia de las crisis vaso-oclusivas, complicaciones pulmonares, disminuye la
necesidad de las transfusiones y reduce la mortalidad en los pacientes SCD (Charanhe
y colbs., 1995; Lima y colbs., 1997). Otra ventaja es su bajo coste que permite
utilizarla de una manera bastante generalizada. El mecanismo de acción de hidroxiurea
no está muy claro. Por un lado, se ha demostrado que ésta induce la síntesis de la HbF,
que tiene un efecto beneficioso en el proceso de oxigenación de los tejidos. Pero por
otro lado, también se sugiere que la hidroxiurea es un agente que reduce la actividad
de mieloperoxidasa (Saleh y colbs., 1999), libera el NO• y estabiliza la eNOS (Cokic y
colbs., 2007).
Algunos estudios confirman la capacidad de hidroxiurea de reaccionar con la
oxihemoglobina, deoxyhemoglobina y metahemoglobina para liberar NO• in vitro e in
vivo (Pacelli y colbs., 1996; Kim-Shapiro y colbs., 1999; Nahavandi y colbs., 2000).
Sin embargo, no todos los pacientes responden al tratamiento con hidroxiurea.
Además, su uso prolongado puede incrementar el riesgo de los defectos hereditarios y
de leucemia, según los datos de National Toxicology Program, 2007.
Transfusiones crónicas: Las transfusiones de sangre mejoran notablemente el
estado de un paciente crítico, siendo una terapia alternativa que evita daños mayores a
los órganos vitales. Sin embargo, siempre queda algún porcentaje de células
falciformes en el organismo, y el proceso patológico continua. Así, los niveles
elevados de la Hb plasmática y de recuento de reticulocitos disminuyen, pero no se
normalizan completamente (Tancabelic y colbs., 1999; Lezcano y colbs., 2006).
Además, el acceso a las transfusiones sanguíneas es limitado, especialmente en países
Introducción
40
africanos. Las transfusiones frecuentes conllevan a que se desarrolle riesgo de
alloinmunización eritrocitaria, sobrecarga de hierro y las infecciones.
Trasplante de células madre hematopoyéticas: Es un tipo de tratamiento
curativo pero la desventaja está en que es difícil de conseguir donante HLA
compatible y que no tenga rasgo falciforme, el trasplante es más efectivo en los niños
que en los adultos, es difícil predecir el curso que va a tomar el paciente luego de la
operación, y las complicaciones aún son bastante frecuentes.
Si se evalúan esos tres tratamientos tradicionales, se puede decir que son menos
que satisfactorios, que se requieren nuevas opciones para disminuir el ratio riesgo-
beneficio. En Francia actualmente se exploran primeros ensayos para la terapia génica,
que sí podría ser un tratamiento definitivo, pero aun no está claro si el gen correctivo
puede tener una expresión efectiva y a largo plazo, si es un procedimiento seguro y
cuál es el perfil de su coste.
4.2. Terapias alternativas.
Inhalación de óxido nítrico: La inhalación de óxido nítrico puede ser una terapia
beneficiosa para los pacientes SCD, como lo indican varios estudios. Por ejemplo,
puede usarse para tratar síndrome torácico agudo, aumentar la tensión arterial de
oxigeno, reducir la tensión arterial pulmonar, e inclusive, el tiempo de hospitalización
(Montero-Huerta y colbs., 2006; Opperty colbs., 2004). Además, se han visto efectos a
nivel sistémico, debido a que al inactivar la Hb plasmática mediante su unión a NO,
disminuye el consumo del NO arterial y se restaura su biodisponibilidad (Reiter y
colbs., 2002), lo que a su vez permite efectuar la vasodilatación, aliviar los dolores
asociados con la vaso oclusión (Weiner y colbs., 2003) y mejorar la tensión arterial de
oxígeno (Zuzak y colbs., 2003).
Terapia con quelantes de hierro y aclaradores de hem/Hb: El 99% de hierro en
el cuerpo se encapsula dentro de la Hb eritrocitaria o en las proteínas de
almacenamiento (transferrina, lactoferrina, y ferritina). Si el Fe2+
es liberado de la
célula y es oxidado, se desencadenan los eventos relacionados con los daños de la
membrana mediante la lipoperoxidación. Se ha investigado que el uso del quelante de
Introducción
41
hierro sérico, deferiprona, disminuye los daños membranales (Shalev y colbs., 1995),
y el uso de la desferoxamina, quelante intracelular, atenúa la adhesión de los
eritrocitos en las vénulas del cerebro de los ratones SCD (Wood y colbs., 2005), y
puede ser usado para prevenir los daños asociados con las transfusiones.
La haptoglobina es una glicoproteína fijadora de la Hb. El complejo de
hemoglobina-haptoglobina se depura en cuestión de minutos por el sistema
mononuclear-fagocítico. En los pacientes con hemólisis significativa, sea intravascular
o extravascular, es característico un descenso de la haptoglobina sérica. Si la cantidad
de hemoglobina liberada supera la capacidad de la fijación de haptoglobina del
plasma, la hemoglobina libre restante contribuye a la formación de los radicales libres
o atraviesa los glomérulos, produciendo hemogloglobinuria. Por lo tanto, las
estrategias para aumentar las concentraciones de haptoglobina pueden tener utilidad en
la SCD y los pacientes talasémicos cuya capacidad de unión de la transferrina con
hemoglobina está afectada por el exceso de la hemólisis (Gladwin y colbs., 2004).
Participación de NOS: Este tipo de terapia se enfoca a mejorar el
funcionamiento de la enzima eNOS desacoplada, suministrándole el sustrato o su
cofactor. La suplementación alimenticia con L-arginina da resultados dudosos, quizás
por el hecho que en el plasma la arginasa se encarga de metabolizarla. La inactivación
de la arginasa con su inhibidor NG-hidroxi-L-arginina protege la L-arginina endógena
y exógena y da mejores resultados. Experimentalmente se ha visto, que el suplemento
de BH4 o su precursor sepiapterina, puede restaurar la síntesis de NO y su rol en la
homeostasis vascular en los ratones (Schmidt y Alp, 2007). Se han hecho estudios que
confirman que la inhibición de la relajación vascular en los ratones SCD se restaura
totalmente por la acción de los donantes de NO, como es el sodio nitroprusiato (SNP).
Este hecho se debe a que SNP se metaboliza por las células del músculo liso (Shalev y
colbs., 1995), que a su vez excluye el efecto negativo del mismo en la producción de
RNS y es efectivo debido a que actúa directamente sobre guanilato ciclasa,
provocando la relajación (Kowaluk y colbs., 1992).
Drogas para combatir ROS: Este tipo de terapia está enfocado hacía el uso de
los agentes químicos que disminuyen la producción endógena de los radicales libres.
La sulfasalazina es un potente anti-inflamatorio que inhibe el factor de transcripción
Introducción
42
-NFkB necesario para la producción de las enzimas que participan en la formación de
las ROS y de moléculas inflamatorias, incluyendo citokinas, quimiokinas y moléculas
de adhesión. En modelos experimentales con ratones SCD se demostró que
sulfasalazina reduce la adhesión celular (Kaul y colbs., 2004). Además, se demostró
que tiene propiedades antioxidantes y previene eventos que conllevan a la disfunción
endotelial (MacDermott, 2000).
Otra droga antioxidante que se ha demostrado que tiene efectos favorables para
la vasodilatación, es la L-4F, análogo de la ApoA-1, (Ou y colbs., 2003). Los estudios
preliminares indican que en los pacientes SCD con hipertensión pulmonar y
resistencia vascular a vasodilatación acetilcolina-dependiente, hay niveles reducidos
de ApoA-1 (Yuditskaya y colbs., 2005).
Terapia combinada: El uso de algunas de estas estrategias terapéuticas por
separado en los pacientes con SCD puede tener limitaciones importantes. Por ejemplo,
las terapias que aumentan la biodisponibilidad de NO (suplemento de L-arginina, la
inhibición de la arginasa, donantes de NO) en un entorno de aumento de estrés
oxidativo pueden producir la lesión nitrosativa a través de especies nitrosativas muy
reactivas (ONOO-) (Wood y colbs., 2006; Ferdinandy y Schulz, 2001). Del mismo
modo, las estrategias que restablezcan funcionamiento de la eNOS a través de la
disponibilidad del cofactor sólo alimentan oxidación si la xantina oxidasa, NADPH
oxidasa o la autooxidación de HBS son principales contribuyentes al medio oxidativo.
Así que una estrategia combinada que tome en cuenta desacoplamiento de la
eNOS, la inhibición de la arginasa, la captación de la hemoglobina libre o su
inactivación, eliminación de ROS y donadores de NO, puede ser mas efectiva.
Finalmente, el énfasis tradicional del fenómeno de la formación de eritrocitos
falciformes y oclusión de los vasos sanguíneos en la SCD debe ser equilibrado con una
apreciación de que esta hemoglobinopatia se manifiesta en gran medida como una
vasculopatía generalizada (Aslan y Canatan, 2008).
Las estrategias terapéuticas destinadas a contrarrestar la disfunción endotelial,
alteraciones inflamatorias y estrés oxidativo pueden reducir la frecuencia de las
hospitalizaciones, de las transfusiones, y de la incidencia de dolor y la aparición del
síndrome torácico agudo y la hipertensión pulmonar en pacientes con SCD.
43
Hipótesis y Objetivos
44
-Hipótesis y
Objetivos-
Hipótesis y Objetivos
45
Hipótesis y Objetivos
46
Para contribuir al conocimiento sobre la implicación del daño oxidativo en la
fisiopatología de la anemia falciforme, hemos evaluado y compararado los niveles del
estrés oxidativo entre el grupo de los pacientes y el grupo control, y analizado los
biomarcadores de estrés oxidativo de acuerdo a la expresión de HbF en dichos
pacientes. Nuestra hipótesis es que el grado de estrés oxidativo podría usarse como
biomarcador del estado y avance clínico de la enfermedad y que, en consecuencia,
pueda tener relación con los haplotipos del cluster globínico beta.
En el caso que exista una correlación directa entre la expresión de los
biomarcadores de estrés oxidativo y el avance clínico, se podrá pensar en buscar un
tratamiento que disminuya el estrés oxidativo, y mejore el funcionamiento endotelial,
ofreciendo una alternativa relativamente económica para mejorar la calidad de vida de
los pacientes pediátricos. En este sentido, una intervención en la edad temprana de los
pacientes podría tener mayores posibilidades de éxito.
Objetivos:
1. Diagnosticar los haplotipos del cluster globínico beta en 100 pacientes
pediátricos panameños y analizar su distribución geográfica y prevalencia en
comparación con otros países latinoamericanos.
2. Correlacionar los haplotipos de anemia falciforme encontrados en los pacientes
panameños con el fenotipo clínico de la enfermedad (leve, moderado y severo) y
los datos hematológicos.
3. Comparar el grado de estrés oxidativo, de acuerdo a los biomarcadores
seleccionados, entre el grupo de enfermos y el grupo control.
4. Evaluar la correlación de los niveles de estrés oxidativo de la sangre de los
pacientes con el haplotipo diagnosticado.
5. Correlacionar los niveles de estrés oxidativo que presentan estos pacientes con el
fenotipo clínico de la enfermedad y la expresión de la HbF.
47
48
-Materiales y
Métodos-
49
Material y Métodos
50
1. PACIENTES Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
Para este estudio se cuenta con el consentimiento informado aprobado por el
Comité Nacional de Bioética de Panamá, siguiendo las normas de ética establecidas
para trabajos de investigación en humanos por la Organización Mundial de la Salud
(OMS) y la Declaración de Helsinki ratificada por la 29th
World Medical Assembly,
Tokio 1975, en su última revisión en 2008.
Los niños incluídos en el estudio ya están diagnosticados previamente como
enfermos falcémicos y se citan con sus familiares una vez a la semana para escuchar
charlas sobre la enfermedad y los cuidados que se debe tener en cuenta. Posterior a la
charla programada, se les explica el objetivo de este estudio y entre aquellos que
quieren participar en el mismo, se escogen al azar los donantes. A lo largo de un mes
se repite el mismo procedimiento una vez por semana hasta llegar a obtener las 100
muestras necesarias para este estudio. El mismo procedimiento se utiliza en un
colegio de la localidad, para obtener las 40 muestras de sangre de niños
aparentemente sanos.
Criterios de inclusión:
Niños HbSS, HbSF y HbSC de ambos sexos con el diagnostico confirmado a
través de la prueba de electroforesis.
Edad de 6 meses hasta los 15 años.
Pacientes cuyos padres o tutor legal han firmado el consentimiento informado.
Criterios de exclusión:
Pacientes mayores de 15 años.
Pacientes falcémicos sin diagnóstico confirmado.
Pacientes que reciben tratamiento con hidroxiurea en el momento de este
estudio.
La determinación del fenotipo hemoglobínico.
El fenotipo hemoglobínico se determina por electroforesis a pH 8,6 en acetato
de celulosa (Lehmann y colbs., 1974).
Material y Métodos
51
Las muestras de sangre se extraen mediante la punción venosa periférica en
horas de la mañana en el laboratorio especializado de hematología del Hospital del
Niño de Panamá. La sangre se distribuye en los tubos con EDTA-K3 como
anticoagulante. La cantidad de tubos varía entre 2 y 3 dependiendo de la edad del
niño y, a veces, por las dificultades para extraer la sangre debido al comportamiento
del niño pequeño.
La sangre se extrae de una forma cuidadosa, evitando la lisis de los hematíes, y
los tubos se colocan verticalmente en una gradilla situada en la nevera a 4 ºC. A
continuación, uno de los tubos se utiliza para realizar el análisis hematológico y para
separar aproximadamente 500 l de sangre total para una posterior extracción de
ADN y análisis de los patrones de restricción con las enzimas de digestión. El resto
de los tubos se centrifuga durante 10 minutos a 5.000 g y 4 ºC. Tras la
centrifugación, se hacen las alícuotas de plasma; y los hematíes se lavan dos veces
con una solución salina isotónica (NaCl 0,9%), centrifugando cada vez a 5.000 g
durante 10 min a 4 ºC.
El plasma y los hematíes se alicuotan para una posterior determinación de la
peroxidación lipídica (LPO) y de nitritos y nitratos (NOx) en el plasma; del glutatión
reducido (GSH), glutatión oxidado (GSSG), las actividades de la glutatión
peroxidasa (GPx), glutatión reductasa (GRd) y superoxido dismutasa (SOD) en los
hematíes.
Figura 14. Preparación de las muestras para el estudio.
Obtención de sangre por punción venosa periférica
500 l ST para la
extracción de ADN
PCR
RFLPHaplotipos
Centrifugar 5000 g, 154 ,׳ºC
PLASMA GLOBULOS ROJOS
LPO Nitritos
2 lavados 2,5 ml sol. NaCl
0.9%, 5000g, 54 ,׳ºC
GSSG, GSH, GPx, GRd, SOD, Hb
Material y Métodos
52
Las alícuotas de plasma y glóbulos rojos se guardan a -80 ºC y posteriormente
se trasladan a España, conservando la cadena de frío. Es importante destacar que no
se hizo ninguna manipulación hasta el día en que se realizan las determinaciones
bioquímicas.
2. MÉTODOS ANALÍTICOS.
2.1. Estrés oxidativo.
2.1.1. Determinación de la concentración de proteínas: método de Lówry.
Todos los resultados obtenidos en este trabajo se normalizan por las proteínas
de la muestra de hematíes tratados. Para calcular la concentración de proteínas se
utiliza el método de Lowry (Lowry y colbs., 1951) con las modificaciones del
método de Biuret (Layne y colbs., 1957). Se trata de una técnica colorimétrica con
dos reacciones complementarias:
a) Reacción de Biuret: es específica de los grupos amino de los enlaces
peptídicos e implica la formación de un complejo coordinado coloreado de
estos grupos con el cobre en medio alcalino. La misión del pH alcalino es
facilitar el desplegamiento de las proteínas globulares en medio acuoso, por
tanto, actúa como un agente desnaturalizante para que los iones de cobre
puedan llegar hasta los grupo amino de los enlaces peptídicos.
b) Reducción del reactivo de fenol: es específica de grupos reductores como el
fenol. La reducción del reactivo de fenol se produce por el efecto de ciertos
radicales aromáticos de los aminoácidos y de los complejos de Biuret. Este
reactivo actúa como un indicador redox que al reducirse adquiere un color
azul. La intensidad de color dependerá de la cantidad de proteínas presentes
en la muestra, y puede cuantificarse midiendo la absorbancia a 650 nm.
Material y Métodos
53
Protocolo:
La medición de la concentración de proteínas totales en la muestra se realiza en
placas de 96 pocillos. Para hacer la recta patrón se utiliza albúmina sérica como
estándar (disuelta en TRIS 20 mM) a concentraciones entre 0,05-0,6 mg/ml.
En primer lugar, se pone en los pocillos 50 l de blanco, patrones o muestras. A
continuación se añade 200 l de reactivo de Lowry (carbonato disódico al 2% en
NaOH 0,1 M, tartrato de sodio-potasio al 1% y sulfato cúprico al 0,5%, la proporción
de estas soluciones es 98:1:1) y se deja reposar durante 10 minutos en agitación
(agitador de placas: 1296-001 Delphia Plateshake). Finalmente, la reacción se revela
con 50 l de reactivo de fenol diluido 1:10 con agua destilada. Se incuba durante 30
minutos a temperatura ambiente y se mide la absorbancia a 650 nm en un
espectrofotómetro de placa (Bio-Tek Power-Wave, Microplate Scanning
Spectrophotometer). Todas las determinaciones se realizan por duplicado.
2.1.2. Determinación de glutation oxidado (GSSG) y glutation reducido (GSH)
en hematíes.
Glutation oxidado y reducido son determinados mediante el ensayo
fluorimétrico (Hissin y Hilf, 1976).
Medición de GSSG:
Complejo Complejo
Proteínas-Cu2+
Proteínas-Cu2+
AA red. AA oxid.
Reactivo Folin Reactivo Folin
oxid. red.
AMARILLO AZUL
Material y Métodos
54
1. La muestra descongelada de hematíes se hemoliza en tampón de hemólisis (10
mM fosfato sódico, 1mM EDTA-Na2, pH 6,25) en proporción 1:1.
Posteriormente se realiza la desproteinización de la muestra añadiendo la
misma cantidad de ácido tricloracético al 10%. Centrifugando a 20.000 g
durante 15 minutos a 4 ºC, se obtiene el sobrenadante que se utiliza para la
medición de GSSG.
2. Se incuban 200 l del sobrenadante con 80 l de solución N-etilmaleimida
(NEM, 5 mg/ml en agua destilada) durante 40 minutos a temperatura ambiente.
La NEM previene la oxidación del GSH presente en la muestra a GSSG.
3. Tras la incubación, se añaden 720 l de NaOH 0,1 N.
4. Se añaden a los pocillos de una microplaca 30 l de las muestras
correspondientes con NEM y NaOH, 160 l de NaOH y 10 l de solución
oftalaldehído (OPT, 1 mg/ml). El OPT reacciona con el GSSG a pH alcalino,
emitiendo fluorescencia en proporción directa a la cantidad de GSSG presente.
5. Se incuba 15 minutos a temperatura ambiente y se lee la fluorescencia en un
fluorímetro de placas (FLx 800 Microplate Fluorescence Reader, Bio-Tek
Instruments, Inc).
6. Para cuantificar GSSG se compara la fluorescencia emitida por las muestras
con las de una curva de disoluciones GSSG estándar (0,1 a 1,63 nmol/ml).
7. Los valores de GSSG se expresan en mol/g proteínas totales.
Medición de GSH:
1. La muestra descongelada de hematíes se hemoliza en tampón de hemólisis (10
mM fosfato sódico, 1mM EDTA-Na2, pH 6,25) en proporción 1:20.
Posteriormente se realiza la desproteinización de la muestra añadiendo la
misma cantidad de ácido tricloracético al 10%. Centrifugando a 20.000 g
durante 15 minutos a 4 ºC, se obtiene el sobrenadante que se utiliza para la
medición de GSSG.
2. 10 l de sobrenadante se incuba con 10 l de solución ophtaldehído-etanol (1
mg/ml) y 180 l de buffer fosfato (100 mM fosfato sódico, 5 mM EDTA-Na2,
pH 8.0) durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Material y Métodos
55
3. Se mide la fluorescencia de las muestras en un lector de fluorimetría (FLx 800
Microplate Fluorescence Reader, Bio-Tek Instruments, Inc).
4. Para cuantificar el GSH se compara la fluorescencia emitida por las muestras
con las de una curva de disoluciones GSH estándar (0,2 a 3,25 nmol/ml).
5. Los valores de GSH se expresan en mol/g proteínas totales.
2.1.3. Determinación de la actividad enzimática de la glutation peroxidasa
(GPx).
Existen dos tipos de GPx, una dependiente de selenio (Se-GPx) y otra
independiente de selenio (iSe-GPx). Ambos tipos pueden usar hidroperóxidos
orgánicos (cumeno hidroperóxido) como substratos, pero solo la Se-GPx es capaz de
utilizar la forma inorgánica (H2O2) (Lawrence y Burk, 1976).
Se utiliza la reacción acoplada con GRd para reducir GSSG producido por la
reducción de peróxidos orgánicos por medio de GPx, e hidroperóxido cuménico como
substrato. (Jaskot y colbs., 1983; Dolphin y colbs., 1989). El método empleado
consiste en una determinación espectrofotométrica indirecta de consumo de NADPH,
midiendo decremento de la absorbancia en función de tiempo a una longitud de onda
de 340 nm. Se tienen lugar las siguientes reacciones:
GPx a) R-OOH + 2 GSH R-OH + GSSG
GRd
b) GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP
+
Protocolo:
1. La muestra descongelada de hematíes se hemoliza en tampón de hemólisis (10
mM fosfato sódico, 1mM EDTA-Na2, pH 6,25) en proporción 1:20, se deja
cinco minutos en reposo y a continuación se centrifuga a 20.000 g, 10 min,
4ºC.
2. 10 l de muestra procesada se agrega a 240 l de la solución de trabajo
(tampón catalizado) que contiene tampón fosfato 100 mM, EDTA-Na2 1 mM,
pH 7,5, 4 mM azida sódica, 60 mM GSH, 20 mM NADPH y 0,5 U/ml GRd.
Material y Métodos
56
3. Paralelamente se sirvan 10 l de muestra procesada con 240 l de la solución
de tampón no catalizado (tampón fosfato 100 mM, EDTA-Na2 1 mM, pH 7,5).
4. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, la
reacción inicia agregando 10 l de hidroperóxido cumenico disuelto en el
tampón no catalizado (0,3%).
5. La absorbancia se mide a 340 nm durante tres minutos en un espectrofotómetro
de placa (Bio-Tek Power-Wavex Microplate Scanning Spectrophotometer). En
todas las determinaciones se resta la oxidación no enzimática del NADPH.
6. La actividad de la GPx se expresa en mol/ min/ g proteínas totales.
2.1.4. Determinación de la actividad enzimática de la glutation reductasa (GRd).
La medida de la actividad de la GRd se realiza siguiendo el método de Jaskot
(Jaskot y colbs., 1983). Este método se basa en el mismo principio que el anterior, es
decir, cuantificar la oxidación del NADPH en el tiempo como consecuencia del
proceso de reducción del GSSG. La reacción que tiene lugar es la siguiente:
GRd
GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP
+
Una unidad de la actividad de la GRd se define como la cantidad de enzima
necesaria para reducir un mol de GSSG durante un minuto a un pH=7,6 y temperatura
25 ºC, y se ha comprobado que para la reducción de una molécula de GSSG se
requiere una molécula de NADPH.
Protocolo:
1. Los hematíes descongelados de hemolisan en tampón de hemólisis (10 mM
fosfato sódico, 1mM EDTA-Na2, pH 6,25) en proporción 1:20, se dejan cinco
minutos en reposo y a continuación se centrifugan a 20.000 g, 10 min, 4 ºC.
2. 35 l de muestra se añaden a 465 l de una solución extemporánea de trabajo
que contiene también el tampón fosfato 10 mM pH 7,5 y 2,5 mM GSSG (30 mg
en 20 ml de tampón fosfato).
3. Tras una incubación a 37 ºC durante cinco minutos, se añaden 8.5 l de NADPH
12 mM para disparar la reacción y la oxidación del NADPH se mide durante tres
Material y Métodos
57
minutos a 340 nm en un espectrofotómetro de cubeta (UV1603 Shimadzu
spectrophotometer).
4. En todas las determinaciones se resta la oxidación no enzimática del NADPH
sustituyendo los 465 l de solución de trabajo por tampón fosfato 10 mM, pH
7,5.
5. La actividad de la GRd se expresa en mol NADP oxidado/ min/ g proteínas
totales.
2.1.5. Determinación de la peroxidación lipídica.
La medición de lipoperoxidación se hace en base a las determinaciones de
malonildialdehido (MDA) y 4-hidroxialkenal (4-HDA) que proveen un índice
conveniente de la peroxidación lipídica. Los peróxidos lipídicos son inestables y se
descomponen formando compuestos carbonilos. Los ácidos grasos poliinsaturados
forman malonildialdehido (MDA) y 4-hidroxialkenal (4-HDA) en condiciones de
oxidación (Esterbauer y Cheeseman, 1990; Botsoglou y colbs., 1994).
Se utiliza el kit BioXytech LPO-568 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI,
USA). El kit contiene un reactivo cromógeno (N-metil-2-fenilindol) que reacciona
con MDA y 4-HDA a 45 ºC formulándose un cromóforo estable con máximo de
absorbancia a 586 nm.
Para una determinación simultanea de los dos biomarcadores (MDA y 4-
HDA), se agrega ácido metasulfónico como un solvente ácido.
La incubación se realiza a 45 ºC durante 40 minutos agitando. En calidad del
estándar no se usa MDA directamente, debido a que éste es muy inestable. El kit
ofrece solución de 1,1,3,3- tetrametoxypropano (TMOP) en Tris-HCl, un acetal, que
Material y Métodos
58
durante la incubación ácida a 45 ºC se hidroliza formando MDA. Las
concentraciones de los patrones utilizados son de 0,625; 1,25; 2,5; 5; 10 y 15 M/ml.
Los resultados se expresados en nmol MDA+4HDA/ ml plasma.
La absorbancia se lee en el espectrofotómetro (lector de placa Power Wave x
Bio-Tek Instruments, Inc) a una longitud de onda de 586 nm. La relación entre la
absorbancia y el valor de concentración del estándar es lineal y permite que el
programa calcule el valor de (MDA + 4HDA) de la muestra basándose en la
siguiente fórmula:
(MDA+ 4HDA) = (A586 –b)/a x df,
Donde: A586 es la absorbancia neta de la muestra a 586 nm,
a= coeficiente de regresión (pendiente)
b = factor de intercepción
df = factor de dilución de la muestra.
2.1.6. Determinación de nitritos.
La molécula de NO•, producida endógenamente, es muy inestable y reacciona
rápidamente con el agua produciendo los nitritos. A su vez, los nitritos se oxidan
fácilmente a nitratos en solución acuosa y a pH 7,4, lo que ocurre normalmente en el
organismo en proporción variable. Por lo tanto, la determinación de los nitritos nos
proporciona una información indirecta sobre los niveles de NO• en el organismo.
La concentración de nitritos presentes en la muestra se determina mediante una
técnica colorimétrica basada en la reacción de Griess (Green y colbs., 1982). El
reactivo de Griess está formado por naftil-etilen-diamina (NEDA) y sulfanilamida, se
combina con los nitritos para formar un compuesto nitrogenado coloreado. La
intensidad del color púrpura producido es proporcional a la cantidad del cromógeno
formado y, en consecuencia, a la cantidad de nitritos existentes según la ley de
Lambert-Berr (Green y colbs., 1982; Verdon y colbs., 1995).
Para determinar los nitratos, éstos son tratados previamente con las enzimas
nitrato reductasa (NRd), que reduce los nitratos a nitritos a expensas del NADPH, y
glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (GP6DH), que recicla el NADPH a partir del
Material y Métodos
59
NADP+ producido, evitando que la reacción de la NRd se detenga por falta de los
cofactores. Estas reacciones se esquematizan de la siguiente manera:
NR
a) NO3- + NADPH + H
+ NO2
- + NADP
+ + H
G6PDH
b) H2O + NADP+ + G6P 6-GP + NADPH + H
+
Protocolo:
1. Las muestras de plasma descongeladas se centrifugan a 4.000 g, 4 ºC, durante 5
min. Posteriormente el sobrenadante se desproteiniza añadiendo a 130 l de
muestra, 26 l de ácido sulfosalicílico 6%.
2. Se mezcla y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente, agitando cada 5
min.
3. Se centrifuga 15 min a 10.000 g y 4 ºC, cuando termina, se sacan 150 l del
sobrenadante en tubos nuevos, sobre hielo.
4. En un tubo eppendorff se mezclan los siguientes reactivos para preparar el
medio de reacción:
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) (50 mU/muestra…… 2 l
Glucosa-6-fosfato (G6P) (750 M/muestra)…………….……...3,75l
Nitrato reductasa (NR) (30 mU/muestra)………………………… 12 l
Tampón fosfato (14 mM, pH = 7,4)……………………………18,25 l
5. En una microplaca se dispensan:
50 l de muestra
4 l de NaOH
36 l de medio de reacción
10 l de NADPH.
6. Agitar 15 minutos, incubar hasta 60 min adicionales, tapando con papel
aluminio.
7. Se añaden 100 l de reactivo de GRIESS y se incuba 10 minutos adicionales
a temperatura ambiente.
Material y Métodos
60
8. La absorbancia se mide a 540 nm en un espectrofotómetro de placa (Bio-Tek
Power-Wavex Microplate Scanning Spectrophotometer), frente a una curva
estándar construida con nitrito sódico (2-20 nmol/ml) disuelto en agua.
9. La concentración de nitritos se expresa en nmol/ ml plasma.
2.1.7. Determinación de la actividad enzimática de la superoxido dismutasa.
El método utilizado para la determinación de SOD eritrocitaria dependiente de
cobre y zinc, (Cu/Zn/-SOD), se basa en el hecho de que la epinefrina (adrenalina) en
medio alcalino experimenta una auto-oxidación, generando anión superóxido (Misra y
Fridovich, 1972), según el siguiente esquema:
RH3- + O2 RH2 + O2
•- + H
+
Donde RH3
- es adrenalina antes de autooxidarse.
A su vez el anión superóxido O2•- actúa con la propia adrenalina transformándola
en adrenocromo RH3•. En presencia de la SOD, se reduce la producción de
adrenocromo, ya que la enzima neutraliza el anión superóxido:
La epinefrina es estable en medio ácido, pero al incrementar el pH tiene
tendencia a oxidarse. Las condiciones de pH=10,2 y temperatura 30 ºC son las más
óptimas para producir mayor cantidad de adrenocromo. El método está dirigido a
determinar específicamente la Cu/Zn-SOD, y la mezcla de cloroformo-etanol se utiliza
para inactivar las Mn-SOD y Fe-SOD.
La reacción de autooxidación de epinefrina a adrenocromo se realiza midiendo
la absorbancia del adrenocromo a 480 nm durante 10 minutos en condiciones de
ausencia y presencia de la SOD a distintas concentraciones de la muestra analizada.
Para valorar la acción de la SOD calculamos la dosis inhibitoria 50% (ID50) del
hemolizado, es decir, la cantidad de proteínas capaces de inhibir en un 50% la
producción de adrenocromo. Por tanto, una unidad de enzima (U) se define como la
RH3 - + O2
•- + 2H+ RH 3
• + H2O2
H2O2
SOD
Material y Métodos
61
cantidad de la proteína total equivalente, capaz de inhibir en un 50% la producción de
adrenocromo durante la incubación, y se expresa en U/g proteínas totales.
Protocolo:
1. Se prepara tampón de carbonato Na2CO3 /NaHCO3 50 mM, EDTA-Na2 0,1
mM, pH 10,2.
2. Los 19,9 mg de epinefrina se diluyen en 10 ml de HCl 1 mM.
3. Se produce la hemolisis de hematíes en agua fría en una proporción de 1:4.
4. La extracción de la SOD se realiza mezclando 1 ml del hemolizado con 1,6 ml
de la mezcla etanol: cloroformo (6,25:3,75), se procede a centrifugar a 3,000
rpm, 4 ºC, durante 5 minutos.
5. El sobrenadante se guarda.
6. Se procede a realizar distintas diluciones del sobrenadante (SOD):
Dilución Sobrenadante SOD
(ul)
H2O bidistilada
1:50 10 490
1:25 20 480
3:50 30 470
2:25 40 460
7. Las determinaciones se realizan en una microplaca, dispensando 250 l de
tampón Na2CO3 /NaHCO3 50 mM, EDTA-Na2 0,1 mM, pH 10,2; 30 l de
distintas diluciones de la muestra, 20 l de epinefrina diluida que se agrega con
una pipeta multicanales justamente antes de realizar la lectura de las
absorbancias cada 60 seg durante 10 minutos. En calidad de blanco se usan 250
l de la solución tampón Na2CO3 /NaHCO3 50 mM, EDTA-Na2 0,1 mM, pH
10,2, 30 l de H2O2 y 20 L de HCl 1 mM.
8. Se imprimen las curvas de los resultados y se realizan los cálculos.
Material y Métodos
62
Los cálculos se hacen encontrando los valores de la absorbancia en el rango de
tiempo, donde la gráfica tiene una máxima pendiente y es aproximadamente lineal. Se
calcula el ratio de la diferencia de las absorbancias presentadas y el rango de tiempo.
Utilizando el análisis de regresión lineal o logarítmica, se calcula el porcentaje del
incremento en condiciones de distintas concentraciones de la muestra y, finalmente, el
cálculo de la actividad de la SOD se expresa en relación al contenido de proteína total
en la muestra (U/ mg proteínas totales).
2.2. Parametros hematológicos.
El análisis hematológico se realiza utilizando el contador electrónico Coulter
Count T890 en el Hospital del Niño de Panamá. Se miden valores de hemoglobina
(Hb), hematocrito (Hcto), volumen corpuscular medio (VCM), concentración de
hemoglobina corpuscular media (CHCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y
reticulocitos.
La cuantificación de la hemoglobina fetal (HbF) se realiza por el método de
desnaturalización alcalina (Betke y colbs., 1959).
Material y Métodos
63
3. ANÁLISIS DE ADN.
3.1. Extracción de ADN.
El ADN se obtiene de la sangre extraída en los tubos con EDTA-K3, utilizando
el kid Pure LinkTM
Genomic DNA Kits de Invitrogen. Se usan 200 l de sangre total
fresca y se realiza el paso de lísis celular y la degradación de la fracción proteica
añadiendo 20 l de proteíncinasa K, 20 l de RNAsa A y 200 l de Lysis/Binding
Buffer del kit, con su posterior incubación a 55 ºC. Para la precipitación de ADN se
agregan 200 l del etanol al lisado y luego se procede al paso de purificación de
ADN, el cuál se realiza primero, uniendo el ADN a las columnas PureLink Spin
mediante la centrifugación, y luego, a través de su lavado y elución con los Wash
Buffers de estas columnas a los tubos de recolección. El ADN extraído se conserva
a -20 ºC.
Las cantidades de ADN extraído se miden con Espectrofotometro Biomate
Thermo, y se llega a preparar las diluciones de ADN de las muestras a una
concentración de 0,3 g/ml aproximadamente.
3.2. Análisis de haplotipos con la técnica de RFLP.
Antes de realizar la identificación de los sitios polimórficos propuestos para
este estudio, se procede a la confirmación molecular del diagnóstico de la presencia
del gen S de la anemia falciforme. Para esto el fragmento específico del exón que
contiene codón 6 del gen beta de 308 pb se amplifica con los iniciadores 5'-
GGGCTGAGGGTTTGAAGTCC-3' y 5
'-CCACTTCATCCACATTCACC-3
', se
pone en contacto con la enzima de restricción DdeI y los productos de la digestión se
analizan en el gel de agarosa al 2%, la ausencia de sitio de corte nos confirma que el
alelo en estudio está mutado, es decir, contiene la mutación S.
La identificación de los sitios polimórficos para la construcción de haplotipos
se realiza en los siete fragmentos del bloque de genes globínicos , en los sitios
específicos, amplificados por RCP de acuerdo a lo descrito por Varawalla y
colaboradores (Varawalla y colbs. 1992). La amplificación de cada uno de los
segmentos de ADN donde se localizan los sitios polimórficos se lleva a cabo mediante
Material y Métodos
64
la utilización de dos iniciadores específicos (primers). Los sitios polimórficos en el
gen globínico se identificarán mediante la utilización de endonucleasas de
restricción y a partir de los productos amplificados mediante PCR. Las sustituciones
nucleotídicas neutras o polimorfismos, pueden introducir o remover sitios de corte
para endonucleasas de restricción (Antonarakis y colbs., 1982) y permiten realizar el
diagnostico de haplotipos. El patrón de digestión de los productos amplificados con las
enzimas de restricción se observa en un gel de agarosa al 2%.
3.2.1. PCR.
Todos los oligos usados para este estudio se resuspenden en agua bidistilada
hasta llegar a una concentración de trabajo de 10 M. Para cada reacción de PCR se
utilizan 2 l de ADN genómico en 25 l de la mezcla de PCR, compuesta por: buffer
1x (KCl 50 mM, Tris-HCl 20 mM); MgCl2 1,5 mM, dNTPs 200 M, oligo sentido y
antisentido 10 pmol de cada uno, y la enzima Taq polimerasa (Invitrogen) 1 Unidad).
El protocolo de PCR para todos los fragmentos se basa en propuesto por
Varawalla (Varawalla, 1992) y consiste en la fase inicial de desnaturalización de un
ciclo a 95 ºC durante 3 minutos. Luego se realizan 30 ciclos consecutivos de
amplificación: 95 ºC durante 1 minuto, 55 ºC durante 1 minuto, 72 ºC durante 1
minuto, y la última fase a 72 ºC durante 3 minutos. Para los fragmentos HindIII-G,
HindIII-A, AvaIII-, HinfI- la temperatura que se utiliza en la fase de
amplificación es de 60 ºC y la cantidad de ciclos de amplificación requeridos para
HindIII es de 35.
3.2.2. RFLP.
Los productos de amplificación se digirieren con las enzimas de restricción
correspondientes en concentración de 1 Unidad de enzima por cada 1 g de ADN, en
condiciones de 37 ºC durante al menos 2 horas o toda la noche. Las condiciones de
digestión se dan en presencia del buffer comercial para cada una de las enzimas y, en
el caso de la enzima HincII se usa la solución de BSA (albúmina de suero bovina).
Para la digestión con HindIII la cantidad mínima de la enzima para optimizar los
resultados es de 5 U.
Material y Métodos
65
3.2.3. Electroforesis.
Los productos de PCR y de la digestión son visualizados en el gel de agarosa 2%
preparado en buffer TBE 1x (EDTA-Na2 0,2 mM, Tris 8,9 mM, ácido bórico 8,9
mM). En cada pocillo se sirven 5 l de amplificado y 4 l de colorante Gel Loading
Solution, dejando correr las muestras en el aparato de electroforesis en condiciones de
100V y 20-30 mA, durante 2 horas aproximadamente. La determinación del tamaño de
las bandas separadas se realiza frente a los marcadores correspondientes
(AMRESCO), servidos en cada gel en relación de 6 l de marcador y 3 l de
colorante. En el caso de los productos de digestión con las enzimas de restricción, se
usan 20 l del digerido y 4 l del colorante.
La visualización se realiza por coloración con bromuro de etidio 1 g/ml y se
denota con los signos más (presencia) o menos (ausencia) (+/-) la presencia o ausencia
de los sitios de restricción. (Salazar R. y colbs., 2006). El patrón de digestión para los
cinco haplotipos 5' está esquematiado en la tabla 6.
Tabla. 6. Patrones de digestión de los fragmentos de ADN con las enzimas de
restricción de acuerdo a los haplotipos del cluster beta.
ε- HincII
γG- HindIII
γ A-HindIII
5ώβ-HincII
3ώβ-HincII
-AvaII -HinfI
Bantu - + - - - + + Benin - - - - + + + Senegal - + - + + + + Camerun - + + - + + - Arabe-hindú
+ + - + + + -
En la tabla 7 detallamos los oligos usados y los fragmentos producto de
digestión con las enzimas de restricción utilizadas.
Material y Métodos
66
Tabla 7. Tamaños de los fragmentos amplificados con los oligos utilizados y
digeridos con las enzimas de restricción correspondientes.
Sitio de restricción
Oligos usados Posición de la restricción
Tamaño del fragmento
Ausencia de sitio de restric-ción (-)
Presencia de sitio de restric-ción (+)
ε-HincII 5’´-TCTCTGTTTGATGACAAATTC-3’
5’-AGTCATTGGTCAAGGCTGACC-3’ 890 pb
corriente
arriba del
inicio del
gen ε
760 bp 760 bp 446 bp
314 bp
G-
HindIII
5’ AGTGCTGCAAGAAGAACAACTACC 3’
5’CTCTGCATCATGGGCAGTGAGCTC 3’
Segundo
intron del
gen G
328 bp 328 bp 91 y
237 bp
A-
HindIII
5’ ATGCTGCTAATGCTTCATTAC 3’
5’ TCATGTGTGATCTCTCTCAGCAG 3’
Segundo
intron del
gen A
635 bp 635 bp 308 y
327 bp
5'ψ-
HincII
5’ TCCTATCCATTACTGTTCCTTGAA 3’
5’ ATTGTCTTATTCTAGAGACGATTT 3’
Segundo
intron del
gen ψ
794 bp 794 bp 104 y
690 bp
3'ψ-
HincII
5’ GTACTCATACTTTAAGTCCTAACT 3’
5’TAACGCAAAGATTATTTCTGGTCTCT3’
28 kb
corriente
abajo del
gen ψ
914 bp 914 bp 435 y
479 bp
-AvaII 5’GTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGG3’
5’TTCGTCTGTTTCCCATTCTAAACT 3’
Segundo
intron del
gen
328 bp 328 bp 100 y
228 bp
-HinfI 5’-AGTTAGAGGCTTGATTTGGAGG-3’
5’-GTTAAGGTGGTTGATGGTAAC-3’
350 pb
corriente
abajo del
gen
638 bp 336 y
302-el
fragment
o
constante
123 y
213 bp
REACTIVOS:
Enzimas de restricción (como una unidad se define la cantidad de enzima
requerida para digerir 1 g de ADN durante 1 hora a temperatura 37 ºC, si el
volumen total de la reacción es de 50 l):
Material y Métodos
67
AvaII, (Bio Labs, New Ingland), 10,000 unidades, 10,000 U/ml, recombinante,
sitio de reconocimiento:
HindIII, (Bio Labs, New Ingland), 50,000 unidades, 20,000 U/ml, recombinante,
sitio de reconocimiento:
HincII, (Bio Labs, New Ingland), 5,000 unidades, 10,000 U/ml, recombinante,
sitio de reconocimiento:
HinfI, (Bio Labs, New Ingland), 5,000 unidades, 10,000 U/ml, recombinante,
sitio de reconocimiento:
DdeI, (Bio Labs, New Ingland), 1,000 unidades, 10,000 U/ml, recombinante,
sitio de reconocimiento:
La enzima utilizada para PCR es la Taq DNA polymerase, Invitrogen, 5 U/l.
Para la preparación del gel se utilizaron los siguientes:
Agarosa UltraPureAgarose, (gel strength 1%1.200 g/cm3), Invitrogen.
Gel Loading Solution (Sigma), contiene los colorantes azul de
bromofenol y azul de xilencianol.
Marcadores de las bandas de ADN: X174 Market Hae III digest, Sigma,
477 ug/ml, revela 11 fragmentos de rango 72 – 1.353 bp; y Marcador
AMRESCO de 100 bp y de 1 kb.
5'. . . G•G W C C . . . 3'
3'. . . C C W G•G . . . 5'
5'. . . A•A G C T T . . . 3'
3'. . . T T C G A•A . . . 5'
5'. . . G T Y•R A C . . . 3'
3'. . . C A R•Y T G . . . 5'
5'. . . G•A N T C . . . 3'
3'. . . C T N A•G . . . 5'
5'. . . C•T N A G . . . 3'
3'. . . G A N T•C . . . 5'
Material y Métodos
68
Tabla 8. Características de las regiones amplificadas.
Sitio Temperatura Pares de
bases
Enzima Fragmentos
5'ε 60ºC 760 bp HincII 446 bp
314 bp
G 60ºC 328 bp HindIII 91 y
237 bp
A 60ºC 635 bp HindIII 308 y
327 bp
5'ψ 55ºC 794 bp HincII 104 y
690 bp
3'ψ 55ºC 914 bp HincII 435 y
479 bp
60ºC 328 bp AvaII 100 y
228 bp
60ºC 638 bp HinfI 123 y
213 y 302 bp
Marcador de 100 bp separado en el
gel de agarosa 2% -TAE buffer,
tenido con marcador SYBR Green I
Nucleic Acid Stain.
Marcador de 1 Kp separado en el gel
de agarosa 0.75% -TAE buffer, tenido
con bromuro de etidio.
Material y Métodos
69
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Se utiliza estadística descriptiva para el análisis de los datos mediante los
programas GraphPad Inc. Versión 3.05, 32 bit para Win 95/NT y Slide Write plus para
Windows Versión 7.0. Los datos son expresados como la media ± error estándar medio
de las determinaciones por duplicado de las muestras dentro del mismo grupo. Para
comparar la media entre los diferentes grupos se ha usado un análisis de la t de Student,
considerando un valor de p menor de 0,05 como estadísticamente significativo.
Las frecuencias genotípicas se estiman mediante contéo manual, mientras las
inferencias haplotípicas, equilibrio de Hardy-Weinberg y variabilidades
intrapoblacionales se obtienen mediante el programa ARLEQUIN 3.1. (Excoffier et al.,
2005).
Resultados
70
71
-Resultados-
Resultados
72
Resultados
73
1. HAPLOTIPOS DEL CLUSTER GLOBÍNICO BETA.
1.1. Datos generales de los pacientes y del grupo control.
Las 100 muestras de sangre de los niños de 6 meses a 15 años de edad son
diagnosticadas previamente como enfermos de anemia falciforme (HbS). Los datos
electroforéticos revelan que el 95 % de ellos son homocigotos HbS/HbS (SS), y el
5% son doble heterocigotos HbS/HbC (SC).
En este estudio la presencia de la mutación falciforme se confirma con la
técnica de biología molecular. Para ello el fragmento específico de 308 pb se
amplifica con PCR y se digiere con la enzima de restricción DdeI. Todos los
pacientes presentan patrón de digestión -/- que confirma el diagnóstico y todos los
sujetos se incluyen en el estudio.
En calidad del grupo control se utilizan 40 muestras de niños aparentemente
sanos de 9 a 12 años de edad. A estas muestras se les aplica la prueba de la
solubilidad de la Hb y la de electroforesis, resultando todas las muestras negativas
para la anemia falciforme. Ambas extracciones son tomadas en horas matutinas, por
el personal técnico especializado del Hospital del Niño de Panamá. En la tabla 9
observamos los datos generales y las características hematológicas de los dos grupos:
Tabla 9. Datos generales y características hematológicas de los pacientes de anemia
falciforme y del grupo control
Grupo Control
(n=40)
Grupo Pacientes
(n=100)
Edad, años 11,27 ± 0,28 7,77 ± 0,42***
Sexo, niños/niñas 23/17 52/48
Hb, g/dL 13,45 ± 0,2 8,3 ± 0,14***
Hematocrito, % 39 ± 4 25 ± 0,4***
HbF, % < 2 14,5 ± 1,8***
VCM, fl 90 ± 6 91 ± 1.1
CHCM, g/dL 34 ± 2 33,6 ± 0,2
Reticulocitos, % 1,1 ± 0,6 11,2 ± 0,5***
Los datos se expresan como media ± error medio estándar; VCM- volumen corpuscular
medio, CHCM- concentración de hemoglobina corpuscular media,
*** P < 0.001 vs. control.
Resultados
74
Como podemos observar, los valores de Hb total, HbF, hematocrito y % de los
reticulocitos difieren significativamente entre ambos grupos (P < ,0001).
1.2. Haplotipos del clúster globínico beta.
Las frecuencias haplotípicas de los 200 cromosomas analizados y su patrón de
restricción con los 7 enzimas usados, están presentadas en la Tabla 10.
Las combinaciones haplotípicas encontradas son las siguientes: 39% de los
pacientes presentan haplotipo Bantú, le sigen 22% con el haplotipo Benin, 6% con
Senegal, 4% con Camerún, 1% Árabe-Hindú, 2% atípicos Hp14/Hp14, y 1 paciente
con el haplotipo Hp5/Hp5. En el estado heterocigoto encontramos 15% Bantú/Benin,
5% Bantú/Senegal, 3% Bantú/Hp5, 1% Bantú/Hp14, 1% Benin/Hp11 (ver Tabla 11).
Tabla 10. Las frecuencias haplotípicas del cluster globínico β encontradas en la población
de los niños panameños.
Sitios polimórficos
Haplotipos ε-
HincII
Gγ-
HindIII
Aγ -
HindIII 5´β-
HincII
3´β-
HincII
β -
AvaII
β -
HinfI
N1
H. Fr.2
Bantu (Hp7) - + - - - + + 102 0.510
Benin (Hp4) - - - - + + + 60 0.300
Senegal
(Hp3)
- + - + + + + 17 0.085
Cameroon
(Hp2)
- + + - + + - 8 0.040
Arabe- Hin.
(Hp10)
+ + - + + + - 2 0.010
Haplotipos
atipicos
Hp5 - + - - + + + 5 0.025
Hp1 + - - - - + + 5 0.025
Hp11 + - - - + + + 1 0.005
1Número de cromosomas.
2Frecuencias haplotípicas.
Resultados
75
Tabla 11. Genotipos y haplotipos del cluster beta identificados en 100 pacientes
panameños con anemia falciforme.
Combinación haplotípica Genotipo según
electroforesis
Número de
pacientes (n=100)
Frequencia
Homocigotos
Bantu / Bantu SS 39 0,39
Benin / Benin SS 22 0,22
Senegal / Senegal SS 6 0,06
Cameroon / Cameroon SS 4 0,04
Arab-Indian / Arab-Indian SS 1 0,01
Heterozygous
Bantu / Benin SS 15 0,015
Bantu / Senegal SS 5 0,05
Bantu /Hp5 SC 3 0,03
Bantu /Hp14 SS 1 0,01
Benin / Hp11 SC 1 0,01
Atipicos
Atipico Hp14/Hp14 SS 2 0,02
Atipico Hp5 / Hp5 SC 1 0,01
Entre todos los pacientes, el 75% de los diagnosticados presentan patrón
homocigoto y el 25% son heterocigotos para los sitios de restricción analizados. La
distribución porcentual de los resultados de frecuencias genotípicas del clúster
globínico beta se presenta en la figura 15.
Dentro del grupo de los pacientes HbSC encontramos que tres de ellos presentan
haplotipo Bantú/Hp5, un paciente es Benin/Hp11 y uno es homocigoto atípico
Hp5/Hp5. La frecuencia del alelo HbC (β6GluLys
) en nuestra población es de 2,5%, y
este porcentaje es algo menor que las frecuencias publicadas en otros países (Ingram,
2004). Pero para determinar las frecuencias de HbC en Panamá, nosotros sugerimos
que se hagan más estudios y, preferiblemente, en pacientes capturados mediante
diagnóstico neonatal masivo.
Resultados
76
Figura 15. Distribución porcentual de las frecuencias haplotípicas del clúster
globínico beta.
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la técnica utilizada, nosotros
encontramos que 11 de los 200 cromosomas analizados presentan haplotipo atípico
(5,5%): Bantu/Hp5 (3 casos), Bantú/Hp14 (1 caso), Benin/Hp11 (1 caso), Hp14/Hp14
(2 casos) y doble homocigoto Hp5/Hp5 (1 caso).
Para todos los locus estudiados la frecuencia genotípica esperada es
significativamente mayor que la frecuencia genotípica observada (P < ,0001).
Los patrones de digestión para cada uno de los sitios de restricción realizados
por RFLP’s correspondientes al cluster globínico de los extremos 5' y 3
' se ilustran
en las fotos tomadas durante el estudio (ver figuras 16 y 17).
Resultados
77
Figura 16. Patrones de digestión con las enzimas HincII 3’ψ, HincII 5’ψ,
HindIII A, HindIII
G.
Figura 17. Patrones de digestión con las enzimas AvaII y HinfI .
HincII 3’
+ +
+ -
+ -
+ -
+ +
+ -
M
914pb
479pb
435pb
HincII 5’
HindIII A
M -/-
HindIIIG
+/- +/+ +/- M
323pb
235pb
98 pb
308 pb
794 pb
AvaII
HinfI
+ / - Patron +/+ +/- M
328 pb
227 pb
101 pb
-/- P +/+ +/- M
336 pb 301 pb 213 pb 123 pb
Resultados
78
1.3. Distribución geográfica de los haplotipos identificados.
La distribución geográfica de los haplotipos se realizó de acuerdo a las
siguientes regiones:
A- Región Metropolitana de Panamá y Colón.
B- Provincias Centrales (Herrera, Los Santos, Veraguas, Coclé).
C- Provincias del Este del país (Darién).
Resulta que en la región Metropolitana de Panamá y Colón predomina el
haplotipo Bantú (53,80% de los cromosomas), le siguen Benín (31,64%), y Senegal
(9,50%).
Del mismo modo, el haplotipo predominante en las Provincias Centrales es
Bantú (42,5%). Además hay una importante presencia del alelo Benin (25%) y otros
haplotipos atipicos. En la muestra analizada tenemos presente sólo un paciente de la
provincia del Este de Panamá y es diagnosticado como Senegal (ver tabla 12, figura
18).
Tabla 12: Distribución geográfica de los haplotipos diagnosticados en Panamá.
Haplotipo Región
Metropolitana
n, (%)
Provincias
Centrales
n, (%)
Provincia de
Este
n, (%)
Bantú 85 (53,80%) 17 (42,5%) 0
Benin 50 (31,64%) 10 (25%) 0
Senegal 15 (9,50%) 0 2 (100%)
Camerún 4 (2,53%) 4 (10%) 0
Árabe-Hindú 2 (1,26%) 0 0
Otros 2 (1,26%) 9 (22,5%) 0
Total de
haplotipos
158 40 2
n- número de cromosomas estudiados
Resultados
79
53 % Bantú31 % Benin9 % Senegal
42 % Bantú25 % Benín
10 % Camerún
Senegal
Figura 18. Los haplotipos del cluster globínico beta determinados en las tres
Regiones de Panamá.
2. CORRELACIÓN DE LOS HAPLOTIPOS DE ANEMIA FALCIFORME
IDENTIFICADOS EN PACIENTES ATENDIDOS EN EL HOSPITAL
DEL NIÑO DE PANAMÁ CON EL FENOTIPO CLÍNICO DE LA
ENFERMEDAD (LEVE, MODERADO Y SEVERO) Y LOS DATOS
HEMATOLÓGICOS.
En primer lugar definimos los criterios utilizados para asignar el fenotipo clínico y
dividir a los pacientes en los siguientes tres grupos:
I- fenotipo leve, sólo presenta la crisis vasooclusiva (CVO) y con una baja
frecuencia.
II- fenotipo moderado, tiene la crisis vasooclusiva frecuente, más otro tipo de
manifestación clínica, como dactilitis, neumonía, secuestro esplénico.
III- fenotipo severo, presenta enfermedad cerebro vascular, accidente cerebro
vascular o daño al órgano, además de las CVO.
Resultados
80
2.1. Análisis del fenotipo clínico de acuerdo a los haplotipos del cluster
globínico beta.
Como puede observarse en la tabla 13, todos los pacientes con el haplotipo
Senegal presentan un cuadro clínico leve. En cambio, el 54,55% de niños con el
haplotipo BEN/BEN y el 33,32% de CAR/CAR tienen el fenotipo moderado y severo.
El haplotipo Camerún se encuentra en segundo lugar en cantidad de pacientes con el
fenotipo leve (75,00%), y sólo un paciente diagnosticado como Árabe-Hindú tiene la
clínica favorable. El haplotipo heterocigoto CAR/SEN también presenta clínica
bastante favorable (80,00% es con fenotipo leve y el 20,00% es moderado).
Tabla 13. Distribución de los haplotipos diagnosticados de acuerdo al fenotipo clínico
Feno-
tipo
clínico
Haplotipos diagnosticados
n (%) Bantu
(CAR/
CAR)
n=39
Benin
(BEN/
BEN)
n=22
Senegal
(SEN/
SEN)
n=6
Came-
rún
(CAM/
CAM)
n=4
Árab-
Hindu
n=1
Bantu/
Benin
(CAR/
BEN)
n=15
Bantu/
Senegal
(CAR/SEN
n=5
Otros
n=8
Leve 26/39
(66,67
%)
10/22
(45,45 %)
6/6
(100 %)
3/4
(75 %)
1/1
(100
%)
10/15
(66,67 %)
4/5
(80 %)
5/8
(62,50
%)
Mode-
rado
6/39
(15,38
%)
10/22
(45,45 %)
0/6
1/4
(25 %)
0/1 3/15
(20 %)
1/5
(20 %)
3/8
(37,50
%)
Severo 7/39
(17,94
%)
2/22
(9,10 %)
0/6 0/3 0/1 2/15
(13,33 %)
0/5 0/8
n = número de casos
Resultados
81
2.2. Valores hematológicos de acuerdo a los haplotipos determinados.
Los datos hematológicos de acuerdo a los diferentes haplotipos se presentan en
la Tabla 14. Se muestra una diferencia estadística significativa de los valores de HbF
entre los haplotipos homocigotos Bantú y Senegal en su estado homocigoto (P 0,01).
El recuento de reticulocitos de los haplotipos Bantú y Benin tiene tendencia al
incremento, además, el haplotipo Bantú presenta recuento reticulocitario
significativamente más alto en comparación con el haplotipo Camerún (P 0,05). El
resto de los valores hematológicos no difieren significativamente.
2.3. Análisis de los valores hematológicos de acuerdo a las manifestaciones
clínicas de los pacientes con anemia falciforme.
Cuando los pacientes fueron clasificados de acuerdo a su fenotipo clínico,
hallamos que altos niveles de HbF se comparten entre los pacientes con el fenotipo
leve, mientras que los niveles más bajos de HbF se mantienen en los pacientes
portadores de un fenotipo severo (Tabla 15).
Resultados
82
Tabla 14. Valores hematológicos de acuerdo a los haplotipos encontrados.
Valores de
hematología
Haplotipos Grupo
Pacientes
Valores
de refe-
rencia
Bantú
(CAR/CAR)
(n=39)
Benín
(BEN/BEN)
(n=22)
Senegal
(SEN/SEN)
(n=6)
Camerún
/Camerún
(n=4)
Árabe-
Hindú
(n=1)
Bantú/Benin
(CAR/BEN)
(n=15)
Bantú/Senegal
(CAR/SEN)
(n=5)
Hb total g/dl 7.43 ± 0.25 7.41 ± 0.40 8.04 ± 0.34
7.79 ± 0.32 7.74 7.83 ± 0.26 7.99 ± 0.34 8.32 ± 0.14 12,5-
16,5
Hb fetal 10.65 ± 3.02
15.63 ± 2.39
28.62 ± 5.18
11.02 ± 3.08 23.2 16.04 ± 5.82 8.88 ± 1.85 15.39 ± 1.21 <2
Hematocrito
%
24.47 ± 064
25.24 ± 1.08 25.98 ± 1.05 27.00 ± 1.05 19.2 23.24 ± 1.05 25.04 ± 0.38 25.02 ± 0.42 35- 43
VCM (fl) 91.78 ± 1.79
89.06 ± 2.08 98.78 ± 3.81
94.33 ± 6.17 74 93.15 ± 2.61 100.64 ± 5.04 91.06 ± 1.11 84- 96
CHCM
(g/dL)
34.00 ± 0.18
33.55 ± 0.38 32.23 ± 0.97 34.70 ± 0.02 33 33.63 ± 0.08 33.75 ± 0.64 33.62 ± 0.16 32- 36
Reticulocitos
(%)
12.31 ± 1.23 11.62 ± 0.82 10.1 ± 1.78 6.63 ± 1.74 8 11.16 ± 1.59 13.75 ± 1.78 11.16 ± 0.54 0,5- 1,8
Los datos se expresan como media ± error medio estándar. Ver las abreviaturas en la Tabla 9.
P < 0.01 vs. Bantú
P < 0.05 vs. Bantú.
Resultados
83
3. VALORACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN EL GRUPO DE
ENFERMOS Y EL GRUPO CONTROL.
Realizamos determinaciones de los biomarcadores seleccionados en el grupo
control y en las muestras de los niños con anemia falciforme. En la tabla 16 se presentan
los valores estadísticos de los siete biomarcadores del estrés oxidativo de las muestras
analizadas. Los niveles plasmáticos significativamente elevados de LPO (P < 0,001) y
NOx (P < 0,05), en el grupo de los enfermos en comparación con los del grupo control,
reflejan un daño oxidativo a nivel celular. El estado redox intracelular se estudió
mediante el sistema de glutatión y la actividad de la enzima SOD. El ratio GSSG/GSH,
considerado como un biomarcador del daño oxidativo intracelular, se encuentra
significativamente elevado en los pacientes falcémicos (P < 0,001), básicamente, debido
al incremento de los niveles de GSSG. Las actividades de las enzimas del ciclo de
glutatión, GPx y GRd, también son alteradas, de modo que la actividad de GPx está
elevada y la de GRd está disminuida (P < 0,001). La actividad de la SOD está
significativamente reducida en el grupo de los enfermos (P < 0,05).
Tabla 15. Valores hematológicos de acuerdo al fenotipo clínico de la enfermedad
Fenotipo clínico
Leve Moderado Severo
Hb (g/dL) 8,33 ± 0,16 8,12 ± 0,27 8,60 ± 0,59
HbF (%) 18,48 ± 2,68*** 12,73 ± 2,53* 5,85 ± 1,40
Hematocrito (%) 24,92 ± 0,40 24,45 ± 0,88 25,54 ± 1,42
VCM (fl) 90,43 ± 1,42 90,35 ± 1,89 98,07 ± 4,22
CHCM (g/dL) 33,55 ± 0,27 33,58 ± 0,24 33,80 ± 0,15
Reticulocitos (%) 11,40 ± 0,76 11,81 ± 0,87 9,32 ± 0,45
Los datos de expresan como media ± error medio estándar. Las abreviaciones ver en la
Tabla 9.
*P < 0.05 y ***P < 0.001 vs. fenotipo severo.
Resultados
84
Tabla 16. Resultados de los biomarcadores de estrés oxidativo en los niños sanos
versus los niños enfermos.
Biomarcador Valores en los
niños sanos
Valores en los
niños con anemia
falciforme LPO,
nmol/ml 5,40 ± 0,30 7,84 ± 0,36 ***
NOx,
nmol/ml 30,00 ± 2,47 36,10 ± 1,81*
GSSG,
mol/g prot. total 0,38 ± 0,02 0,63 ± 0,02 ***
GSH,
mol/g prot. total 2,54 ± 0,15 3,08 ± 0,08 **
GSSG/GSH
0,12 ± 0,01 0,21 ± 0,01 ***
GRd,
mol/min/g prot. total 1,28 ± 0,09 0,76 ± 0,07 ***
GPx,
mol/min/g prot. total 15,15 ± 1,06 37,93 ± 1,33 ***
SOD,
U/mg prot. total 817,45 ± 69,47 676,59 ± 34,58
*
*P < 0,05; **P < 0,01, y ***P < 0,001 vs. grupo control.
Resultados
85
Fig.19. LPO (MDA + 4-HDA) en plasma de
niños sanos y niños con anemia falciforme. ***
P < 0,001 versus control.
Fig.20. Niveles de nitritos en el grupo de
niños sanos y niños con anemia
falciforme. *P < 0,05 versus control.
Fig.21. Niveles de GSSG en el grupo de
niños sanos y niños con anemia falciforme. ***
P < 0,001 versus control.
Fig.22. Niveles de GSH en el grupo de
niños sanos y niños con anemia falciforme. **
P < 0,01 versus control.
Resultados
86
Fig.23. Ratio de GSSG/GSH en el grupo de
niños sanos y niños con anemia falciforme. ***
P < 0,001 versus control.
Fig.25. Actividad de GPx en el grupo de
niños sanos y el grupo de falcémicos.
***
P < 0,001 versus control.
Fig.26. Actividad de GRd en el grupo de
niños sanos y el grupo de falcémicos. ***
P < 0,001 versus control.
Fig.24. Actividad de SOD en el grupo de
niños sanos y el grupo de falcémicos.
*P < 0,05 versus control.
Resultados
87
Tomando en cuenta que la edad media de los pacientes con anemia falciforme
es significativamente distinta a la edad media del grupo control, nosotros analizamos
el estado del estrés oxidativo en los pacientes divididos entre los dos subgrupos: niños
menores de 6 años y niños mayores de 6 años. Las diferencias estadísticas entre los
dos grupos no han sido encontradas (Ver Tabla 17).
Table 17. Biomarcadores del estrés oxidativo en los pacientes divididos en dos grupos
según la edad.
Edad < 6 años
(n = 39) Edad 6 años
(n = 61)
LPO, nmol/ml 7.67 ± 0.54 7.95 ± 0.49
NOx, nmol/ml 32.0 ± 2.47 34.10 ± 1.81
GSSG, mol/g proteína 0.59 ± 0.02 0.63 ± 0.02
GSH, mol/g proteína 3.28 ± 0.36 3.01 ± 0.09
GSSG/GSH 0.17 ± 0.01 0.20 ± 0.01
GRd, mol/min/g proteína 0.87 ± 0.14 0.67 ± 0.07
GPx, mol/min/g proteína 36.81 ± 2.04 38.72 ± 1.81
SOD, U/mg proteína 798.75 ± 72.23 691.08 ± 48.75
Resultados
88
4. CORRELACIONES DEL ESTRÉS OXIDATIVO CON LOS
HAPLOTIPOS DEL CLUSTER GLOBÍNICO BETA,
MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y LOS NIVELES DE HbF
EXPRESADOS EN LOS PACIENTES PANAMEÑOS CON ANEMIA
FALCIFORME.
4.1. Resultados del estrés oxidativo de acuerdo a los grupos haplotípicos.
Con el objetivo análisar una posible relación entre distintos haplotipos
determinados y los biomarcadores del estrés oxidativo, hemos dividido a todos los
pacientes en tres grupos haplotípicos, de acuerdo a Inati y colb. (Inati, 2003). Esta
división está basada en que las enzimas cortan ciertos sitios de ADN de manera no
aleatorina, como es el caso de la enzima HincII que corta un sitio específico en el gen
5'ψ solo para los haplotipos Senegal y Árabe-hindú. Otro sitio importante es el 3'ψ
que se corta (+) con la enzima HincII en el caso de Benín y no se pude cortar (-) en el
caso de Bantú.
El mecanismo de producción de estas asociaciones no aleatorias dentro de
ciertas regiones de ADN puede explicarse por la selección de ADN en condiciones de la
presión ejercida y/o por diferentes frecuencias de recombinación dentro de estas
regiones (Antonarakis y colbs., 1985).
La división utilizada es la siguiente:
Grupo I: los pacientes asociados al haplotipo Benín en su estado homocigoto.
Grupo II: los pacientes que tienen por lo menos un cromosoma Bantú.
Grupo III: incluye pacientes Árabe/hindú y los Sen/n, donde n - es cualquier otro
haplotipo, excepto Bantú.
La tabla 18 presenta los valores de biomarcadores de estrés oxidativo en los
grupos haplotípicos. Se observa que el grupo III, donde están incluidos la mayoría de
los pacientes con la clínica leve, tiene actividades de la GRd (P < 0,01) y de la SOD
(P < 0,05) más altas que el grupo I. La actividad GRd del grupo II es
significativamente más alta en comparación con el grupo I (P < 0,05). Además, hay
diferencias significativas en los valores de la actividad de la SOD entre los grupos II y
III (P < 0,05). La actividad de la SOD del grupo III es más alta. Con relación a los
Resultados
89
niveles de LPO observamos una tendencia al incremento en el grupo I, donde se
encuentra a mayoría de los pacientes con la clínica desfavorable.
Tabla 18. Los biomarcadores del estrés oxidativo de acuerdo a los grupos haplotípicos.
GRUPO I GRUPO II GRUPO III Pacientes
LPO, nmol/ml
9,03 ± 0,84 7,54 ± 0,44 7,67 ± 1,53 7,84 ± 0,36
NOx, nmol/ml
38,05 ± 3,15 35,54 ± 2,63
32,97 ± 3,14 36,10 ± 1,81
GSSG, mol/g
proteína
0,61± 0,01 0,67 ± 0,02 0,61 ± 0,02 0,63 ± 0,02
GSH, mol/g
proteína
3,06 ± 0,22 3,06 ± 0,11 3,26 ± 0,28 3,08 ± 0,08
GSSG/GSH
0,20 ± 0,01 0,22 ± 0,01 0,19 ± 0,01 0,21 ± 0,01
GRd, mol/min/g
proteína
0,54 ± 0,08 0,81 ± 0,11 * 0,93 ± 0,17 ** 0,74 ± 0,06
GPx, mol/min/g
proteína
37,47 ± 2,30 37,68 ± 1,96 42,67 ± 5,38 37,93 ± 1,33
SOD, U/mg
proteína
670,85 ± 64,01 620,03 ± 44,50 831,55 ± 106,52
*
676,59 ± 34,58
Grupo I: los pacientes con haplotipo BEN/BEN; Grupo II: los pacientes CAR/n, donde n
es cualquier otro haplotipo; Grupo III: incluye paciente Árabe/Hindú y los Sen/n, donde
n - es cualquier otro haplotipo, excepto Bantú.
*P <0.05 vs. Grupo I, **P < 0.01 vs. Grupo I, P < 0.05 vs. Grupo II.
Resultados
90
4.2. La relación entre los biomarcadores del estrés oxidativo y el fenotipo
clínico de la anemia falciforme en la población panameña.
La relación entre el estado del estrés oxidativo y las características fenotípicas
de la enfermedad se presenta en la Tabla 19. Los niveles de LPO son
significativamente mayores en el grupo de los pacientes con manifestación clínica
severa en comparación con aquellos que presentan manifestaciones clínicas leves y
frente al promedio de todos los enfermos (P < 0,05, figura 27). Además, el grupo con
la clínica severa tiene las actividades de la GRd (P < 0,01) y de la SOD (P < 0,05)
más bajas (figuras 28 y 29).
Tabla 19. Biomarcadores de estrés oxidativo de acuerdo al fenotipo clínico.
Leve Moderado Severo Enfermos
LPO, nmol/ml 7,56 ± 0,45 8,03 ± 0,65 10,31 ± 1,41* 7,89 ± 0,36
NOx, nmol/ml 33,22 ± 2,05 35,27 ± 2,29 38,16 ± 9,79 36,10 ± 1,81
GSSG, mol/g
protein
0,62 ± 0,03 0,61 ± 0,06 0,67 ± 0,03 0,65 ± 0,02
GSH, mol/g
protein
3,06 ± 0,09 3,05 ± 0,14 3,62 ± 0,41 3,12 ± 0,08
GSSG/GSH 0,21 ± 0,01 0,22 ± 0,01 0,18 ± 0,01 0,21 ± 0,01
GRd,
mol/min/g
protein
0,79 ± 0,09 0,78 ± 0,12 0,48 ± 0,02** 0,76 ± 0,07
GPx,
mol/min/g
protein
38,36 ± 1,58 35,02 ± 2,01 43,21 ± 9,11 37,93 ± 1,35
SOD, U/mg
protein
758,45 ± 54,08 759,37 ± 64,06 468,03 ± 65,62* § 676,59 ±34,58
*P < 0,05 y **P < 0,01 vs. fenotipo leve., §P<0,05 vs. fenotipo moderado y
P < 0,05 vs.
grupo enfermos.
Resultados
91
Fig.27. Niveles de lipoperoxidación encontrados en
diferentes fenotipos clínicos (leve, moderado,
severo). *P < 0,05 versus cuadro leve. P < 0,05 vs.
Pacientes.
Fig. 29. Actividades de la GRd encontradas en
diferentes fenotipos clínicos (leve, moderado,
severo). **P < 0,05 versus cuadro leve.
Fig. 28. Actividades de SOD encontradas en
diferentes fenotipos clínicos (leve, moderado,
severo). P<0,05 vs. fenotipo leve,
§P<0,05 vs.
fenotipo moderado y P < 0,05 vs. grupo
enfermos.
Resultados
92
4.3. La relación entre los biomarcadores del estrés oxidativo y la expresión de
HbF en los pacientes falcémicos de Panamá.
Al comparar los valores hematológicos entre diferentes haplotipos del cluster
globinico beta y entre los fenotipos clínicos de la enfermedad, nos damos cuenta que la
característica común, estadísticamente significativa, es el valor de HbF. Suponiendo,
que su expresión puede estar relacionada con la gravedad de la enfermedad y/o los
niveles del estrés oxidativo, tomamos la decisión de comparar los siete biomarcadores
del estrés oxidativo entre los tres grupos de pacientes (Grupo A: pacientes que tienen
niveles de HbF menores a 5%; Grupo B: HbF entre 5 y 15 %; y Grupo C: HbF mayor a
15%) (Inati y colbs., 2003). Los niveles altos de HbF se asocian con niveles de LPO
más bajos (P < 0,05, vs. Grupo A, ver tabla 20). Además, se observa que a medida que
aumentan los valores de HbF, se tiene tendencia al incremento de NOx y de la actividad
de GRd.
Tabla 20. Biomarcadores del estrés oxidative de acuerdo a los niveles de HbF.
HbF < 5 5 < HbF < 15 HbF 15
LPO, nmol/ml 11,22 ± 0,72 9,51 ± 0,68 7,91 ± 1,06*
NOx, nmol/ml 37,92 ± 2,01 39,25 ± 3,39 42,57 ± 5,57
GSSG, mol/g protein 0,64 ± 0,05 0,55 ± 0,03 0,56 ± 0,04
GSH, mol/g protein 3,28 ± 0,14 3,28 ± 0,09 3,30 ± 0,15
GSSG/GSH 0,19 ± 0,01 0,17 ± 0,01 0,17 ± 0,01
GRd, mol/min/g protein 0,64 ± 0,12 0,71 ± 0,09 0,81 ± 0,11
GPx, mol/min/g protein 38,36 ± 1,58 35,02 ± 2,01 43,21 ± 9,11
SOD, U/mg protein 877,38 ± 140,25 686,53 ± 72,89 821,71 ± 91,84
*P < 0,05 vs. grupo con HbF < 5.
93
94
-Discusión de los resultados-
95
Discusión de los resultados
96
1. HAPLOTIPOS DEL CLUSTER GLOBÍNICO BETA.
1.1. Datos generales de los pacientes y del grupo control.
Para la realización de este estudio en una población pediátrica de Panamá, se
logra obtener 100 muestras de sangre de los niños diagnosticados de anemia de células
falciforme, que representa alrededor de 40% del total de la población atendida por el
Hospital del Niño de Panamá. Entre los 100 pacientes, existe una representación de
ambos sexos (52 niños y 48 niñas) y su edad promedio es de 7,77 ± 0,42 años. Para
obtener valores de referencia de una población pediátrica del mismo país, se cuenta con
las 40 muestras de sangre de los niños sanos, de ambos sexos (23 niños y 17 niñas) y la
edad promedio 11,27 ± 0,82 años.
Los estudios en niños falcémicos muestran que los valores de hemoglobina
pueden variar alrededor de 8,09 ± 4,03 g/dl (Fernández-García y González, 2006). En
nuestro estudio el valor promedio de la Hb en el grupo de los enfermos es de 8,31 ±
0,14 g/dL y está dentro del rango correspondiente a esta patología hematológica. Este
valor es significativamente menor (P < 0,0001) que el promedio de la Hb del grupo
control. Una acelerada destrucción de los glóbulos rojos afectados también explica los
valores bajos de hematocrito y altos del % de recuento reticulocitario.
1.2. Haplotipos del cluster globínico beta.
De las cien muestras diagnosticadas con la técnica de RFLP, se encontró
que el 75% de los pacientes son homocigotos y los 25% son heterocigotos para los sitios
de restricción analizados, siendo haplotipo Bantú/Bantú el predominante (39%), le
siguen haplotipo Benín/Benín (22%), Senegal/Senegal (6%), Camerún/Camerún (4%) y
un paciente con haplotipo Árabe-Hindú/Árabe-Hindú. En el grupo heterocigoto (ver
resultados en la tabla 12), también predominan alelos Bantú y Benín. Con estos
resultados se confirma el origen afro-antillano de la mutación de las células falciformes
en Panamá.
La enfermedad de anemia falciforme oscila entre el 8% y el 16% en la
población panameña (Schroeder et al., 1990; OMS, 2006). Sin embargo, no hay
Discusión de los resultados
97
suficientes datos actualizados y publicados sobre la prevalencia de la enfermedad de
células falciformes en la República de Panamá. Sólo recientemente, y gracias a la
aprobación de la ley tamizaje neonatal en el 2007, se va a poder realizar un diagnóstico
masivo y determinar la prevalencia de la anemia de células falciformes en el país. El
porcentaje de haplotipos atípicos en los pacientes panameños es de 5,5% y es similar al
señalado previamente en otras poblaciones (Zago, 2001). Estos resultados sugieren que
el cluster clobínico β es dinámico y que los haplotipos son producidos por diversos
mecanismos genéticos, incluyendo la recombinación.
La República de Panamá es un país que se caracteriza por un alto porcentaje de
mezclas entre distintas razas. La migración africana está relacionada con dos momentos
históricos: la traída de los esclavos africanos a partir del siglo XVI destinado a las
plantaciones de la costa tropical del Pacífico sudamericano, y la actividad relacionada
con la construcción del Canal de Panamá a finales del siglo XIX, inicio del siglo XX.
La cantidad exacta de los inmigrantes es difícil de estimar debido a la falta de
registros escritos pero, por ejemplo, en la segunda mitad del siglo XVIII, se estima que
los esclavos en el Istmo de Panamá formaban el 7% de la población (Conte-Porras and
Castillero, 1998). La situación de la llegada de los esclavos permaneció hasta el año
1821, cuando se prohibió la esclavitud (la ley de libertad de vientres). Pero la presencia
de la población de origen africano permaneció en el país. Además, el mismo año
comienzan a llegar los contingentes de antillanos, jornaleros libres para la construcción
del ferrocarril de Panamá. Ellos constituyen el antecedente de llegadas más importante
que se producen durante la construcción del Canal de Panamá, sobre todo desde el 1881
hasta el 1889 y entre 1904 y 1914.
En el período francés de la construcción del Canal de Panamá (1881-1889) la
población se duplicó debido a la llegada de los trabajadores del continente africano.
Durante el período norteamericano de la construcción del Canal de Panamá (1904-
1914), de los 60.000 trabajadores extranjeros traídos a propósito, aproximadamente un
tercio eran blancos y dos tercios, negros. Llegaron los migrantes de Cartagena,
Venezuela, Cuba, Barbados y Santa Lucía. Algunos africanos llegan de Senegal. Europa
representa alrededor de 26,3% de trabajadores, de los cuales más de 80% eran españoles
y el resto, italianos.
El impacto de las obras del canal en la formación de la población de Panamá,
sobre todo en el siglo XX, es considerable. Así, en 1911, uno de cada cuatro habitantes
Discusión de los resultados
98
del Istmo, incluyendo la Zona del Canal, es extranjero. En la Región Metropolitana, más
de la mitad de la población ha nacido en el exterior, de la cuál una proporción
importante en las Antillas y es de origen afroamericano.
La presencia afro-antillana en Panamá se confirma con los hallazgos de
haplotipos, que en su gran mayoría son de origen africano (Bantú, Benín, Senegal).
Siendo el Hospital del Niño un centro de referencia en atención a la población pediátrica
de la mayor parte del país, podemos hacer una estimación importante de la distribución
geográfica de los haplotipos encontrados. Para esto hemos observado que en la
población estudiada existe una representación de las tres regiones: Región
Metropolitana (provincias de Panamá y Colón y la Zona del Canal de Panamá), las
Provincias Centrales (Herrera, Los Santos, Veraguas, Coclé), y sólo un paciente de
Darién (provincia del Este del país).
No observamos muchas diferencias en las prevalencias de haplotipos más
comunes (Bantú y Benín) entre la Región Metropolitana y las Provincias Centrales. La
presencia de muchas mezclas entre las personas de distintos orígenes, permite estimar
una alta presencia de haplotipos en su estado heterocigoto. La llegada de los
trabajadores de Senegal para la construcción del Canal de Panamá, estima su
relativamente alta presencia (9,5%) en la Ciudad de Panamá, donde actualmente se
dedican al comercio en distintas áreas de la economía panameña. Además, la presencia
de haplotipo de origen árabe-hindú, se puede explicar por la presencia de los
inmigrantes árabes en la ciudad.
Los estudios de anemia falciforme en América del Norte y del Sur, y en el área
de Caribe, demuestran, en su mayoría, la prevalencia de los haplotipos de origen
africano, y mayoritariamente, de Benín (Currat M, y colbs, 2002). En algunos países la
prevalencia de haplotipos depende de la región, por ejemplo, en el estado Sucre de
Venezuela predomina haplotipo Benín (Salazar y colbs., 2006), pero en el resto del país
el más frecuente es Bantú (32,2%) (Arends, y colbs, 2007). En Brasil predomina el
haplotipo Bantú (Zago y colbs, 1992), al igual que en la Costa Chica de México
(Magaña, 2005).
En este estudio nosotros encontramos que el haplotipo Bantú es el más
frecuente en Panamá. Una situación similar se ha presentado en otros países, tales como
Costa Noreste de Venezuela, Brasil y el norte de la Región Costa Chica de México
(Vívenes de Lugo et al., 2003; Lemos Cardoso Farías y Guerreiro, 2006; Magaña et al.,
Discusión de los resultados
99
2002). En los Estados Unidos, Trinidad y Jamaica, el haplotipo predominante es Benin,
y es el resultado del tráfico de africanos a estas regiones durante el comercio británico
de esclavos del Atlántico (Wainscoat et al., 1983; Schroeder et al., 1989; Jones-
Lecointe et al., 2008) (Tabla 21).
Si comparamos las prevalencias de los haplotipos encontrados en Panamá
con los países vecinos, podemos darnos cuenta que, por ejemplo, en la Costa Atlántica
de Costa Rica el haplotipo más frecuente es Benín (73.3%) (Rodríguez Romero et al.,
1998). En Colombia predomina haplotipo Bantú (55.5%), le siguen Benín (34.8%) y
Senegal (4.3%) (Cuéllar-Ambrosi F, y colbs., 2000). Nuestro estudio confirma la
prevalencia de Bantú y Benín en la población panameña y una cercanía en los
porcentajes de los mismos con los encontrados en Colombia, lo que sugiere un origen
común de las poblaciones de Panamá y Colombia.
Tabla 21. Distribución de los βs haplotipos en algunos países americanos
s
haplotipos
Costa
Noreste de
Venezuelaa
Cubab
Brazil
Nortec
Mexico
(Costa
Chica)d
Costa
Ricae
Colombiaf
Trinidadg
Panamah
Benin 36.0 51.0 21.8 18.2 73.3 34.8 61.8 30.0
Bantu 50.0 41.0 66.0 78.8 6.7 55.5 17.3 51.0
Senegal 2.0 8.0 10.9 0.0 20 4.3 8.5 8.5 aVívenes de Lugo y colbs., 2003
bMuniz y colbs., 1995
cLemos Cardoso y Farias Guerreiro, 2006
dMagaña y colbs., 2002
eRodríquez Romero y colbs., 1998
fCuéllar-Ambrosi y colbs., 2000
gJones-Lecointe y colbs., 2008
hDatos del presente estudio.
Discusión de los resultados
100
2. CORRELACIÓN DE LOS HAPLOTIPOS DE ANEMIA FALCIFORME
IDENTIFICADOS EN PACIENTES PEDIÁTRICOS PANAMEÑOS CON
EL FENOTIPO CLÍNICO DE LA ENFERMEDAD (LEVE, MODERADO Y
SEVERO) Y LOS DATOS HEMATOLÓGICOS.
Hemos realizado correlaciones de los haplotipos con los tres niveles de
gravedad de la enfermedad de células falciforme, de acuerdo a los criterios descritos
en el apartado de los resultados. En el grupo con fenotipo leve encontramos un 100%
presencia de los pacientes con haplotipo Senegal siguiéndoles los haplotipos Camerún
(75%), Bantú (66,67%) y Benín (45,45%). El único paciente con haplotipo Árabe-
hindú, tiene un cuadro clínico leve. Si sumamos los pacientes con los fenotipos severo
y moderado, el total es liderado por el haplotipo Benín, le siguen Bantú y Camerún. El
mayor porcentaje del fenotipo severo (17.94%) es representado por CAR/CAR.
Estos datos en parte concuerdan con los publicados en la literatura, donde el
fenotipo más severo se le otorga a Bantú, le siguen Benín, Senegal y Camerún. En
nuestro estudio parece ser que el haplotipo Benín es el que tiene un mayor número de
pacientes con la clínica moderada y severa. Pero hay que tener en cuenta que es un
estudio de la población pediátrica, donde por un lado, pueden existir casos de niños
que aún no han llegado a la edad en la que se revelan las complicaciones clínicas de la
enfermedad. Por otro lado, casi todos los informes científicos anteriores se han hecho
con las poblaciones de adultos enfermos.
Los estudios de Kulosik y colbs. (1987), Nagel y colbs. (1991), y Steinberg y
colbs. (1995) demuestran que diferentes haplotipos del cluster globínico βs influyen en
la severidad clínica y los valores hematológicos de la enfermedad. En nuestro estudio
encontramos las diferencias significativas de HbF y del % de reticulocitos.
Hemos realizado análisis estadístico de los datos hematológicos tomados en
cuenta para este estudio: Hb, HbF, hematocrito, VCM, CHCM, % de reticulocitos. El
primer paso al valorar la analítica de un niño con sospecha de anemia es comparar sus
niveles de Hb y Hcto con las cifras normales correspondientes para su edad y sexo
(Tabla 22). Otro aspecto importante es valorar los índices eritrocitarios. El volumen
corpuscular medio (VCM) se calcula como: Hematocrito (%) x10/núm. eritrocitos
(mln/mm3), este índice valora el tamaño del hematíe y permite clasificar la anemia en
microcítica, normocítica o macrocítica. La anemia falciforme por lo regular se
Discusión de los resultados
101
encuentra en el grupo de anemias normociticas, lo cuál se confirma en este estudio
(VCM = 91,06 ± 1,11).
La concentración de la hemoglobina corpuscular media (CHCM) se calcula
como Hbx100/Hematocrito y valora en contenido de Hb en los eritrocitos. Este valor
también se encuentra dentro del rango de referencia (ver Tabla 14).
Tabla 22: Valores normales de Hb, Hcto, VCM (Fernández-García y González,
2006).
Edad Hb (g/dl), media Hematocrito
(g/dl), media VCM (m
3)
Recién nacido 16,5 51 108
6 meses- 2 años 12,5 35 96
2-4 años 12,5 38 79
5-7 años 13,0 39 81
8-11 años 13,5 40 83
12-14 años
Mujer
Varón
13,5
14,0
41
43
85
84
Un hallazgo importante del estudio es que el haplotipo CAR/CAR tiene valores
de HbF significativamente menores que el haplotipo SEN/SEN (P < 0,01), ver tabla
14. Estos resultados corresponden a los de la mayoría de las publicaciones (Powars,
1991b; Lu y Steinberg, 1996). Nagel et al. (Nagel et al., 1991) que demuestran que la
presencia de un solo cromosoma con el haplotipo Senegal, en comparación con otras
combinaciones de haplotipos africanos, se asocia con un mayor nivel de HbF y un
menor daño a los órganos.
Nuestros resultados nos llevan a pensar que el haplotipo Bantú, siendo en
nuestro caso el haplotipo con una clínica desfavorecida, se caracteriza por un menor
valor de HbF, en comparación con el haplotipo Senegal. Estos datos corresponden con
la mayoría de los presentes en la literatura. Por ejemplo, Steinberg y colaboradores
informan que en los estudios hechos en la población adulta e independientemente del
sexo, los individuos con haplotipo Senegal homocigoto o en combinación BEN/SEN,
Discusión de los resultados
102
tienen niveles de HbF significativamente mayores que el resto de los grupos
(Steinberg y colbs., 1995). En nuestro estudio no contamos con los pacientes
BEN/SEN, pero una mayor producción de la HbF se ha observado no solamente en
haplotipo Senegal, sino también en el paciente con haplotipo Árabe-hindú (23,2%). Se
ha identificado una asociación entre la presencia del alelo Senegal y el polimorfismo -
158(CT) en el promotor del gen G (Lu y Steinberg, 1996). A su vez, la HbF inhibe
la polimerización de la HbS y está relacionada con las manifestaciones clínicas más
suaves (Marotta y colbs., 1977).
El recuento de reticulocitos nos evalúa la producción eritrocitaria:
Reticulocitos (%) = [Número de Reticulocitos / Número de Glóbulos Rojos] x 100.
El recuento de reticulocitos es un reflejo de la actividad reciente de la médula
ósea e indirectamente de la hemólisis. Si la médula responde adecuadamente al
incremento de la demanda de los hematíes, ésta permite una liberación temprana de
los glóbulos rojos inmaduros (reticulocitos) y se observa un aumento en su recuento.
Si un paciente sufre hemorragias, el número de reticulocitos aumentará unos días
después para compensar la pérdida de los hematíes. Si un paciente sufre hemorragias
crónicas, el número de reticulocitos quedará aumentado de forma permanente, ya que
la médula está tratando de mantener la demanda constante de glóbulos rojos.
Se ha observado que los pacientes drepanocíticos con un cuadro clínico más
leve, muestran un aumento de supervivencia de células con HbF debido a una
disminución de la concentración de Hb corpuscular media (CHCM) y a un menor
grado de hemólisis, con el consiguiente incremento de las concentraciones de Hb
y del hematócrito y con un menor % de los reticulocitos (Adekile, 1994). En nuestro
estudio se observó un elevado recuento de reticulocitos en el caso de los pacientes con
haplotipos Benín y Bantú, siendo inclusive que Bantú tiene estos valores
significativamente mayores que Camerún en su estado homocigoto (P < 0,05).
Algunos autores relacionan altos niveles de reticulocitos con una elevada tasa de
hemólisis. Nuestros datos sugieren que los niños con haplotipos Bantú y Benín en su
estado homocigoto son más propensos a los fallos hemolíticos y una elevada
destrucción de los glóbulos rojos en comparación con los pacientes Camerún en su
estado homocigoto.
Discusión de los resultados
103
3. VALORACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN EL GRUPO DE
ENFERMOS Y EL GRUPO CONTROL.
Varios estudios evidencian la participación del estrés oxidativo en la
fisiopatología de la anemia falciforme (Hebbel y colbs, 1982; Lachant y colbs., 1983;
Ren y colbs., 2008). Una excesiva producción de anión superóxido, peróxido de
hidrógeno y radical hidroxilo, junto con una menor actividad de las enzimas
antioxidantes, conlleva a la producción del daño oxidativo. En este trabajo hemos
evaluado el estado del estrés oxidativo en los pacientes a través de las mediciones de
siete biomarcadores en el plasma (LPO, NOx) y en los eritrocitos (GSSG, GSH,
GRd, GPx, SOD). Encontramos que la LPO media del grupo de los pacientes
presenta un 45% de incremento en comparación con el grupo control (ver figura 19).
Estos resultados reflejan que los pacientes con anemia falciforme tienen una
sobreproducción de los radicales libres de oxigeno (Lachant y colbs., 1983; Hebbel y
colbs., 1990), que dañan la membrana celular y contribuyen a la hemólisis.
Los eritrocitos poseen un sistema enzimático muy específico capaz de
neutralizar los radicales libres. La primera línea de antioxidantes enzimáticos es la
Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD), que cataliza dismutación del anión superóxido
(O2•-) a peróxido (H2O2), con su posterior conversión en H2O por medio de la
catalasa y GPx. En el presente estudio se ha encontrado que los enfermos tienen
actividad de la SOD significativamente más baja en comparación con el grupo
control (P < 0,05). Es posible que esta disminución sea secundaria a la inactivación
de la enzima por los radicales libres (Ren y colbs., 2008).
Para evaluar el estado del sistema antioxidante del organismo, hemos realizado
una evaluación completa del sistema de glutation: GSH, GSSG, GRd y GPx. En este
trabajo resulta que los niños con anemia falciforme presentan la actividad de la GRd
más baja (P<0,001, figura 26) y de GPx mas alta (P < 0,001, figura 25), con un valor
del cociente GSSG/GSH más alto (P < 0,001, figura 23), en comparación con el
grupo control.
Los niveles de GSH pueden variar dependiendo de varios factores, tales como
disponibilidad de sustrato para la síntesis endógena de GSH, el reciclaje de GSSG
por medio de la GRd o un aumento en el consumo de GSH en condiciones del estrés
Discusión de los resultados
104
oxidativo. La mayoría de los estudios de GSH en los pacientes adultos con anemia
falciforme muestran una disminución de este biomarcador (Reid M y colbs., 2006).
Con relación a la síntesis de GSH, existen ciertas contradicciones. Por ejemplo,
Morris y colbs. (2008) indican que existe una disminución en la biodisponibilidad de
glutamina necesaria para la formación de glutamato, un sustrato para la síntesis
endógena de GSH. Por otro lado, Reid y colbs. (2006) publicaron un estudio donde
confirman que la síntesis de GSH en pacientes con anemia falciforme era un 57%
mayor que en el grupo control, lo que puede indicar que bajos niveles de GSH se
deben no a la disminución de la síntesis, sino al aumento de consumo de GSH. Por
otro lado, la síntesis endógena puede estar condicionada por los niveles de cisteína,
un aminoácido requerido para la formación endógena de GSH (Reid y colbs., 2006).
El GSH es el cofactor fundamental de la glutation peroxidasa. Constituye
además el principal agente reductor de los eritrocitos y su síntesis requiere de dos
reacciones:
1. Ácido glutámico + cisteína γ-glutamil-cisteína
2. γ-glutamil-cisteína + glicina GSH
La primera reacción está catalizada por la γ-glutamil-cisteína sintetasa y la
segunda por la glutation sintetasa. El proceso que evita la oxidación de la Hb requiere
la oxidación del glutation reducido (GSH) a glutation oxidado (GSSG) por la enzima
glutation peroxidasa. Para ello, es necesario un sistema que mantenga un suministro
continuo de GSH. Este sistema está representado por la glutation reductasa, que
cataliza la reducción de GSSG a GSH, con la participación del NADPH, producido en
la vía de las pentosas fosfato por medio de la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
(Peñuela, 2005). A pesar, que al principio se pensaba que los pacientes drepanocíticos
tienen bajos niveles de la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, un amplio estudio de
pacientes con HbSS y grupo control (HbAA) en Congo, ha demostrado que no existe
ninguna relación biológica entre la mutación de la deficiencia de glucosa-6 fosfato
deshidrogenasa y la mutación HbS (Bouanga y colbs., 1998).
Estos datos parecen indicar que en la población pediátrica con anemia falciforme
existe una elevación en los niveles de GSH debido a que se incrementa su síntesis
endógena. Pero en condiciones del estrés oxidativo elevado se afecta la actividad de la
enzima GRd y su actividad baja significativamente. Esta deficiencia en la actividad de
Discusión de los resultados
105
GRd, encontrada en nuestros resultados, confirma algunos estudios previos (Lachant y
colbs, 1983).
El GSH juega un papel importante en la protección contra el estrés oxidativo:
elimina los radicales libres y regenera antioxidantes como GPx, glutation transferasa,
y vitaminas C y E (Masella y colbs. 2005). Pero para poder evaluar mejor el daño
oxidativo de un organismo, se usa el cociente GSSG/GSH que a su vez es un indicador
importante del estado redox intracelular y sus oscilaciones determinan el
funcionamiento celular. En condiciones fisiológicas el estado redox se mantiene
dentro de un rango permisible, algo similar al sistema biológico de regulación del pH.
El ratio GSSG/GSH actúa como un potente amortiguador frente al daño oxidativo
(Dröge, 2002). Bajo un elevado estrés oxidativo, aumentan los niveles de GSSG, que a
su vez se relaciona con el aumento de los puentes de disulfuro en las proteínas que
contienen el grupo thiol. Si estos cambios se producen en proteínas funcionales, tales
como los receptores, enzimas, o factores de transcripción, se altera no solo su
estructura sino también el funcionamiento. Por tal motivo podemos estimar que el
GSSG actúa como una molécula de señalización no específica.
Una de las enzimas antioxidantes que se activa en condiciones del estrés
oxidativo elevado es la glutation peroxidasa (Elosua A y colbs., 2005). En este estudio
se observa un incremento de la actividad de GPx en más de dos veces, comparando
con los niños sanos (figura 25), confirmando otros estudios previos (Aslan y colbs.,
2001; Manfredini y colbs., 2008).
Nuestros resultados sugieren que una alta producción de los radicales libres
acompañada por una disminución de la actividad de la GRd y un aumento de la
actividad de GPx en los niños con anemia falciforme, conllevan al aumento del
cociente GSSG/GSH, cambiando el estado redox en los eritrocitos (Droge y colbs.,
1994).
Podemos concluir que los pacientes pediátricos con anemia falciforme tienen
una elevada producción de ROS, con una disminución de la actividad antioxidante de
las enzimas SOD y GRd. El incremento del cociente GSSG/GSH activa la enzima GPx
y finalmente, se produce daño a las biomoléculas, incluyendo un aumento de la LPO
(Hebbel y colbs., 1982; Misra y Fridovich, 1972, ver figura 30).
Discusión de los resultados
106
Fig. 30. Eventos dentro del eritrocito SS.
No sólo el estrés oxidativo es responsable del daño a las macromoléculas. En
nuestro estudio, el grupo de pacientes de anemia falciforme presenta elevados niveles
de NOx en comparación con el grupo control (P < 0,05, figura 20). Estos datos
suponen un aumento del la producción de RNS y por tanto, de estrés nitrosativo, que
confirman algunos datos previos (Díaz-Da-Motta y colbs, 1996).
La biodisponibilidad del NO se mantiene a través el balance entre su
producción por las isoenzimas iNOS y eNOS, y su consumo. Este balance se
encuentra interrumpido en el caso de la enfermedad de células falciformes (Wood y
Discusión de los resultados
107
Granger, 2007). Los niveles de NOx son una medida indirecta de la actividad de la
NOS. En condiciones del estrés oxidativo elevado y hemólisis estos niveles aumentan
por distintas razones (figura 40). Por un lado, la hemoglobina liberada al plasma se
oxida espontáneamente consumiendo NO y de esta forma contribuye a la disminución
de su biodisponibilidad (Reiter y colbs., 2002) (ver figura 40).
Fig. 40. Producción de los NOx en situación de la hemolisis en anemia falciforme y
aumento en el consumo de NO•. Las enzimas eNOS desacoplada, xantin oxidasa y
NADPH oxidasa producen superóxido (O2•-), éste reacciona con NO
• formando
peroxinitritos (ONOO-). La Hb liberada durante la hemolisis consume el NO
• formando
nitratos.
Por otro lado, los radicales libres a través de la activación de la vía inflamatoria
del NF-kB inducen la expresión de la iNOS, responsable del aumento de los niveles de
NO y la producción de RNS (Aslan y colbs., 2003; Schulz y colbs., 2004). El O2
•-
reacciona con NO• formando peroxinitritos (ONOO
-), altamente pro-oxidantes, que
pueden inactivar proteínas por nitrosilación, y pueden descomponerse en radical
hidroxilo que a su vez origina daño al ADN y LPO (Carr et al., 2000):
NO• + O2•- → ONOO
-
Los estudios en los modelos animales con isquemia/reperfusión cardíaca, hepática
y renal demostraron un incremento en la expresión de la iNOS y una elevación de los
niveles de NO2- (Lee y colbs., 2001). Se ha visto que el aumento de NOx, derivado de
Discusión de los resultados
108
la inducción de la iNOS en neutrofilos, junto a una disminución en la formación de
GSH, da lugar a la formación de peroxinitritos citotóxicos (Aslan y Canatan, 2008). En
humanos, niveles elevados de ROS contribuyen a que el NO reaccione con O2
-
produciendo peroxinitritos que, al reaccionar con lípidos, producen lípidos nitrogenados
(LNO2, L(O)NO2). Como consecuencia de ello, se deteriora el funcionamiento vascular
e incrementa el daño inflamatorio de las paredes de vasos sanguíneos. Igualmente,
varios estudios demuestran que los defectos en la producción de NO se asocian con
varias enfermedades cardiovasculares, incluyendo ateroesclerosis, hipertensión,
diabetes, obesidad, hiperlipidemias, y SCD (Simionescu y Simionesci, 1986). La
biodisponibilidad de NO y su efecto sobre la vasodilatación es difícil de evaluar sin
conocer la actividad de la eNOS.
4. CORRELACIONES DEL ESTRÉS OXIDATIVO CON LOS
HAPLOTIPOS DEL CLUSTER GLOBÍNICO BETA, MANIFESTACIONES
CLÍNICAS Y LOS NIVELES DE HbF EXPRESADOS EN LOS PACIENTES
PANAMEÑOS CON ANEMIA FALCIFORME.
El daño oxidativo ocurre en condiciones de producción elevada de ROS/RNS
y/o la disminución de la actividad de los sistemas antioxidantes endógenos y
exógenos. Las diferencias individuales en el equilibrio entre los factores prooxidantes
y antioxidantes pueden contribuir a la heterogeneidad clínica de la enfermedad.
Al agrupar a los pacientes de acuerdo al patrón de los haplotipos diagnosticados,
se ha encontrado que aquellos pacientes que tienen aunque sea un alelo Senegal y no
llevan el alelo Bantú (Grupo III), presentan las actividades de GRd y de la SOD más
elevados que los pacientes CAR/CAR (grupo I, ver Tabla 18). Es relevante subrayar
que la mayoría de los pacientes del Grupo III tienen clínica más suave. Esto puede
indicar que, en condiciones del estrés oxidativo la enzima antioxidante GRd está
produciendo una mayor cantidad de GSH, y la enzima SOD pueda que se relaciona
con una mejor protección frente al daño oxidativo.
Al realizar análisis del resto de los biomarcadores del estrés oxidativo entre
distintos grupos haplotípicos, podemos señalar que el grupo I (CAR/CAR) tiene una
Discusión de los resultados
109
tendencia a la elevación de los niveles de LPO y de NOx, en comparación con el resto
de los grupos haplotípicos.
Existen otros estudios que relacionan niveles de NOx con el estado del paciente.
López y colbs. (2003) encontraron que los adultos sanos y los adultos SCD pero en su
estado controlado, sin crisis de dolor, tienen niveles similares de NOx, mientras que
los pacientes con las crisis y dolor fuerte tienen niveles de NOx más bajos que
aquellos enfermos que tienen sensación de dolor mucho menor. Esta observación
posiblemente se explica por el hecho de que en condiciones de una menor producción
de NO•, hay un aumento de la isquemia tisular y de la sensación de dolor.
En pacientes pediátricos, Morris y colaboradores (2005) observaron que los
niños controlados tienen valores similares de arginina y NOx que los niños normales.
En cambio, cuando se presenta la crisis de dolor, los niveles de NOx y de arginina
disminuyen significativamente. Los mismos autores informaron que tras el suplemento
oral con arginina, los niveles de NOx en el plasma de pacientes aumentan. Todos estos
datos sugieren que los niveles de arginina y NOx fluctúan durante las crisis de dolor y
el estado clínico del paciente. La eliminación de NO• a su vez aumenta expresión de la
molécula vascular de adhesión celular (VCAM-1), producción de endotelina-1 y
citoquinas inflamatorias (De Caterina y colbs., 1995; Rybicki y Benjamin LJ, 1998;
Lin y colbs., 2001).
Por todo lo expuesto anteriormente, es posible pensar que puedan existir
biomarcadores de estrés oxidativo que se relacionen con las manifestaciones clínicas
en los enfermos con anemia falciforme. Al analizar los biomarcadores del estrés
oxidativo entre los tres fenotipos clínicos (leve, moderado y severo), podemos resaltar
que los pacientes con la clínica menos favorecida presentan unos niveles de LPO
significativamente más elevados, y las actividades de la GRd y SOD más bajas (P <
0,01 y P < 0,05, respectivamente), en comparación con el grupo de los pacientes que
tienen la clínica más leve.
Hay estudios que indican que los pacientes con una mayor gravedad clínica
tienen bajos niveles de actividad de la SOD. Y que la acumulación de H2O2, la
activación de NF-kB y la adhesión leucocitaria en ratones SCD, disminuyen al
tratarlos con análogo de catalasa (polinitroxyl albumina) (Sultana y colbs., 1998) y
antioxidantes probucol (Mahaseth y colbs., 2005). Estos datos refuerzan nuestros
Discusión de los resultados
110
resultados con relación a una baja actividad de la SOD en el grupo de pacientes con
clínica severa.
Teniendo en cuenta que la mayoría de los pacientes con la clínica grave tienen
haplotipo CAR/CAR o CAR/BEN, y al contrario, la mayor parte de los pacientes con
la clínica leve es de tipo SEN/n, nuestros resultados concuerdan en parte con las
evaluaciones de los biomarcadores del estrés oxidativo para los grupos haplotípicos.
Basándonos en el hecho que los niveles de HbF son significativamente
diferentes entre distintos haplotipos y entre diferentes fenotipos clínicos de la
enfermedad (ver tablas 14 y 15), nosotros estudiamos los biomarcadores del estrés
oxidativo entre los grupos de pacientes que difieren en las expresiones de HbF.
Encontramos resultados que concuerdan en parte con los hallazgos hechos en los
modelos animales. Por ejemplo, Dasgupta y colbs. (2010) hicieron estudios en los
ratones con anemia falciforme y genéticamente modificados de acuerdo a distintos
niveles de expresión de HbF. Los autores hallaron que aquellos ratones que
expresaban una mayor cantidad de HbF (mayor a 40%), presentan menores niveles de
LPO y mayores valores de GSH y de las actividades de las enzimas antioxidantes
SOD, GPx y catalasa, comparándolos con el grupo que tenía menor expresión de HbF
(menor de 1%). Nuestros resultados en parte confirman la función protectora de HbF
en la población pediátrica con anemia falciforme. En efecto, los pacientes con altos
niveles de HbF presentan menores valores de LPO; a cambio, los NOx y la actividad
de GRd tienden a elevarse (ver tabla 20) en este grupo de pacientes, confirmando en
parte la hipótesis del grupo de Kaul (Dasgupta y colbs., 2010).
El aspecto central en la fisiopatología de anemia de células falciforme es la
polimerización de la HbS y drepanocitosis intravascular, cuyas consecuencias son la
oclusión de los vasos sanguíneos, daños por isquemia-reperfusión, la hemólisis de los
hematíes, la disminución en la biodisponibilidad de NO y el estrés
oxidativo/nitrosativo (Fabry y Nagel, 1982; Hebbel y colbs., 2004; Persons y colbs.,
2003; Dasgupta y colbs., 2010). El aumento de la expresión de HbF puede estar
relacionado con los haplotípos del cluster globínico beta, y conducir a la reducción del
estrés oxidativo y aumento de la biodisponibilidad del óxido nítrico, sustancia anti-
inflamatoria y anti-oclusiva.
Al disminuir el estrés oxidativo, se reduce la hemólisis y a su vez, disminuye la
liberación de la arginasa y el consumo de la arginina, el sustrato de la NOS. Por otro
Discusión de los resultados
111
lado, la reducción de la hemólisis contribuye a que disminuya la liberación de
hemoglobina libre al espacio extracelular, lo que a su vez contribuye al estrés
oxidativo. En conjunto, estos acontecimientos conducen al incremento de la
biodisponibilidad de NO y una disminución del daño causado por el estrés oxidativo
(Morris y colbs., 2008; Dasgupta y colbs., 2010).
Los estudios en los ratones demuestran que a una mayor expresión de los genes
de la HbF, existe una inversa relación entre el estrés oxidativo medido a través de LPO
(es menor) y la biodisponibilidad del óxido nítrico medido a través de los metabolitos
NOx (es mayor). A su vez el daño a los órganos es menor en aquellos ratones que
expresan mayores cantidades de HbF. Por el contrario, elevados niveles de estrés
oxidativo hacen fallar a los sistemas antioxidantes que a su vez contribuye aun más al
proceso de hemolisis y múltiples daños orgánicos (Dasgupta y colbs., 2006).
Considerando que la generación de HbS es un evento monogénico, producto de
la expresión de los genes G y
A, el fenotipo de la anemia falciforme es multigénico
(Kutlar, 2007). Otros genes, aparte del locus globínico , participan en los eventos
patológicos que a su ves pueden mejorar o agravar las manifestaciones clínicas
(Morris y colbs., 2005). Por lo tanto, la pregunta es: ¿el nivel de estrés oxidativo
podría ser empleado para predecir el estado clínico de los pacientes? Nosotros
observamos que el grupo III de los pacientes, con alelos Senegal y Arabe-Hindú,
tienen mayores actividades de la GRd y de la SOD, lo que sugiere que los pacientes de
este grupo (todos ellos con fenotipo leve), tienen una mejor defensa antioxidante que
los demás. Por otra parte, los pacientes con manifestaciones clínicas graves tienen
valores más altos de LPO, y actividades más bajas de la GRd y de la SOD.
La participación del estrés oxidativo relacionado con hemólisis y la expresión
en la enfermedad de HbF SCD puede influir en diferentes subfenotipos clínicos. Por
ejemplo, algunos autores sugieren que altos niveles de HbF reducen la incidencia de
algunas subfenotipos de la enfermedad de células falciformes, como la osteonecrosis,
el síndrome torácico agudo y los episodios dolorosos agudos. Sin embargo, alto nivel
de HbF no se ha asociado con la protección frente a la hipertensión pulmonar, derrame
cerebral o priapismo (5). Los agentes que disminuyen la hemólisis o restablecen la
biodisponibilidad de NO pueden ser potencialmente útiles para reducir la incidencia y
severidad de la enfermedad de células falciformes.
Discusión de los resultados
112
En conclusión, los resultados de este estudio apoyan la existencia de un
importante estrés oxidativo en pacientes de anemia falciforme y sugieren que al menos
tres marcadores redox, LPO, GRd y SOD, están relacionados con la clínica de estos
apcientes. Estos datos, junto a la relación entre HbF elevada y LPO bajo, y entre HbF
elevada y elevada actividad GRd y niveles de NOx, indcian que el uso de marcadores
de estrés oxidativo/nitrosativo como éstos puede ser importante en la evaluación del
estado y evolución clínica de los pacientes. Asimismo, el uso de terapias para mejorar
su estado redox y aumentar la biodisponibilidad del óxido nítrico podrían ser
beneficioso para mejorar la función vascular y reducir la severidad de la anemia
drepanocítica.
113
114
-CONCLUSIONES-
Conclusiones
115
Conclusiones
116
1. Este estudio evalúa por primera vez los haplotipos del cluster beta en pacientes
pediátricos panameños de anemia falciforme. Como resultado, se ha encontrado
un 75% de los haplotipos homocigotos y un 25% heterocigotos. Se confirma la
presencia de las raíces afro-antillanas en el bagaje genético del país y una
cercanía en los porcentajes de los haplotipos del cluster globínico beta con los
encontrados en Colombia, lo que sugiere un origen común de las poblaciones de
Panamá y Colombia.
2. La presencia de por lo menos un alelo Senegal está relacionada con la clínica
más leve y valores de HbF significativamente más elevados en comparación con
el resto de los haplotipos hallados. El haplotipo Bantú, por el contrario, presenta
valores significativamente menores de HbF y el recuento de reticulocitos más
elevado, indicando un mayor grado de hemólisis intravascular.
3. Este estudio ha permitido obtener y publicar por primera vez los valores de
referencia de los biomarcadores de estrés oxidativo en niños panameños sanos
prebúberes.
4. Los pacientes con anemia falciforme presentan valores significativamente más
altos de los marcadores de estrés oxidativo extra e intracelulares que los niños
controles, indicando un mayor estrés oxidativo/nitrosativo en los primeros.
5. Se obtiene por primera vez una relación entre los valores de estrés oxidativo y
los distintos haplotipos de anemia falciforme identificados en Panamá. La
presencia del alelo Senegal y haplotipo Árabe-Hindú, con actividades más altas
de los enzimas antioxidantes GRd y SOD, se traduce en un fenotipo leve. Por el
contrario, los pacientes con manifestaciones clínicas graves tienen valores más
altos de LPO, y actividades más bajas de GRd y SOD.
6. El grupo de pacientes con altos niveles de HbF, que presentan una clínica más
leve, tienen menor estrés oxidtivo y una tendencia al aumento de los niveles de
NOx y de la actividad de GRd. Es decir, estos pacientes están mejor protegidos
frente al daño oxidativo.
Conclusiones
117
7. Los resultados confirman que el estrés oxidativo está relacionado con la
hemólisis y la expresión en la enfermedad de HbF, y puede influir en diferentes
subfenotipos clínicos. Por lo tanto, el uso de marcadores de estrés oxidativo,
sobre todo LPO, GRd y SOD, puede ser importante en la evaluación del estado y
evolución clínica de los pacientes pediátricos con anemia falciforme, y sugiere
que las terapias para mejorar el estado redox serán beneficiosas para mejorar la
función vascular y reducir la severidad de anemia drepanocítica.
118
119
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