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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
INSTITUTO DE SERVICIOS DE LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO
E INVESTIGACIÓN EN SALUD “S.E.L.A.D.I.S.”
“DETERMINACIÓN DE MARCADORES BIOQUÍMICAS EN CONEJOS
(Oryctolagus cuniculus) PARA ESTABLECER LA INOCUIDAD/TOXICIDAD
DE UN EXTRACTO HIDRO-ALCOHÓLICO DE Erytrhoxylum coca”
Tesis de Postgrado para obtener el Título de Especialista en Diagnóstico de Laboratorio en
Salud, Mención Bioquímica Clínica
POR: Lic. Mery Limachi Alcon
TUTOR: Dr. Roger Carvajal Saravia Ph.D.
CO-ASESORA: Dra. Magaly Solares Espinoza
LA PAZ-BOLIVIA
2020
“Dedicatoria”
A mís padres por su comprensión, apoyo y amor
incondicional que hicieron todo en la vida para que
yo pudiera lograr mis sueños, por motivarme y
darme la mano cuando sentía que el camino se
terminaba.
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 2
A. ORGÁNOS CON FUNCIÓN A SER EXPLORADA 2
A.1. EXPLORACIÓN DEL HÍGADO 2
A.1.1. Estructura, función del hígado 3
A.1.2. Función destoxificadora y excretora 4
A.1.3. Función metabólica 4
A.1.3.1. Metabolismo hidrocarbonado 5
A.1.3.2. Metabolismo lipídico 5
A.1.3.3. Metabolismo proteíco 6
A.1.4. Liberación de enzimas por el hígado lesionado 6
A.1.5. Pruebas de función hepática: Bilirrubinas, AST, ALT, FAL y γ-GT 7
A.1.5.1. Hiperbilirrubinemia 7
A.1.5.2. Patrón de citólisis 7
A.1.5.3. Patrón colestasis 8
A.1.6. Enfermedad hepática aguda 8
A.1.7. Lesión hepática inducida por medicamentos (Drug Induced Liver Injury
o DILI) 9
A.1.7.1. Mecanismos patogénicos de la hepatotoxicidad 10
A.1.7.2. Las manifestaciones clínicas y de laboratorio de DILI 11
A.1.7.3. Clasificación de gravedad en hepatotoxicidad por drogas y
sustancias extrañas 12
A.2. EXPLORACIÓN DEL RIÑÓN 13
A.2.1. Estructura y función del Riñón 14
A.2.2. Fisiología renal 15
A.2.2.1. Filtración glomerular y resorción tubular 17
A.2.2.2. Regulación de la función renal 19
A.2.3. Lesión Renal Aguda 21
A.2.3.1. Causas de Lesión Renal Aguda 23
A.2.3.2. Datos de laboratorio de la Lesión Renal Aguda 23
A.2.3.3. Daño tubular agudo o Necrosis Tubular Aguda 25
A.2.3.3.1. Diferentes mecanismos vinculan el daño tubular agudo 25
con una FG reducida, entre estos destaca 25
A.2.3.3.2. Mecanismos de la toxicidad directa sobre las
células renales 25
A.2.3.3.3. Fisiopatología de la Necrosis Tubular Aguda 27
A.3. EXPLORACIÓN DEL PÁNCREAS 27
A.3.1. Estructura bioquímica del páncreas 28
A.3.2. Fisiología del páncreas 29
A.3.3. Alteraciones del páncreas exocrino 29
A.3.3.1. Fisiopatología de la pancreatitis 31
A.3.3.2. Diagnóstico de la pancretitis 32
A.3.3.3. Exámenes de laborator io para el diagnóstico de la pancreatitis
aguda 32
A.4. AFECTACIÓN DE OTROS ÓRGANOS 33
B. LA HOJA DE COCA (Erytrhoxylum coca) 34
TABLA DE CONTENIDO
3. ANTECEDENTES GENERALES DEL PROBLEMA EN ESTUDIO 37
A. ESTUDIOS REALIZADOS EN BOLIVIA 37
B. ESTUDIO EN EL AMBITO INTERNACIONAL 39
4. PLANTEMIENTO DEL PROBLEMA 43
5. JUSTIFICACIÓN 46
6. OBJETIVOS 47
A. OBJETIVO GENERAL 47
B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 47
7. HIPÓTESIS 48
8. ESTRATEGIA DE EJECUCIÓN 48
9. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES 49
10. DISEÑO METODOLÓGICO 57
A. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN 57
A.1. Tipo de Investigación 57
A.2. Metodos generales de la investigación 57
B. DESCRIPCIÓN DEL ÁMBITO DE INVESTIGACIÓN 58
C. DETERMINACIÓN DE LA POBLACIÓN EN ESTUDIO 58
C.1. Descripción de la población 58
C.1.1. Criterios de inclusión 60
C.1.2. Criterios de exclusión 60
C.1.3. Criterios de eliminación 61
C.2. Muestra 61
D. ASPECTOS ÉTICOS 62
E. MATERIALES Y MÉTODOS 62
E.1. Diseño experimental 62
E.2. Obtención del extracto hidro-alcohólico de la hoja de coca 65
E.3. Animales experimentales 66
E.3.1. Alimento: suministro y preparación 67
E.3.2. Medición de parámetros generales 68
E.3.2.1. Test de Irwin modificado 68
E.3.2.2. Evaluación del peso de los animales 69
E.3.2.3. Medición del peso de consumo de alimento 70
E.3.2.4. Evaluación del consumo de agua 70
E.3.2.5. Evaluación de la temperatura corporal 71
E.3.3. Obtención de sangre y orgános 71
E.3.4. Procedimientos bioquímicos 72
11. PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN 102
A. Procesamiento del estadístico y análisis de los datos 102
12. RESULTADOS 103
13. DISCUSIÓN 132
14. CONCLUSIÓN 145
15. RECOMENDACIONES 147
16. BIBLIOGRAFÍA 148
ANEXOS
Tabla 1. Clasificación de gravedad del daño hepático inducido por drogas 13
Tabla 2. Componentes de la nefrona 14
Tabla 3. Categoría RIFLE 22
Tabla 4. Clasificación KDIGO de la LRA 22
Tabla 5. Indices diagnósticos urinarios 26
Tabla 6. Causas de Pancreatitis aguda 30
Tabla 7. Alcaloides naturales de Erythroxylum coca var. Coca 36
Tabla 8. Dosificación de los alcaloides naturales de Erythroxylum coca var.
coca de Bolivia 38
Tabla 9.Contenido del EHAEc en mg., en cada dosis administrada para un volumen
de 250 ml para cada jaula 64
Tabla 10. Temperatura rectal de conejos sometidos a la acción del EHAEc y de conejos
control 103
Tabla 11 . Se muestra la comparación en promedio y ± DS de la ingestión de
alimentos durante los 36 días de experimentación de los conejos. 106
Tabla 12 y 13. Condensación de los resultados de las observaciones propias del
Sistema Nervioso Central, ojos, orejas y piel: efectos generales, efectos
específicos 108,109
Tabla 14. Se muestra promedio y ±DS del consumo del líquido diario durante
36 días 109
Tabla 15. Se muestra promedio y ±DS del consumo de EHAEc en mg/día, de los
grupos mínimo, medio y máximo durante los 36 días de experimentación 112
Tabla 16. Valor de Riesgo individual para estimar posibles daños hepáticos en
animales que recibieron EHAEc en diferentes dosis 119
Tabla 17. Se muestra promedio ± 1DS del recuento diferencial de los
leucocitos 132
ÍNDICE DE TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Se observa el consumo del extracto hidro-alcohólico ad libitium. ............................ 65
Figura 2 y Figura 3. Se observa a los conejos consumiendo alimento balanceado. ................. 68
Figura 4. Se observa el manejo del animal para la evaluación del test de Irwin modificado.... 69
Figura 5. Se observa el pesaje de los conejos Nueva Zelanda blanco. ...................................... 70
Figura 6. Se observa la medición de la temperatura rectal de los conejos ................................ 71
Figura 7. Se muestra la temperatura rectal de conejos sometidos a la acción del EHAEc y de
conejos control, a lo largo de 36 días ....................................................................................... 104
Figura 8. Ingesta de alimentos durante los 36 días de experimentación. ................................ 105
Figura 9. Se muestra la evolución del peso de los cuatro grupos de animales. ....................... 107
Figura 10. Consumo de líquido durante los 36 días de experimentación, cada punto consigna
el promedio de consumo de una jaula. ..................................................................................... 110
Figura 11. Se muestra el consumo de EHAEc en miligramos en los diferentes grupos ......... .111
Figura 12. Niveles de Fosfatasa alcalina en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se
aprecian los promedios ± 1DS. ................................................................................................. 114
Figura 13. Niveles de GOT en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS. ..................................................................................................................... 115
Figura 14. Niveles de GPT en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS de cada grupo............................................................................................... 115
Figura 15. Niveles de γ-GT (promedios ± 1DS.) en plasma de conejos tratados con
EHAEc. ..................................................................................................................................... 116
Figura 16. Niveles de bilirrubina directa en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se
aprecian los promedios ± 1DS.. ................................................................................................ 117
Figura 17. Niveles de bilirrubina total en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian
los promedios ± 1DS.. .............................................................................................................. 117
Figura 18. Se aprecian los promedios ± 1DS de proteínas totales en plasma de conejos
tratados con EHAEc... ............................................................................................................... 118
Figura 19. Niveles de albúmina en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS.... .................................................................................................................. 118
Figura 20. Niveles de colesterol en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS..... ................................................................................................................. 120
Figura 21. Niveles de triglicéridos en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS...... ................................................................................................................ 121
Figura 22. Niveles de HDL-Colesterol en plasma en conejos tratados con EHAEc. Se aprecian
los promedios ± 1DS....... ......................................................................................................... 121
Figura 23. Niveles de urea en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 122
Figura 24. Niveles de creatinina en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 123
Figura 25. Niveles de ácido úrico en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 123
Figura 26. Niveles de potasio en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 124
Figura 27. Niveles de sodio en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 125
Figura 28. Niveles de cloro en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 125
Figura 29. Niveles de calcio en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 126
Figura 30. Niveles de fosforo en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 127
Figura 31. Niveles de magnesio en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 127
Figura 32. Niveles de glicemia en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 128
Figura 33. Niveles de α-amilasa en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 129
Figura 34. Niveles de glóbulos rojos en conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 130
Figura 35. Niveles de hematocrito en conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los promedios
± 1DS........ ................................................................................................................................ 130
Figura 36. Niveles de glóbulos blancos en conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS........ .............................................................................................................. 131
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Exámenes diagnósticos iniciales en el abordaje de DILI
Anexo 2: Causas de colestasis
Anexo 3: Aprobación por los fondos IDH 2013-2014, para el proyecto RES.C.T.A. 88/2017;
RES.H.C.F. Nº 179/17 “Investigación Pre-clínica de la toxicidad/inocuidad de E. coca:
estudios in vitro e in vivo en modelos experimentales animales”, Instituto SELADIS-UMSA
Anexo 4: Material y equipo para la Bioterio, para la eutanasia, reactivo y material para
pruebas bioquímicas, equipos, reactivos y materiales para hemograma completo
Anexo 5: Procedimientos para el estudio físico-químico de las hojas de coca.
Anexo 6. Estandarización del preparado del extracto de Erythroxylum coca
Anexo 7. Test de Irwin modificado
Anexo 8. Parámetros histopatológicos
Anexo 9. Control de calidad interno. Valores para determinados componentes bioquímicos en
la sangre de conejos normales
Anexo 10. Valores normales para determinados componentes bioquímicos en la sangre de
conejos
GLOSARIO
Ácido biliar.- Son moléculas anfipáticas con un esqueleto esteroidal que son
producidas por las células del hígado a partir del colesterol.
Aflatoxinas.- Son un tipo de toxinas producidas por ciertos hongos en cultivos agrícolas
como el maíz, el maní o cacahuates, la semilla de algodón y los frutos secos (de cáscara
dura como las nueces).
Amiloidosis.- Es una enfermedad poco frecuente que se produce cuando una sustancia
llamada «amiloide» se acumula en los órganos.
Alcaloide.- Sustancia nitrogenada que se encuentra en ciertos vegetales y constituye un
estimulante natural; puede ser venenosa y algunas se emplean en terapéutica médica.
Biomarcador o marcador biológico.- Es aquella sustancia utilizada como indicador de
un estado biológico. Debe poder medirse objetivamente y ser evaluado como un
indicador de un proceso biológico normal, estado patogénico o de respuesta a un
tratamiento farmacológico.
Células de Ito.- También llamadas células estrelladas hepáticas, o adipocitos hepáticos,
se encuentran en el espacio perisinusoidal de Disse.
Citocromo P450 (abreviado CYP en inglés, o CIP en español, o
simplemente P450).- Es una enorme y diversa superfamilia
dehemoproteínas encontradas en bacterias, archaea y eucariotas.1 Las proteínas del
citocromo P450 usan un amplio rango de
compuestos exógenos y endógenos como sustratos de sus reacciones enzimáticas. Por lo
general forman parte de cadenas de transferencia de electrones con multicomponentes,
denominadas sistemas contenedoras de P450. La reacción más común catalizada por el
citocromo P450 es una reacción monooxigenasa, es decir, la inserción de
un átomo de oxígeno proveniente deoxígeno molecular (O2) en un sustrato orgánico
(RH) a la vez que el otro átomo de oxígeno es reducido a agua:
RH + O2 + 2H+ + 2e
– → ROH + H2O
Conducto biliar.- Tubo por el cual la bilis transita por el hígado y sale de este.
También se llama vía biliar.
Estrés oxidativo.- Es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas
del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de decodificar rápidamente los reactivos
intermedios o reparar el daño resultante. Todas las formas de vida mantienen un entorno
reductor dentro de sus células.
Fitofármaco.- on Son medicamentos cuyos ingredientes activos se producen
exclusivamente a partir de plantas, o de partes de plantas. Su uso se ajusta a los
principios de una medicina amparada por la investigación de las ciencias naturales.
Hepatitis tóxica.- La hepatitis tóxica es una inflamación del hígado como reacción a
determinadas sustancias a las que estuviste expuesto. La hepatitis tóxica puede ser
provocada por el alcohol, las sustancias químicas, los medicamentos o los suplementos
nutricionales.
Hígado graso.- Es una condición en la que el tejido normal del hígado es reemplazado
por más de un 5-6 por ciento de grasa.
Insuficiencia hepática fulminante.- Es una entidad aguda, catastrófica y de alta
mortalidad, que resulta de un daño hepático grave, asociado generalmente a una
necrosis hepática masiva.
Insuficiencia suprarrenal (IS).- Es una enfermedad poco frecuente pero con riesgo
vital si no se trata. Puede ser por fallo primario de las glándulas suprarrenales (IS
primaria) o por mal funcionamiento del eje hipotalámico-hipófiso-adrenal (HPA) (IS
secundaria).
Microsomas hepáticos.- Son orgánulos parenquimatosos de este órgano, que catalizan
transformaciones metabólicas en su mayor parte, por enzimas del retículo
endoplasmático.
Necroptosis.- Es una forma de muerte celular programada, ya que está regulada
genéticamente.
Lipogenésis.- Es la reacción bioquímica por la cual son sintetizados los ácidos grasos
de cadena larga esterificados (unidos con el glicerol) para formar triglicéridos o grasas
de reserva.
Lipoproteína anormal LpX.- Es una lipoproteína anormal que se encuentra en
pacientes con enfermedad obstructiva biliar y desaparecen circulación cuando se trata la
colestasis que la ha originado.
Ofidios.- Las serpientes son un suborden de saurópsidos (reptiles) diápsidos
pertenecientes al orden Squamata, del superorden Lepidosauria, caracterizado por la
ausencia de patas (la pitón mantiene diminutas extremidades vestigiales, herencia de su
pasado evolutivo) y el cuerpo muy alargado.
Peroxidación lipídica o lipoperoxidación.- Hace referencia a la
degradación oxidativa de los lípidos. Es el proceso a través del cual los radicales
libres capturan electrones de los lípidos en las membranas celulares. Este proceso es
iniciado por un mecanismo de reacción en cadena de un radical libre. En la mayoría de
los casos afecta los ácidos grasos poliinsaturados, debido a que contienen múltiples
dobles enlaces entre los cuales se encuentran los grupos metileno (-CH2-) que
poseen hidrógenos particularmente reactivos. Al igual que cualquier reacción con
radicales, esta se modela en tres pasos fundamentales: iniciación, propagación y
terminación.
Pirógenos endógenos.- son polipéptidos elaborados por distintas células del huésped.
Formados localmente o en todo el organismo penetran a la circulación y producen fiebre
actuando sobre el centro termorregulador del hipotálamo
Radical libre.- Es un átomo o molécula que contiene un electrón desapareado en orbital
exterior. Los más importantes son los derivados del oxígeno que se producen
normalmente dentro de las células por diversas reacciones metabólicas.
Reacción de oxidación- reducción.- Modificación química en las que se elimina
electrones de un átomo, ión o molécula (oxidación) mediante la transferencia simultanea
de estos electrones (reducción) a otro átomo, ión o molécula. En la reacción también
pueden transferirse átomos electronegativos (P. ej., oxígeno) o átomos de
electronegatividad de una molécula a otra.
Reactivo biológico.- Es un animal estandarizado, lo que significa que tiene una
composición genético-sanitaria definida, son criados y mantenidos en ambientes
controlados que cumplen con los requerimientos específicos para cada especie, los
cuales garantizan, además el bienestar animal.
Síndrome congénito de Crigler-Najjar.- Es un trastorno hereditario del metabolismo
de la bilirrubina caracterizado por una hiperbilirrubinema no conjugada debido a un
déficit hepático de la actividad de la bilirrubina glucuronosiltransferasa
Síndrome congénito de Dubin-Johnson y rotor.- Causan hiperbilirrubinemia
conjugada sin colestasis, por lo cual no generan síntomas ni secuelas además de la
ictericia.
Síndrome nefrótico.- El síndrome nefrótico es un trastorno renal que hace que el
cuerpo excrete demasiadas proteínas en la orina.
Sulfas.- Son sustancias químicas derivadas de las sulfonamidas; no fueron obtenidas de
los cultivos de hongos, sino originadas en el mundo inerte del laboratorio.
Ureagénesis.- Es el proceso de síntesis y excreción de la urea, que tiene gran
importancia, ya que su funcionamiento no depende de las variaciones en el equilibrio
ácido-básico, que impone limitaciones a la excreción renal del amoníaco en forma de
sales de amoníaco.
Xantelasma.- Xantoma plano que afecta a los párpados.
Xenobiótico.- Un compuesto químico extraño a un sistema biológico determinado. En
el caso de los animales y seres humanos., los xenobióticos incluyen los fármacos y sus
metabolitos y algunos compuestos ambientales, como los contaminantes que no se
producen en el organismo.
RESUMEN
Los antecedentes de uso de la hoja de coca y las perspectivas de utilización de esta especie en
el campo industrial (infusiones, caramelos y bebidas estimulantes), o médico (fitofármacos de
diferente presentación), determinan la necesidad de investigar y demostrar las ventajas de su uso
y sus aplicaciones desde al ámbito científico. Sin embargo, con el propósito de cumplir con
protocolos internacionales para la investigación clínica y el aprovechamiento de las plantas
medicinales, es indispensable establecer previamente si este producto es seguro en su
administración para consumo humano. En este orden, antes de realizar estudios que confirmen
científicamente los beneficios reportados por la medicina tradicional de la región andina, es
necesario realizar estudios preclínicos de inocuidad/toxicidad que determinen dicha seguridad.
Para lograr lo anterior, en este trabajo se ha evaluado el efecto de la administración de un
extracto hidro-alcohólico de hoja de coca, producida sin pesticidas, en conejos (Oryctolagus
cuniculus) en un ensayo de tipo subagudo.
En animales a los que se administró diferentes dosis del extracto por vía oral (disuelto en agua
saborizada con alfalfa licuada) a lo largo de 36 días, se exploraron cambios en el
comportamiento y se determinaron por técnicas convencionales los niveles de biomarcadores
bioquímicos. Ell perfil hepático incluyó: la fosfatasa alcalina, la aspartato aminotransferasa
(GOT), la alanino aminotransferasa (GPT), la γ-glutamil transferasa (GGT), las bilirrubinas, las
proteínas totales, la albúmina; el perfil renal: la creatinina, la urea, el ácido úrico; el perfil
pancreático: la α-amilasa, la glicemia y los electrolitos: el ion cloro (Cl-), el ion potasio (K
+), el
ion sodio (Na+), el calcio total, el fósforo y el magnesio, el perfil hematológico: recuento de
glóbulos rojos y glóbulos blancos, recuento diferencial de los glóbulos blancos, el hematocrito y
la hemoglobina.
En cuanto al comportamiento, según el test de Irwin modificado, así como en el incremento de
peso, consumo de agua y alimentos no se encontraron alteraciones en conejos que recibieron las
diferentes dosis, en relación al grupo control.
En la medición de los marcadores bioquímicos, se pudo establecer que a las dosis equivalentes a
la del consumo habitual humano y a dosis 10 veces mayores no se produjo un efecto deletéreo
detectable en ninguno de los marcadores examinados. A las dosis mayores (el equivalente a 30
veces el consumo habitual humano) se encontró un incremento significativo en algunos
biomarcadores hepáticos: se incrementa significativamente la GPT y se aprecia gran variabilidad
de la GOT así como de la GGT, en niveles compatibles con ligera colestasis. Los valores
hematimétricos no se alteraron a las dosis equivalentes al consumo humano, a excepción de un
incremento significativo del número de leucocitos totales en los conejos que recibieron la dosis
máxima; asimismo, se observó un incremento de monocitos y reducción de polimorfonucleares
en las dosis altas (sin ser estos últimos significativos estadísticamente).
Se puede concluir que, en conejos a los que se administró HEAEc (extracto hidro-alcohólico
de Erytrhoxylum coca) solo se observaron cambios en los que recibieron las dosis más altas
(equivalente a 30 veces la dosis recomendada por la medicina tradicional): un incremento en el
monto de leucocitos en sangre, leves cambios en marcadores bioquímicos hepáticos compatibles
con colestasis. Estos datos sob compatibles con estudios histopatológicos que se realizaron
paralelamente en el laboratorio.
Se aclara que estos resultados no son necesariamente extrapolables a lo que puede ocurrir en el
humano. Por lo demás, estos resultados fueron obtenidos con hojas de coca diferentes a las que
normalmente existen en el mercado, puesto que estaban exentas de pesticidas y otros aditivos
químicos.
Palabras clave: extracto hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca, conejos (Oryctolagus
cuniculus), estudio pre-clínico.
SUMMARY
The background in the use of coca leaf and the perspective use of this specie in the industrial
field (infusions, candies and stimulant drinks), or medical (phytopharmaceuticals of different
presentation), determine the need of research and prove the advantage of its use and applications
from the scientific field. However, with the purpose of comply with international protocols for
the explotation of medicinal plants; it’s indispensable to previously establish if the product is
safe for the administration or human consumption. In this order, before performing studies that
scientifically confirm the reported benefits by the traditional medicine from de Andean region,
safety/toxicity studies are necessary to determine its security. To achieve this purpose, in this
work, it has been evaluated the effect of the administration of a coca leaf produced without
pesticides, hydro-alcoholic extract, in rabbits (Oryctolagus cuniculus), in a subacute type test.
In animals to which different doses of the extract were administered orally (dissolved in
flavored water with liquefied alfalfa) over 36 days, behavior changes were explored and
biochemical biomarker levels were determined by conventional methods (liver profile: alkaline
phosphatase, aspartate aminotransferase (GOT), alanino aminotransferase (GPT), γ-glutamyl
transferase (GGT), bilirubins, total proteins, albumin; kidney profile: creatinine, urea, uric acid;
pancreatic profile: α-amylase, glycemia, and electrolytes: chlorine ion (Cl-), potassium ion (K
+),
sodium ion (Na+), total calcium, phosphorus and magnesium), hematological (red blood cell and
white blood cell count, differential white blood cell count, hematocrit and hemoglobin) and
histophatological (histological sections of the liver, kidney, spleen and cecum). Regarding the
behavior according to the modified Irwin test, as well as in weight gain, no alterations were
found in rabbits that received the different doses, in relation to the control group.
In the measurement of biochemical markers, it could be established that at doses equivalent to
that of habitual human consumption and at 10 times higher doses, there was no marked
deleterious effect on any of the markers examined. At higher doses (the equivalent of 30 times
the usual human consumption) a significant increase was found
in some liver biomarkers: significantly increases the GPT and great variability of the GOT as
well as the GGT, at levels compatible with mild cholestasis, which is not corroborated in the
histopathological images. At doses equivalent to human consumption, hematometric values were
not altered, except for a significant increase in the white blood cells count
in rabbits that received the maximum dose; likewise, an increase in monocytes was observed and
reduction of segmented in high doses (without being statistically significant). In
histopathological studies, in general, similar images were observed in all the organs,
with very slight increases of altered images in kidney, cecum and spleen at the highest doses.
It can be concluded that, in rabbits given HEAEc (Erytrhoxylum coca hydro-alcoholic extrac)
changes were only seen in those who received the highest doses (equivalent to 30 times the dose
recommended by traditional medicine): an increase in the number of leukocytes in the blood,
slight changes in liver biochemical markers compatible with cholestasis,
and the presence of congestive sinusoids in liver histopathological images.
But nevertheless, it should be clarified that these results
are not necessarily extrapolated to what can happen in humans. Otherwise, these results were
obtained with different coca leaf from those that normally exist in the market
since it was free of pesticides and other chemical additives.
Key words: hydro-alcoholic extract of Erytrhoxylum coca, rabbits (Oryctolagus cuniculus),
preclinical study.
1
1. INTRODUCCIÓN
Cada órgano, para su funcionamiento, incluye decenas o centenas de moléculas inorgánicas,
orgánicas y biomoléculas que interactúan entre sí. Muchos de estos componentes pueden ser
identificados y cuantificados por diferentes técnicas bioquímicas y son llamados biomarcadores
porque están presentes en cantidades relativamente estables en un sujeto normal. Estos
marcadores bioquímicos pueden estar en los tejidos o, liberarse activamente en los humores que
generan o, también, instalarse en tejidos o humores diferentes, para tener un impacto biológico
en otro lugar del organismo. También pueden ser producto del daño de un tejido el cual los libera
pasivamente hacia diversos humores (Arango, 2012).
En medicina clínica se utilizan estos marcadores biológicos como indicadores de cambios en
el funcionamiento de un órgano, ya sea como efecto de una patología o de daño producido por
un agente externo. En este último caso, estos marcadores son de elevada importancia para el
estudio del efecto de agentes externos del organismo que al ser introducidos pudieran causar
daño y/o afectación. Este aspecto ha sido ampliamente utilizado para el estudio de fármacos,
tanto para el estudio experimental, como para la determinación de efectos tóxicos durante su
consumo terapéutico (Vargas, 2015). Es un clásico ejemplo la determinación de transaminasas si
se sospecha de daño hepático por el uso de diversos agentes terapéuticos durante el monitoreo de
estos. El estudio de estos marcadores también es de alta utilidad en la determinación de la
inocuidad y toxicidad de fármacos ya sea de origen natural o de origen químico.
En Bolivia se utiliza una gran cantidad de productos naturales con efectos terapéuticos
reconocidos, por ejemplo: la hoja de coca (Erythroxylum coca), el tomillo (Thymus vulgaris), la
chachacoma (Senecio eriophyton), la chancapiedra (Phyllanthus niruri), el guaco (Mikania
laevigata ssp.), el anis (Pimpinella Anisum) y otros. Sin embargo, no se han explorado los
posibles efectos tóxicos de todos, para establecer su seguridad durante su administración. Para
lograr esta determinación de inocuidad/toxicidad se realizan estudios de seguridad preclínica o
seguridad clínica a través de la indagación de posibles cambios en marcadores bioquímicos
producidos en animales de experimentación o en personas a las que se administran un producto
2
determinado, en diferentes dosis. Cualquier cambio en los niveles de estos marcadores mostrará
el grado de afectación en un órgano, lo cual podrá ser interpretado solo si se conoce la dinámica
de aparición de dicho marcador en el tejido estudiado; para esto, será imprescindible conocer el
funcionamiento del órgano a nivel molecular y bioquímico.
En este trabajo se realizó el estudio de la seguridad preclínica de Erytroxylum coca en la
perspectiva tanto de conocer las posibles afectaciones de los órganos en los animales que se
administra este producto natural, como de establecer la base teórica de la dinámica de generación
y aparición de estos marcadores bioquímicos. Para esto se estudiaron marcadores relacionados
con: perfil hepático, renal, lipídico, pancreático, los electrolitos y algunos de los principales
marcadores hematológicos, en las condiciones experimentales a las que se sometieron a los
animales trabajados en el estudio.
2. MARCO TEÓRICO
La exploración de los efectos de este producto en el organismo, en este caso de animales
experimentales, requiere conocer suficientemente las funciones de estos órganos y los eventos
que caracterizan sus fallas en el funcionamiento y que puede ser detectado por marcadores
biológicos específicos.
A. ÓRGANOS CUYA FUNCIÓN FUE EXPLORADA
A.1. EXPLORACIÓN DEL HÍGADO
Es ampliamente conocido el hecho de que el hígado es uno de los órganos que más
frecuentemente se ven afectados por la presencia de factores tóxicos en el organismo. De hecho,
las mayores patologías hepáticas son generalmente producto de la presencia crónica o aguda de
productos externos al organismo (Larrey, 2011). El alcohol que produce cirrosis, el tetracloruro
de carbono que produce necrosis celular, diferentes fármacos consumidos por largos periodos
pueden conducir a la cirrosis o a la insuficiencia hepática (Salinas y González, 2004). Otros
agentes frecuentemente involucrados son los virus y los trastornos autoinmunes (Thomas et al.,
3
2016). En el presente trabajo se explora si un producto natural de amplio uso local puede
constituirse en un factor de afectación de este importante órgano. Por tal motivo los siguientes
subtítulos se refieren a la función del hígado en condiciones normales y condiciones de
afectación, orientando la detección de estas últimas a través de ciertos marcadores bioquímicos.
A.1.1. Estructura y función del hígado
El hígado está constituido por lobulillos con forma de prismas poliédricos limitados por tejido
conjuntivo, vasos y conductos biliares. Cada prisma tiene como eje central una vénula hepática
terminal y, periféricamente, en los vértices, se disponen los conductos biliares y las ramas de la
arteria hepática y de la vena porta, que constituye la tríada portal (Gonzáles, 2014). Los
principales tipos celulares son los hepatocitos, responsables de las funciones metabólicas, y las
células de Kupffer, que forman el mayor sistema fagocítico fijo del organismo, tapizan la pared
de los conductos venosos del sistema porta. Además, forman parte del parénquima las células
endoteliales y las células de Ito (Porth, 2006).
El flujo de sangre en los lobulillos hepáticos es centrípeto, de forma que la sangre más
oxigenada de la arteria hepática y los nutrientes absorbidos por la vena porta circulan hacia la
vénula situada en el centro del lobulillo. Gracias a esto, existe un gradiente de oxigenación y de
concentración de hormonas y de metabolitos tóxicos, como el amonio. Así, la zona peri-portal
está más oxigenada que la zona peri-venosa. Los hepatocitos que rodean la arteria hepática
tienen un metabolismo más oxidativo, con muchas mitocondrias y más enzimas relacionadas con
la gluconeogénesis, la eliminación de radicales libres y la ureagénesis. Esta zona, por tanto, es
rica en aminotransferasas (GOT y GPT), enzimas del ciclo de la urea, lactato-deshidrogenasa
(LDH) y γ-glutamiltransferasa (γ-GT). La zona perivenosa está, en cambio, menos oxigenada y
sus hepatocitos tienen mucho retículo endoplásmico liso y abundantes enzimas relacionadas con
la glucólisis, la lipogénesis o la biotransformación de xenobióticos, pues se trata de una zona rica
en enzimas como la glutamina-sintetasa o la glutamato-deshidrogenasa (McPhee y Ganong,
2007) (Gonzáles, 2014).
4
A.1.2. Función detoxificadora y excretora
La detoxificación, tanto de productos endógenos como de exógenos, ocurre cuando estos
pasan de la sangre a los hepatocitos en los sinusoides hepáticos. Para ello, estos compuestos se
modifican en los hepatocitos y se incrementa su solubilidad para facilitar su posterior
eliminación. Esta acción se lleva a cabo mediante dos tipos de reacciones metabólicas que se
producen en los microsomas hepáticos:
1. Reacciones de fase I, que son reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis, en las cuales
participan distintas enzimas, como el citocromo P-450 (CYT450), la alcohol-deshidrogenasa, las
mono-oxigenasas, etc.
2. Reacciones de fase II, que son reacciones de conjugación con sulfato, ácido glucurónico o
hidratos de carbono, que convierten los compuestos que se detoxifican en sustancias más polares,
las cuales se pueden eliminar fácilmente por la bilis o la orina (Pedona, 2013).
La bilirrubina es un producto de la degradación en el catabolismo de la hemoglobina, que está
presente en el suero de manera no conjugada (liposoluble), o conjugada (hidrosoluble), después
de ser metabolizada en el retículo endoplásmico liso del hepatocito debido a la intervención de la
glucuronil transferasa. La hiperbilirrubinemia, cuando es de suficiente intensidad (porque no ha
sido transferida a la bilis) da a lugar a una coloración amarillenta de la piel y las mucosas,
denominada “ictericia” (Prieto, 2013).
A.1.3. Función metabólica
El hígado es un órgano central del metabolismo que realiza numerosas funciones esenciales
para la vida. A él llegan los aminoácidos, hidratos de carbono, lípidos, vitaminas y minerales
absorbidas en el intestino, que metaboliza, almacena y distribuye al resto del organismo.
También sintetiza muchas de las proteínas circulantes, incluyendo la albúmina. Por ello, el
estudio de la capacidad metabólica del hígado abarca aspectos muy diversos y, con frecuencia, es
necesario valorar su capacidad metabólica con independencia de su actividad excretora o de su
integridad (McPhee y Hammer, 2010).
5
A.1.3.1. Metabolismo hidrocarbonado
El hígado es un lugar clave en el mantenimiento de la homeostasia de la glucosa plasmática.
Por un lado, es el principal almacén del glucógeno que sirve de reserva de glucosa durante el
período o postprandial y, por el otro, realiza la gluconeogénesis a partir de lactato y de los
aminoácidos para suministrar glucosa en los períodos de ayuno. El ácido láctico que proviene del
metabolismo muscular es captado para esta vía y así se elimina de la circulación para evitar su
efecto tóxico. El hígado también degrada la insulina procedente del páncreas. Por todo ello, las
enfermedades hepáticas alteran el metabolismo de la glucosa y pueden provocar situaciones de
acidosis láctica o hipoglucemia más o menos graves (Saz y Ortiz, 2007).
A.1.3.2. Metabolismo lipídico
En la enfermedad hepatocelular aguda, disminuye la actividad de las enzimas sintetizadas en
el hígado, como la colesterol-aciltransferasa y la lipasa hepática, lo que provoca la disminución
de los niveles séricos de los ésteres de colesterol y el incremento del colesterol libre. Asimismo,
se suele observar un aumento de triglicéridos y ácidos grasos. También se altera la composición
de las lipoproteínas del suero: la concentración de HDL-colesterol desciende y se eleva la de
LDL-colesterol. Además, las lipoproteínas de baja densidad (LDL, del inglés, low-density
lipoprotein) tienen una composición anómala, con muchos triglicéridos y pocos ésteres de
colesterol. El descenso de actividad de la lipasa hepática provoca la elevación de la relación entre
la HDL3 y la HDL2 (menos aterogénica). Estas alteraciones no son específicas de las lesiones
hepáticas, por lo que su utilidad en la práctica clínica para diagnosticar disfunción hepática es
limitada (Zabala, 2000).
Durante la colestasis puede aparecer la lipoproteína anormal LpX, específica de este proceso,
que se caracteriza por tener colesterol libre y fosfolípidos, así como albúmina y apoliproteína C,
como componentes proteicos (Moreno, 2012).
6
A.1.3.3. Metabolismo proteico
La alteración de la función hepática puede producir un descenso paulatino de la concentración
sérica de proteínas, como la albúmina. La albúmina es una proteína sintetizada por el hígado con
una vida media de 20 días por lo que no es útil como indicador de síntesis hepática en el fallo
hepático agudo. La hipoalbuminemia no es específica de enfermedad hepática y puede
producirse en la malnutrición proteínica de cualquier causa, en las enteropatías con pérdida de
proteínas, y en el síndrome nefrótico, aunque puede utilizarse como indicador pronóstico en los
pacientes con cirrosis hepática (Quero et al., 2015) (Cortés y Montoro, 2012). Sin embargo, el
hígado posee una elevada capacidad de reserva, por lo que la concentración de proteínas
plasmáticas puede mantenerse normal hasta que la lesión hepática es grave (Torres y Alí, 2014).
El hígado sintetiza gran parte de los factores de la coagulación como la protrombina, o los
factores V, VII y X. En casos de lesión hepatocelular, el tiempo de protrombina, que depende de
la actividad de estos factores, se alarga. Dada la corta vida media de éstos, el tiempo de
protrombina es un marcador temprano de lesión hepática. Otros marcadores que se pueden
determinar son: el tiempo de tromboplastina y los factores V (vida media de 4 hs) y VII (vida
media de 5 hs) (Torres y Ali, 2014).
A.1.4. Liberación de enzimas por el hígado lesionado
Cuando los hepatocitos sufren lesión celular (citólisis) se produce la liberación de moléculas
al torrente sanguíneo, entre las cuales destacan: la fosfatasa alcalina (FAL), la γ-
glutamiltransferasa (γ-GT), la 5’nucleotidasa, la lactato deshidrogenasa (LDH), la aspartato
aminotransferasa (AST) y la alanino aminotransferasa (ALT). Estas enzimas no son específicas
del hígado y se producen en otros muchos tejidos, pero el modo de incremento y la relación entre
ellas proporcionan gran información sobre si el origen es hepático y el tipo o grado de lesión:
1. Si la lesión afecta solamente a la permeabilidad de la membrana plasmática, se
solubilizarán moléculas de membrana, como la FAL o la γ-GT, o saldrán al exterior
componentes citosólicos.
7
2. Si la lesión es más intensa y hay necrosis, se liberarán también moléculas mitocondriales
y de otros orgánulos celulares. Cuando hay una lesión celular se liberan la ALT y AST
citosólicas y, si el daño es más intenso, también la AST mitocondrial. Estas enzimas
pueden detectarse en plasma y sus niveles serán proporcionales a la intensidad de la
lesión producida. En general, la liberación es mayor en la enfermedad aguda que en la
crónica.
3. La actividad hepática de la AST es unas 7.000 veces mayor a la sérica y la de la ALT,
casi 3.000 veces. Al existir este gradiente de concentración entre el hepatocito y el
espacio sinusoidal, una pequeña lesión hepática produce un importante incremento de la
actividad sérica. De esta forma, la determinación de las aminotransferasas es una de las
pruebas bioquímicas más útiles para detectar la lesión hepatocelular. La actividad de
otras enzimas en el hígado, como la LDH, está en una menor relación con respecto al
suero y la lesión ha de ser mayor para que se produzca un incremento significativo.
4. El patrón de elevación de las enzimas se modifica también por la vida media de estas. La
vida media de la ALT en circulación es de 45 hs y de la AST es de 17 hs. Así, aunque
haya menor proporción de ALT que de AST, en las enfermedades hepáticas agudas la
concentración sérica de ALT es mayor que la AST (AST/ALT ) (Gonzáles, 2014)
(Rojas et al., 2017).
A.1.5. Pruebas de función hepática: Bilirrubinas, AST, ALT, FAL y γ-GT
A.1.5.1. Hiperbilirrubinemia.- Consiste en un aumento de la concentración de
bilirrubina en sangre que puede o no acompañarse de otras alteraciones de las pruebas de función
hepática según el proceso en cuestión. El fallo en los procesos de conjugación o excreción de la
bilirrubina, puede darse de forma aislada en los síndromes congénitos de Gilbert y Crigler-Najjar
(conjugación) y de Dubin-Johnson y Rotor (excreción), o bien como parte de un problema
hepático mucho más amplio, por ejemplo en el de una hepatitis aguda o en el curso de una
cirrosis. Por último, la obstrucción al flujo de la bilis que impide su eliminación al intestino y,
por lo tanto, se promueve su traslado al torrente sanguíneo, se produce en trastornos como la
cirrosis biliar primaria, los tumores de la cabeza de páncreas, la presencia de cálculos en la vía
biliar, etc. (Busto y Herrera, 2015) (Prieto y Yuste, 2010).
8
A.1.5.2. Patrón de Citólisis.- Es debido a un daño celular del hepatocito bien de origen
tóxico o de causa autoinmune. La muerte de las células se traduce en un aumento de la
permeabilidad de la membrana con salida del contenido citosólico y, por tanto, se detecta un
aumento de las transaminasas. Dado que la ALT se encuentra predominantemente en el hígado,
un aumento importante (≥1.000 UI/L) de ALT (que normalmente se acompañará de un aumento
de AST) procederá casi siempre del hígado, indicando destrucción de las células hepáticas, lo
que es característico de procesos como la hepatitis vírica aguda, la hepatitis isquémica aguda o la
hepatitis tóxica. Los aumentos moderados de AST y ALT, pueden obedecer tanto a
enfermedades hepáticas (hepatitis alcohólica aguda, hepatitis vírica crónica, esteatosis hepática,
etc.) como a extra-hepáticas (hipertiroidismo, enfermedad celiaca, insuficiencia suprarrenal, etc.)
(Busto y Herrera, 2015).
A.1.5.3. Patrón de Colestasis.- El término colestasis comprende todas las situaciones en las
cuales existe un impedimento en el flujo normal de bilis desde el polo canalicular del hepatocito
hasta el duodeno, lo que produce alteraciones morfológicas, fisiológicas y clínicas.
Estrictamente, es un proceso bioquímico que se caracteriza por el incremento de la fracción
hepatobiliar de la FAL, además de otros parámetros bioquímicos asociados, como la γ-GT, la
5´Nucleotidasa, los ácidos biliares y el colesterol, entre otros. Desde el punto de vista clínico, tal
hecho se manifiesta a través de un conjunto de signos y síntomas (ictericia, prurito, xantelasma,
entre otros) que son consecuencia de la acumulación en el plasma de productos normalmente
excretados por la bilis, tales como bilirrubina, ácidos biliares y colesterol (Del Valle et al., 2017).
Por tanto, existe aumento de FAL y γ-GT “enzimas de colestasis”, con o sin aumento asociado
de bilirrubina. Las patologías causantes de colestasis son: las infecciones bacterianas severas,
procesos que obstruyen las vía biliar principal, infiltración tumoral del hígado, la amiloidosis, la
cirrosis biliar primaria, etc. (García, 2013) (Busto y Herrera, 2015).
A.1.6. Enfermedad hepática aguda
La enfermedad hepática aguda aparece de forma abrupta en un corto período de tiempo
debido, mayormente, a la ingestión de sustancias tóxicas (fármacos, toxinas), a infecciones
9
(hepatitis víricas: hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C y E, también citomegalovirus, el virus de
Epstein-Barr y el Coxsackie) o a la perfusión sanguínea inadecuada (hepatitis isquémica) (Lott et
al., 2005).
Los estudios de laboratorio que se realizan son: hemograma, pruebas de coagulación, pruebas
de función hepática, perfil renal y electrolitos, gases arteriales y cultivos de vigilancia (Keeffe,
2005).
En cuanto al pico de la elevación de las ALT y AST corresponde aclarar que este, no guarda
relación con el pronóstico, ni se asocia con la gravedad, sino que se relaciona más con la causa
de la lesión hepática. Los niveles séricos de ambas ALT y AST aumentan rápidamente durante el
comienzo de las hepatitis víricas y permanecen elevadas durante 1 o 2 semanas. Por su parte, la
enzima LDH se libera al suero cuando existe lesión o necrosis hística, pero, al estar presente en
numerosos tejidos, sin una especial preponderancia en el hígado, su presencia en niveles
moderados y/o leves, no tiene significancia clínica. Su actividad sérica aumenta
significativamente en: las hepatitis víricas o tóxicas, la obstrucción biliar extrahepática, la
necrosis hepática aguda, la cirrosis y la destrucción celular de otras localizaciones (García et al.,
2008).
A.1.7. Lesión hepática inducida por medicamentos, (Drug Induced Liver Injury o
DILI)
La lesión hepática inducida por medicamentos (DILI), se refiere a la lesión hepática inducida
por todos los tipos de medicamentos recetados o no recetados, incluidas las moléculas pequeñas,
las medicinas tradicionales chinas (MTC), las medicinas naturales (MN) y suplementos
dietéticos (SD) (Yu et al., 2017). Es una entidad importante en la práctica clínica diaria, lo que se
constituye en un problema de salud que amerita mayor atención por parte de los entes
reguladores por el creciente aumento en la comercialización de dichos productos y por su
potencial para causar efectos secundarios. Los productos hepatotóxicos no farmacéuticos, como
ser las MTC y las MN, suelen incluir, además, la presencia de microorganismos, aflatoxinas,
pesticidas y metales pesados, con el correspondiente consumo (Mengual et al., 2015). Su
incidencia es desconocida debido a la escasez de estudios prospectivos poblacionales. Se ha
10
estimado una incidencia anual de DILI en la población general de 1 a 2 casos por 100 000
personas en Argentina (Cavalieri y Agostino, 2017).
La mayoría de los fármacos lipofílicos podría causar hepatotoxicidad, los antibióticos, los
antiinflamatorios no esteroides (AINE) y anticonvulsivantes son los grupos farmacológicos con
una mayor probabilidad. Además, entre los medicamentos administrados por vía intravenosa, los
antibióticos y antineoplásicos son los grupos más asociados con toxicidad hepática (Cano,
Cifuentes y Amariles, 2017).
Los factores de riesgo para DILI son edad, sexo, estado nutricional, consumo de drogas
concomitantes, idiosincrasia, embarazo, enfermedad hepática previa o subyacente, medio
ambiente, tabaco y la predisposición genética. Las enfermedades hepáticas crónicas, como la
hepatitis C, el hígado graso y el consumo de alcohol, predisponen a una mayor susceptibilidad
ante el consumo de algunas drogas o sustancias extrañas (Cavalieri y Agostino, 2017) (Cano,
Cifuentes y Amariles, 2017).
En los DILI, las células diana lesionadas son principalmente los hepatocitos, las células
epiteliales del conducto biliar y las células endoteliales vasculares de los sinusoides hepáticos y
del sistema venoso intrahepático; estas células pueden lesionarse de varias formas complejas.
Los cambios histológicos en DILI pueden simular casi todos los cambios observados en otras
enfermedades hepáticas (Yu et al., 2017).
A.1.7.1. Mecanismos patogénicos de la hepatotoxicidad
El mecanismo patogénico de la lesión hepática por DILI es complejo y tiende a ser el
resultado de una secuencia de efectos simultáneos a través de varios mecanismos que, hasta el
momento, aún no se han dilucidado por completo. A continuación se menciona la
hepatotoxicidad directa, la cual nos permite asumir criterios para asemejar al presente estudio, en
caso de existir lesión hepática por E. coca (Yu et al., 2017).
Las causas de hepatotoxicidad por hierbas se da por el mecanismo de hepatotoxicidad directa,
la cual surge de la administración de una sustancia con toxicidad intrínseca y es dependiente de
la dosis, es predecible en modelos animales y es reproducible, o sea que, afecta a todos los
11
individuos en grado variable (Cavalieri y Agostino, 2017) (Cano, Cifuentes y Amariles, 2017).
La hepatotoxicidad directa implica una alteración de la membrana celular y de los organelos a
través de la peroxidación de lípidos de membrana causando la necrosis hepatocitaria. El daño es
usualmente citolítico, pero puede ser colestásico si la necrosis afecta principalmente al epitelio
biliar (Fernández, 2015). La hepatotoxicidad directa de los fármacos puede incluir otros
mecanismos de lesión hepática que implican respuestas inmunitarias, inflamatorias, o por
inducción de apoptosis o necroptosis (Yu et al., 2017).
A.1.7.2. Las manifestaciones clínicas y de laboratorio de DILI
La toxicidad hepática puede presentarse con manifestaciones clínicas y patológicas que
virtualmente evocan cada variedad de enfermedad hepática conocida y cuya intensidad puede
oscilar desde elevaciones asintomáticas de las enzimas hepáticas hasta insuficiencia hepática
aguda grave de curso fulminante. La forma de presentación más común es un cuadro clínico que
simula la hepatitis vírica aguda, con ictericia, náuseas, astenia y malestar o dolor abdominal,
pero son posibles otras presentaciones, que incluyen la hepatitis o colestasis crónica, cirrosis
hepática, enfermedad veno-oclusiva e incluso neoplasias. Aunque, en teoría la histología
hepática sería la herramienta más apropiada para definir el patrón de lesión, rara vez está
disponible, y en el momento actual existe un consenso amplio respecto a que la mejor forma de
definir la lesión hepática tóxica es utilizando los valores de aminotransferasas séricas y de
bilirrubina plasmática (Cavalieri y Agostino, 2017) (Cano, Cifuentes y Amariles, 2017). (Ver
anexo 1: exámenes diagnósticos iniciales en el abordaje de DILI).
Así, podría decirse que hay hepatotoxicidad cuando en presencia de un fármaco sospechoso y
sin otra explicación aparente, se detectan alguna de las siguientes anomalías (Cavalieri y
Agostino, 2017) (Cano, Cifuentes y Amariles, 2017):
a. Aumento de la alanino aminotransferasa (ALT) más de cinco veces el límite superior
normal (LSN),
b. Aumento de la FAL más de dos veces el LSN o
c. Aumento de la ALT más de tres veces el LSN, conjuntamente con un aumento de la
bilirrubina sérica total más de dos veces el LSN. El umbral de ALT para definir un caso de
12
hepatotoxicidad se ha elevado recientemente a cinco veces el LSN (frente a dos veces el
LSN del consenso previo) para:
Reducir el número de falso positivos (p. ej.: elevaciones moderadas de transaminasas
asociadas a la enfermedad hepática grasa no alcohólica), y
Excluir los casos de “adaptación” (elevaciones moderadas de transaminasas que
acaban resolviéndose a pesar de la continuación del tratamiento; tal es el caso del
tratamiento con isoniazida, aspirina, estatinas y otros) (Andrade y Lucena, 2001).
Se han definido 3 patrones de lesión de DILI resultante en función de la relación (R)1, que son:
1. Hepatitis o lesión hepatocelular: R>5. ALT elevada 3 o más veces del valor normal,
AST elevada, FAL y γ-GT levemente elevadas.
2. Colestasis: R<2. FAL elevada 2 o más veces del valor normal, γ-GT muy elevada, ALT,
AST levemente elevadas (Ver anexo 2: Causas de Colestasis).
3. Mixto: R 2-5. ALT y FAL elevadas en forma similar (Morales, Vélez y Muñoz, 2016).
Donde R se calcula:
A.1.7.3. Clasificación de gravedad en hepatotoxicidad por drogas y sustancias extrañas
El grado de gravedad del daño hepático se clasifica en leve, moderado o grave según el nivel
de bilirrubina y enzimas hepáticas, signos de falla hepática, recuperación, cronicidad o muerte
(Cavalieri y Agostino, 2017) (Ver tabla 1).
1 Definición del valor R para patrones de DILI. FAL: fosfatasa alcalina; ALT: alanino aminotransferasa.
13
Tabla 1. Clasificación de gravedad del daño hepático inducido por drogas
Puntaje Grado Definición
1 Leve Aumento de ALT y/o FAL, pero bilirrubina < 2,5 mg/dL y RIN<1,5
2 Moderado Aumento de ALT y/o FAL y bilirrubina > o = 2,5 mg/dL o RIN>o=1,5
3 Moderado-
grave
Aumento de ALT,FAL y bilirrubina o RIN, con hospitalización por
episodio de DILI
4
Grave
Aumento de ALT y/o FAL, pero bilirrubina <2,5 mg/dL y RIN<1,5
Aumento de ALT y/o FAL, y bilirrubina > o = 2,5 mg/dL, con uno de
los siguientes:
-Falla hepática (RIN > o =1,5, ascitis o encefalopatía)
-Otra falla orgánica a causa de DILI (renal o pulmonar)
5 Fatal Trasplante hepático o muerte por episodio de DILI ALT: alanino aminotransferasa; FAL: fosfatasa alcalina; RIN: razón internacional normalizada; DILI: Drug
Induced Liver Injury.
A.2. EXPLORACIÓN DEL RIÑÓN
Otro de los órganos que se afectan de manera importante por la presencia de agentes tóxicos
en el organismo es el riñón. Esto porque, por este órgano pasa toda la sangre varias veces al día
para ser depurada de los catabolitos producidos en el organismo; además porque existen procesos
concomitantes que aumentan la susceptibilidad de las células renales (p. ej. la isquemia) (Rivas
et al., 1995). Si bien existen otros mecanismos de daño del riñón como ser la presencia de
agentes infecciosos y de procesos autoinmunes, son los efectos de los agentes tóxicos, como ser
tóxicos ambientales (orgánicos, p. ej. aldehídos volátiles; inorgánicos, p. ej. metales pesados;
toxinas vegetales, p. ej. alcaloides; toxinas animales, p.ej. ofidios; drogas, p. ej. heroína; virus y
protozoos) y fármacos (p. ej. sulfas), los que mayormente dañan el riñón con expresiones clínicas
diversas (Lardies y Cisterne, 2º trimestre 1995). En este trabajo, en principio, se explora los
posibles efectos de E. coca sobre el riñón por lo cual en este capítulo describimos las funciones
de este órgano en situación normal y en situación de afectación (disfunción).
Fuente: Cavalieri y Agostino, 2017.
14
A.2.1. Estructura y función del Riñón
El riñón es el órgano encargado de la depuración de la sangre, para esto, dicho componente es
suministrado por medio de la arteria renal, que normalmente es única, y que ramifica en
pequeños vasos que irrigan los diferentes lóbulos del riñón. El riñón recibe importante aporte
sanguíneo por la arteria renal y el flujo sanguíneo representa el 25 % del gasto cardíaco. El riñón
posee numerosos vasos linfáticos que drenan en ganglios hilares, los cuales comunican con los
ganglios peri aórticos, craneal y caudalmente a la zona del hilio (Restrepo y Parra, 2018).
La nefrona es la unidad funcional del riñón, hay aproximadamente 1.200.000 unidades en
cada riñón. Los componentes esenciales de la nefrona son (Ver tabla 2): el corpúsculo renal o de
Malpighi (el glomérulo y la cápsula de Bowman), el túbulo contorneado proximal, el asa de
Henle, el túbulo contorneado distal y el túbulo colector. La regulación del flujo sanguíneo en los
glomérulos se consigue mediante el aparato yuxtaglomerular, que está situado en el polo
vascular del glomérulo, donde una porción de la nefrona distal entra en contacto con su
glomérulo correspondiente (McPhee y Hammer, 2010).
Tabla 2. Componentes de la Nefrona
Partes Función Sustancia
Glomérulo Filtración H2O, y solutos, electrolitos (Na+, K
+, PO4
3-, Ca
2+, Cl
-, Mg
+),
urea, creatinina, ácido úrico, glucosa, aminoácidos
Túbulos
proximales
Reabsorción
Secreción
H2O, electrolitos (Na+, K
+, Mg
+, Ca
2+, Cl
-,HCO3
-),
glucosa, aminoácidos
Asa de Henle Reabsorción H2O, Electrolitos (Na+, K
+)
Túbulo distal
Equilibrio
ácido-base
Secreción
Hidrogeniones (H+, Na
+)
Túbulo
colector Concentración de H2O
Fuente: (Restrepo y Parra, 2018).
El Glómerulo o corpúsculo renal, es una estructura compuesta por un ovillo de capilares,
originados a partir de la arteriola aferente, que después de formar varios lobulillos, conformados
por capilares en ovillos, se reúnen nuevamente para formar la arteriola eferente. Ambas entran y
salen, respectivamente, por el polo vascular del glomérulo. La pared de estos capilares está
15
constituida, de dentro a fuera de la luz, por la célula endotelial, la membrana basal y la célula
epitelial. A través de esta pared se filtra la sangre que pasa por el interior de los capilares para
formar la orina. Los capilares glomerulares están sujetos entre sí por una estructura formada por
células y material fibrilar llamada mesangio, y el ovillo que forman está recubierto por una
cubierta esférica, la cápsula de Bowman, que actúa como recipiente del filtrado del plasma y
que da origen, en el polo opuesto al vascular, al túbulo proximal (Restrepo y Parra, 2018).
A.2.2. Fisiología renal
Las funciones de los riñones son las siguientes:
Regulación de la composición iónica de la sangre. Los riñones ayudan a regular los
niveles plasmáticos de diversos iones, en especial sodio (Na+), potasio (K
+), calcio
(Ca+2
), cloruro (Cl-) y fosfato (HPO4
2-).
Regulación del pH sanguíneo. Los riñones excretan una cantidad variable de iones
hidrógeno (H+) hacia la orina y conservan los iones bicarbonato (HCO3
-), que son
importantes para amortiguar los H+ de la sangre. Estas dos funciones contribuyen a
mantener el pH sanguíneo.
Regulación de la volemia. Los riñones regulan la volemia a través de la conservación o
la eliminación de agua en la orina. El aumento de la volemia incrementa la tensión y un
descenso de ésta disminuye la tensión arterial.
Regulación de la tensión arterial. Los riñones también intervienen en la regulación de
la tensión arterial, mediante la secreción de la enzima renina, que activa el sistema
renina-angiotensina-aldosterona. El aumento de la renina eleva la tensión arterial.
Mantenimiento de la osmolaridad de la sangre. A través de la regulación de la pérdida
de agua y, por otro mecanismo, de la pérdida de solutos en la orina, los riñones
mantienen la osmolaridad sanguínea relativamente constante alrededor de 300
miliosmoles por litro (mOsm/L).
Producción de hormonas y activación de vitaminas. El riñón actúa como una glándula
que produce o activa:
Forma activa de la vitamina D (calcitriol), mediante la hidroxilación en posición 1
16
del 25-hidroxicolecalciferol sintetizado en el hígado. La enzima responsable de esta
reacción está presente únicamente en las mitocondrias de la corteza renal.
Eritropoyetina en los fibroblastos peritubulares del córtex renal. Esta hormona
constituye el estímulo más importante de la eritropoyesis en la médula ósea. Por
tanto, clásicamente los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal presentan
anemia intensa, con hematocritos en el intervalo de 20 a 25 % y los pacientes mejoran
en respuesta a la administración de eritropoyetina (epoetina alfa).
Enzima renina. Aunque la renina no es una hormona, es necesaria para la síntesis de
la hormona angiotensina, que, a su vez, estimula la producción de la hormona
aldosterona en la corteza suprarrenal.
A su vez, el riñón es una importante diana de varias hormonas que intervienen en el equilibrio
hídrico y mineral: de la aldosterona que regula la reabsorción de sodio y la secreción de potasio
en el túbulo contorneado distal; de la parathormona que estimula la reabsorción renal del calcio,
y de la vasopresina que regula la reabsorción de agua.
Regulación de la glucemia. Al igual que el hígado, los riñones pueden utilizar el
aminoácido glutamina para la gluconeogénesis, que es la síntesis de nuevas moléculas de
la glucosa, y luego liberar glucosa hacia la sangre para mantener una glucemia normal.
Excreción de desechos y sustancias extrañas. Mediante la formación de la orina, los
riñones contribuyen a la excreción de desechos, o sea sustancias que no cumplen una
función útil en el cuerpo. Algunos de los desechos excretados con la orina son el
producto de reacción es metabólicas, como el amoníaco y la urea, que se forman luego de
la des-aminación de los aminoácidos, la bilirrubina procedente del catabolismo de la
hemoglobina, la creatinina de la degradación de la creatina fosfato en las fibras
musculares y el ácido úrico del catabolismo de los ácidos nucleicos. Otros residuos que
se excretan con la orina son sustancias extrañas incorporadas con los alimentos, como
fármacos y toxinas ambientales (Gonzáles, 2014).
17
A.2.2.1. Filtración glomerular y resorción tubular
La filtración glomerular, consiste en la formación de un ultrafiltrado a partir del plasma que
pasa por los capilares glomerulares. Se denomina ultrafiltrado, pues sólo contiene solutos de
pequeño tamaño capaces de atravesar los poros de la membrana semipermeable que constituye la
pared de los capilares. Ésta permite libremente el paso de agua y de sustancias disueltas, con
peso molecular inferior de 15.000 Daltons; es totalmente impermeable, en condiciones normales,
a solutos con peso molecular superior a 70.000 Daltons y deja pasar en cantidad variable los de
peso molecular entre 15.000 y 17.000 Daltons. La orina, que se recoge en el espacio urinario del
glomérulo, y que a continuación pasa al túbulo proximal, está constituida, por agua y pequeños
solutos en una concentración idéntica a la del plasma el cual, además, contiene algunas células,
proteínas y otras sustancias de peso molecular elevado. El filtrado es producto únicamente de
fuerzas físicas. La presión sanguínea hidrostática, en el interior del capilar favorece la filtración
glomerular, la presión oncótica ejercida por las proteínas del plasma (las cuales retienen agua por
su hidrofilia y capacidad de captura de iones), y la presión hidrostática del espacio urinario que
actúa en contra de la filtración. La resultante del conjunto de dichas fuerzas es la que
condicionara la mayor o menor cantidad de filtrado producido por cada glomérulo. En el adulto
sano, la superficie de capilar glomerular total capacitada para la filtración es de
aproximadamente de 1 m2 (Castaño, Slon y Nuria, 2009) (Martí, 2015).
Gran parte del volumen de agua y solutos filtrados por el glomérulo son reabsorbidos en el
túbulo renal. Si no fuera así, y teniendo en cuenta solo el filtrado glomerular normal, el
volumen diario de orina excretada podría llegar a 160 L, en lugar de 500 mL a 2 L habitual. En
las células tubulares, como en la mayoría de las del organismo, el transporte de sustancias de la
orina a la sangre a través de las células tubulares, puede efectuarse por mecanismo activos a
través de receptores transportadores (consumen energía) o pasivos (el transporte se efectúa
gracias a la existencia de un gradiente de potencial químico o electroquímico, particularmente en
la reabsorción de iones). Por uno u otro de estos mecanismos, la mayor parte del agua y
sustancias disueltas que se filtran por el glomérulo son reabsorbidas y pasan a los capilares peri-
tubulares y de esta forma nuevamente al torrente sanguíneo. No se reabsorben las sustancias
extrañas, lo que se constituye en el mecanismo de depuración de las mismas (Martí, 2015).
18
Así como existe la capacidad de reabsorber ciertas sustancias, el túbulo renal también es
capaz de secretar otras sustancias que, pasan desde el torrente sanguíneo a la luz tubular
(mediante proteínas transportadoras de membrana). A través de estas funciones reguladas por
mecanismos hemodinámicos y hormonales, el riñón produce orina en un volumen que oscila
entre 500 y 2.000 mL al día. Las sustancias que se secretan son aniones y cationes orgánicos
como la creatinina, la histamina y muchos fármacos y toxinas (Tortora y Derrickson, 2006).
En el túbulo proximal se reabsorbe del 65 al 70 % del filtrado glomerular. Esto se produce
gracias a una reabsorción activa de sodio en este segmento, que arrastra de forma pasiva al agua.
Además de sodio y agua, en este segmento se reabsorbe gran parte del bicarbonato, de la glucosa
y de los aminoácidos filtrados por el glomérulo (Martí, 2015).
El asa de Henle tiene como función, por sus características específicas, la de crear un
intersticio medular con una osmolaridad creciente a medida que nos acercamos a la papila renal;
en este segmento se reabsorbe un 25 % del cloruro sódico y un 15 % del agua filtrados, de tal
forma que el contenido tubular a la salida de este segmento es hipo-osmótico respecto al plasma
(contiene menos concentración de solutos). Finalmente, en el túbulo distal, además de secretarse
potasio e hidrogeniones (estos últimos contribuyen a la acidificación de la orina), se reabsorben
fracciones variables del 10 % de sodio y 15 % de agua restantes del filtrado glomerular
(Gonzáles, 2014).
En circunstancias normales, no más de 5 a 10 ml/min de filtrado glomerular se envía hacia los
conductos colectores. En estos últimos conductos el agua se absorbe de modo directo por medio
de canales de agua controlados por vasopresina (también se conoce como hormona antidiurética
(ADH). Bajo el control de aldosterona, la resorción de Na+
desde el líquido de los túbulos, y el
transporte de K+ e H
+ hacia dicho líquido, ocurren en diferentes tipos células en los conductos
colectores renales.
Los ácidos fosfórico y sulfúrico, y otros ácidos, no son volátiles y, en consecuencia, no
pueden excretarse por los pulmones. En lugar de eso, deben excretarse como sales por los
riñones, por lo cual se les llama “ácidos fijos”; su excreción urinaria ocurre en el conducto
colector. Aun cuando maneja menos de una décima parte del filtrado glomerular total, el
conducto colector es el sitio de regulación de volumen de orina, y el sitio en el cual se logra el
19
equilibrio de agua, del Na+, del equilibrio ácido básico y del K
+. La función crucial del conducto
colector en la regulación de la función renal depende de dos características: en primer lugar,
dicho conducto está bajo control hormonal, en contraste con el túbulo proximal, cuyas acciones
de manera regular están en función simple del volumen y la composición del líquido de los
túbulos y transportadores activos desde el punto de vista constitutivo. En segundo lugar, el
conducto colector es la última región del túbulo renal que se cruza antes de que los 1 a 2 ml/min
restantes del filtrados glomerular original salgan hacia los uréteres como orina (Restrepo y Parra,
2018).
A.2.2.2. Regulación de la función renal
Existen diversos mecanismos físicos, hormonales y neurales mediante los cuales se controlan
las funciones del riñón. Bajo condiciones normales, la vasopresina, junto con la física del
multiplicador de contracorriente en el asa de Henle, y el intersticio medular hipertónico,
posibilitan la concentración de la orina. Esto confiere al riñón normal la capacidad de conservar
la homeostasis líquida bajo muy diversas condiciones (mediante la generación de una orina
concentrada o diluida, según las necesidades corporales de conservar o excretar sal, agua y otros
solutos).
La retroalimentación tubuloglomerular se refiere a la capacidad del riñón para regular la
velocidad de filtración glomerular (VFG) en respuesta a la concentración del soluto en el túbulo
renal distal. Cuando la mácula densa detecta una concentración excesiva del Na+
en el líquido
tubular, se desencadena la vasoconstricción de la arteriola aferente. Esto disminuye la cantidad
de sangre en el glomérulo y por tanto el filtrado glomerular, por lo que el túbulo renal tiene una
carga soluta más pequeña por unidad de tiempo, permitiendo al Na+
ser recuperado de manera
más eficiente del líquido tubular. Varias sustancias vasoactivas como las prostaglandinas, óxido
nítrico y péptidos como la endotelina y la bradicina, contribuyen al control humoral de la
retroalimentación túbulo-glomerular (Gonzalez, 1997).
Otro reto importante para el riñón consiste en la regulación del flujo sanguíneo cortical
respecto al medular. El flujo sanguíneo en la corteza renal necesita ser suficiente para conservar
la VFG lo bastante grande como para depurar de manera eficiente los desechos que se excretan
20
por el riñón, sin exceder la capacidad de los túbulos renales para la resorción del soluto. De igual
manera, el flujo sanguíneo en la médula debe regularse finamente. El flujo medular excesivo
puede alterar el gradiente osmolar logrado mediante el mecanismo de intercambio a
contracorriente. El flujo sanguíneo insuficiente en la médula puede causar lesión anóxica del
túbulo renal. Desde el punto de vista de las nefronas individuales, la redistribución del flujo
sanguíneo de la corteza hacia la médula involucra el suministro sanguíneo preferencial (y, por
tanto, aporte de oxígeno) a las nefronas con asas de Henle largas que se introducen
profundamente en la médula (Franco, Navar, Herrera y Bell, 1992).
La mayor parte del consumo de oxígeno en la médula se utiliza para generar el ATP que dota
energía al conjunto de transportadores activos involucrados en la resorción de solutos en el asa
de Henle. Por tanto, cuando la demanda de oxígeno excede el suministro disponible, los
mecanismos reguladores tienden a limitar la carga de trabajo de los transportadores
consumidores del ATP. Estos mecanismos reguladores disminuyen el soluto entregado al asa de
Henle; es decir, disminuyen la VFG (retroalimentación túbulo-glomerular). El flujo sanguíneo
renal también se desvía de manera preferente hacia las nefronas medulares. En los momentos de
una demanda excesiva de oxígeno se liberan mediadores, los cuales favorecen la
vasoconstricción de algunos lechos vasculares y la dilatación de otros. Esto sirve para disminuir
la VFG y, al mismo tiempo, redistribuir el flujo sanguíneo desde la corteza hacia la médula
(McPhee y Hammer, 2010).
Las adaptaciones del riñón a la lesión también deben considerarse como modalidades de la
regulación. Así, la perdida de nefronas ocasiona una hiperfiltración glomerular compensadora
(incremento de la VFG por nefrona) y en hipertrofia renal. Si bien la hiperfiltración puede
resultar una adaptación a corto plazo, al permitir la conservación de la VFG total del riñón, se le
ha involucrado como un evento incidente frecuente en la destrucción subsecuente de la nefrona
por diversas causas. Se estima que una vez que tiene lugar la hiperfiltración glomerular, se inicia
la evolución gradual e inexorable hacia la insuficiencia renal crónica (Musso, Reynaldi y
Aparicio, 2009).
Existen otras adaptaciones a la lesión clínicamente importantes. La deficiente perfusión renal
por cualquier causa produce respuestas que mejoran la perfusión mediante la vasodilatación
21
arteriolar aferente y la vasocontricción arteriolar eferente, en respuesta a los estímulos hormonal
y neural. Estos efectos reguladores se refuerzan mediante estímulos que determinan el equilibrio
del Na+
y constituye otra vía para influir en la presión arterial y, de esta manera, en la presión de
perfusión renal. La inervación simpática a cargo de los nervios renales influye en la liberación de
la renina. Las prostaglandinas renales también participan de manera importante en la
vasodilatación, en especial en los pacientes con deficiente perfusión renal crónica (Franco,
Navar, Herrera y Bell, 1992).
A.2.3. Lesión renal aguda
La lesión renal aguda (LRA) es definida como el deterioro de la función de los riñones que
ocurre en horas o días, que conduce a una disminución de la filtración glomerular (FG), y por
tanto a un aumento de la creatinina plasmática y a una disminución variable de la producción
urinaria. Siendo potencialmente reversible, puede dejar secuelas graves como la enfermedad
renal crónica (ERC) o, incluso, llevar a la muerte, con altos costos para cualquier sistema de
salud (Nieto y Bello, 6 de abril del 2018) (Sancho, López, y López, 2015).
Los principales factores de riesgo para desarrollar LRA son: edad avanzada,
politraumatismos, quemaduras, cirugías mayores (cardíacas y no cardíacas), ERC de cualquier
etiología (que se reagudizan), diabetes, falla cardíaca, cirrosis, desnutrición, patologías
autoinmunes, enfermedades oncológicas, infecciones agudas graves, exposición a agentes
nefrotóxicos, intoxicaciones, consumo de estimulantes de la ovulación, etc. (Nieto y Bello, 6 de
abril del 2018).
Los límites para definir y clasificar el daño o fracaso renal agudo, desde el punto de vista
bioquímico son muy variables, según diversos autores, ya que su establecimiento es totalmente
artificial y arbitrario. Bajo el acrónimo RIFLE (Ver tabla 3), que corresponde a las palabras
inglesas riesgo (Risk), lesión (Injury), fallo (Failure), pérdida prolongada de la función renal
(Loss) y fin irreversible de la función renal (End) se ha pretendido unificar los criterios
diagnósticos. Esta clasificación validada en múltiples trabajos, se desarrolló durante la 2º
conferencia de consenso de la Adequate Dialysis Quality Initiative (ADKI) (Gainza, 2017).
22
Tabla 3. Categoría RIFLE
Las denominadas guías KDIGO de LRA de 2012 (Nieto y Bello, 6 de abril del 2018),
unificaron las clasificaciones RIFLE y AKI (acute kidney injury) con el fin de que todo el
mundo hablé el mismo idioma y así facilitar el diagnóstico y seguimiento. Según esta
clasificación los criterios para definir LRA son:
Tabla 4. Clasificación KDIGO de la LRA
Estadio Creatinina Gasto Urinario
1 1.5 – 1.9 veces o aumento ≥ 0.3 mg/dl <0.5 ml /kg/h por 6 a 12 horas
2 2.0 - 2.9 veces <0.5 ml/kg/h ≥ 12 horas
3 ≥ 3 veces ó
Incremento a ≥ 4 mg/dl (siempre y cuando
aumente ≥ 0.3 mg/dl) ó Inicio de terapia de
reemplazo renal ó
En < 18 años, disminución de la
TFG < 35 ml/min por 1.73 m2
<0.3 ml/kg/h ≥ 24 horas ó
Anuria ≥ 12 horas
TFG (Tasa de Filtración glomerular), KDIGO (Kidney Disease: Improving Global Outcomes)
Fuente: Nieto y Bello, 6 de abril del 2018.
FU: Gasto urinario; FG: Filtración glomerular; FR: Función renal;
Cre: creatinina; ESRD: enfermedad renal terminal
Fuente: Carrillo y Castro, 2009.
23
A.2.3.1. Causas de lesión renal aguda
Se clasifican en tres categorías:
1) Prerrenal: Procesos caracterizados por hipoperfusión renal en los que se conserva la
integridad del tejido parenquimatoso renal y representa un 55-60% de los pacientes con
LRA. Como causas prerrenales tenemos la hipovolemia, la disminución del gasto
cardíaco, la vasodilatación periférica, la vasoconstricción renal y la alteración de las
respuestas renales autoreguladoras por AINES (Antiinflamatorios no esteroides) y
EICAS (Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina). Los riñones responden
para intentar mantener la tasa de filtración glomerular y evitar su daño, por medio de la
vasodilatación de la arteriola aferente, por acción de las prostaglandinas, y
vasoconstricción de la arteriola eferente, por la acción de la angiotensina II. Se
caracterizan por tener un sodio en orina inferior a 20 mEq/L y una fracción de excreción
de sodio en orina inferior al 1% (Martí, 2015) (Nieto y Bello, 6 de abril del 2018).
2) Parenquimatosas: enfermedades que afectan al parénquima renal y suponen del 35 al
40% de los pacientes con LRA. La mayoría se produce por isquemia o por la acción de
nefrotoxinas. Según la frecuencia, la afección más común es la necrosis tubular aguda
(NTA), la nefritis túbulo-intersticial aguda, las glomerulonefritis agudas, la lesión de
grandes vasos. Otras más raras, pero extremadamente graves, son la necrosis cortical y la
necrosis papilar (Fauci et al., 2009).
3) Posrenal: Enfermedades asociadas con una obstrucción aguda del tracto urinario y se
producen en menos del 5% de los pacientes con LRA. Las patologías pélvico-uretral
intrínseca o extrínseca, vesical o uretral, entre las que se destacan, la litiasis renal, la
pielonefritis crónica-agudizada y otras post-quirúrgicas causas post-renales (Martí, 2015).
A.2.3.2. Datos de laboratorio de la Lesión Renal Aguda
La característica fundamental de la LRA es la aparición de uremia aguda de rápida aparición.
A nivel práctico se considera que esto ocurre cuando la creatinina plasmática aumenta
0,5mg/dl/día durante varios días. Si la LRA ocurre en el seno de una insuficiencia renal crónica,
se considera que el aumento debe ser mayor de 1 mg/dL/día. La creatinina es más fiable que la
24
urea para el diagnóstico de LRA (Gonzáles, 2014). También puede calcularse el grado de
disfunción renal detectando el deterioro del aclaramiento de creatinina. En el caso de LRA el
aclaramiento de creatinina debe reducirse un 50% (Ruiz y Ruiz, 2010).
Existirá hiperpotasemia en casos de LRA oligúrica o en estados hiper-catabólicos, como
sucede en la hemólisis, rabdomiólisis y en los casos de lisis tumoral. La hipopotasemia se da en
las formas poliúricas (Tenorio et al., 2010).
La hiponatremia es también un hallazgo frecuente. Un manejo incorrecto del paciente, con un
aporte excesivo de agua en proporción a la de sodio, puede agravar aún más la hiponatremia
(Angel, Restrepo y Uribe, 2008).
El aumento del ácido úrico es característico de la LRA aunque habitualmente es moderado y
asintomático, no pasando de los 12 mg/dL (Gonzáles, 2014). Los datos actuales sugieren que el
ácido úrico puede ser un factor de riesgo o un biomarcador de pronóstico renal y cardiovascular
en población con patología renal, aunque la hiperuricemia es más una condición que acompaña
de manera muy frecuente a los pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) (Goicochea et al.,
2012).
Por otro lado, suele existir hipocalcemia, hiperfosforemia e hipermagnesemia; la severidad de
estas alteraciones será paralela a la del daño renal que las ha ocasionado (Gonzáles, 2014).
Hemograma: Puede tener gran importancia en el diagnóstico diferencial entre LRA e IRC; así, si
aparece una anemia normocítica normocrómica, estará más en concordancia con una IRC
(Tenorio et al., 2010).
Sedimento urinario: En la LRA prerrenal el sedimento no contiene células pero si cilindros
hialinos formados por la proteína de Tamm-Horsfall. En la NTA, en cambio, existen cilindros
granulosos, pigmentados y de células epiteliales, generalmente en asociación con hematuria
microscópica.
La proteinuria que suele verse en la NTA, es la de tipo tubular y generalmente con un resultado
menor de 1g/24 hs (De Lucas e Izquierdo, 2014).
25
A.2.3.3. Daño tubular agudo o Necrosis Tubular Aguda (NTA)
Caracterizada por la muerte y/o disfunción de las células epiteliales tubulares en uno o varios
segmentos tubulares. La disfunción de las células tubulares, que dá como resultado la muerte del
paciente o alteraciones subletales, es el evento iniciador en la NTA que conduce a una disfunción
renal (es decir, a la reducción de la tasa de filtración glomerular) y a la insuficiencia renal
(Sancho, López y López, 2015).
A.2.3.3.1. Diferentes mecanismos vinculan el daño tubular agudo con una FG
reducida; entre estos destacan:
La lesión de las células tubulares impide la recaptación tubular apropiada, lo que activa el
mecanismo de retroalimentación tubuloglomerular para reducir la filtración y minimizar la
pérdida hidroelectrolítica;
Los residuos tisulares, las células muertas y los residuos celulares ocluyen los túbulos
renales, lo que dificulta la filtración en nefronas obstruidas, aumenta la presión glomerular y
reduce la tasa de filtración glomerular general;
El daño tubular y la muerte celular llevan a la activación de las células existentes, que
producen mediadores proinflamatorios y citoquinas vasoactivas. Estos, a su vez contribuyen,
a mantener bajo el filtrado glomerular y amplificar aún más el daño a diferentes estructuras
renales (Sancho, López y López, 2015).
A.2.3.3.2. Mecanismo de la toxicidad directa sobre las células renales, las sustancias
nefrotóxicas interactúan con los componentes de la membrana plasmática de las células renales o
pueden ser captados, internalizados o absorbidos por las células renales, ejerciendo así sus
acciones tóxicas a nivel intracelular. Algunas nefrotoxinas producen el daño celular
interactuando con la membrana de la célula tubular, mientras que otras, como la ciclosporina de
carácter hidrofóbico, se unen a los lípidos de membrana sin aparentes efectos adversos. El daño
celular se manifiesta en alteraciones morfológicas y funcionales de las células renales: cuando un
tóxico interacciona con los componentes de la membrana plasmática de las células renales altera
tanto la permeabilidad de la membrana como la actividad de sus sistemas de transporte. Esto
provoca cambios en la concentración citosólica de iones y otras sustancias. La unión del tóxico a
las membranas también puede originar la activación de las enzimas asociadas a ellas, como ser:
26
la fosfolipasa A2 [induce las síntesis de eicosanoides y del factor activador de las plaquetas
(PAF)]; la fosfolipasa C [induce la liberación de inositol trifosfato (IP3) y de di-acil glicerol
(DAG) que son precursores de agentes inflamatorios]; y la fosfolipasa D que favorece la
liberación de DAG. Los aumentos intracelulares de IP3, activan la salida de Ca2+
del retículo
sarcoplásmico aumentando de esta forma los niveles de Ca2+
citosólico libre. El DAG estimula a
la proteína kinasa C (PCK), que es capaz de activar enzimas celulares y otros mediadores de la
señalización intracelular que activan la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias, por fosforilación.
En ambos casos se produce una activación celular que, si no tiene un adecuado soporte
energético (ATP), puede tener efectos deletéreos para la célula. También existen efectos sobre la
función lisosomal y mitocondrial. La mitocondria de la célula tubular renal es el lugar de acción
de muchas nefrotoxinas. Estas interfieren con la fosforilación oxidativa y la consiguiente
producción de ATP, alterando las funciones de transporte dependientes del mismo y produciendo
muerte celular (Rivas et al., 1995).
Entre los xenobióticos nefrotóxicos más importantes destacan: la aspirina, la indometacina, la
cefalosporinas, las tetraciclinas, el cisplatino, la ciclosporina A, el mercurio, el cadmio, las
micotoxinas, solventes orgánicos como la gasolina y el tricloro-etileno.
También es fundamental la distinción entre LRA prerrenal y NTA. Para ello nos basamos en
una serie de parámetros urinarios e índices orina/plasma que se resumen en la tabla siguiente:
Parámetro Prerrenal Necrosis Tubular Aguda
Concentración urinaria de sodio < 10 > 20 (mEq/L)
CreO/CreP > 40 < 20
Urea orina / urea plasma > 8 < 3
Densidad urinaria > 1020 < 1010
Osmoralidad urinaria (mOsm/Kg) > 400 < 350
Sedimento Cilindros hialinos Cilindros granulosos,
pigmentados
Y de células epiteliales
Fracción Excretada de sodio (EFNa) (%) < 1 > 1
Índice de fallo renal (IFR) < 1 > 1
Tabla 5. Índices diagnósticos urinarios
CreO: Creatinina en orina; CreP: Creatinina en Plasma.
Fuente: Moreno y Arrabal, 2016.
27
En donde:
;
IFR=
A.2.3.3.3. Fisiopatología de la Necrosis Tubular Aguda. La NTA cursa generalmente con 5
estadios que son:
1. Prerrenal, disminuye el flujo sanguíneo renal, pero se mantiene la integridad celular;
2. Iniciación, aparece cuando el descenso del flujo sanguíneo renal provoca una depleción
de ATP y se produce la lesión de la célula tubular epitelial con efectos como ser: perdida
de microvilli, exfoliación, etc.;
3. Extensión, se caracteriza por la persistencia de la hipoxia, y la respuesta inflamatoria,
ambos eventos son más pronunciados en la unión cortico-medular. Es en esta fase, en la
que la disfunción de la célula endotelial desempeña una papel fundamental: alteración de
la permeabilidad, estado pro-coagulante, alteración en la regulación de las células pro-
inflamatorias, liberación de citoquinas, etc., y cuando se produce muerte celular: necrosis
y apoptosis;
4. Mantenimiento, las células comienzan a repararse: diferenciación, migración, apoptosis,
proliferación en un intento de mantener la integridad celular y tubular;
5. Recuperación, si se dan la condiciones de reinstalación del flujo sanguíneo renal se
mantiene la diferenciación celular y se restablece la polaridad epitelial (Martí, 2015). En
la fase de recuperación se produce inicialmente aumento del volumen urinario que
puede llegar hasta la poliuria y posteriormente se restablece la depuración de azoados
(Nieto y Bello, 6 de abril del 2018).
A.3. EXPLORACIÓN DEL PÁNCREAS
Entre los órganos que pueden afectarse por la presencia de agentes extraños al organismo se
cuenta también el páncreas, particularmente el área tisular relacionada con sus funciones
28
exocrinas. Así mismo, su destrucción por agentes tóxicos puede conducir a que los productos de
la excreción de este órgano hacia el ducto intestinal (enzimas pancreáticas digestivas) pueda
ingresar al torrente sanguíneo, debido al daño estructural del órgano. Tal posibilidad ha sido
explorada en este trabajo, al margen de los otros eventos que pueden dañar al páncreas como ser
trastornos obstructivos, autoinmunes o virales. En los siguientes subtítulos examinaremos
aspectos de la estructura y función normal; así como aspectos vinculados a la disfunción de esta
glándula.
A.3.1. Estructura bioquímica del páncreas
El páncreas tiene dos porciones:
1. Páncreas exocrino: está formado por los acinos y los conductos pancreáticos. En los acinos
se produce el jugo pancreático que pasa a los conductos para terminar vertiendo a los
conductos pancreáticos principal y accesorio. Los acinos están formados por células acinares
y los conductos por células ductales y ambos se distribuyen por toda la glándula. Los acinos
son agrupaciones esféricas formadas por células exocrinas secretoras; cada acino tiene su
propio conducto intraacinar. Las células acinares tienen forma de pirámide truncada, con
base ancha y superficie apical estrecha. Su base reposa sobre la lámina basal. Su núcleo es
redondo, entre sus organelas se encuentra un gran RER (retículo endoplasmático rugoso)
responsable de la basofilia del citoplasma, donde se sintetizan las proteínas enzimáticas,
estas pasan al aparato de Golgi donde las empaquetan en vacuolas o vesículas que se ubican
en el citoplasma. Allí se agrupan los llamados gránulos zimógenos que luego secretan al
exterior de la célula las proenzimas pancreáticas. En los acinos se origina el sistema ductal.
Los conductos intercalares que comienzan en el centro del acino, están formados por epitelio
de una sola capa de tipo cúbico. Los conductos interlobulillares surgen de la fusión de los
conductos intercalares, estos están compuestos por epitelio cilíndrico. Los conductos inter-
lobulillares son ramificados de los conductos pancreáticos principales, los cuales están
revestidos por algunas células caliciformes y epitelio cilíndrico alto (Sastre, Sabater y
Aparisi, 2005).
2. El páncreas endocrino: está formado por los islotes de Langerhans ubicados en medio de
tejido conectivo altamemente vascularizado. El páncreas tiene casi un millón de islotes y la
29
mayoría de ellos se encuentran en la cola, rodeados de acinos exocrinos. Los islotes se
encuentran dispersos entre los acinos. Las células que conforman los islotes son: las células
alfa, células beta, células delta y células PP (Gonzáles, 2014).
A.3.2. Fisiología del páncreas
La porción exocrina; es la que vierte al duodeno el jugo pancreático que se produce en las
células acinares, el cual está formado por enzimas pancreáticas como la lipasa, proteasa,
amilasa, nucleasa y otras. Estas enzimas ayudan a descomponer lípidos, proteínas,
carbohidratos y ácidos nucleicos; y son vertidas a la segunda porción del duodeno por medio de
dos conductos: principal de Wirsung y accesorio de Santorini (Leiva, 2014).
La porción endocrina vierte su secreción a la sangre. Concretamente, segrega hormonas como
la insulina y el glucagón, las cuales son producidas en los islotes de Langerhans. La insulina
interviene en el metabolismo de los hidratos de carbono, los lípidos y las proteínas; el glucagón
aumenta el nivel de glucosa sanguínea al estimular la formación de este carbohidrato a partir del
glucógeno almacenado en hepatocitos. También ejerce efecto en el metabolismo de proteínas y
grasas (Leiva, 2014).
A.3.3. Alteraciones del páncreas exocrino
La pancreatitis es la principal alteración del páncreas exocrino en los adultos y puede cursar
como aguda, recidivante o crónica (Gonzáles, 2014).
La pancreatitis aguda (PA) es un proceso inflamatorio agudo y difuso del páncreas, que se
produce debido a la activación prematura intra-parenquimatosa de las enzimas pancreáticas
principalmente del tripsinógeno a tripsina (activación que en condiciones normales debería darse
a la salida del jugo pancreático) dentro de las células acinares, provocando su auto-digestión y la
estimulación potente de macrófagos; pudiendo comprender una afectación local o el daño de los
sistemas u órganos remotos (Leiva, 2014) (Bustamante et al., 2018).
La etiología de la PA varía según la región geográfica. Se estima que tiene una incidencia de
4.9-73.4:100,000 habitantes a nivel mundial. Las causas en orden de importancia son: los
cálculos biliares que ocupan la primera causa (32-49%) y son más prevalentes en mujeres; el
30
consumo prolongado de alcohol (4-6 bebidas/día más de 5 años) es la segunda causa (20-31.8%)
más frecuente en hombres; la hiper-trigliceridemia es la tercera causa (2-5 %); el tabaquismo está
asociado al 50% de los casos de PA; los fármacos causan menos del 5% , la mayoría en efectos
leves, entre ellos: azatioprina, didanosina, estrógenos, furosemida, pentamidina, sulfonamidas,
tetraciclina, ácido valproico, 6-mercaptopurina, inhibidores de la enzima convertidora de la
angiotensina, mesalamina y otros (Velásquez y Cárdenas, 2017) (Bustamante et al., 2018).
Un estudio en el año 2016 agrupa los factores etiológicos en tres según mecanismo de acción:
tóxico-metabólico, mecánico y genético (Ver tabla 6) (Lipovestky y Kohan, 2016).
Tabla 6 .Causas de Pancreatitis aguda
Tóxico- metabólicas - Alcohol - Organofosforados
- Hipertrigliceridemia - Otras sustancias tóxicas
- Hipercalcemia - Veneno de escorpión y arañas
- Fármacos
Mecánicas
- Biliar: litiasis, microlitiasis,
barro biliar
- Duplicación duodenal
- Páncreas divisium - Quiste de colédoco
- Páncreas anular - Disfunción o estenosis ampular
- Divertículos duodenales - Trauma
Genéticas - Familiar Esporádica
Misceláneas Vascular
Hipotensión
Vasculitis
Embolismos
Hipercoagulabilidad
Enfermedades autoinmunes
Síndrome de Sjögren
Colangitis esclerosante primaria
Enfermedad celíaca
Hepatitis autoinmune
Infecciones
Virus: paperas, coxsackie, de la inmunodeficiencia humana,
citomegalovirus
Bacteria: Mycobacterium tuberculosis
Parásitos: Ascaris
Otros: Mycoplasma
Idiopática
Fuente: Lipovestky y Kohan, 2016.
El daño acinar conduce a que la α-amilasa sérica se eleve desde las primeras horas de la
enfermedad y, por ello, es útil para el diagnóstico precoz de la pancreatitis. Alcanza un pico, al
31
menos, de tres veces su concentración a las 24 hs y se mantiene elevada durante 3-5 días, dado
que se elimina rápidamente por la orina. El grado de elevación de la α-amilasa no correlaciona
con la gravedad de la enfermedad, pues pueden obtenerse valores dentro del intervalo de
referencia si se recoge el espécimen demasiado pronto o demasiado tarde, respecto al ataque, en
pacientes con hiper-lipidemia o con una importante insuficiencia del páncreas exocrino, por
ejemplo, por abuso de alcohol. De hecho, hasta el 32 % de los pacientes con pancreatitis aguda
tienen una actividad dentro del intervalo de referencia al ingreso hospitalario. Es muy útil la
cuantificación de la α-amilasa en la orina, que se mantiene elevada tras normalizarse en el suero
y permite descartar una macro-amilasemia, en la cual la actividad α-amilasa sérica es elevada,
pero no la urinaria, ya que se encuentra formando parte de complejos macromoleculares no
filtrables. La actividad de la lipasa sérica alcanza el máximo a las 24-48 hs del comienzo de los
síntomas y se mantiene elevada durante más tiempo, entre 1 y 2 semanas. Habitualmente, se
observa una ligera hiperglucemia, con hipoalbuminemia, que se relacionan con la gravedad del
proceso. Se observa hipocalcemia debida a la formación de sales cálcicas con los ácidos grasos
producidos como efecto de la actividad de la lipasa sérica incrementada. La proteína C reactiva
(PCR) se eleva notablemente. La necrosis celular produce un incremento de la lactato
deshidrogenasa (LDH) y, sí hay compromiso biliar, se pueden elevar las concentraciones de
bilirrubina y de fosfatasa alcalina (Gonzáles, 2014).
A.3.3.1. Fisiopatología de la pancreatitis
Se han identificado dos fases. La primera fase inicia con la activación de los gránulos
zimógenos dentro de los acinos pancreáticos. Éstos se unen a lisosimas intracelulares que
contienen enzimas, como catepsina B, convirtiendo el tripsinógeno en tripsina y, de esta manera,
se liberan enzimas pancreáticas activas hacia los acinos y entre las células de los acinos. Una vez
activadas las enzimas pancreáticas se produce necrosis celular y si induce respuesta inflamatoria
local con la presencia de neutrófilos, macrófagos y factores proinflamatorios como FNT-α
(Factor de Necrosis Tumoral Alfa) e IL-6 e IL-8 (IL, Interleucinas). Posteriormente, por la
circulación de las enzimas pancreáticas en la sangre, la respuesta inflamatoria se generaliza,
32
produciendo una respuesta inflamatoria sistémica que puede ocasionar fallo orgánico. Es posible
que esta fase dure hasta siete días.
En la segunda fase hay manifestaciones locales a consecuencia de la respuesta inflamatoria
local. Las manifestaciones locales pueden ser colecciones pancreáticas o peri-pancreáticas y la
necrosis, pancreática o peripancreática (McPhee y Ganong, 2007).
A.3.3.2. Diagnóstico de la Pancreatitis Aguda
Se realiza con 2 o más de los siguientes criterios: dolor abdominal superior característico,
niveles elevados de lipasa y amilasa sérica al menos 3 veces el valor normal y/o hallazgo en
imágenes anormales de abdomen, mediante USG (Ultrasonido), TCC (Tomografía
Computarizada Contrastada) o RM (Resonancia Magnética) (Bustamante et al., 2018).
A.3.3.3. Exámenes de laboratorio para el diagnóstico de Pancreatitis Aguda
Deben ser específicos para realizar una valoración completa y sistemática del paciente.
Incluyen: hemograma completo, panel metabólico (los triglicéridos, función renal y hepática),
niveles de lipasa y amilasa, el LDH, el calcio, el magnesio, el fósforo (si hay antecedentes de
abuso de alcohol) y urianálisis. De acuerdo al escenario clínico se debe determinar: PCR, gases
arteriales y niveles plasmáticos de IL-6 o IL-8 (Bustamante et al., 2018).
Los niveles de lipasa son los más sensibles y específicos que los de amilasa. Puede existir
hiper-amilasemia en insuficiencia renal, parotiditis, isquemia y obstrucción intestinal,
macroamilasemia y por uso de múltiples medicamentos. La lipasa puede elevarse
espontáneamente en peritonitis bacteriana, isquemia intestinal y esofagitis (Bustamante et al.,
2018). Lo cual debe ser considerado en el diagnóstico. En el estudio presente se explora la
posibilidad de daño pancreático agudo por la administración del producto examinado.
33
A.4. AFECTACIÓN DE OTROS ÓRGANOS
El examen para determinar la toxicidad por xenobióticos en otros órganos tales como: cerebro
(neurotoxicidad central), pulmón (neumotoxicidad), intestino (enterotoxicidad), estómago
(gastrotoxicidad), y también la genotoxicidad, la mutagenicidad, la carcinogenicidad, la
teratogenicidad, la embriotoxicidad, deben ser fundamentalmente histo-patológico pues no se
cuentan con marcadores bioquímicos (séricos) cuando dichos órganos, tejidos o sistemas son
afectados por patologías o sustancias toxicas (Giannuzzi, 2018).
El tejido sanguíneo es también susceptible de ser afectado por agentes tóxicos externos. Si
bien la afectación principal por la mayoría de agentes tóxicos tiene como blanco el proceso de
formación de tejido sanguíneo (hematopoyesis), también existen agentes tóxicos que afectan
directamente a las células sanguíneas circulantes. Tal es el caso de las saponinas y taninos de
diferentes productos de origen vegetal, con efecto hemolítico (Mena et al., 2015). Entre los
agentes que mas efecto tóxico tienen sobre el sistema hematológico se encuentran los metales
pesados; tal es el caso del plomo que produce anemia normocrómica y normocítica con un
punteado basófilo característico en los hematíes (Ferrer, 2003). Los solventes orgánicos
inhalados por períodos largos, aun a bajas dosis de exposición, también generan daño en diversos
órganos, pero un indicador importante es el daño sobre las células sanguíneas, especialmente la
médula ósea. Estos efectos pueden trastornar la producción normal de sangre y provocar un
decrecimiento en los componentes importantes de la sangre. La reducción en otros componentes
puede causar sangrado excesivo (gingivorragia, epistaxis); astenia, palidez, leucemia y aplasia
medular, según lo especifica la Centro Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC)
desde 1982. La aplasia medular es el efecto más severo que se causa por la exposición a
benceno, se presenta en dos fases, la primera se caracteriza por una hiperplasia (incremento en la
producción de células sanguíneas), seguida de hipoplasia donde decrece la síntesis de células
sanguíneas. Los cambio hematológicos (anemia, leucopenia, leucocitosis) citados a veces en
34
trabajadores expuestos crónicamente a tolueno y xileno se deben probablemente a la exposición
simultánea a benceno como contaminante del tolueno y del xileno comercial (Fonseca, Heredia,
y Navarrete, s.f.). Otros productos vegetales también pueden provocar cambios en el sistema
hematopoyético, por lo cual el examen de estas células es fundamental en el estudio de los
efectos tóxicos de sustancias extrañas en el organismo (Berenguer et al., 2010).
B. LA HOJA DE COCA (Erytrhoxylum coca)
Etimológicamente la palabra coca proviene del quechua “kuka” o “koka”, que debe
interpretarse, según Stomi, “ Ku” o “ko” como la parte más destacada o principal de algo, “ka” o
“kau”, como vivificante, que da vida, vigorosa y fuerte. Existe evidencia del uso de la hoja de
coca desde el cuarto período precerámico (2500-1800 A.C.) en Huaca Prieta en las peruanas. Sin
embargo hay también reportes arqueológicos de su uso en la cultura Valdivia, en las costas
ecuatorianas, que ubican su uso alrededor del año 3000 A.C. (Zuleta, y Daza, 2018).
El Perú es el principal productor de coca del mundo y su consumo es una costumbre
ancestral. El género Erythroxylum está formado por unas 250 especies que proliferan en la zona
tropical, especialmente en el continente americano (Gamarra et al., 2017).
Bolivia tiene una vegetación autóctona variada conocida a nivel internacional desde un punto
de vista social, económico, científico y cultural; en esta se tiene la planta Erythroxylum coca
Lam var. coca, de la familia Erythroxylaceae, especie cultivada en Yungas y Chapare de La Paz.
Es conocida popularmente por sus usos: por un lado el Etnomédico para la elaboración de mates
(té) y masticación (pijcheo/acullico) y por otro el contenido del principal alcaloide: la cocaína,
catalogada actualmente como droga de abuso (Condori et al., 2015).
35
Erythroxylum coca, es un arbusto que crece hasta 2,5 metros de altura, de tallos leñosos y
hojas elipsoidales, pequeñas de color verde intenso; sus flores son minúsculas de color blanco;
rinde un promedio de cocaína de 1,1% y tiene un olor parecido al heno, té de china y a vainilla.
Sus frutos, de color rojo, tienen forma ovoide y miden alrededor de un centímetro. Crece en
tierras cálidas y húmedas, en un rango de altitud de 800 hasta 2000 msnm (Hurtado, Cartagena, y
Erostegui, 2013) (Gamarra et al., 2017).
Según Hurtado, Cartagena, y Erostegui (2013), su composición en 100 gr es: Calorías 305
Kcal, Carbohidratos 44,3 gr, Nitrógeno 20 mg, Alcaloides totales no volátiles 700 mg, Grasa 3,7
mg, Proteínas 19,9 gr, Beta caroteno 9,4 mg, α-caroteno 2,8 mg, Vitamina C 6,5 mg, Vitamina E
40,2 mg, Tiamina 0,73 mg, Riboflavina 0,88 mg, Niacina 8,4 mg, Calcio 997,6 mg, Fosfato
412,8 mg, Potasio 1,739 mg, Hierro 136,6 mg, Sodio 39,4 mg, Aluminio 17,4 mg, Bario 6,2 mg,
Estroncio 12,02 mg, Boro 6,7 mg, Cobre 1,2 mg, Zinc 2,2 mg, Manganeso 9,15 mg y Cromo
0,12 mg.
Dentro de E. coca var. coca que crece en Bolivia, no existen más que tres alcaloides
naturales: la cocaína que se encuentra en mayor cantidad (entre 300 mg y 600 mg de cocaína por
100 g de hojas secas en función de la estación) y los derivados cis y trans cinamilcocaína que son
minoritarios; esta información fue obtenida mediante la Cromatografía Líquida de Alta Precisión
(CLAP) (ver tabla 7). En la tabla 8, se muestra que las concentraciones de la cocaína y de sus
derivados minoritarios en la zona del Chapare y en la región de los Yungas son idénticas durante
la misma estación, o sea comienzos de la estación lluviosa. Al contrario, entre la estación de la
lluvia y la estación de sequía, la concentración aumenta en 100% en ambas zonas siendo
altamente significativa para la zona de los Yungas (p<0,001) (Sauvain et al., 1997).
36
Tabla 7. Alcaloides naturales de Erythroxylum coca var. coca
Tabla 8. Dosificación de los alcaloides naturales de Erythroxylum coca var. coca de Bolivia
Localidades X cocaína S.E.M. X ciscinamilcoc. S.E.M. X transcinamilcoc. S.E.M.
Yungas Dic 91 0,327 0,054 0,0160 0,0030 0,0030 0,0008
Chapare Dic 91 0,318 0,042 0,0205 0,0069 0,0031 0,0011
Yungas Febrero 92 0,496 0,026 0,0118 0,0020 0,0050 0,0011
Chapare Marzo 92 0,53 0,025 0,0177 0,0027 0,0056 0,0008
Yungas Mayo 92 0,599 0,044 0,0079 0,0010 0,0031 0,0005
Chapare Junio 92 0,507 0,036 0,0096 0,0014 0,0050 0,0006
X=promedio del compuesto dosificado en gramos de hojas secas
S.E.M.: Standard Error of the Mean=Error estándar sobre el promedio Fuente: Sauvain et al., 1997.
Productos de hidrólisis o del metabolismo en el humano
Fuente: Sauvain et al., 1997.
37
3. ANTECEDENTES GENERALES DEL PROBLEMA EN ESTUDIO
1. ESTUDIOS REALIZADOS EN BOLIVIA:
En el año 1961, se incluyó a la hoja coca en la lista I de la Convención Única sobre
Estupefacientes, exigiendo la erradicación de los cultivos ilegales del arbusto de coca (Artículo
26) y la prohibición de la masticación de la hoja de coca en un período de 25 años (artículo 49).
La lógica que explica que la hoja de coca se incluyera en la Convención Única se basa
principalmente en un informe elaborado por la Comisión de Estudio de las hojas de coca del
Consejo Económico y Social de la ONU (ECOSOC) en 1950, tras una breve misión a Bolivia y
Perú en 1949 (Martínez, 11 febrero 2011) (Jelsma, marzo de 2011).
El Programa sobre Abuso de Sustancias de la OMS, en septiembre de 1995, elaboró el estudio
Historia natural del abuso de cocaína: Una tentativa de estudios de caso en Cochabamba-
Bolivia, que trata del proceso de elaboración del clorhidrato de cocaína y sus productos
secundarios a partir de la hoja de coca, para la obtención de pasta de coca. Se trató del mayor
estudio a escala mundial sobre el uso de la cocaína emprendido hasta la fecha. Las conclusiones
chocaron de pleno con los paradigmas aceptados en el campo de la fiscalización de las drogas, de
modo que casi tan pronto como el documento informativo basado en el estudio empezó a circular
por los pasillos de la ONU, los funcionarios estadounidenses recurrieron a toda su influencia
para impedir que se publicara. Más adelante, el estudio se prohibió formalmente a raíz de una
decisión de la Asamblea Mundial de la Salud. El representante estadounidense amenazó con que
“si las actividades de la OMS relacionadas con las drogas no logran reforzar los enfoques
demostrados para la fiscalización de drogas, se deberán recortar los fondos para los programas
pertinentes”. Este episodio dio lugar a que se decidiera suspender la publicación. De este modo,
se “quemaron” años de trabajo y centenares de páginas de valiosos datos e ideas sobre la coca y
la cocaína de más de 40 especialistas en investigación (Cortés y Pien, diciembre 2019).
38
El 18 de enero del 2013, se constituyó en una victoria de nuestra cultura, de nuestros pueblos
indígenas y movimientos sociales. Se corrigió un error histórico después de casi 50 años. La
“coca en su estado natural no es droga”, dijo Dionisio Núñez, en ese entonces viceministro de
Coca y Desarrollo Integral de Bolivia, al conocer la noticia de que fue levantada la prohibición
sobre la práctica ancestral del acullicu o pijcheo (masticado) de la hoja de coca incluida en la
Convención Única de las Naciones Unidas sobre Estupefacientes (Jelsma, marzo de 2011).
Este logro vino antecedido por varios hechos en el ámbito médico. En el Instituto Boliviano
de Biología de la Altura (IBBA) con ayuda de la Cooperación Francesa (2008), se realizó la
investigación: Sobre la Influencia del Acullico de Coca en la Capacidad Física, y se llegó a la
conclusión de que los acullicadores no pueden realizar un trabajo más intenso que los no-
acullicadores, pero que pueden tolerar mejor el esfuerzo prolongado como demuestra el consumo
de oxígeno estable. El incremento del nivel de glucosa y de los ácidos grasos libres circulantes
en los acullicadores (3-4 veces por semana), sugiere que la mejor tolerancia al esfuerzo
prolongado puede deberse a un retraso de la disminución de las reserva de glucógeno (Spielvogel
et al., 1996).
Hurtado, Cartagena y Erostegui (2013), en la Universidad Mayor de San Simón, investigaron
la respuesta glucémica post-ingesta de la hoja de coca (Erythroxylum coca) en personas sin
antecedente patológico metabólico, llegando a la conclusión de que la hoja de coca reduce la
glucemia postprandial en sujetos sanos, siendo estadísticamente significativa en las dos formas
de consumo: mate 81,8 (±7,5) mg/dL y (p=0,003) y masticación 82,07 (±8,8) mg/dL y
(p=0,082), en comparación con el grupo control 100,4 (±11,9) mg/dL y (p=2,129); este estudio
muestra uno de los beneficios del consumo de coca, como hipoglucemiante pero no se ha
continuado el estudio para su posterior aplicación en una población con Diabetes Mellitus y su
potencial uso en la dieta, para un consumo diario o semanal.
39
Por su lado Condori et al., (2015), realizaron la investigación sobre el contenido
microbiológico en la hoja de coca Chapareña y Yungueña, en la Universidad Mayor de San
Simón; la investigación llego a la conclusión de que la hoja de coca presenta una abundante
contaminación por hongos en relación a la contaminación bacteriana, además de presentar
contaminación por parásitos y otros microorganismos; en este estudio se recomienda ampliar el
estudio en muestras de mayor tamaño y el estudio de Micotoxinas y con esto ayudar a la
prevención de enfermedades y la mejora de las condiciones de producción, almacenamiento y
venta de la hoja de coca ya que actualmente Bolivia no cuenta con normativa vigente que
establezca valores de referencias para cultivo y expendio de la hoja de coca.
Negrete y Quispe (2015), examinaron la actividad antibacteriana de la hoja de coca frente a
Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, en la Universidad Cristiana
de Bolivia UCEBOL; se llegó a la conclusión de que este vegetal tiene acción antibacteriana
frente a bacterias grampositivas en preparados de solución alcohólica.
B. ESTUDIO EN EL ÁMBITO INTERNACIONAL
Gonzales et al., (2013), investigaron el Efecto terapéutico del extracto etanólico de E. coca en
anemia ferropénica inducida en ratas, en la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, (Lima-
Perú); se llegó a la conclusión de que este producto presenta efecto anti-anémico, ya que se
encontró diferencia significativa en los niveles séricos de hemoglobina entre los grupos hierro
deficiente que recibieron el extracto etanólico E. coca (18g/dL) y los que no lo hicieron
(p=0,0062), hasta alcanzar valores normales. No se encontró diferencia significativa en los
valores de hemoglobina entre los grupos con hierro suficiente (p=0,06). En este estudio no se
menciona la ausencia o presencia de toxicidad en los órganos vitales, ya que no se realizaron
pruebas bioquímicas.
40
Por su parte, Sanjines (2016), investigó la actividad antibacteriana del extracto de la hoja de
Erythroxylum coca Lamarck, frente a la flora aerobia salival en estudiantes de estomatología de
la Universidad Andina del Cusco, del Perú. La investigación llego a la conclusión de que el
extracto de la hoja de Erythroxylum coca Lamarck si presenta actividad antibacteriana:
bacteriostática, en las concentraciones de 2,5mg/100uL, 5,0mg/100uL y bactericida en las
concentraciones de 10.0mg/100uL; la actividad anti-bacteriana de estas concentraciones no
tienen diferencia estadísticamente significativa entre ellas, vistas a las 24, 48 y 72 horas,
respectivamente; la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) del extracto al 85% es
10.0mg/100uL y la Dosis Letal Media estadísticamente (DL50) es de 5.069 mg/100uL,
resultados determinados para las muestras evaluadas.
En 2016, Salinas de la Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima-Perú, realizó la revisión
de la literatura existente sobre el uso del mate de hoja de coca en la prevención del Mal Agudo
de Montaña (MAM); llegó a la conclusión de que la evidencia científica no apoya el uso de mate
de hoja de coca en la prevención del MAM y más bien podría incrementar los síntomas del
MAM; también concluye que no obstante que existen usos y aplicaciones de la hoja de coca con
fines terapéuticos, la falta de estudios aplicados a los mismos no permite que esta especie sea
utilizada dentro de la medicina basada en evidencias.
Por su parte Velarde y Risco (2016), realizaron la revisión sobre el “Potencial de la hoja de
coca en la medicina actual” (Sociedad Española de Fitoterapia, Madrid-España) llegando a las
conclusiones de que: la hoja de coca es una droga vegetal con implicaciones medicinales y
culturales diferentes a las de la cocaína; la hoja de coca tendría un potencial terapéutico en el
tratamiento de la astenia, de los dolores bucales o del tracto gastrointestinal, en la obesidad,
especialmente si se encuentra asociada a diabetes tipo II, y en programas de entrenamiento para
el ejercicio físico. También establece que bajo valoración psiquiátrica podría ser útil en el
tratamiento del síndrome ansioso-depresivo y en la terapia de deshabituación de cocaína y
41
alcohol. No se ha observado toxicidad aguda, adicción ni síndrome de abstinencia en
consumidores habituales de la hoja de coca, pero se requieren más estudios clínicos que permitan
establecer la posología más adecuada para cada una de las indicaciones.
En cambio Gamarra et al., (2017), investigaron los Metabolitos detectados en las hojas de
Erythroxylum coca Lam y Erythroxylum novogranatense (Morris) Hieron y las evaluaron en sus
propiedades biológicas mediante diferentes bioensayos (Universidad Mayor de San Marcos,
Lima-Perú). La investigación llego a la conclusión de que los alcaloides totales extraídos de
ambas especies, tienen potencial antioxidante similar a la vitamina C (control); asimismo, los
flavonoides y alcaloides totales de Erytroxylum coca Lam tienen mayor actividad antibacteriana
contra S. epidemidis y P. aeruginosa, mientras que Erythroxylum novogranatense (Morris)
Hieron es mayormente activa contra Escherichia coli, comparados con el control positivo
(ciprofloxacino y gentamicina). Existen más estudios que implican el uso del extracto hidro-
alcohólico de E. coca como una alternativa en la lucha contra la resistencia antimicrobiana.
Trigo y Suárez (2017), evaluaron el efecto del consumo de hoja de coca pulverizada en
marcadores de recambio óseo en mujeres posmenopáusicas (Universidad Mayor de San Marcos,
Lima-Perú), investigación que llego a la conclusión de que la administración de 4 g diarios
genera efectos beneficiosos observable en dos biomarcadores, uno de formación ósea
(propéptido N-terminal de procolágeno tipo 1, P1NP) y otro de resorción ósea (telopéptido N-
terminal del colágeno tipo 1, NTX1). Existió reducción significativa del marcador de resorción
ósea NTX1 (de 12,719 a 0,9945 ng/mL; p<0,05). El marcador de formación ósea P1NP mostró
una diferencia positiva de medianas (de 156,39 a 184,51 pg/mL; p>0,05). Con los resultados y la
discusión comparativa con la literatura revisada, puede proponerse que el potencial de la hoja de
coca molida no solo está en función del elevado contenido de calcio, sino también de los
metabolitos secundarios, especialmente polifenoles, que parecen contribuir a modificar
favorablemente los marcadores de recambio óseo en la población posmenopáusica. Además, y de
42
manera importante, todas las voluntarias quedaron conformes con la prescripción del consumo
del pulverizado de coca. Este grado de adherencia y persistencia durante el periodo de 90 días de
complementación de la dieta, refleja la buena aceptación de este producto. Trigo y Suárez
refiere una publicación de Ramos (1987) en la que se muestra que existen evidencias de la no
toxicidad de la hoja de coca, que ratifica lo ocurrido (en cuanto a su consumo) por más de 300
generaciones.
Zuleta y Daza en Abril del 2018, realizaron una Revisión Sistemática de Artículos Científicos
de Uso Medicinal, Nutricional y Agroindustrial de la Hoja de Coca y sus derivados, (Bogota
D.C., Colombia). La investigación llego a la siguientes conclusiones: el tipo de publicaciones
que soportan el uso de la coca y sus derivados con base en la evidencia se restringen al uso de la
cocaína como anestésico local, comparable con otros anestésicos en cuanto a eficacia y a los
rangos de seguridad; si bien las características comportamentales debidas al uso de la hoja de
coca durante trabajos de gran esfuerzo físico, muestran que hay mejor desempeño y resistencia
física, no hay claridad en cuanto a la absorción de los componentes de la coca que derivan en los
cambios (se requiere mayor investigación en esta área para obtener mejor evidencia que
corrobore cualquiera de estas posiciones); existe muy poca información sobre las acciones de los
distintos alcaloides, más allá de la cocaína y la ecgonina, en el sistema dopaminérgico, con
potenciales usos médicos en las patologías en donde se presentan alteraciones de este sistema
como son la Esquizofrenia, el Parkinson y algunos trastornos de movimientos, estos autores
consideran que el avance en el conocimiento de la hoja de coca ha estado bloqueado por
diferentes razones, entre los cuales la principal ha sido el mantener la hoja de coca como un
estupefaciente, lo cual, además de limitar su investigación, a todas luces es falso.
En nuestro laboratorio se han realizado estudios preliminares, aún no reportados, que
muestran el efecto del extracto hidro-alcohólico en la inhibición de la Fosfolipasa A2, de manera
similar a otros productos antiinflamatorios como la dexametasona. Otros ensayos muestran
43
actividad in vitro sobre el comportamiento de los fagocitos sanguíneos y la liberación de
citoquinas pro y anti inflamatorias (Padilla, 2019). En el ámbito testimonial, existen evidencias
de caso que muestran efectos benéficos particularmente en enfermedades crónicas como la
artritis y la artrosis, en la misma línea de uso de la medicina tradicional boliviana que indica para
estos males el consumo de una cucharada (aproximadamente 3 g) de hoja de coca molida (harina
de coca) (Rojas, 2013).
Como se ve, existe un gran potencial terapéutico en el uso de la hoja de coca; sin embargo, esto
requiere investigación enmarcada en protocolos clínicos que cumplan con el rigor metodológico
adecuado. Para esto, es necesario conocer previamente las dosis a las cuales se pueden trabajar
sin riesgo, es decir, conocer la franja de seguridad terapéutica en estudios preclínicos.
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Erytrhoxylum coca, es una especie de amplio consumo en sectores importantes de la
población Boliviana y de países vecinos. El consumo mayoritario es en forma de masticado de
hojas, infusiones, licores, harinas, etc. Los efectos medicinales reportados por la medicina
tradicional son múltiples (Rojas, 2013), sin embargo, su uso como fitofármaco no se ha
extendido al ambiente médico por no existir estudios científicos sobre su inocuidad; no obstante
que se asume su falta de toxicidad validada por la praxis durante muchas generaciones. En este
orden, los estudios de seguridad pre-clínica son considerados como una condición ineludible
para ejecutar protocolos clínicos (OMS, 2000). Si bien se han ejecutado algunas investigaciones
con el acullico, los resultados no establecen su uso como fitofármaco. En cambio, el uso como
harina o pulverizado, que es como se indica en la medicina tradicional, que apunta a la terapia de
varias enfermedades, solo ha sido aplicado en un estudio (Trigo y Suárez, 2017), en el cual no se
hicieron mediciones de biomarcadores para conocer algún efecto deletéreo; de hecho, los autores
44
explican algunos resultados con base en la posibilidad de un efecto de E. coca sobre el
funcionamiento de órganos no explorados. Una propuesta inicial hecha por el proyecto matriz2
para evaluar el uso de esta harina en humanos a una dosis menor a la de este estudio (3 g en lugar
de 4 g), no fue autorizado por la comisión de Bioética de la UMSA, la cual sugirió sobre la
necesidad de realizar estudios pre-clínicos de manera previa3.
Considerando que muchas patologías como ser: la gastritis, el hígado graso, la osteoporosis,
la artritis reumatoide, y expresiones clínicas como el dolor de estómago, dolor muscular y
articular, la resolución de lesiones como los golpes, las fracturas, la luxación, son tratadas por la
medicina tradicional administrando este producto, y tomando en cuenta que el tratamiento
convencional no siempre tiene los resultados esperados, es que se pretende, con este trabajo,
orientar al uso de la coca pulverizada por vía oral para evaluar su uso en las patologías
mencionadas, particularmente en las que la medicina tradicional reporta efectos benéficos
(Rojas, 2013). Este propósito solo podrá ser respaldado con la ejecución de estudios pre-clínicos
de inocuidad/toxicidad que a su vez promoverán, subsecuentemente, estudios clínicos
relacionados con diferentes afecciones. Asimismo, se espera demostrar que, por la vía de
administración planteada en el estudio, no existan efectos que pudieran asociarse a los reportados
con las drogas de abuso. Tal situación se respalda en el hecho de que los componentes
farmacológicos activos (cocaína) provenientes de la hoja de coca, están presentes en trazas (la
hoja de coca contiene 0.5-1% de alcaloide de cocaína) que son transformadas al contacto con la
saliva de la boca y con otros fluidos excretados en el tracto digestivo, hecho que explica porque
el auténtico toxicómano nunca deglute el clorhidrato de cocaína. Más bien, trazas de cocaína
presentes en la hoja de coca han demostrado ser muy útiles a la salud. La cocaína se transforma a
los metabolitos benzoílo-ecgonina, éster de metilo-ecgonina y ecgonina en el cuerpo (Salazar et
2 Proyecto matriz: “Investigación Pre-clínica de la toxicidad/ inocuidad de E. coca: estudios in vitro e in vivo en modelos experimentales
animales”, Coordinador: Roger Carvajal Saravia, M.D., M.Sc., Ph.D. Unidad de Biomedicina Experimental-SELADIS. 3 La comisión de Bioética de la UMSA, con base en un informe en el 2013, no respaldó el estudio de seguridad clínica en humanos que se había
propuesta para los fondos concursables de IDH.
45
al, 2016). Esta degradación empieza con el contacto con la saliva, pero ocurre principalmente en
el tracto digestivo, en las paredes intestinales ante la presencia de jugos digestivos. La última y
completa degradación de la cocaína sucede en el hígado. Adicionalmente sabemos que las
propiedades químicas de la sangre con un pH de 7.3 a 7.4 no son favorables para la integridad
del alcaloide. Pero una vez consumida la hoja de coca, no solo da a lugar la aparición de sus
metabolitos inmediatos, sino también a que los otros principios activos presentes y sus
metabolitos generados, puedan contribuir a los efectos biológicos traducidos en proceso de
curación y/o prevención de las patologías a ser tratadas, en el entendido de que los efectos
tóxicos que pueda tener sean mínimos o casi nulos a las dosis administradas (Damin y Grau,
2015).
Para conocer si tiene efectos tóxicos la hoja de coca de acuerdo a la dosis suministrada, se ha
formulado este estudio en el cual se evalúan marcadores bioquímicos en conejos (Oryctolagus
cuniculus) que recibieron un extracto hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca. Este estudio
experimental fue realizado in vivo e in vitro. Se trabajó con conejos reproducidos y criados en la
granja de la Facultad de Agronomía en Cota Cota y mantenidas en experimentación en el
Bioterio de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas. El estudio fue ejecutado en la
Unidad de Biomedicina Experimental del Instituto SELADIS de la F.C.F.B. y en la Unidad de
Fisiología Experimental del Instituto Boliviano de Biología de la Altura de la Facultad de
Medicina de la UMSA, pero no hubo la autorización para realizar dicho estudio en conejos de
parte del Comité de Bioética, sin embargo el proyecto matriz tiene RES.CTA 88/2017;
RES.H.C.F.Nº179/17, de aprobación.
Para esto se planteó la siguiente pregunta de investigación: ¿Cuáles son los cambios que
ocurren en los marcadores bioquímicos y hematológicos de conejos (Orytolagus cuniculus) que
recibieron un extracto hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca?
46
5. JUSTIFICACIÓN
Actualmente la hoja de coca (Erytrhoxylum coca), es una especie de amplio consumo en
sectores importantes de la población de Bolivia y de países vecinos. De hecho, el mascar hoja de
coca (acullico) se práctica hace más de 4000 años. En realidad, las hojas de coca no son
masticadas (molidas) sino son mantenidas en la boca conjuntamente con una sustancia alcalina
que, de acuerdo con su composición, recibe diferentes nombres como “lejía”, “cuta” o “pillagua”
(IBBA, 2008). El consumo varía en función de cada individuo, no llegando a conocerse si es
tóxico para la salud, aunque hasta el momento no existen registros de toxicidad por el consumo
de hoja de coca, en los montos tradicionales.
Por lo demás, desde hace tiempos remotos la hoja de coca es considerada como una planta
sagrada por la cultura ancestral andina, por los usos dados a esta planta, como ser: un suave
energizante que mejora la productividad en el trabajo manual e intelectual, una medicina eficaz
para enfermedades diversas y problemas cotidianos de salud como cefalea, dolor estomacal y
reumático, mejora el rendimiento, útil en problemas de salud mental como agotamiento,
depresión, angustia, stress, es una fuente de micronutrientes y vitaminas. Asimismo, se considera
un importante facilitador de las relaciones sociales y la solidaridad en las comunidades andinas,
siendo el principal instrumento religioso para la ritualidad que apunta a la trascendencia
espiritual y al enlace con la naturaleza, tan querida y respetada en la cosmovisión andina (Zuleta
y Daza, 2018). Por su parte, la medicina tradicional también la utiliza para problemas de origen
inflamatorio crónico como la artritis, la osteoporosis y la gastritis, indicando su consumo como
polvo o harina de la hoja seca en dosis habituales alrededor de 3 g diarios (1 cucharada). Sin
embargo no se conocen los efectos que pudieran ocurrir por el consumo regular o crónico de los
preparados de harina de coca (hoja de coca pulverizada), que se usan en la medicina tradicional o
que pueden ser usados en estudios clínicos y experiencias médicas. No existe un estudio en el
que se examinen sus posibles efectos deletéreos en los diferentes órganos, a través de marcadores
47
bioquímicos que determinen las consecuencias producidas por la administración oral en el marco
de la exploración de la función de los órganos y tejidos que pudieran ser afectados.
Por lo demás es importante la valoración de los marcadores bioquímicos en modelos
experimentales, toda vez que permite conocer la importancia de estos cambios fisiopatológicos
como efecto de daños tisulares que pudieran ser causados por sustancias extrañas al organismo,
más allá del valor de estos marcadores para el diagnóstico de patologías definitivas. Todo lo
anterior en el marco de la pertinencia académica de estos hechos los cuales contribuyen al
proceso enseñanza–aprendizaje en la formación disciplinaria de la bioquímica clínica.
En otro orden, está claro que este estudio se justifica ante la necesidad de contar con
experiencias pre-clínicas antes de su investigación en niveles clínicos como parte del enfoque
ético de la investigación biomédica. Por todo lo anterior, se ha visto pertinente realizar el
presente estudio pre-clínico de Erytrhoxylum coca, tras la administración oral de este producto
en conejos (Orytolagus cuniculus).
6. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL
Analizar un conjunto de marcadores bioquímicos de daño tisular en conejos (Orytolagus
cuniculus) que recibieron diferentes dosis de un extracto hidro-alcohólico de
Erytrhoxylum coca por vía oral y en conejos control, para la determinación de la
existencia o no de toxicidad tras el consumo de este producto.
B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Determinar mediante los marcadores bioquímicos que del perfil hepático, el
perfil renal, el perfil pancreático, el perfil lipídico y los niveles de electrolitos;
48
la presencia o ausencia de toxicidad en conejos (Orytolagus cuniculus) por el
consumo del extracto hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca por vía oral.
2. Determinar los valores del hemograma completo, además de la presencia o
ausencia de toxicidad en conejos (Orytolagus cuniculus) por el consumo del
extracto hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca por vía oral.
7. HIPÓTESIS
HIPÓTESIS NULA (Ho): En conejos (Oryctolagus cuniculus) que reciben el extracto
hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca, no se evidencia alteración de los marcadores
bioquímicos, hematológicos e histo-patológicos estudiados.
HIPÓTESIS ALTERNATIVA (Hi): En los conejos (Oryctolagus cuniculus) que
reciben el extracto hidro-alcohólico de Erytrhoxylum coca, se evidencia alteración de los
marcadores bioquímicos, hematológicos e histopatológicos.
8. ESTRATEGIA DE EJECUCIÓN
Para responder a la pregunta de investigación y confirmar o rechazar las hipótesis de trabajo, se
propone determinar los niveles y características de los marcadores bioquímicos y hematológicos,
y establecer la correlación entre estas variables en conejos a los que se los administro un extracto
hidro-alcohólico de E. coca. Para esto se diseña una estrategia de ejecución que se muestra en el
49
siguiente esquema (diagrama de flujo):
9. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
VARIABLE DEFINICIÓN TIPO DE
VARIABLE
ESCALA INDICADOR
Variable
Independiente:
Dosis del extracto
hidro-alcohólico
de E. coca
Es el incremento de la
concentración del liofilizado del
extracto hidro-alcohólico de E.
coca, disuelta en agua saborizada
con alfalfa, bebida por los
conejos. Este incremento fue de
corte semilogarítmico.
Cuantitativa
Continua
Razón Volumen
consumido del
extracto hidro-
alcohólico de E.
coca por día,
durante 36 días.
Variables dependientes:
Peso de conejos Es una medida de la fuerza Cuantitativa Razón Peso del conejo
2.-Obtención de un extracto hidro-
alcohólico de E. coca que pueda ser
administrado en modelos experimentales
3.-Administración del extracto de coca
en conejos a diferentes dosis, a lo largo
de 36 días
4.-Evaluación de parámetros
hematológicos y
bioquímicos
50
gravitatoria que actúa sobre el
animal, en función a su masa
corporal y su dieta.
Continua en gramos por
día, durante 36
días.
Temperatura
rectal
Temperatura corporal registrada
en el recto del conejo mediante un
termómetro clínico.
Cuantitativa
Continua
Intervalo
38 - 40 º C
(Harris,
1994)
Temperatura
rectal medida
diariamente,
durante 36 días.
Consumo del
alimento
balanceado
Es la ingesta del alimento
balanceado por los conejos con
fines nutricionales.
Cuantitativa
Continua
Razón Consumo del
alimento
balanceado en
gramos por día,
durante 36 días.
Niveles de
Fosfatasa
alcalina
Corresponde a un grupo de
enzimas que intervienen en la
hidrólisis de las uniones éster del
ácido ortofosfórico a pH alcalino.
Es un marcador de lesión
hepatocelular y también marcador
de formación ósea.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de fosfatasa
alcalina en UI/L
de plasma.
Niveles de
Aspartato-
aminotransferasa
o transaminasa
glutámico-
oxalacético (AST
o SGOT)
Enzima que transfiere el grupo
amino del ácido aspártico al ácido
α-cetoglutárico para formar ácido
oxalacético. Es un marcador de
lesión hepatocelular, para conocer
el tipo o grado de lesión; sus
niveles serán proporcionales a la
intensidad de la lesión producida.
Si el daño es más intenso se libera
también la AST mitocondrial, por
lo cual es marcador de necrosis
hepatocelular. También es un
marcador cardiaco.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de GOT en
UI/L de plasma.
Niveles de
Alaninoamino-
Enzima que transfiere el grupo
amino de la alanina al α-
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de GPT en UI/L
51
transferasa o
transaminasa
glutámico-
pirúvica (ALT o
SGPT)
cetoglutarato con el resto del
ácido pirúvico, con formación de
glutamato y piruvato. Es un
marcador de lesión y necrosis
hepatocelular.
de plasma.
Niveles de
Bilirrubinas
La bilirrubina es un tetrapirrol
lineal liposoluble que procede del
metabolismo del grupo hem de
varias proteínas (85% proviene de
la hemoglobina y 15%
catabolismo de hemoproteínas
tisulares). Es marcador de daño
hepatocelular y de obstrucción
biliar.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de bilirrubinas
en mg/dL de
plasma.
Niveles de
Proteínas totales
Las proteínas totales están
integradas por las fracciones
albúmina y globulina, que se
determinan por procedimiento
electroforético. Es un marcador de
hepatopatía crónica
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de proteínas en
g/dL de plasma.
Niveles de
Albúmina
Es una proteína producida por el
hígado, que se encuentra en gran
proporción en el plasma
sanguíneo, siendo la principal
proteína de la sangre, y una de las
más abundantes en el ser humano.
Es un marcador de lesión hepática
crónica y también de trastorno
glomerular que provoca la pérdida
de proteínas por orina, que excede
la capacidad de síntesis hepática.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de albúmina en
g/dL de plasma.
Niveles de γ –
glutamiltrans-
peptidasa o γ –
glutamiltrans-
Enzima que cataliza la
transferencia de grupos gamma-
glutamil de un péptido a otro o de
un péptido a un aminoácido. La
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de γ-GT en UI/L
de plasma.
52
ferasa (γ-GT) determinación de la concentración
de la enzima se considera buen
marcador de la enfermedad
hepatobiliar y de las hepatopatías
con daño celular.
Niveles de
Colesterol
Lípido de origen hepático que
interviene de forma esencial en la
constitución de las membranas
celulares, de las lipoproteínas
plasmáticas y en la síntesis de las
hormonas tiroideas
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de colesterol en
mg/dL de
plasma.
Niveles de
Triglicéridos
Son lípidos formados por una
molécula de glicerol y tres
moléculas de ácidos grasos; su
función principal es transportar
energía hasta los órganos de
depósito.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de triglicéridos
en mg/dL de
plasma.
Niveles de
lipoproteínas de
alta densidad
(HDL-colesterol)
Son unas partículas de muy
pequeño tamaño compuestas por
grasas (sobre todo por colesterol y
fosfolípidos) y una proporción
alta de proteínas (sobre todo una
proteína que se llama
apoliproteína A-1). Precisamente,
es esta proporción alta de
proteínas la que hace que tengan
una densidad alta.
El perfil lipídico incluye
marcadores de riesgo aterogénico
y alteraciones metabólicas (cuya
causa no necesariamente tiene su
base en el metabolismo lipídico,
pero se da de forma secundaria).
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de HDL-
colesterol en
mg/dL de
plasma.
Niveles de Base nitrogenada que se forma en Cuantitativa Razón Concentración
53
Creatinina los músculos a partir creatina
hidrolizada por acción del fosfato
de creatina como resultado del
proceso de contracción muscular.
2% de dicha sustancia se
convierte diariamente en
creatinina. Se elimina en su
totalidad por el riñón y no sufre
reabsorción tubular por lo que es
útil como marcador de fallas en la
función renal.
Continua de creatinina en
mg/dL de
plasma.
Niveles de Urea Es el producto final del
metabolismo proteico.
Es sintetizada por el hígado, pasa
al torrente sanguíneo y se excreta
por el riñón. Toda lesión renal que
perturbe la función excretora, se
refleja en un aumento de la urea
sanguínea.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de urea en
mg/dL de
plasma.
Niveles de Ácido
úrico
Es el producto del catabolismo de
las purinas. Su mayor parte se
excreta por el riñón y una
proporción menor por el tracto
intestinal. En una insuficiencia
renal progresiva hay una retención
de urea, creatinina y ácido úrico.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de ácido úrico
en mg/dL de
plasma.
Niveles de Calcio El calcio es el mineral más
abundante e importante del cuerpo
humano, el 99% se halla en los
huesos. La concentración sérica
de calcio incluye la fracción de
calcio unido a proteínas
(fundamentalmente la albúmina) y
calcio iónico, que representa
Cuantitativa
continua
Razón Concentración
de calcio en
mg/dL de
plasma.
54
aproximadamente el 50% del
calcio total y que es
fisiológicamente activo. Es un
marcador que detecta un déficit
del funcionamiento del
parénquima renal, lo cual produce
una alteración de la 1-α-
hidroxilación de la 25-hidroxi-
vitamina D.
Niveles de
Fósforo
Es un mineral presente en el
plasma y es esencial para el
metabolismo normal de los
carbohidratos, grasas y proteínas,
así como para la generación de
energía desde estas fuentes. Sus
variaciones en el plasma se
relacionan con insuficiencia renal
aguda o crónica y/o insuficiencia
hepática aguda grave, trastorno
metabólico óseo.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de fósforo en
mg/dL de
plasma.
Niveles de
Magnesio
Es el segundo catión intracelular
más abundante en el organismo
humano después del potasio,
siendo esencial en gran número de
procesos enzimáticos y
metabólicos. Permite al
organismo utilizar el ATP
(adenosín-trifosfato) como fuente
energética. El riñón es el órgano
fundamental para el control del
nivel sérico. Sirve como marcador
de insuficiencia renal y perdidas
gastrointestinales, como diarrea,
malabsorción, o pérdidas renales
que ocurren en el empleo de
Cuantitativa
continua
Razón Concentración
de magnesio en
mg/dL de
plasma.
55
medicamentos diuréticos o
nefrotóxicos y diaforéticos.
Niveles de Ion
Cloro (Cl-)
Anión extracelular necesario para
el balance ácido-base y la
regulación osmótica del fluido
extracelular. Varía en condiciones
de alteraciones del equilibrio
ácido-base y otros procesos que
incluyen perdida de aniones como
el vómito o la diaforesis intensa.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de cloro en
mmol/L de
plasma.
Niveles de Ion
Potasio (K+)
Es el catión de mayor
concentración en el líquido
intracelular (150 mEq/L). Su
dosificación es indispensable en
todo estudio de balance
electrolítico, pues muestra
alteraciones en insuficiencia renal
aguda y crónica, acidosis,
alcalosis y elevadas pérdidas de
potasio, tanto renales como
extrarrenales.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de potasio en
mmol/L de
plasma.
Niveles de Ion
Sodio (Na+)
Es el catión más importante de los
líquidos extracelulares, pues de su
concentración depende el grado
de hidratación celular,
estableciendo la verdadera presión
osmótica de los líquidos
intersticiales. Su determinación es
indispensable en el estudio de
balance electrolítico. Es un
marcador de insuficiencia renal
aguda y crónica, o en el hiper-
aldosteronismo, insuficiencia su-
prarrenal, síndrome nefrótico y
otros trastornos frecuentes.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de sodio en
mmol/L de
plasma.
56
Niveles de
Glicemia
Es una hexosa que se descompone
por oxidación secuencial
liberando energía. Es un marcador
de alteraciones pancreáticas
endocrinas en el hígado e intestino
delgado. También se modifican
sus niveles como efecto de
múltiples procesos que alteran los
niveles hormonales que a su vez
regulan las hormonas pancreáticas
(estrés).
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de glicemia en
mg/dL de
plasma.
Niveles de α-
amilasa
Es una enzima pancreática que
ayuda a digerir el glucógeno y el
almidón ingeridos en el intestino
delgado. Su determinación se
realiza principalmente para
diagnosticar o controlar daño en el
páncreas.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de α-amilasa en
UI/L de plasma.
Recuento de
Glóbulos rojos
Concentración de eritrocitos en
sangre total venosa.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de millones de
glóbulos rojos
por mm3 de
sangre.
Hematocrito Representa la proporción de
glóbulos rojos frente a la fracción
plasmática en la sangre.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
del hematocrito
en %.
Niveles de
Hemoglobina
Representa la cantidad de esta
proteína por unidad de volumen
de sangre total.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de hemoglobina
en g/dL de
sangre.
Recuento de
Glóbulos blancos
Cantidad de leucocitos por mm3.
Cuantitativa
Continua
Razón Concentración
de glóbulos
rojos por mm3
de sangre.
Recuento Recuento de las células que se Cuantitativa Razón Concentración
57
Diferencial de
glóbulos blancos
encuentran en sangre periférica
los cuales son: los neutrófilos,
eosinófilos, basófilos, linfocitos y
monocitos.
Continua de la serie de
blanca en %.
10. DISEÑO METODOLÓGICO
A. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
A.1. Tipo de investigación
Esta investigación es de tipo experimental in vitro e in vivo, de tipo subagudo4.
A.2. Métodos generales de la investigación
La experimentación se desarrolla en conejos a los que se administró extracto hidro-
alcohólico de E. coca en dosis mínima, media y máxima y en conejos del grupo
control que no recibieron el extracto hidro-alcohólico de E. coca, pero estuvieron
sometidos a las mismas condiciones que los otros animales. Se llevó a cabo en el
bioterio de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA, durante un
período de 36 días. Pasado los días de experimentación se procedió con la eutanasia de
cada conejo, se extrajo la muestra sanguínea intracardiaca y los órganos internos para
el estudio histopatológico. Este último estudio no es parte de la tesis pero si del
proyecto matriz, al cual está sujeto el presente estudio.
Las pruebas hematológicas se procesaron el mismo día en el laboratorio de
Biomedicina Experimental del Instituto de Servicios de Laboratorio de Diagnóstico e
Investigación en Salud (SELADIS). Para las pruebas bioquímicas se separó el plasma
4 Estudios subagudos.- Se define como los efectos tóxicos que se manifiestan tras la administración repetida de una
sustancia durante un corto período de tiempo, generalmente entre 14 y 30 días (Gámez, 2007).
58
de la sangre total y estos fueron almacenados a -78ºC hasta su procesamiento el cual
se realizó en el laboratorio de Fisiología Experimental del Instituto Boliviano de
Biología de Altura (IBBA). Los órganos internos de los conejos se conservaron en
formol al 40%, y se transportaron a la unidad de Patología del Hospital Militar
COSSMIL.
B. DESCRIPCIÓN DEL ÁMBITO DE INVESTIGACIÓN
La investigación experimental (manutención de animales, administración del extracto y
medición de variables in vivo) se realizó en el bioterio la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímicas, UMSA, ubicado en la Avenida Saavedra Nº 2224. El procesamiento de las
pruebas bioquímicas se realizó en el Laboratorio del Instituto Boliviano de Biología de Altura
(IBBA), ubicado en el Complejo Hospitalario, calle Claudio Sanjinés sin Nº. Las pruebas
hematológicas se procesaron en el laboratorio de Biomedicina Experimental del Instituto de
Servicios de Laboratorio de Diagnóstico e Investigación en Salud (SELADIS) ubicado en la
Avenida Saavedra Nº 2224.
C. DETERMINACIÓN DE LA POBLACIÓN EN ESTUDIO
C.1. Descripción de la población
La población en estudio son conejos (Oryctolagus cuniculus) de la Raza Nueva
Zelanda blanco, cuyas características para ser objeto de estudio son las siguientes:
El conejo es una de las especies más utilizadas en las investigaciones
biomédicas, estos animales pequeños tienen grandes ventajas económicamente
sobre los de mayor tamaño porque son de menor costo de producción, el
mantenimiento es más fácil, requieren condiciones más sencillas, ejemplos: el
59
alimento (el conejo es un animal no muy exigente con la comida ya que tiene
una gran capacidad para adaptarse al tipo de alimento que predomine, según la
región natural), la temperatura (los conejos toleran grandes fluctuaciones
térmicas, entre 10 a 26 ºC, es recomendable un rango de entre 18 a 22 ºC); y
además es ideal para este estudio toxicológico (Fuentes et al., 2010). Por lo
demás, para este tipo de estudios preclínicos, se requieren al menos dos tipos
de animales experimentales, de los cuales al menos uno debe no ser roedor5.
Habiéndose realizado simultáneamente la experimentación con ratas, en este
trabajo se reporta lo ejecutado en conejos.
Como se trata de un sujeto experimental, también nace el concepto de reactivo
biológico: un animal de experimentación, capaz de dar una respuesta fiable y
reproducible. Para su idoneidad la pureza del animal debe ser vigilada,
controlada y contrastada. No se debe olvidar que también son susceptibles a la
contaminación tanto biótica como abiótica, que puede provocar un efecto
distorsionador sobre los resultados del proceso experimental. Por otro lado, la
posibilidad de reproducir las experiencias está limitada por su propia
variabilidad biológica. Sobre esta base, el empleo de animales homogéneos
asegura la fiabilidad de la respuesta esperada (Maldonado, 2016). La
homogeneidad del reactivo biológico, presenta:
- Homogeneidad somática: Igualdad de sexo, peso, edad, con pareamiento
según diseño experimental.
- Homogeneidad genética: Esto se obtiene habitualmente por una tasa de
consanguinidad elevada. Sin embargo en los conejos el procesado de
obtención de consanguinidad es costoso y difícil por lo que solo se logró
contar con especímenes criados en una granja en la que los cruces son
controlados y las condiciones de criar son las recomendadas por los
5 El Manual de experimentación con Plantas Medicinales de la OMS de 1995, hace énfasis en este procedimiento.
60
criadores de la Facultad de Agronomía en la cátedra de pequeñas especies
(Hernández, 2006). Los conejos utilizados provienen de un pie de cría
Nueva Zelanda adquirido de criadores comerciales.
- Homogeneidad sanitaria: Se evitó la tendencia a posibles perturbaciones
debidas a estados patológicos no deseados, que influyen en la expresión
genética del animal (genotipo), condicionando a largo plazo el fenotipo y a
corto plazo el estado físico (Hernández, 2006) (Morales, 2015).
Para la selección de la población de estudio se tomaron en cuenta los siguientes criterios de
inclusión, exclusión y eliminación:
C.1.1. Criterios de inclusión:
Conejos de Raza Nueva Zelanda blanco, de los cuales se tomó en cuenta a los conejos sanos
libres de entero-parásitos y ectoparásitos con las siguientes características (Fuentes et al., 2010):
Los conejos sanos están alertas, activos y en buenas condiciones físicas.
Presentan los ojos claros y brillantes y el pelaje suave y brillante, excepto cuando
pelecha (refiere a la caída o retiro del pelaje del conejo, esto sucede en las hembras
reproductoras momentos antes del parto, después del destete, por falta de vitaminas y
también en machos cuando cambian de pelaje, además si tienen infección parasitaria
causantes de la sarna u otro similar) (Fuentes et al., 2010).
Tienen buen apetito, por lo tanto, la comida es consumida rápidamente y la
ganancia diaria de peso es continua.
C.1.2. Criterios de exclusión:
Conejos de otra raza como ser:
Raza californiano, de cuerpo cilíndrico, piel blanca con manchas negras sobre el
hocico, las orejas, el rabo y las cuatro patas.
61
Raza Chinchilla, de cuerpo corto y fino, la piel cubierta de pelos negros y blancos
entremezclados, dando aspecto de color grisáceo (Lebas et al., 1996).
C.1.3. Criterios de eliminación:
Conejo enfermo de Raza Nueva Zelanda blanco que muestre algún comportamiento
particular, como ser:
Que tiene el pelo hirsuto, se muestra desinteresado por lo que lo rodea, se
acurruca generalmente en el fondo de la jaula y se muestra aletargado e
indiferente.
También si es que presentó pérdida del apetito, con disminución del estado
general.
Puede tener problemas respiratorios evidenciados en la respiración dificultosa y
descarga nasal, también diarrea o descarga de mucus y chirrido de dientes
(Fuentes et al., 2010).
C.2. Muestra
Se utilizó 20 conejos (Oryctolagus cuniculus) para esta investigación Pre-clínica de corte
subagudo. Esta determinación del tamaño de la muestra es un factor crítico en este estudio de
comparación para obtener diferencias significativas entre los grupos. Si bien es deseable
contar con el mayor número posible de animales en cada grupo para asegurar la
reproducibilidad estadística de los resultados se debe prestar atención a los requisitos legales y
las consideraciones éticas y prácticas para mantener el número de animales tan pequeños
como sea posible (Rodríguez, 2007; Morales, 2015; Villamizar y Guerra, 2016). Por tanto,
se defiende la idea, que reducir al mínimo el uso de animales en la investigación no solo es
una exigencia de los organismos de financiación en todo el mundo, sino también una
obligación ética (Hernández, 2006).
62
D. ASPECTOS ÉTICOS
El protocolo de investigación ha sido aprobado por el comité de ética de la UMSA al
momento de su aprobación por los fondos IDH 2013-2014, para el proyecto RES.C.T.A.
88/2017; RES.H.C.F. Nº 179/17 “Investigación Pre-clínica de la toxicidad/inocuidad de E. coca:
estudios in vitro e in vivo en modelos experimentales animales”, Instituto SELADIS-UMSA (Ver
anexo 3, la copia del original), del cual forma parte este trabajo6.
E. MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales y equipos utilizados para el conjunto de pruebas bioquímicas y el manejo
experimental se consignan en un listado en anexo 4. En los siguientes subtítulos solo se
describen los procedimientos aplicados, especificando algunos utilizados en cada prueba.
E.1. Diseño experimental.
Se conformaron 4 grupos de 4 animales (2 machos y 2 hembras por grupo). Tres para las
dosis mínima, media y máxima, y dos sin extracto (grupo control). Estos se distribuyeron en
jaulas separados, en las que se colocó dos conejos del mismo sexo y del mismo grupo.
Adicionalmente se utilizaron 4 animales que complementaron el grupo control, por lo que en el
6 Originalmente en el Proyecto matriz, el estudio fue planteado como un trabajo de seguridad clínica en humanos. La Comisión de ética de la
UMSA, determinó que de manera previa debería realizarse en animales tal como lo recomienda la Organización Panamericana de la
Salud/Organización Mundial de la Salud OPS/OMS (OPS/OMS, 2007) (Martínez et al., 2015).
En este aval la comisión de ética no valoro el componente relacionado con los animales de experimentación. Esta valoración hasta el momento de
la aprobación del trabajo, no pudo ser solicitada a ninguna entidad que realice este tipo de tareas; no se logró determinar la existencia de alguna
entidad que se dedique a esta actividad (comités de bioética para valorar la experimentación en animales) en nuestro medio (Mashiri y Elizabeth,
2010) (Cortes, enero-junio 2014) (Cortes, agosto de 2017). De hecho, actualmente tampoco existe un tribunal de bioética para experimentación
con animales, en las tres facultades de la UMSA que cuentan con bioterio o granjas de experimentación de animales: Facultad de Ciencias
Farmacéuticas y Bioquímicas, Facultad de Medicina y Facultad de Agronomía.
De todos modos los procedimientos de experimentación se realizaron en el marco de los estándares bioéticos que se utilizan para este tipo de
trabajos (Jayo y Cisneros, 1999) (Hernández, 2006) (OPS/OMS, 2007) (Fondecyt, 2009) (Martínez et al., 2015).
63
grupo control se consideraron 8 conejos: 4 conejos estuvieron en las mismas condiciones
experimentales de los grupos que recibieron el extracto (se realizó test de Irwin modificado
excepto la administración del extracto); los otros 4 conejos estuvieron en las condiciones de
crianza habituales, sin recibir el extracto. De estos, solamente se obtuvo la sangre y los órganos
para las pruebas bioquímicas e histopatológicas respectivamente.
Suministro del extracto
Por cuestiones relacionadas con las limitaciones que imponen las actuales normas de bioética, la
modalidad del suministro del extracto fue efectuado sobre la base de las siguientes
consideraciones:
La administración de harina de coca o del EHAEc en polvo de manera directa por vía
digestiva a través de cánula o sonda nasogástrica mostró dificultades extremas en un
grupo de conejos en los que previamente se ensayaron los procedimientos. Se pudo
advertir malestar y sufrimiento del animal al aplicar estos dispositivos. Como dicho
procedimiento debía ser diario, se preveían las mismas y crecientes dificultades a lo
largo de la experimentación.
La posibilidad de incorporar la harina o el extracto en el alimento, también fue
excluida porque los animales rechazaban el mismo, lo que conducía a una reducción
de peso con consecuencias previsibles en la inmunidad y el metabolismo, por lo que
existía la posibilidad de que los resultados se deban mayormente a esta situación y no
a la administración de la coca.
La administración del extracto como líquido a través de dispositivos de suministro
oral (sonda), mostraba las mismas dificultades que la administración de la harina.
Por lo anterior se decidió adicionar el extracto al agua de consumo a diferentes dosis.
Por la apetencia de los conejos a la alfalfa se adiciono 5 % de un molido total de este
64
vegetal con lo cual el líquido fue ingerido sin mayores dificultades por los conejos.
Sin embargo, como era de esperarse, al ser ingerida el agua más extracto ad libitum
los especímenes no tomaban la misma cantidad diaria. Por tal hecho, se evaluó el
promedio de ingesta y se vio que los montos que ingerían los días que tomaron no
eran mayores a más o menores a una desviación estándar (+/-1DS) del promedio.
La dosis mínima del extracto del EHAEc se suministró en montos equivalentes a 3 g
de hoja de coca que es el utilizado para el consumo de humano [monto indicado por
la medicina tradicional (Rojas, 2013), la dosis media es 10 veces la dosis mínima y la
dosis máxima es 33 veces la dosis mínima (escala semi-logarítmica de
concentración). El cálculo se lo realizó en términos de kilo peso, asentando un peso
promedio de 70 kg para humanos y 1,500 g para conejos, con un rendimiento de
obtención del EHAEc de 16% aprox. Por lo tanto, 3 g de hoja de coca es equivalente
a 450 mg del EHAEc en un humano y en un conejo es 9,64 mg. Se disolvió 9,64 mg
del EHAEc en 100 ml de agua estéril para consumo. Entonces se suministró a cada
jaula según dosis correspondiente, 250 ml del EHAEc disuelta en agua estéril/día y al
grupo control 250 ml de agua/día a cada jaula, conociendo que en cada jaula se
colocó a dos conejos. En ese orden, el suministro del EHAEc en agua bebible fue en
los siguientes montos:
Tabla 9. Contenido del EHAEc en mg en cada dosis administrada
para un volumen de 250 ml para cada jaula
DOSIS Peso EHAEc mg
MINIMA 24,1
MEDIA 241
MAXIMA 795,3
65
● Se destaca que este último procedimiento no generó cambios en los animales que
sean compatibles con un estado de estrés, tal como pudo advertirse con los otros
procedimientos desestimados.
Fig.1. Se observa el consumo del extracto hidro-alcohólico ad libitium
E.2. Obtención del extracto hidro-alcohólico de hoja de coca
Las hojas de coca fueron provistas por el Viceministerio de la Coca y Desarrollo Integral, las
mismas que provenían de un cultivo en parcela controlada en la región de Los Yungas
(Municipio de Coroico, Central Suapi, La glorieta) en la que no se aplicaron productos químicos,
en calidad de pesticidas. Las características fisicoquímicas de este material vegetal fueron
estudiadas por el laboratorio de bromatología del Instituto SELADIS; los resultados de estos
estudios se muestran en el anexo 5.
Para eliminar partículas y microorganismos que pudiera contener el producto, este fue lavado
con agua corriente y después sumergido por 5 minutos 3 veces, de manera continuada y
secuencial, en una solución de etanol al 70 % en agua tri-destilada. Después se secaron las hojas
a temperatura ambiente. Una vez secas, las hojas fueron molidas en molino con cuchillas de
66
acero inoxidable (Buhler Miag, Milano) a diámetro semi-fino para lograr un pulverizado o
“harina” de coca. Este producto fue macerado en una solución de etanol con agua al 50 % en la
siguiente proporción: 100 gramos de hoja por 1 litro p/v. por 48 horas.
El sobrenadante fue filtrado en papel Whatman 3 y sometido a evaporación en rota-
evaporador para eliminar el alcohol. El agua fue eliminada por liofilización en un equipo
LabConco. Se logró un polvo fino, que fue conservado a 4ºC hasta su uso (El procedimiento de
la extracción, incluyendo las pruebas para obtener el mejor rendimiento se consignan en el anexo
6). El rendimiento promedio fue de 16%.
La composición de la hoja coca no se determinó en este estudio, puesto que existen previos
estudios, mencionados en el marco teórico.
E.3. Animales experimentales
La experimentación se realizó con conejos (Oryctolagus cuniculus) de la cepa Nueva
Zelanda, de ambos sexos, los cuales provienen de un pie de cría (un macho y una hembra)
adquiridos de criadores comerciales. Fueron criados en la Granja de la Facultad de Agronomía
en Cota Cota, a cargo de la cátedra de especies menores en condiciones convencionales. El peso
de los animales fue diverso, no obstante que la edad no variaba en más de dos meses. Ante esto
se optó por parear las unidades de observación, es decir que en cada grupo se incorporó animales
de alto y bajo peso, de modo que en todas las jaulas la suma de los pesos sea equivalente. La
experimentación fue llevada a cabo en el bioterio de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímicas, la cual se inició después de un periodo de adaptación y control de 3 semanas. Se
cumplió con las condiciones de crecimiento y minimización del estrés, como ser: ventilación
correcta, luz artificial 12 a 13 horas, el control de la temperatura ambiental del bioterio fue en la
mañana (20±0,2) ºC y en la tarde (21 0,3) ºC; y la humedad relativa en la mañana fue
(49+3,2)% y en la tarde (51+2,8) %, los animales estaban aislados del ruido por la ubicación del
67
ambiente dentro del Bioterio. Se realizó esterilizaciones de las jaulas con la flama de fuego cada
2 semanas, además de la limpieza diaria de las jaulas.
E.3.1. Alimento: suministro y preparación
Se continuó con la alimentación suministrada en la granja de cría por lo que se preparó el
alimento según el siguiente procedimiento:
Para obtener 1 kilo de peso seco de alimento se mezcló: 600 g de afrecho, 250 g de frangollo,
150 g de torta de soya y 10 g de sal mineral. Cada 100 g de alimento seco fue mezclado con 60
ml de agua estéril para formar una pasta que se suministró en los receptáculos de alimento de los
conejos. También se permitió la ingesta de alfalfa (Medicago sativa) ad libitum, observándose
que el consumo de ese producto era similar en monto, independientemente del grupo de
pertenencia de los animales. La medición del consumo se efectuó restando a lo suministrado el
peso de lo no consumido.
El extracto hidro-alcohólico de E. coca (EHAEc) fue administrado por vía oral adicionando
dicho extracto, como polvo seco, al agua de consumo en la cual se solubilizó. Se adicionó este
producto en montos definidos de acuerdo a dosis a ser administrada. La cantidad de EHAEc
consumida se calculó para cada animal, de acuerdo al monto de agua ingerida.
68
Fig.2
Fig.3
Fig.2 y Fig.3. Se observa a los conejos consumiendo alimento balanceado
E.3.2. Medición de parámetros generales:
E.3.2.1. Test de Irwin modificado
Este test incluye la exploración de 34 variables, que evalúan tres áreas de posible afectación:
a) efectos sobre el sistema nervioso central, b) efectos generales y c) efectos “subjetivos”. Las
evaluaciones se realizaron cada 24 horas a partir del día cero. La evaluación consistió en la
observación y aplicación de algunas maniobras específicas para los reflejos. La calificación se
realizó mediante la categorización de cada una de las variables: (-) respuesta sin cambios, (+)
69
cambios leve a moderado y (++) cambios exagerados. Las respuestas de la evaluación de los
reflejos y las subjetivas fueron categorizados como dicotómicas: (+) presenta y (-) no presenta.
En el anexo 7 consigna todos los parámetros explorados.
Fig.4. Se observa el manejo del animal para la evaluación del Test de Irwin modificado
E.3.2.2. Evaluación del Peso de los animales
El control de peso, se realizó diariamente al inicio de los procedimientos de evaluación, a la
misma hora y en las mismas condiciones. Se utilizó una balanza analítica marca “OHAUS”;
previa realización del taraje se colocó un contenedor para el conejo, luego se procedió a
introducir al animal, cuidando que permanezca quieto durante la lectura de los valores en la
pantalla de la balanza, los datos fueron registrados en un formulario destinado para el propósito.
La maniobra fue realizada por personal entrenado y con normas e indumentaria de bioseguridad.
70
Fig.5. Se observa el pesaje de los conejos Nueva Zelanda blanco
E.3.2.3. Medición del peso de consumo de alimento
Diariamente, se hizo el registro del peso de alimento consumido en un formulario cerrado
específicamente diseñado para este propósito. El pesaje se realizó en una balanza analítica de 0-
2000 g marca “OHAUS” previo taraje de la misma. La cantidad consumida se determinó
midiendo la diferencia entre lo suministrado y lo no consumido (remanente diario), en gramos.
Considerando que el consumo era ad libitum, el cálculo de consumo se hizo por grupo y se
expresó por cada 100 g de peso animal.
E.3.2.4. Evaluación del consumo de agua
La medida del volumen de agua consumida se realizó utilizando una probeta graduada. Se
midió previamente la cantidad con la que inició el día cero, al momento de evidenciarse un
consumo del 75% el líquido fue nuevamente suministrado, hasta alcanzar una disposición
constante y continua de agua. Se llegó a la conclusión de que se debía suministrar 250 ml/día de
71
agua con EHAEc disuelta en agua, a diferentes concentraciones, a cada jaula conformado por dos
conejos.
E.3.2.5. Evaluación de la temperatura corporal
Durante el estudio, la evaluación de la temperatura se realizó cada día a lo largo del tiempo
que duró el experimento; se efectuó la medición a la misma hora y en las mismas condiciones.
La medida se hizo con un termómetro “Physitemp” TCAT-2AC, que dispone de un bulbo
metálico para vía rectal.
Se colocó al animal sobre el mesón de trabajo, se inmovilizó tomándolo de la base de la cola
y apoyando la palma de la mano en el dorso; exponiendo la región anal se introdujo el bulbo, el
cual previamente fue lubricado con vaselina líquida. El registro se realizó hasta la estabilización
de la lectura en pantalla, lo cual duró aproximadamente 10 a 15 segundos, al cabo de los cuales
se retiró suavemente el bulbo. Los datos fueron registrados en el formulario destinado a la
evaluación general (Test de Irwin modificado).
Fig. 6. Se observa la medición de la temperatura rectal de los conejos
E.3.3. Obtención de sangre y órganos
Al final del periodo de experimentación los animales fueron sometidos a depresión del
Sistema Nervioso Central por saturación de CO2 en ambiente cerrado. Una vez dormidos se
72
sacrificaron induciendo anestesia profunda con Halotano, por inhalación a partir de algodón
saturado con el anestésico. Una vez lograda la ausencia total de sensibilidad, se procedió al
sacrificio por punción cardiaca después de exponer el corazón por corte quirúrgico del peto
esterno-costal y apertura de la cavidad torácica. La sangre obtenida (16-18 cm3) fue
inmediatamente sometida al procesamiento requerido para evaluar los parámetros hematológicos
y la obtención de plasma.
Los órganos fueron retirados utilizando material quirúrgico que permitió debridar ligamentos
y cortar paquetes vásculo-nerviosos. Cada órgano fue puesto en formalina al 40% hasta su
procesamiento histopatológico (en anexo 8 se muestran los resultados de parámetros histo-
patológicos, para motivos de correlación con los resultados bioquímicos).
E.3.4. PROCEDIMIENTOS BIOQUÍMICOS:
Obtención del plasma:
Se obtuvo la sangre por punción cardiaca
Se recogió la sangre en tubo con heparina sódica como anticoagulante y se
homogenizo por agitación leve.
Se centrifugo a 2000 r.p.m. por 5 minutos.
Se separó el plasma en tubos Eppendorf.
El plasma obtenido de cada animal fue congelado a -78 ºC hasta su procesamiento. Las
diferentes pruebas (colorimétricas y cinéticas) fueron ejecutadas en un fotómetro ERWA
Mannheim, Modelo: CHEM 7, con software incorporado. El equipo CHEM 7 facilita la
memorización de la Densidad óptica (D.O.) o absorbancia del blanco de reactivo, D.O. del
blanco de muestra, memorización de estándar, del factor y de las curvas no lineales.
73
El principio de operación de uso del equipo CHEM 7, fue el arrastre y volumen de
aspiración. El arrastre es la influencia de una solución, a la cual otra solución ha sacado de la
celda de flujo, sobre las lecturas de absorbancia de la solución que se aspira a continuación.
Después de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a través de la solución muestra
en la celda de flujo, el fotómetro detecta la cantidad de fotones que se absorbe y luego envía una
señal a un galvanómetro o una pantalla digital. La medición de la absorbancia se basa en la
interacción entre la luz introducida y el producto según la ley de Lambert-Beer.
Control de calidad preventivo.- Para efectuar el control de calidad preventivo se tomó en
cuenta control de material y reactivos y control analítico de los métodos.
Control del material y reactivos:
Se verificó el buen funcionamiento del analizador semi-automático ERWA Mannheim,
Modelo: CHEIM-7.
Se verificó la calibración de las micropipetas.
Se verificó que el material fungible a utilizar estuviera escrupulosamente limpio para la
determinación de los marcadores bioquímicos; y se utilizó material nuevo para la
determinación.
Se verificó también la integridad, la fecha de vigencia y conservación de los reactivos.
Se verificó las técnicas y métodos, mediante la verificación de la programación de las
pruebas y la calibración de los mismos en el equipo.
Calibración del equipo de medición: Las curvas de los analitos ya se encontraban establecidas
por ser prueba de rutina en el laboratorio. Pero se ajustó la calibración, para lo cual se utilizaron
estándares (sueros de viscosidad y características similares) propios de los siguientes analitos: las
proteínas totales, la albúmina, la creatinina, la urea, el ácido úrico, el colesterol, los triglicéridos,
las HDL-colesterol, la glicemia, el calcio, el magnesio, el fósforo, el cloro, el potasio y el sodio.
74
Los estándares se trabajaron como si fuera una muestra más, con el correspondiente
procedimiento de cada analito, pero se leyó en el equipo CHEM 7 como estándar, para guardar
su absorbancia en dicho equipo.
Para las pruebas de cinético-factor, se trabajó con un factor provisto en el protocolo, para los
siguientes analitos: las transaminasas, la FAL, la -GT y la α- amilasa.
Control analítico de los métodos.- En este control se tomó en cuenta la confiabilidad y
practicabilidad.
Confiabilidad.- En los prospectos de cada juego diagnóstico se mencionan los datos sobre
especificidad, linealidad, sensibilidad, precisión, exactitud, estos datos fueron generados durante
el desarrollo de cada procedimiento por sus autores y confirmados por los fabricantes en el
desarrollo de cada juego diagnóstico. Por tanto los métodos utilizados en este estudio fueron
estandarizados contra los métodos recomendados por la Federación Internacional de Química
Clínica y Medicina de Laboratorio (IFCC), Sociedad alemana de química clínica (DGKC) y
Sociedad escandinava de química clínica (SCE), según los casos (Pesce y Kaplan, 1990)
(Velázquez, 2009).
Estos kits comerciales certificados, si bien son utilizados para el diagnóstico clínico en
humanos, su uso en animales está avalado por diferentes autores (Mussan y Rave, 1978) (López,
Márquez y Mendoza, 2000) (Pascual, Sánchez y Rosas, 2003) (Archetti et al., junio 2008). De
hecho, lo que se mide en el caso de las enzimas no es el monto de las enzimas que podría ser
diferentes entre especies, sino es la actividad de cada enzima, que es igual en las diferentes
especies. También los diferentes autores muestran que estos kits comerciales se pueden usar en
diferentes especies ya que los analitos son los mismos, por ejemplo: glicemia, colesterol.
75
En cuanto a la exactitud analítica, se utilizó sueros control bovino normal y patológico, para
cada parámetro, permitiendo la validación de las pruebas analíticas, resultados se muestra en el
anexo 9.
Características de los sueros control. - Los sueros control bovino liofilizado utilizados tienen
concentraciones y actividad en el intervalo normal y patológico de los analitos, lo cual permitió
controlar la exactitud o la precisión de las lecturas.
PERFIL HEPÁTICO:
1. Determinación cuantitativa de Fosfatasa Alcalina
Método: Colorimétrico. Cinético: p-nitrofenilfosfato; tampón: dietanolamina con iones Mg.
Método optimizado basado en las recomendaciones de la Sociedad alemana de química clínica
(DGKC) y de la Sociedad escandinava de química clínica (SCE).
Principio del método: La fosfatasa alcalina (FAL) cataliza la hidrólisis del p-nitrofenilfosfato a
pH 10,4 liberando p-nitrofenol y fosfato, según la siguiente reacción:
p-nitrofenilfosfato p-Nitrofenol Fosfato
(color amarillo)
pH 10.4
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
76
La velocidad de formación del p-Nitrofenol, determinada fotométricamente a una longitud de
onda 405 nm, es directamente proporcional a la actividad de la FAL. La hidrólisis se realiza en
presencia de iones magnesio provisto por el tampón utilizado.
La actividad de la FAL se determinó midiendo el aumento de la absorbancia.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 600 uL del Reactivo Total (RT): mezcla de 100 uL de R2
substrato (p-nitro-fenilfosfato 10 mmol/L) más 400 µl R1 (tampón dietanolamina pH 10.4,
1mmol/L; cloruro de magnesio 0,5 mmol/L y se adicionó 10 µL de muestra de plasma. Se mezcló
y preincubó 1 minuto. Se leyó en fotómetro. La absorbancia fue traducida directamente por el
equipo en UI/L (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 UI/L, linealidad de 0,010 UI/L hasta 700 UI/L.
Especificidad: no hay interferencia significativa con bilirrubina no conjugada hasta 36 md/dL,
con bilirrubina conjugada hasta 25 md/dL, con hemoglobina hasta 50 g/dL, con triglicéridos
hasta 600 mg/dL, y también se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden
interferir, las drogas que provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%),
penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Young, 1997) (Vassault et al., 1999).
2. Determinación cuantitativa de GOT/AST
Método: Federación Internacional de Química Clínica y Medicina de Laboratorio (IFCC).
Malato deshidrogenasa (MDH)- dinucleótido de nicotinamida y adenina en su forma reducida
(NADH). Cinético UV.
Principio del método: La aspartato-aminotransferasa cataliza la transferencia reversible de un
grupo amino del aspartato al α-cetoglutarato con formación de glutamato y oxalacetato. El
oxalacetato producido es reducido a malato en presencia de malato deshidrogenasa y el NADH
77
es oxidado a NAD+:
→
Aspartato α-Cetoglutarato Oxalacetato L-Glutamato
+H+ →
Fuente: Murray, Granner y Rodwell, 2007.
La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio, determinada
fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de AST en la muestra ensayada.
El NADH se determina por absorbancia a 340 nm de longitud de onda.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500 uL de RT [mezcla de 100 µL del R2: substrato
(NADH 0,18 mmol/L; α-cetoglutarato 12 mmol/L), más 400 uL del R1 (tampón: TRIS pH 7,8 80
mmol/L; L-aspartato 200 mmol/L; y malato deshidrogenasa 600 U/L)] y se adicionó 50 uL de
muestra de plasma. Se mezcló y preincubó 1 minuto y se leyó en fotómetro. La absorbancia fue
Oxalacetato NADH
+
Malato NAD+
+
78
traducida directamente por el equipo en UI/L (Murray, Granner y Rodwell, 2007) (Pesce y
Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 UI/L, linealidad de 0.000 UI/L hasta 467 UI/L.
Especificidad: los anticogaulantes de uso corriente como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro
no afectan los resultados, la hemólisis interfiere con la determinación, y también se han descrito
muchas otras substancias y fármacos que pueden interferir, las drogas que provocaron más alerta
son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%)
(Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
3. Determinación cuantitativa de GPT/ALT
Método: LDH -NADH. Cinético UV. IFCC
Principio del método: La aspartato aminotransferasa cataliza la transferencia reversible de un
grupo amino del α-alanina al α-cetoglutarato con formación de glutamato y piruvato. El piruvato
producido es reducido a lactato en presencia de LDH y el NADH es oxidado a NAD+:
→
+ +
α-Alanina α-Cetoglutarato Glutamato Piruvato
𝑳𝑫𝑯→
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
79
La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio, determinada
fotométricamente es proporcional a la concentración catalítica de AST en la muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500 µL de RT [mezcla de 100 µL de R2: substrato (NADH
0,18 mmol/L; α-cetoglutarato 15 mmol/L), más 400 uL de R1: tampón (TRIS pH 7,8 100
mmol/L; L-alanina 500 mmol/L; lactato deshidrogenasa 1200 U/L)] y se adicionó 50 µL de
muestra de plasma. Se mezcló y preincubó 1 minuto. Se leyó en fotómetro a 340 nm de longitud
de onda. La absorbancia fue traducida directamente por el equipo en UI/L (Murray, Granner y
Rodwell, 2007) (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 UI/L, linealidad de 0,000 UI/L hasta 400 UI/L.
Especificidad: los anticoagulantes de uso corriente como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro
no afectan los resultados, la hemólisis interfiere con la determinación, y también se han descrito
muchas otras substancias y fármacos que pueden interferir, las drogas que provocaron más alerta
son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%)
(Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
4. Determinación cuantitativa de gamma-glutamil transferasa (γ-GT)
Método: Sustrato carboxilado. Cinético
Principio del método: La γ-GT cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamilo de la γ-glutamil-
p-nitroanilida al dipéptido aceptor glicilglicina, según la siguiente reacción:
→
L-γ-Glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida
+
Glicilglicina
L-γ-Glutamil-glicilglicina + Ácido 5-amino-2-nitrobenzoico
Fuente: Szewczuk, Kuropatwa y Lang, 1988.
80
La velocidad de formación del ácido 5-amino-2-nitrobenzoico que se absorbe a 405 nm de
longitud de onda es determinada fotométricamente y su monto es proporcional a la concentración
catalítica de γ-GT en la muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500 uL de RT [(400 uL de R1 (tampón: TRIS pH 8,6 100
mmol/L; glicilglicina 100 mmol/L), más 100 uL de R2 (substrato: L-γ-glutamil- 3- carboxi-4-
nitroanilida 3 mmol/L)] y se adicionó 50 µL de muestra. Se mezcló, se preincubó 1 minuto a
37ºC y se leyó en fotómetro a 405 nm de longitud de onda. La absorbancia fue traducida
directamente por el equipo en UI/L (Jean, Kuete y Jacobus, 2014) (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 UI/L, linealidad: 2 UI/L hasta 300 UI/L.
Especificidad: no utilizar plasma, los anticoagulantes inhiben la enzima, la hemólisis elevada
interfiere en el ensayo, y también se han descrito otras substancias y fármacos que pueden
interferir, las que provocaron más alertan fueron la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%),
penicilina (6.5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
5. Determinación cuantitativa de bilirrubina total y directa
Método: Dimetilsulfóxido (DMSO)- Colorimétrico
Principio del método: La bilirrubina se convierte en azo-bilirrubina color rojo-cereza mediante
una reacción de adición con el ácido sulfanílico diazotado, lo cual se midió fotométricamente.
De las dos fracciones presentes en suero: bilirrubin-glucurónico (polar) y bilirrubina libre ligada
a la albúmina (no polar), solo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa)
precisando la segunda la solubilización con DMSO para que reaccione (bilirrubina indirecta). En
la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiente el
resultado a la bilirrubina total.
La intensidad del color formado, la azobilirrubina, es proporcional a la concentración de
bilirrubina presente en la muestra ensayada.
81
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990
Procedimiento: En principio se prepararon los siguientes reactivos:
Blanco de bilirrubina total: Se colocó en un tubo 750µL R2 (Total): ácido sulfanílico 30
mmol/L y ácido clorhídrico 50 mmol/L) y se adicionó 50 µL de muestra de plasma.
Bilirrubina total: Se colocó en un tubo 750 µL R2 con 25 µL R3 (nitrito de sodio) y se
adicionó 50 µL de muestra de plasma.
Blanco de bilirrubina directo: Se colocó en un tubo 750 µL de R1 (ácido sulfanílico 30
mmol/L; ácido clorhídrico 150 mmol/L; dimetilsulfóxido 7mol/L) y se adicionó 50 µL de
muestra de plasma.
Bilirrubina directo: Se colocó en un tubo 750 µL R1 con 25 µL R3 y se adicionó 50 µL
de muestra de plasma.
82
Se mezclaron y la mezcla se incubó exactamente 5 minutos a 15-25 ºC. Se leyó en fotómetro en
el que la absorbancia fue traducida directamente por el equipo en mg/dL, a una longitud de onda
de 555 nm (530-580) (Murray, Granner y Rodwell, 2007) (Velázquez, 2009).
Características del reactivo: para bilirrubina total, sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 0,099
mg/dL hasta 18 mg/dL; para bilirrubina directa, sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 0,04 mg/dL
hasta 20 mg/dL. Especificidad, la presencia de hemólisis disminuye el valor de bilirrubina, y
también se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden interferir, las drogas
que provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina (6,5%),
hidroclorotiazida (4,7%) (Malloy y Evelyn, 1937) (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
6. Determinación cuantitativa de proteínas totales
Método: Biuret. Colorimétrico
Principio del método: En medio alcalino, las proteínas, las cuales contienen dos o más enlaces
peptídicos cercanos, forman un complejo color violeta azulado en presencia de sales de cobre,
conteniendo yoduro como antioxidante. Es posible que el color se desarrolle por la formación de
un ion coordinado, tetracúprico, con dos grupos amida adyacentes.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de proteína total en la
muestra ensayada.
83
Fuente: Venezolana, Mairin y Cortez, 2015.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500 uL de reactivo de Biuret (tartrato de sodio y potasio
15 mmol/L; yoduro sódico 100 mmol/L; yoduro de potasio 5 mmol/L; sulfato de cobre II 19
mmol/L) y se adicionó 12,5 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó a 5 minutos a 37ºC. Se
leyó en fotómetro a 540 nm (530-550) de longitud de onda, utilizando como blanco solo el
reactivo Biuret. La absorbancia fue traducida directamente por el equipo en g/dL (Bolaños et al.,
2003).
Características del reactivo: sensibilidad 1 g/dL, linealidad de 0,01 g/dL hasta 14 g/dL.
Especificidad: interfieren la hemoglobina, la lipemia, y también se han descrito muchas otras
substancias y fármacos que pueden interferir, las drogas que provocaron más alerta son la
furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Pesce y
Kaplan, 1990) (Young, 1997) (Burtis y Ashwood, 1999).
7. Determinación cuantitativa de albúmina
Método: Verde de bromocresol (3,3’,5’–tetrabromo-m-cresolsulfonftaleína). Colorimétrico
(Azul)
(violeta)
84
Principio del método: El procedimiento con verde de bromocresol es un ensayo por fijación de
colorante7. A pH ligeramente ácido el verde de bromocresol se encuentra en forma no ionizada
(amarillo). A medida que se agrega albúmina, la forma ionizada del colorante (azul) se fija
específicamente y así es eliminada de la solución. A medida que se agrega más proteína, se fija
mayor cantidad de la forma ionizada, con lo cual se ioniza una fracción significativa del
colorante, de modo que el color de la solución varía del amarillo al verde y luego al azul.
Verde de Bromocresol
(amarillo)
Albúmina
Amarillo verdoso
Fuente: Quesada, 2007.
7
Las técnicas de fijación de colorantes, se basan en un desplazamiento del máximo de absorción del colorante cuando está unido a la albúmina.
Este desplazamiento permite que el color resultante sea medido en presencia de un exceso de colorante, lo cual junto con la alta afinidad de fijación con la albúmina permite que todas las moléculas de esta proteína tomen parte de la reacción (Velázquez, 2009).
ph=4,20
Aniones orgánicos
+
·Albúmina
85
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1mL de verde de bromocresol 0,12 mmol/L (en su
composición incluyó también un tampón de succinato 0,075 mol/L a pH 4,20 y Brij-35, este
último es un detergente no iónico para reducir la absorbancia del blanco, evitar la turbidez y
favorecer la linealidad), y se adicionó 5 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 5 minutos
a 37ºC. En este procedimiento la absorbancia del verde de bromocresol unido a la albúmina se
leyó en fotómetro a 630 nm (600-650) de longitud de onda, utilizando como blanco solo el
reactivo. La absorbancia fue traducida directamente por el equipo en g/dL (Pesce y Kaplan, 1990)
(Quesada, 2007).
Características del reactivo: sensibilidad 1 g/dL, linealidad de 0,3491 g/dL hasta 6 g/dL.
Especificidad: no se han observado interferencias de bilirrubina hasta 110 mg/dL, hemoglobina
hasta 10 g/dL, lipemia hasta 1000 mg/dL, y también se han descrito muchas otras substancias y
fármacos que pueden interferir, las drogas que provocaron más alerta son la furosemida (10%),
acetaminofeno (9,8%), penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Doumas et al., 1981) (Pesce
y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
PERFIL LIPÍDICO:
8. Determinación cuantitativamente de colesterol
Método: Colesterol estearasa (CHE)/ Colesterol oxidasa (CHOD)/ Peroxidasa (POD)/ Trinder /
Enzimático colorimétrico
Principio del método:
El colesterol libre de la muestra, proveniente de la de la hidrólisis de los ésteres por acción de la
colesterol-esterasa, es oxidado a 4-colestona por acción del colesterol oxidasa.
El peróxido de hidrógeno producido, en presencia de peroxidasa, 4-aminofenazona y fenol,
forma una quinonaimina con un pico de absorción a 505 nm.
86
Fuente: Determinación de colesterol, 5 de Abril 2020
La intensidad del color rojo de la quinonaimina formada es proporcional a la concentración de
colesterol presente en la muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1 mL de RT [tampón PIPES (ácido 1,4-
piperazinedietanosulfónico) pH 6,0 90 mmol/L; fenol 26 mmol/L; colesterol esterasa 1000U/L;
colesterol oxidasa 300U/L; peroxidasa 650 U/L; 4-aminofenazona 0.4 mmol/L] y se adicionó 10
µL de muestra de plasma. La mezcla se leyó en un fotómetro a 505 nm (500-550) de longitud de
onda, utilizando como blanco la mezcla. La absorbancia fue traducida directamente por el equipo
en mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990) (Richmond, 1992).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 0,113 mg/dL hasta 750 mg/dL.
Especificidad: no se han observado interferencias de hemoglobina hasta 50 g/dL, bilirrubina
hasta 10 mg/dL, y también se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden
87
interferir, las drogas que provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%),
penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
9. Determinación cuantitativa de triglicéridos
Método: Lipasa/ glicerol quinasa (GK)/Glicerol-3-fosfato/ Peroxidasa/ Trinder/ Enzimático
colorimétrico.
Principio del método: Los triglicéridos en el plasma son hidrolizados por una lipoproteinlipasa
(LPL), liberando el glicerol. Posteriormente, éste es fosforilado a glicerol-3- fosfato (G3P) por
medio de la enzima glicerol quinasa (GK). El G3P es a su vez sustrato de la glicerol fosfato
oxidasa (GPO) que produce peróxido de hidrógeno (H2O2) y es convertido a dihidroxiacetona
fosfato (DAP) en la reacción. El H2O2 oxida a la 4-aminofenazona (4-AF), reacción catalizada
por la peroxidasa (POD), formando una quinona de coloración roja:
Glicerol
Glicerolquinasa
Triglicéridos Glicerol
Ácidos grasos libres
LPL
Glicerol-3-
fosfato
88
Fuentes: Pesce y Kaplan, 1990.
La intensidad del color formado de la quinonaimina es proporcional a la concentración de
triglicéridos presentes en la muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1 mL de RT (tampón PIPES pH 7,5, 50 mmol/L; p-
Clorofenol 2 mmol/L; lipoproteinlipasa 150000 U/L; glicerol quinasa 500 U/L; glicerolfosfato
deshidrogenasa 2500 U/L; peroxidasa 440 U/L; 4-aminofenazona 0.1 mmol/L; ATP 0.1 mmol/L)
y se adicionó 10µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 5 minutos a 37ºC. La mezcla se
leyó en un fotómetro, a 505 nm (490-550) de longitud de onda utilizando como blanco el RT. La
absorbancia fue traducida directamente por el equipo en mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 0,000 mg/dL hasta 1600 mg/dL.
Especificidad: no se han observado interferencias con bilirrubina hasta 10 mg/dL, hemoglobina
O2 H2O2
Glicerol-3-fosfato Dihidroxiacetona
fosfato
Glicerol fosfato
oxidasa
H2O2 +
+ + + H2O
𝑷𝒆𝒓𝒐𝒙𝒊𝒅𝒂𝒔𝒂→
p-clorofenol 4-aminofenazona
Quinonaimina
89
hasta 100 g/dL, y también se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden
interferir, las drogas que provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%),
penicilina (6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Fossatiy Prencipe, 1982) (Young, 1997).
10. Determinación precipitante de HDL-Colesterol
Método: ácido fosfotúngstico/Mg++, Precipitante
Principio del método: Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y baja densidad (LDL)
del suero o plasma, se precipitan con fosfotungstato en presencia de iones magnesio. Tras la
centrifugación, el sobrenadante contiene lipoproteínas de alta densidad (HDL). La fracción de
HDL colesterol se determina utilizando el reactivo enzimático de colesterol total.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 25 µL de Reactivo precipitante (Ácido fosfotungstico
14mmol/L; Cloruro magnésico 2 mmol/L) y se adiciono 250 µL de muestra de plasma. Se
mezcló y dejo reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugo 20 minutos a 4000
r.p.m.
Se recogió el sobrenadante y se procesó como muestra en la determinación de colesterol total. La
mezcla se leyó en un fotómetro (Grove, 1979).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 1,57 mg/dL hasta 275 mg/dL.
Especificidad: no se han observado interferencias con triglicéridos hasta 400 mg/dL, y también
se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden interferir, las drogas que
provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina (6,5%),
hidroclorotiazida (4,7%) (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
PERFIL RENAL
11. Creatinina
Método: Jaffé. Cinético-colorimétrico
90
Principio del método: La determinación de creatinina está basada en la reacción de ésta con el
picrato alcalino descrito por Jaffé. La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un
complejo rojizo, con absorbancia máxima a 505 nm de longitud de onda. La intensidad de color
formado es proporcional a la concentración de creatinina.
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500 µL de una mezcla de RT [250 µL R1 (reactivo
pícrico) y 250 µL de R2 (reactivo alcalino)] y se adicionó 50 µL de muestra de plasma. Se
mezcló y leyó en fotómetro, utilizando como blanco el RT. La absorbancia fue traducida
directamente por el equipo en mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad hasta 15 mg/dL. Especificidad: no
se observan interferencias por hemoglobina hasta 78 g/dL, triglicéridos hasta 1700 mg/dL, ni
bilirrubina hasta 24 mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
12. Determinación cuantitativa de urea
Método: Ureasa/Glutamato deshidrogenasa (GDLH)/NADH/α-Cetoglutarato/ Cinético– U.V.
Principio del método: La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en
amoniaco (NH4+) y anhídrido carbónico (CO2).
Creatinina Picrato Complejo rojo de Janovski
91
Los iones amonio formados se incorporan al α-cetoglutarato por acción de la glutamato
deshidrogenasa, con oxidación paralela de NADH a NAD+.
+ H2O+2H+ → (NH4
+)2 + CO2
→
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
La disminución de la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de
urea de la muestra ensayada. Esta reacción se mide a 340 nm de longitud de onda.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1mL de RT de enzimas (480 µL de R1: TRIS pH 7,8 80
mmol/L; α-cetoglutarato 6mmol/L; ureasa 75000 U/L tampón más 120 µL de R2 GLDH
60000U/L; NADH 0,32 mmol/L) y se adicionó 10 µL de muestra de plasma. Se mezcló y leyó en
fotómetro, utilizando como blanco el RT. La absorbancia fue traducida directamente por el
equipo en mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad: 0,743 mg/dL hasta 433 mg/dL.
Especificidad: como anticoagulante se recomienda la heparina, en ningún caso se deben usar
sales de amonio o fluoruro (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
Urea
NH4 +
+ + + + H2O
NADH NAD
+
α-Cetoglutarato L-Glutamato
92
13. Determinación cuantitativa de ácido úrico
Método: Uricasa/peroxidasa/Trinder/ Enzimático colorimétrico
Principio del método: El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de
hidrógeno (2H2O2) que en presencia de POD, 4-aminofenazona y 2-4 diclorofenol sulfonato,
forma un compuesto rosáceo llamado quinonaimina.
La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración del ácido úrico
presente en la muestra ensayada.
+ 2H2O + O2 → + CO2 + 2H2O2
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500 µL de una mezcla de RT (PIPES pH 7,5 50 mmol/L;
2-4 dicloro-fenolsulfonato 4 mmol/L; peroxidasa 6600 U/L; ascorbato-oxidasa 1200 U/L; 4-
aminofenazona 1mmol/L) y se adicionó 12,5 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 5
minutos a 37ºC. Se leyó en fotómetro a 500 nm de longitud de onda, utilizando como blanco el
RT. La absorbancia fue traducida directamente por el equipo en mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990).
Ácido úrico
Alantoína
SO3-
𝑷𝒆𝒓𝒐𝒙𝒊𝒅𝒂𝒔𝒂→
2H2O2 + +
+ 4 H2O
4-aminofenazona 2-4 Diclorofenol
Sulfonato Quinonaimina
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
93
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad: 0.2 mg/dL hasta 25 mg/dL.
Especificidad: no se han observado interferencias con bilirrubina hasta 9,9 mg/dL, hemoglobina
hasta 13 g/dL y ácido ascórbico hasta 33 mg/dL, (Fossati, Prencipe y Berti, 1980) (Young,
1997).
ELECTROLITOS
14. Determinación cuantitativa de ión Cloruro
Método: Tiocianato-Hg. Colorimétrico
Principio del método: Los iones cloruro de la muestra reaccionan con tiocianato de mercurio
desplazando el ión tiocianato. El tiocianato libre en presencia de iones férricos forma un
complejo coloreado rojo que se mide por colorimetría llamado tiocianato férrico.
2Cl- +Hg(SCN)2 HgCl2 +2SCN
-
3SCN-+Fe
+++ Fe(SCN)3
El tiocianato férrico es de color amarillo y la intensidad del color es proporcional a la
concentración de iones cloruro presente en la muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1mL de reactivo tiocianato-Hg (Tiocianato de mercurio 4
mmol/L; nitrato de hierro 40 mmol/L; nitrato de mercurio 2 mmol/L; ácido nítrico 45 mmol/L) y
se adicionó 10 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 5 minutos a 37ºC. La mezcla se
leyó en un fotómetro a 480 nm (440-500), utilizando como blanco el reactivo. La absorbancia
fue traducida directamente por el equipo en mmol/L (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mmol/L, linealidad: 0,454 mmol/L hasta 190
mmol/L. Sensibilidad: interfiere la hemólisis, los anticoagulantes a excepción de la heparina, no
Color rojo ladrillo Fuente: Schosinsky et al., 1995.
94
se han observado interferencias con bilirrubina hasta 12 mg/dL, albumina bovina hasta 15 g/dL,
triglicéridos hasta 600 mg/dL, (Schosinsky et al, 1995) (Young, 1997).
15. Determinación cuantitativa de ión Potasio
Método: Método TPB-Na
Principio del método: El potasio reacciona con el tetrafenilborato sódico en un medio alcalino
libre de proteínas formándose una turbidez dispersa de tetrafenilborato de potasio. La turbidez
producida es proporcional a la concentración de potasio y puede medirse fotométricamente.
→
Fuente: Determinación cuantitativa de Potasio, s.f.
Procedimiento: A) Se colocó en un tubo 125 µL de solución precipitante de proteínas (ácido
tricloroacético 0.3mol/L) y se adicionó 12,5 µL de muestra de plasma y se agitó cuidadosamente.
Se centrifugó a 4000 r.p.m. por 10 minutos; luego se procedió a trabajar con el sobrenadante
B) Se colocó en un tubo 500 µL de RT (250uL de R1: tetrafenilborato de sodio (TPB-Na) 0.2
mol/L y 250ul R2: hidróxido sódico 2.0 mol/L; se mezcló antes de usar) y se adiciono 25 µL de
sobrenadante. Para que se produzca una turbidez homogénea, el sobrenadante se virtió en el
centro del RT. Se mezcló y se dejó reaccionar entre 5 y 30 minutos a 15-25ºC. Se leyó en
fotómetro a 578 nm de longitud de onda, frente a blanco reactivo, utilizando como blanco el RT
sin el sobrenadante. La absorbancia fue traducida directamente en mmol/L (Tietz, 1976).
K+ +
tetrafenilborato sódico tetrafenilborato de potasio
95
Características del reactivo: sensibilidad 1 mmol/L, linealidad de 2 mmol/L hasta 20 mmol/L.
Especificidad, se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden interferir, las
drogas que provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina
(6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Young, 1997).
16. Determinación cuantitativa del ión Sodio
Método: Método Mg-Uranilacetato
Principio del método: El sodio se precipita con Mg acetato de Uranilo, los iones de uranilo en
suspensión forman un complejo de color marrón-amarillento con ácido tioglicólico. La
diferencia entre el blanco del reactivo (sin precipitado de sodio) y la muestra, es proporcional a
la concentración de sodio.
NaCl + 3UO2(C2H3O2)2 + Mg(C2H3O2)2 + H.C2H3O2 + 9H2O=
= NaMg(UO2)3(C2H3O2)9.9 H2O + HCl
UO2+2
Fuente: Muratorio, 1955.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500µL de solución precipitante (acetato de uranilo 19
mmol/L; acetato de magnesio 140 mmol/L) y se adicionó 10 µL de muestra de plasma. Se
taparon los tubos y se mezcló cuidadosamente. Se dejó reposar durante 5 minutos. Se agito
Precipitado (amarillo cristalino) de acetato de sodio,
magnesio y uranilo
Complejo de color
marrón-amarillento
+
Tioglicolato de amonio Uranilo
96
vigorosamente durante 30 segundos y se dejó reposar 30 min. Se centrifugó a 4000 r.p.m. por 10
minutos. Luego se procedió a trabajar con el sobrenadante.
Se colocó en un tubo 500 µL de reactivo (tioglicolato de amonio 550 mmol/L; amonio 550
mmol/L) y se adicionó 10 µL de sobrenadante. Se mezcló e incubó 5 y 30 minutos a 15-25ºC.
Se leyó en fotómetro, utilizando como blanco 500 µL del reactivo (tioglicolato de amonio
550mmol/L; amonio 550 mmol/L) y 10 µL de la solución precipitante. La absorbancia fue leída a
410 nm de longitud de onda, dicha lectura fue traducida directamente por el equipo en mmol/L,
gracias a un software estandarizado incorporado (Vogel, 1969).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mmol/L, linealidad de 40 mmol/L hasta 400 mmol/L.
Especificidad, se han descrito muchas otras substancias y fármacos que pueden interferir, las
drogas que provocaron más alerta son la furosemida (10%), acetaminofeno (9,8%), penicilina
(6,5%), hidroclorotiazida (4,7%) (Young, 1997).
17. Determinación cuantitativa de Calcio
Método: o-Cresolftaleina/ Colorimétrico.
Principio del método: La medición del calcio se basa en la formación de un complejo coloreado
entre el calcio de la muestra y la o-cresolftaleína, en medio alcalino pH 10,7:
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
Ca
2Ca+
+
+ 𝒑𝑯𝟏𝟎,𝟕→
Ca
o-Cresolftaleína
complexona Complejo violeta
97
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de calcio presente en la
muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo la mezcla de 500 µL del tampón: etanolamina 500mmol/L,
pH 10,7, y 500 µL del cromógeno (o-Cresolftaleína 0.62mmol/L; 8-hidroxiquinoleina 69
mmol/L) y se adicionó 10 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 5 minutos a 37ºC. La
mezcla se leyó en un fotómetro a 570 nm (550-590) de longitud de onda utilizando como blanco
la mezcla; la absorbancia leída fue traducida directamente por el equipo en mg/dL (Schosinsky,
Vargas y Chavarría, 1986) (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 0,071 mg/dL hasta 35 mg/dL.
Especificidad: triglicéridos ≤ 125 mg/dL no interfieren (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
18. Determinación cuantitativa de fósforo inorgánico
Método: Fosfomolibdato. U.V. (Método directo)
Principio del método: El fósforo inorgánico reacciona en medio ácido (pH<1,0) con molibdato
amónico formando un complejo fosfomolíbdico de color amarillo. La intensidad del color
formado es proporcional a la concentración de fósforo inorgánico presente en la muestra
ensayada
7H3PO4 + 12(Mo7O24)-6
+ 51H+
7[P(Mo12O40)]
-3 + 36H2O
Ácido
fosfórico Molibdato
Complejo
fosfomolibdico Fuente: Phosphorus liquirapid, s.f.
98
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1 mL de reactivo molíbdico (Molibdato amónico 0.40 mM;
ácido sulfúrico 210mM; detergente Tween 80 que previene la precipitación de las proteínas) y se
adiciono 10 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubo exactamente 5 minutos a 37ºC. La
mezcla se leyó en un fotómetro, la absorción máxima del complejo fosfomolibdico se midió a
340 nm utilizando como blanco el reactivo Molíbdico. La absorbancia fue traducida
directamente por el equipo en mg/dL (Daly y Ertingshausen, 1972).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad hasta 35 mg/dL. Especificidad: no
realizar la prueba con muestras hemolizadas ya que los hematíes contiene una alta concentración
de esteres de fósforo orgánico, que es hidrolizado a fosforo inorgánico durante su conservación,
el incremento es de 4-5 mg/dL por día (Young, 1997) (Burtis y Ashwood, 1999).
19. Determinación cuantitativa de Magnesio
Método: Colorimétrico: Calmagita- Etilenglicol-bis- (2-Amonietil)-Tetraacético (EGTA).
Principio del método: El magnesio forma un complejo de color púrpura al reaccionar con la
calmagita en medio alcalino. La calmagita (ácido tribásico) en el intervalo de pH 9-11, en el que
el propio indicador es de color azul, forma complejos con muchos iones metálicos. Por tanto la
calmagita, al tener una alta absortividad molar (alrededor de 20 000 a pH 10), es un detector
sensible de los metales con los que reacciona.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de magnesio en la muestra
ensayada.
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
Mg++
+ Complejo a 520 nm (violeta)
Calmagita
99
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1 mL de la mezcla de 500 µL de R1: tampón (Amino-metil-
propanol 1 mmol/L; EGTA 0,21 mmol/L), y 500 µL de R2: cromógeno (calmagita 0,30 mmol/L).
Se adicionó 10µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 5 minutos a 37ºC. La mezcla se
leyó en un fotómetro, a 520 nm (500-550) de longitud de onda utilizando como blanco la mezcla
de reactivos. La absorbancia fue traducida directamente por el equipo en mg/dL (Pesce y Kaplan,
1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 0,2 mg/dL hasta 5 mg/dL.
Especificidad: interfiere la hemolisis, los anticoagulantes a excepción de la heparina (Pesce y
Kaplan, 1990) (Young, 1997).
PERFIL PANCREÁTICO
20. Determinación cuantitativa de glucosa
Método: Enzimático colorimétrico: Glucosa oxidasa (GOD)/ peroxidasa (POD)/ Trinder /
Principio del método: La GOD cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El H2O2,
producido en presencia de POD se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno, fenol-
ampirona. Se forma quinonaimina que es un producto coloreado que se absorbe a 505 nm. La
intensidad de color formado, es proporcional a la concentración de glucosa presente en la
muestra ensayada.
glucosa Ácido glucónico δ-gluconolactona
100
Fuente: Determinación de glicemia, s.f.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 1 mL de una mezcla de: TRIS pH 7,4 92 mmol/L; Fenol
0.3 mmol/L, glucosa oxidasa 15000U/L; peroxidasa 1000U/L; 4-aminofenazona 2.6 mmol/L y se
adicionó 100 µl de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 10 minutos a 37ºC. La mezcla se leyó
en fotómetro a 505 nm (490-550) de longitud de onda, utilizando como blanco la mezcla de
reactivos, sin la muestra (RT). La absorbancia fue traducida directamente por el equipo en
mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 mg/dL, linealidad de 1 mg/dL hasta 500 mg/dL.
Especificidad: no se han observado interferencias con hemoglobina hasta 1,9 g/dL, bilirrubina
hasta 10 mg/dL (Pesce y Kaplan, 1990) (Young, 1997).
21. Determinación cuantitativa de α-amilasa
Método: 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotriosido (CNPG3). Cinético
Principio del método: La α-amilasa convierte el sustrato artificial el CNPG3 a 2-cloro-4-
nitrofenol (CNP) y forma 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltosido (CNPG2), maltotriosa (G3) y
4-aminofenazona (4-aminoantipirina)
fenol Quinonaimina
101
glucosa (G), según la siguiente reacción:
→
Fuente: Pesce y Kaplan, 1990.
La velocidad de formación de 2-cloro-4-nitrofenol, determinado fotométricamente, es
proporcional a la concentración catalítica de α-amilasa en la muestra ensayada.
Procedimiento: Se colocó en un tubo 500uL de reactivo (MES pH 6.00 100 mmol/L; CNPG3
2.25 mmol/L; NaCl 350 mmol/L; Acetato cálcico 6 mmol/L; tiocianato de potasio 900 mmol/L;
azida sódica 0.95g/L) y se adicionó 10 µL de muestra de plasma. Se mezcló e incubó 30
10
2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotriosido
H + + 9 9
OH
2-cloro-4-nitrofenol maltotriosa
+ 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltosido
OH HO
glucosa
OH
102
segundos. Se leyó en fotómetro a 405 nm. La absorbancia fue traducida directamente por el
equipo en UI/L (Pesce y Kaplan, 1990).
Características del reactivo: sensibilidad 1 UI/L, linealidad de 0,2439 UI/L hasta 2000 UI/L.
Especificidad: la hemólisis interfiere, la actividad α-amilasa puede ser inhibida por agente
quelantes como citrato y EDTA (Young, 1997).
PROCEDIMIENTOS HEMATIMÉTRICOS:
La sangre que se obtuvo por punción cardiaca, se colocó en un tubo con anticoagulante
EDTA·K3 y se homogenizó por inversión. Se realizó el frotis sanguíneo en portaobjetos el cual,
para las lecturas de serie blanca, fue teñido con tinción Panóptica rápida.
El hematocrito se determinó centrifugando el capilar con sangre a 13000 r.p.m. por 5 minutos. Se
obtuvieron los valores de glóbulos rojos mediante cálculo y se realizó el recuento manual de
glóbulos blancos con solución diluyente de Turk (1/10) en cámara de Neubauer y el recuento
diferencial de los leucocitos (Vives y Aguilar, 2001).
11. PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN
A. Procesamiento estadístico y análisis de los datos.- Se revisaron los datos obtenidos, para
luego aplicar estadísticos descriptivos (promedio, desviación estándar) e inferenciales utilizando
los paquetes estadísticos Minitab 18 y Microsoft EXCEL. Con los resultados se elaboraron
análisis de dispersión y comparación para significancia estadística (t de student) entre los grupos,
los cuales son: control-dosis mínima; control-dosis media y control-dosis máxima. El análisis
estadístico, incluyó un nivel de significancia del 5%. Se consideró p<0,05 como significativa,
con un nivel de confianza del 95%.
103
12. RESULTADOS
Parámetros Generales:
Temperatura Rectal
La tabla 10 y la figura 7 nos muestra los resultados de las mediciones de la temperatura rectal en
los animales experimentales a lo largo de los 36 días. Se puede observar que ésta no se modificó
en ninguno de los grupos con respecto al control. Las leves variaciones a lo largo del tiempo
fueron en la misma magnitud en todos los grupos.
Tabla 10. Temperatura rectal de conejos sometidos a la acción del EHAEc y de conejos control
X TEMPERATURA ±DS X±DS
CONEJO CONTROL HEMBRA 1 37,8 ºC 0,6 ºC
(37,4±0,26)°C
CONEJO CONTROL HEMBRA 2 37,3 ºC 0,5 ºC
CONEJO CONTROL MACHO 1 37,1 ºC 0,6 ºC
CONEJO CONTROL MACHO 2 37,5 ºC 0,4 ºC
CONEJO DOSIS MÍNIMA HEMBRA 1 37,6 ºC 0,7 ºC
(37,2±0,38)°C CONEJO DOSIS MÍNIMA HEMBRA 2 36,8 ºC 0,6 ºC
CONEJO DOSIS MÍNIMA MACHO 1 37,5 ºC 0,8 ºC
CONEJO DOSIS MÍNIMA MACHO 2 36,8 ºC 0,7 ºC
CONEJO DOSIS MEDIA HEMBRA 1 37,5 ºC 0,6 ºC (37,4±0,18)°C
CONEJO DOSIS MEDIA HEMBRA 2 37,4 ºC 0,5 ºC
CONEJO DOSIS MEDIA MACHO 1 37,1 ºC 0,7 ºC
CONEJO DOSIS MEDIA MACHO 2 37,6 ºC 0,7 ºC
CONEJO DOSIS MÁXIMA HEMBRA 1 36,9 ºC 0,6 ºC (37,1±0,33)°C
CONEJO DOSIS MÁXIMA HEMBRA 2 37,5 ºC 0,7 ºC
CONEJO DOSIS MÁXIMA MACHO 1 36,7 ºC 0,7 ºC
CONEJO DOSIS MÁXIMA MACHO 2 37,4 ºC 0,8 ºC
Se muestra el promedio (X) y ± DS. No se encontró diferencias estadísticamente significativas
entre los diferentes grupos.
104
Fig. 7. Se muestra la temperatura rectal de conejos sometidos a la acción del EHAEc y de conejos
control, a lo largo de 36 días.
CONEJO NORMAL HEMBRA 1 (CNH1); CONEJO NORMAL HEMBRA 2 (CNH2); CONEJO NORMAL MACHO 1 (CNM1); CONEJO NORMAL MACHO 2
(CNM2) CONEJO MINIMA HEMBRA 1 (CMH1); CONEJO MINIMA HEMBRA 2 (CMH2); CONEJO MINIMA MACHO 1 (CMM1); CONEJO MINIMA
MACHO 2 (CMM2) CONEJO MEDIA HEMBRA 1 (CMEDH1); CONEJO MEDIA HEMBRA 2 (CMEDH2); CONEJO MEDIA MACHO 1 (CMEDM1);
CONEJO MEDIA MACHO 2 (CMEDM2) CONEJO MAXIMA HEMBRA 1 (CMAXH1); CONEJO MAXIMA HEMBRA 2 (CMAXH2); CONEJO MAXIMA
MACHO 1 (CMAXM1); CONEJO MAXIMA MACHO 2 (CMAXM2).
CO
NTR
OL
MÍN
IMA
M
EDIA
M
ÁX
IMA
DÍAS
105
Consumo de Alimentos.
La figura 8, nos muestran la evolución de la ingestión de alimentos durante los días de
experimentación. Se aprecia que no hubo ningún cambio significativo y sostenido en el tiempo y
tampoco diferencia entre los grupos experimentales y el control. La tabla 11 muestra los
promedios de consumo por grupo y la DS. El análisis estadístico no mostró diferencias
significativas entre los grupos.
0
200
400
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37
GR
AM
OS
CONSUMO NETO DE ALIMENTO GRUPO CONTROL
HEMBRAS
MACHOS
0
200
400
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37
GR
AM
OS
CONSUMO NETO DE ALIMENTO GRUPO DOSIS MÍNIMA
HEMBRAS
MACHOS
0
200
400
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37
GR
AM
OS
CONSUMO NETO DE ALIMENTO GRUPO DOSIS MEDIA
HEMBRAS
MACHOS
0
200
400
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37
GR
AM
OS
CONSUMO NETO DE ALIMENTO GRUPO DOSIS MÁXIMA
HEMBRAS
MACHOS
DÍAS
Fig.8. Ingesta de alimentos durante los 36 días de experimentación
106
Tabla 11. Se muestra la comparación en promedio y ± DS de la ingestión de alimentos durante los 36
días de experimentación de los conejos.
Incremento del Peso
El incremento en el peso tuvo la misma cinética en todos los grupos de animales experimentales.
La figura 9 nos muestra esta evolución a lo largo de los 36 días. Como los animales en cada
grupo experimental (de acuerdo a dosis) fueron pareados de acuerdo a peso (los de alto y los de
bajo peso: ver Material y Métodos), las diferencias fueron ostensibles desde el principio, pero el
incremento en el tiempo fue similar en porcentajes. Solo en el grupo de dosis mínima se observó
un decremento al inicio, que luego se recuperó de manera evidente. No se observó una tendencia
al decremento, en ningún caso.
107
Fig.9.-Se muestra la evolución del peso de los cuatro grupos de animales. El incremento en 36 días fue en
promedio entre el 20 y el 30% en todos los grupos (en secuencia de arriba abajo: grupo control, grupo dosis
mínima, grupo dosis media, grupo dosis máxima)
Sistema Nervioso Central (Reacciones psico-neuro-motoras), efectos generales y efectos
específicos
Las expresiones corporales del Sistema Nervioso Central fueron monitoreadas por observación
de diversos parámetros (test de Irwin modificado, ver en Materiales y Métodos) a lo largo de los
36 días que duró la experimentación. Solo un conejo macho del grupo de dosis mínima mostró
temblores finos del cuerpo los días: 4(+) y 33 (+) hasta el 35, de manera eventual y como
episodios aislados; dos conejos presentaron fasciculaciones eventuales: un conejo macho del
DO
SIS
MÍN
IMA
D
OSI
S M
EDIA
D
OSI
S M
ÁX
IMA
C
ON
TRO
L
DÍAS
108
grupo dosis mínima (+) y un conejo hembra del grupo dosis media (+). Se observó a un solo
conejo del grupo control que presentaba las orejas pálidas el día 0; también se observó en un
conejo macho del grupo dosis máxima con cianosis leve el día 1(+), y, por último, se observó
que cinco conejos presentaron diarrea episódicas algunos días, como ser: un conejo macho del
grupo control, dos conejos hembra de la dosis mínima, un conejo macho de la dosis mínima y un
conejo macho de la dosis máxima; este fenómeno remitió sin tratamiento. Las tablas 12 y 13
condensan estas observaciones.
Tabla 12 y 13. Condensación de los resultados de las observaciones propias del Sistema Nervioso
Central, ojos, orejas y piel: efectos generales, efectos específicos.
Se muestra el número de conejos que evidenciaron dicha observación.
Tabla 12.
109
Consumo de agua y de extracto hidro-alcohólico de E.coca disuelto en agua
En la fig. 10 y tabla 14, se muestra que el consumo del agua del grupo control y el consumo del
extracto hidro-alcohólico de E. coca disuelta en agua para las dosis mínima, media y máxima, en
cantidad son similares con variaciones eventuales menores al 5%, en los cuatro grupos el
consumo ad libitium por día durante los 36 días de experimentación, fue similar y el análisis
estadístico muestra que no existen diferencias estadísticamente significativas.
Tabla 14. Se muestra promedio y ±DS del consumo del líquido diario durante 36 días
PROMEDIO (mL) ±DS (mL) PROMEDIO
(mL) ±DS (mL) p-valor
CONTROL
MACHOS 224 79,3
204,8 80,7
HEMBRAS 182 74,5
MINIMA
MACHOS 156 63,2
190,1 73,6
0,42
HEMBRAS 223 69,7 0,79
MEDIA
MACHOS 209 77,6
209,4 66,5
0,33
HEMBRAS 209 53,2
MAXIMO
MACHOS 198 53,2
190 42,8
HEMBRAS 182 26,7
Tabla 13.
110
Figura 10. Consumo de líquido durante los 36 días de experimentación, cada
punto consigna el promedio de consumo de una jaula
MIL
ILIT
RO
S
Dosis mínimo
Dosis media
Dosis máxima
111
Consumo del extracto hidro-alcohólico de E.coca en mg En la fig. 11, se observan los datos
de consumo ad libitium del extracto hidro-alcohólico de E. coca en mg, en las tres dosis:
mínima, media y máxima a lo largo de 36 días. Se puede apreciar similitud en cuanto a la
cantidad diaria de consumo del líquido en el cual está disuelto el liofilizado del extracto hidro-
alcohólico de E. coca a pesar de contener diferente concentración del extracto.
Dosis máxima
Dosis media
Dosis mínimo
Figura 11.- Se muestra el consumo de EHAEc en miligramos en los
diferentes grupos
112
Esto muestra que las diferentes dosis son tolerables por los conejos de experimentación. La
ingesta sin manifestaciones de rechazo se consiguió por necesidad de tomar líquido con lo que
tomaron el extracto disuelto, sin problemas visibles durante los 36 días de experimentación. En
la tabla 15 muestra los promedios y las DS de las concentraciones consumidas, por grupos.
Queda clara las diferencias en las dosis consumidas.
Tabla 15. Se muestra promedio y ±DS del consumo de EHAEc en mg/día, de los grupos mínimo,
medio y máximo durante los 36 días de experimentación
PARÁMETROS BIOQUÍMICOS.- Las pruebas bioquímicas se realizaron en los animales a
los que se administró el EHAEc y al grupo control. Las diferentes pruebas estaban efectuadas
para comparar los datos obtenidos en los grupos experimentales con los del grupo control. Estos
últimos (promedio, DS de N =8) sirvieron como valores de referencia interna. No se utilizaron
valores de referencia externa puesto que estos tienen muy alta variabilidad, la misma que
depende de las condiciones aplicadas por cada autor: raza, espécimen, peso, edad, tipo de
alimentación, condiciones medioambientales, altura snm, estado de ayuno y, sobre todo, el
método de determinación utilizado (Piquer, 1987). Además, en el caso de las enzimas, utilizar
valores de referencia de otros autores es muy difícil, ya que los procedimientos analíticos de este
tipo son muy susceptibles de variaciones y, como es sabido, cada laboratorio tiene que
determinar perfectamente sus condiciones para poder utilizar unos valores de referencia (Piquer,
113
1987). Cabe mencionar también que los valores de referencia pueden estar influenciados por
factores genéticos y fisiológicos (Abugarade, 1998). No obstante lo anterior, corresponde hacer
notar que los valores obtenidos en el grupo control, en general estuvieron incluidos dentro del
rango de la variabilidad que se menciona (ver anexo 10).
PERFIL HEPÁTICO:
Mediante las pruebas hepáticas se pudo explorar si existe o no hepatotoxicidad causada por
EHAEc, ya que este órgano cumple funciones de eliminación de estos productos extraños (la
FAL y la γ-GT). Por tanto corresponde examinar la integridad del hepatocito (la GOT y GPT), la
capacidad de síntesis (albúmina y otros) y otras funciones.
Fosfatasa alcalina
La Fig.12, muestra los niveles promedio 1DS de esta enzima encontrados en cada grupo. No se
observan modificaciones mayores en ningún grupo respecto al control; no obstante, el grupo que
recibió la dosis media muestra valores levemente inferiores al control, aunque estos no son
diferentes significativamente en términos estadísticos. También se observa una leve elevación en
la dosis mínima y máxima con respecto al control, pero tampoco son diferentes
significativamente en términos estadísticos.
114
Fig. 12. Niveles de Fosfatasa alcalina en plasma de conejos tratados
con EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
Aspartato-aminotransferasa o transaminasa glutámico-oxalacético (GOT/AST)
Las enzimas GOT medidas en los diferentes grupos muestran niveles promedio altos en la dosis
mediana y altas con respecto al control, aunque con gran dispersión respecto al promedio; sin
embargo, estos niveles no son diferentes significativamente en términos estadísticos respecto al
control, las otras dosis incluyendo la máxima tampoco son diferentes al control (ver fig.13).
Alaninoaminotransferasa o transaminasa glutámica-pirúvica (GPT/ALT)
En la figura 14, se muestra que la transaminasa glutámico pirúvica GPT está aumentada en los
conejos que recibieron las dosis media y máxima en comparación al control. La tendencia es
bastante clara; las diferencias no son estadísiticamente significativos para el grupo de dosis
media respecto al control, pero si para el grupo máximo, respecto al control con un valor de
p<0,05, no obstante la evidente dispersión de datos.
0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
UI/
L
DOSIS
FOSFATASA ALCALINA EN PLASMA
PROMEDIO
115
Fig. 13. Niveles de GOT en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los promedios ±
1DS.
Fig.14. Niveles de GPT en plasma de conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS de cada grupo
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
200,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
UI/
L
DOSIS
GOT EN PLASMA
PROMEDIO
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
UI/
L
DOSIS
GPT EN PLASMA
PROMEDIO
116
Gamma-glutamil transferasa (γ-GT)
En el caso de la γ-GT se puede observar que existe un incremento en los niveles promedio de
esta enzima en el plasma de los grupos de animales que recibieron las dosis media y máxima
respecto al control. Aunque los promedios son muy diferentes respecto al control, lo que marca
una tendencia de incremento en relación a la dosis, la alta dispersión de los valores en estos
grupos, comparados con el control influye en la inexistencia de diferencias estadísticamente
significativas (figura 15).
Fig. 15. Niveles de γ-GT (promedios ± 1DS.) en plasma de conejos tratados con EHAEc.
Bilirrubinas total y directa
En la cuantificación de la bilirrubina directa y la bilirrubina total (fig. 16 y fig. 17), no se
apreciaron variaciones significativas entre los grupos que recibieron las dosis mínima, media y
máxima, con relación al grupo control.
0,000
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
70,000
80,000
90,000
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
UI/
L
DOSIS
γ-GT EN PLASMA
PROMEDIO
117
Fig. 17. Niveles de bilirrubina total en plasma de conejos tratados
con EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
0,0
0,0
0,0
0,1
0,1
0,1
0,1
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
l
DOSIS
BILIRRUBINA DIRECTA EN PLASMA
PROMEDIO
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
L
DOSIS
BILIRRUBINA TOTAL
PROMEDIO
Fig. 16. Niveles de bilirrubina directa en plasma de conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
118
Proteínas totales y albúmina
Se observa en la fig. 18, que ninguno de los grupos de conejos que recibieron las dosis mínima,
media y máxima son diferentes estadísticamente respecto al grupo control en cuanto a los niveles
de proteínas totales determinados en plasma.
De manera particular, los niveles de albúmina plasmática no se modificaron en ningun grupo con
respecto al control. La fig. 19 muestra este hecho.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
g/
dL
DOSIS
PROTEÍNAS TOTALES EN PLASMA
PROMEDIO
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
g/
dL
DOSIS
ALBÚMINA EN PLASMA
PROMEDIO
Fig. 18. Se aprecian los promedios ± 1DS de proteínas totales en plasma de
conejos tratados con EHAEc.
Fig. 19. Niveles de albúmina en plasma de conejos tratados
con EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
119
El análisis de los análisis de riesgo (R) fue elaborado para cada uno de los conejos y también por
grupo de acuerdo a la dosis recibida. La tabla 16 muestra los resultados obtenidos; puede
observarse que a ninguna dosis se obtuvieron valores de riesgo compatibles con lesiones
hepatocelular (R>5); solo en algunos animales que recibieron la dosis máxima se observaron
valores R compatibles con una leve colestasis (R<2).
Tabla.16.- Valor de Riesgo individual para estimar posibles daños hepáticos en animales
que recibieron EHAEc en diferentes dosis
DOSIS VALOR FAL (UI/L)
VALOR ALT (UI/L) *LSN
CONTROL CNH1 663 67 LSN FAL: X+1DS (UI/L)
622,9
CNH2 541 109
CNM1 539 63 LSN ALT:X+1DS (UI/L) 122,3
CNM2 527 133 VALOR R X de R
MINIMO CMINH1 563 65 0,6
0,9 CMINH2 774 109 0,7
CMINM1 744 54 0,4
CMINM2 385 144 1,9
MEDIO CMEDH1 673 162 1,2
1,6 CMEDH2 374 123 1,7
CMEDM1 478 72 0,8
CMEDM2 469 245 2,7
MÁXIMA CMAXH1 836 166 1,0
1,2 CMAXH2 668 151 1,2
CMAXM1 848 182 1,1
CMAXM2 361 112 1,6
* El Límite superior normal (LSN): X + 1DS del grupo control.
PERFIL LIPÍDICO: Para evaluar si el extracto hidro-alcohólico de la hoja de coca puede
incidir en los órganos encargados de regular los componentes del metabolismo lipídico, se
administró el extracto en diferentes dosis en conejos normales. Se vio que, en general, la
120
administración del extracto EHAEc no modificó los marcadores bioquímicos del perfil
lipídico/cardiaco. La fig. 20, muestra que ninguno de los grupos a los que se administró
diferentes concentraciones de EHAEc, mostró variación significativa respecto al grupo control en
los niveles de colesterol en plasma; solo un incremento en la dispersión de datos en la dosis
media fue la observación más ostensible.
Fig.20. Niveles de colesterol en plasma de conejos tratados con
EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
Los triglicéridos, por su parte, no se afectan en cuanto a su nivel promedio en ninguno de los
grupos de animales que recibieron EHAEc en diferentes dosis respecto al control. La figura 21
muestra este hecho.
Los niveles de HDL-colesterol medidos en plasma se muestran en la fig. 22. Puede apreciarse
que los diferentes grupos que percibieron el extracto a diferentes dosis, muestran niveles
promedio de este analito bastante similares, aunque la dispersión de datos es más ostensible en la
dosis mínima.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
200,00
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
l
DOSIS
COLESTEROL EN PLASMA
PROMEDIO
121
Fig.22. Niveles de HDL-Colesterol en plasma en conejos tratados
con EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
200,00
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
L
DOSIS
TRIGLICÉRIDOS EN PLASMA
PROMEDIO
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
l
DOSIS
HDL-COLESTEROL EN PLASMA
PROMEDIO
Fig.21. Niveles de triglicéridos en plasma de conejos tratados con
EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
122
PERFIL RENAL:
Los riñones son los órganos que reciben mayor irrigación por gramo de tejido (20-25%), son la
principal vía de eliminación de sustancias tóxicas y otras que requieren ser depuradas. Ante la
posibilidad de que la hoja de coca, puede afectar las funciones renales y dañar sus estructuras se
exploraron diversos marcadores cuya modificación señala cambios en el funcionamiento de este
órgano. De esta manera se administró EHAEc a diferentes dosis y se midió la urea en plasma, la
cual evalúa tanto el funcionamiento hepático como el renal. En la figura 23, solo se observa que
existe una leve elevación de este marcador en el grupo de dosis máxima con respecto al control,
pero la diferencia no es significativa. Por lo demás, datos de la figura 24 muestran que no se
modificaron los niveles de la creatinina, en los diferentes grupos respecto al control, por tanto, se
muestra que este marcador bioquímico específico no se modifica con la administración del
extracto de coca.
Fig.23. Niveles de urea en plasma de conejos tratados con
EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
L
DOSIS
UREA EN PLASMA
PROMEDIO
123
Fig.24. Niveles de creatinina en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS.
En referencia al ácido úrico, la figura 25 nos muestra que los niveles promedio de este analito en
los grupos que recibieron diferentes concentraciones de EHAEc., no se modifican respecto al
control.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
l
DOSIS
CREATININA EN PLASMA
PROMEDIO
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
l
DOSIS
ÁCIDO ÚRICO EN PLASMA
PROMEDIO
Fig.25. Niveles de ácido úrico en plasma de conejos tratados con EHAEc. Se
aprecian los promedios ± 1DS.
124
ELECTROLITOS:
El efecto del EHAEc sobre el metabolismo y la dinámica de la homeostasis mineral, fue medido
complementando el perfil renal, ya que si se daba el caso de que exista daño renal los niveles de
electrolitos puedan verse afectados, dando a lugar un desequilibrio hidroelectrolítico. Para
valorar esto en los animales a los que se suministró EHAEc en diferentes dosis por 36 días,.se
midió los niveles en plasma de K+, Na
+, Cl
-, PO4
=, Ca
++ y Mg
++
Ión Potasio.
El Potasio mostró ligeros cambios respecto al control, en los animales experimentales (Fig.26).
Se pudo observar un leve descenso en la dosis mínima que se recuperó en las dosis altas. Sin
embargo, estos cambios no fueron estadísticamente significativos (p> 0.05).
Fig.26.- Niveles de Potasio en plasma en conejos tratados con
EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
Ión Sodio, ion Cloro
Por su parte la figura 27 muestra que los niveles de Sodio en plasma, se mantienen similares al
grupo control en todos los grupos experimentales. De la misma manera, se pudo apreciar que los
niveles de Cloro no se modifican con el tratamiento. La Figura 28 da cuenta de esta ausencia de
efecto por parte de EHAEc, en los conejos tratados.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mm
ol/
L
DOSIS
ION POTASIO EN PLASMA
PROMEDIO
125
Fig.28.- Niveles de Cloro en plasma en conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
0
50
100
150
200
250
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mm
ol/
L
DOSIS
ION SODIO EN PLASMA
PROMEDIO SODIO
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mm
ol/
L
DOSIS
ION CLORO EN PLASMA
PROMEDIO
Fig. 27.- Niveles de Sodio en plasma en conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
126
Calcio total
Los niveles de calcio en plasma no sufrieron alteraciones mayores con la administración de
EHAEc en los conejos, a diferentes dosis. En la fig. 29 se puede observar que en la dosis mínima
hay una leve disminución la misma que no se aprecia en la dosis siguiente. Esta diferencia no es
estadísticamente significativa en comparación con el grupo control.
Fósforo
Los niveles de fósforo en plasma de los conejos que recibieron el extracto no son diferentes, en
ninguna dosis, a los del grupo control, que no recibió el extracto de coca. Tal hecho lo muestra la
Figura 30.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
L
DOSIS
CALCIO EN PLASMA
PROMEDIO
Fig.29. Niveles de calcio en plasma en conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
127
Fig.30. Niveles de fósforo en plasma en conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
Magnesio
La Fig. 31 muestra, por su parte, que los valores promedio de magnesio en plasma no se alteran
en los diferentes grupos experimentales de conejos respecto al grupo control que no recibió
EHAEc. Las leves diferencias existentes no son estadísticamente significativas.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
L
DOSIS
FÓSFORO EN PLASMA
PROMEDIO
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
mg
/d
l
DOSIS
MAGNESIO EN PLASMA
PROMEDIO
Fig. 31.- Niveles de Magnesio en plasma en conejos tratados con
EHAEc. Se aprecian los promedios ± 1DS.
128
PERFIL PANCREÁTICO:
La posibilidad de que la hoja de coca pueda afectar el funcionamiento del páncreas, tanto en su
componente endocrino como en su actividad exocrina, fue evaluada administrando diversas dosis
de EHAEc a conejos en los que se midió glucosa y α-amilasa.
Glucosa
La figura 32, muestra que los animales de los grupos que recibieron una dosis baja y media no
modificaron su nivel de glucosa en sangre en comparación de los grupos control. En cambio, el
grupo que recibió máxima dosis muestra leve incremento de glicemia con respecto al control,
aunque los niveles no son estadísticamente significativos, pero sus valores son bastante dispersos
con respecto al promedio.
Fig. 32. Niveles de glicemia en plasma de conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
0
50
100
150
200
250
300
350
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
DOSIS
GLICEMIA EN PLASMA
PROMEDIO GLUCOSA
129
α-AMILASA
Los niveles de α-amilasa en plasma de los conejos que recibieron el extracto no son diferentes, en
ninguna dosis, a los del grupo control, que no recibió el extracto de coca. Tal hecho lo muestra la
Figura 33.
Fig. 33. Niveles de α-amilasa en plasma de conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS
La probabilidad de que la hoja de coca tenga efectos hematotóxicos (o mielotóxicos) fue
examinada midiendo parámetros hematológicos en conejos a los que se administró el extracto en
concentraciones crecientes. Se midieron las concentraciones de glóbulos rojos, leucocitos en sus
diferentes componentes, hematocrito y hemoglobina, los resultados se muestran a continuación.
El recuento de los glóbulos rojos en la sangre de los conejos estudiados, muestra que no existen
diferencias entre los diferentes grupos examinados. Es decir que los grupos que recibieron
EHAEc tienen valores similares a los del grupo control. Tal hecho se muestra en la Figura 34.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
UI/
L
DOSIS
α-AMILASA EN PLASMA
PROMEDIO
130
Fig. 34.- Niveles glóbulos rojos en conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± 1DS.
De la misma forma la Figura 35 muestra que el hematocrito es similar en los diferentes grupos
experimentales, respecto al control.
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
control minimo medio maximo
cel/
mm
3
DOSIS
GLÓBULOS ROJOS
promedio
0
10
20
30
40
50
60
control minimo medio maximo
%
DOSIS
HEMATÓCRITO
promedio
Fig. 35.- Niveles de hematocrito en conejos tratados con EHAEc. Se aprecian los
promedios ± 1DS
131
El efecto del EHAEc sobre los glóbulos blancos se muestra en la Figura 36. Puede apreciarse que
con la dosis mínima no existe efecto observable en el número de leucocitos por mm3 con
respecto del control; en cambio con la dosis media se aprecia una leve elevación respecto del
grupo control, aunque la diferencia no es significativa estadísticamente. En cambio, respecto al
grupo control la dosis máxima muestra una significativa elevación del número de leucocitos
(valor p=0,05), no obstante la gran dispersión de los datos obtenidos.
Fig. 36.- Niveles de glóbulos blancos en conejos tratados con EHAEc.
Se aprecian los promedios ± DS.
Recuento diferencial de los leucocitos
En la tabla 17 muestra que los promedios de los granulocitos segmentados disminuyen en la
medida que se incrementa la dosis aunque las diferencias no son estadísticamente significativas
con relación al control. En cambio, los linfocitos mostraron leve incremento en los diferentes
grupos mínima, medio y máxima con respecto al control (p = 0,433, p=0,531 y p=0,412,
respectivamente) aunque tampoco se observó diferencias estadísticamente significativas
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
CONTROL MINIMA MEDIA MAXIMA
cel/
mm
3
DOSIS
GLÓBULOS BLANCOS
PROMEDIO
132
En el caso de los monocitos, se encontró un incremento en las dosis media y alta pero, no
obstante la tendencia, las diferencias entre los grupos y el control tampoco fueron significativas
estadísticamente.
Tabla 17. Se muestra promedio ± 1DS del recuento diferencial de los leucocitos
El recuento de basófilos mostró cantidades normales en todos los grupos, sin diferencias
significativas entre los diferentes grupos. En el caso de los eosinófilos, se pudo advertir la
ausencia o presencia muy escasa de estas células en la sangre de los conejos.
13. DISCUSIÓN
Es un hecho ampliamente reconocido el que los marcadores bioquímicos reflejan el estado de
funcionamiento de un órgano, sistema o tejido; estos marcadores fueron encontrados a lo largo
de la evolución de los estudios biomédicos y permitieron contribuir al diagnóstico de
enfermedades diversas. En tal virtud, los análisis de laboratorio se han ido perfeccionando para
aumentar la sensibilidad y la especificidad de los procedimientos para su detección.
133
Cada uno de estos marcadores tienen una significación particular, la cual contribuye a la
interpretación de una afectación determinada en las células de un órgano, por lo cual es de
extrema importancia conocer los mecanismos y la dinámica de expresión de dichos marcadores,
tanto cuando el órgano está en condiciones fisiológicas como cuando se ha alterado su
funcionamiento o existe franco daño en su estructura. En el capítulo introductorio de este trabajo
se describió el significado de cada biomarcador, asimismo, se hizo una definición de cada
marcador bioquímico en el cuadro de operacionalización de variables; está claro que tales
significados deben ser contrastados con los resultados de cualquier estudio para aproximarse al
conocimiento de la afectación. Esta última puede ser el producto de una patología de origen
interno (genética, metabólica, autoinmune) o el efecto de un agente externo (microorganismo,
tóxicos, sustancias extrañas y agentes físicos).
En este trabajo se ha examinado las consecuencias de la administración de un producto
natural sobre el organismo en un modelo experimental. Las posibles afectaciones fueron
valoradas utilizando como herramienta de estudio, la evaluación de diferentes marcadores
bioquímicos y hematológicos; esta posible afectación fue medida a través de marcadores propios
de funcionamiento de órganos específicos. En este sentido, se examinó la posibilidad de daño en
el hígado, el páncreas, el riñón y la sangre que son los órganos o tejidos, más expuestos a un
posible daño por agentes externos de tipo químico. El modelo utilizado fue el de un estudio sub-
agudo en conejos a los que se administró por 36 días, tres dosis diferentes de un extracto hidro-
alcohólico de coca por vía oral, mezclada con el agua de ingesta.
El extracto hidro-alcohólico se preparó de acuerdo a protocolos convencionales en la idea de
que esta proporción agua/etanol (50:50) extrae la mayor cantidad de componentes tanto
hidrofóbicos e hidrofílicos como anfóteros (Sharapin y Pinzón, 2000). De todos modos, el
extracto obtenido tuvo las características fisicoquímicas que permitieron su solubilidad para ser
administrado sin problemas por vía oral. Los componentes del extracto fueron examinados en un
procedimiento cromatográfico preliminar el cual mostró la existencia de diferentes compuestos
entre los que destacan los alcaloides, según la comparación hecha con un extracto obtenido en la
ruta de preparación de cocaína (datos no mostrados). No fue de interés de este trabajo identificar
los componentes ya que ese es un trabajo fitoquímico que ya fue realizado previamente (Sauvain
134
et al., 1997). Lo que se requería en este trabajo es saber el efecto tóxico que pudiera tener la hoja
total administrada en los humanos como harina, pero como este compuesto era rechazado por los
animales de experimentación, se procedió a preparar un extracto palatable que, una vez diluido,
sea de fácil administración. Todo lo anterior supone que la mayor parte de los componentes que
se administran en la harina se absorben en el intestino y están presentes en nuestro extracto.
En este orden, la administración del extracto hidro-alcohólico en lugar de la hoja de coca
completa, respondió a la necesidad de normalizar las características del agente en estudio, es
decir, suministrar a los animales los posibles componentes químicos capaces de tener un efecto
en el organismo (benzoílo-ecgonina, ecgonina y otros). Adicionalmente, como se mencionó
antes, se debió efectuar esta acción porque los animales experimentales rechazaban la ingestión
de la hoja de coca molida (harina) mezclada con el alimento, no así el extracto hidro-alcohólico
(liofilizado) diluido en el agua de consumo. Asimismo, conviene destacar que la posibilidad de
administrar el extracto hidro-alcohólico en cantidades definidas, por procedimientos artificiales:
cánula, sonda, etc., causaban en los animales cambios drásticos en el comportamiento y
situaciones de estrés muy evidentes. Todo lo anterior justificó ampliamente el procedimiento de
suministro ya descrito en Materiales y Métodos. Queda claro que no todos los animales
consumían lo mismo en términos de volumen, pero se pudo conocer el promedio del consumo y
sus variaciones no fueron mayores a una desviación estándar. Por lo demás, la variable
relacionada con la dosis o concentración suministrada del extracto consistía en diferencias muy
grandes entre grupos: la dosis mínima relacionada con el peso del animal fue equivalente a lo
que el ser humano consume, cuando hace un tratamiento indicado por la medicina tradicional
para una dolencia cualquiera (3 g por 70 kg de peso); la dosis media fue 10 veces mayor, con
respecto a la dosis mínima, y la dosis máxima 33 veces más que la dosis mínima (por par de
conejos machos la dosis mínima fue 15,0 ± 6,1 mg, la dosis media 200,9 ± 73,2 mg y la dosis
alta 628,3 ± 169,4 mg; por par de conejas hembras la dosis mínima fue 21,8 ± 7,8 mg; la dosis
media 201,8 ± 51,3 mg y dosis alta 580,4 ± 85,0 mg). Por lo tanto, la dosis media y la más alta
equivaldrían a montos extremadamente elevados que no es posible ser consumido por el humano
(30 g y 99 g /70 kg de peso, respectivamente). Por lo demás, estas dosis tienen relación con la
concentración del extracto hidro- alcohólico de E. coca utilizada en sistemas de cultivos de
tejidos para evaluar la viabilidad y funcionalidad de las células de la inmunidad innata en
presencia de diferentes concentraciones de este producto (Padilla, 2019).
135
El estudio puede considerarse como sub-agudo, según lo establecido por los protocolos de
investigación en animales (Gámez, 2007); sin embargo, si se extrapola a lo que ocurre en los seres
humanos, el tiempo de suministro del extracto de 36 días (3.3% de la vida media de 3 años de los
conejos) equivale a 27 meses en la vida de un humano con vida media de 70 años. Por tanto, es
posible considerar que el tiempo en el que se hizo la administración en los conejos, es
suficientemente largo como para equiparar al consumo de la coca en los humanos por tiempos
relativamente extensos.
Si bien no se efectuaron mediciones de los marcadores bioquímicos y hematológicos en el
tiempo cero, para después compararlos con los niveles de estos marcadores en el tiempo final, se
pudo conocer esta diferencia por los resultados obtenidos en los animales control a los que no se
les administró el producto y permanecieron en las mismas condiciones de cría a lo largo del
experimento; para esta comparación se utilizaron 8 animales control, de modo que el promedio
de los datos obtenidos tenga una adecuada representatividad de los niveles normales de esta
especie, al menos en las condiciones de experimentación que se desarrolló en este estudio.
Asimismo, la decisión de no hacer la medición en tiempo cero obedeció
también al hecho de que la obtención de sangre en vivo, en montos elevados para todas las
pruebas de experimentación es un acto de intervención que podría, estimamos, generar
distorsiones en el comportamiento de los animales.
Parámetros generales
Lo que sí se pudo estudiar a lo largo de todo el tiempo de experimentación fue el
comportamiento, según parámetros ya establecidos (test de Irwin modificado) (Avellaneda,
2011). Resulta interesante haber encontrado que no hubieron cambios ostensibles en el consumo
de agua, en el consumo de alimentos, en el incremento de peso ni en los parámetros neurológicos
estudiados a ninguna dosis, tanto en hembras como en machos. Esto pudiera significar que el
extracto suministrado no tiene efectos deletéreos tanto en la esfera neuro-psíquica como en la
metabólica, reflejadas ambas en los parámetros estudiados. Solo se observaron episodios aislados
de diarrea, que desaparecieron espontáneamente y que no tuvieron relación con ninguna dosis
del producto. De la misma forma la ausencia de cambios significativos en la temperatura
corporal, a las diferentes dosis, muestra que este producto no tiene efectos ostensibles en la
136
esfera de la termorregulación, ya sea central (hipotalámica) o periférica (liberación de pirógenos
endógenos desde los leucocitos).
En el estudio de la esfera neurológica, sólo dos conejos presentaron fasciculaciones durante
varios días las cuales que no continuaron hacia el final del tratamiento. Consultados los criadores
de conejos sobre este hecho, destacan que es frecuente que existan individuos de esta especie con
este tipo de expresiones, como hechos aislados, sin que signifique patología evidente. Queda
claro que al no ser una cepa endogámica y homogénea genéticamente, la diversidad fenotípica es
bastante amplia por lo que no es esperable funcionamientos orgánicos idénticos. Todo esto
sugiere que el extracto de coca, en las dosis ensayadas, no incide de manera significativa en el
comportamiento ni en la reactividad neurológica de los animales experimentales.
Pruebas bioquímicas
La obtención de las muestras de sangre para su análisis fue realizada según procedimientos
convencionales, una vez que el animal fue adormecido con la aplicación de anhídrido carbónico,
por inhalación. La necesidad de volumen relativamente grande de esta muestra para los
respectivos análisis (21 determinaciones bioquímicas y hemograma completo), condujo a la
extracción de sangre venosa desde el ventrículo derecho prácticamente hasta el agotamiento de la
volemia para cada animal. Por lo demás, conviene hacer notar que la obtención de las muestras
de sangre no fue realizada en ayunas ya que hasta antes del procedimiento y eutanasia los
animales consumieron alimentos ad libitum.
Por cuestión de volumen uno de los criterios para utilizar plasma en lugar de suero fue el
hecho observable a que la sangre de los conejos en contacto con el tubo de vidrio tendía de
manera evidente hemolizarse. Si bien este hecho no está documentado en la literatura biomédica,
será interesante profundizar sobre este fenómeno, en subsecuentes estudios.
Con referencia a los métodos utilizados para la determinación de los biomarcadores, es
preciso resaltar el hecho de que estos son métodos convencionales validados por el fabricante.
Además, su validación ha sido largamente ratificada a través de su uso en procedimientos
clínicos en laboratorios de química clínica y hematología en el Instituto SELADIS. No obstante
todo lo anterior, en este trabajo se efectuaron para cada prueba la calibración del aparato de
medición, el fotómetro, con estándares, y para la validación se usó sueros control normal y
137
patológico, provistos por el fabricante. Si bien no se contaba con los valores de referencia para
conejos, los datos obtenidos del grupo control (8 conejos en total), fueron considerados como
valores básicos a ser referidos cuando se observen variaciones estadísticas en cualquiera de los
grupos que recibieron tratamiento con el extracto de hoja de coca.
Perfil hepático
Los marcadores bioquímicos que exploran el funcionamiento hepático muestran importantes
incrementos en los animales que recibieron las dosis altas de EHAEc. Si bien la mayoría de estos
no son estadísticamente significativos, la tendencia es evidente. Es posible que en el presente
estudio la dispersión de datos ocasionada por la variabilidad biológica sumada a la variabilidad
de la dosis consumida no permita apreciar las diferencias de manera estricta. Tal es el caso de la
γ-glutamiltransferasa, en la que se observó un incremento importante en el promedio en la dosis
alta (30 veces mayor a la del grupo control) pero la ostensible dispersión los datos en los
diferentes grupos interfiere con un adecuado análisis estadístico para determinar una diferencia
significativa entre grupos. Lo anterior hace ver la posibilidad de que estas diferencias
evidentemente existan y que se requiera un número mayor de animales experimentales para
ponerlos en evidencia.
Para examinar la posibilidad de que exista afectación hepática por medicamentos o productos
extraños, particularmente en humanos, se ha establecido un valor de riesgo (R) en el cual se
estima las relaciones en el valor de transaminasas, FAL y γ-glutamiltransferasa (Morales, Vélez
y Muñoz, 2016). Este valor de R es el valor sérico de ALT sobre su valor normal (VN) dividido
entre el valor sérico de FAL sobre su VN. Se sabe que si el R>5, el patrón de daño es
hepatocelular; si R es de 2-5, es mixto; si R<2, es colestásico (Morales, Vélez y Muñoz, 2016).
En este estudio no se encontraron valores de R grupales que puedan significar daño
hepatocelular, ni mixto; solo pudiera pensarse en colestasis leve a las dosis media y máxima
(valor R de los promedios: 1,6 y 1,2 respectivamente). Sin embargo, si se considera a cada
conejo individualmente se pudo ver que solo en un caso (R=2,7) tiene un patrón mixto muy leve,
que bien podría incluirse en el patrón colestásico. La enzima que se elevó considerablemente a
las dosis media y máxima es la γ-glutamiltransferasa (alrededor del doble), lo cual también es
compatible con la existencia de colestasis, la cual, obviamente, tendría un mecanismo intra-
138
hepático (hepatitis, colangitis esclerosante o cirrosis biliar primaria, excluyéndose este último
por ser un proceso crónico).
Cabe recalcar que el hepatocito es la célula diana habitual del efecto tóxico de los
medicamentos sobre el hígado y es la hepatitis aguda ictérica o anictérica la forma de
presentación más frecuente de la hepatotoxicidad (90% de los casos). La lesión de los
hepatocitos puede producir hepatitis aguda o crónica, esteatosis, hepatitis coléstasica, cirrosis,
hepatitis granulomatosa o tumores (Tejada, 2010).
Por lo demás, los otros biomarcadores hepáticos no muestran alteraciones ostensibles: tanto
las bilirrubinas como las proteínas totales (la albúmina nos sirve más para hepatopatías crónicas)
se mantienen en niveles similares al control, lo que significaría que no hay trastornos
compatibles con las leves colestasis encontradas mediante el valor R, asentando mas la idea de
que esta leve colestasis no es de origen obstructivo sino de daño en las células que tapizan los
conductos biliares. El hecho de que no exista elevación de las proteínas totales y de la albúmina
a ninguna dosis es compatible con la idea de que al menos durante este periodo de
administración no se instalan procesos esclerogénicos (cirrosis o fribrosis hepática). En resumen,
las dosis media y alta de EHAEc parecen indicar la existencia de un leve proceso colestásico de
origen no obstructivo cuya naturaleza exacta no es posible ser establecido por marcadores
bioquímicos.
Posible Mecanismo de la hepatotoxicidad directa del extracto hidro-alcohólico de E. coca.-
Para poder hacer consideraciones sobre el mecanismo de toxicidad observado a las dosis
altas, parece pertinente examinar lo que se ha descrito sobre la toxicidad de los alcaloides de la
coca y sus metabolitos. Se sabe que la cocaína, una vez ingerida, es metabolizada casi en su
totalidad, a los 15-30 minutos después de la administración (Mosquera y Cote-Menéndez, 2005).
La principal vía de transformación es la hidrólisis enzimática, siendo las esterasas plasmáticas
(BChE) y hepáticas (hCE-1) las principales enzimas responsables de la formación de sus
metabólitos: éster de metilo-ecgonina, ecgonina y benzoil-ecgonina (Salazar et al., 2016). Todos
estos metabolitos se eliminan por la orina y ninguno de ellos presenta hepatotoxicidad (Zaragoza
et al., 2000). La hidrólisis a benzoil-ecgonina se produce en un 45% de una dosis administrada;
porcentaje similar a la hidrólisis a ecgonina metil-ester. Ninguno de los dos metabolitos posee
139
actividad biológica significativa en humanos (Lizasoain, Moro y Lorenzo, 2002). La cocaína es
metabolizada por las esterasas plasmáticas (80%) y esterasas hepáticas (10%). Sólo un 10% es
metabolizada a través del sistema P450 (Campos Franco et al., 2002).
La vida media de la BChE en el plasma de los animales es de aproximadamente 21.6 horas y
metaboliza rápidamente a la molécula de cocaína en el metabolito éster de metilo-ecgonina; en
cambio, las enzimas hepáticas transforman a la cocaína en los metabólitos norcocaína y
benzoílo-ecgonina (Salazar et al., 2016). En el hígado sigue una vía oxidativa microsómica
hepática, esta vía metabólica minoritaria produce metabolitos intermedios como la norcocaína,
nitróxido de norcocaína, peróxido de hidrógeno y anión superóxido que causan una marcada
disminución del NADPH hepatocitico y del glutatión (Campos Franco et al., 2002). Este proceso
gira en torno al nitrógeno del anillo tropano y los enzimas responsables de llevarlo a cabo son el
sistema citocromo P-450 y la FAD-mono-oxigenasa, ambas mono-oxigenasas microsómicas de
función mixta hepatotoxicidad (Zaragoza et al., 2000). Por su lado, la norcocaína es un
metabolito muy hepa-totóxico y un poderoso anestésico local. En cambio, el éster de metilo-
ecgonina no genera ningún efecto fisiológico adverso y es rápidamente eliminado por el riñón,
por lo que el incremento en la concentración de este metabolito no genera efectos tóxicos en el
sujeto (Lizasoain, Moro y Lorenzo, 2002) (Mosquera y Cote-Menéndez, 2005) (Salazar et al.,
2016).
Por su parte, se sabe que la porción del citocromo P450, CYP3A4 y la FAD-monooxigenasas
en la vía oxidativa microsómica hepática, catalizan la desmetilación de la cocaína a norcocaína,
que luego es oxidada a N-hidroxinorcocaína la cual es transformada a un reactivo metabólico, el
radical libre norcocaína nitróxido que media la hepatotoxicidad, ya que posteriormente es
oxidado al Ion nitrosonium (Sierra y Torres, 2005) (Fernández, 2015). Así mismo, el radical
norcocaína nitróxido puede ser reducido nuevamente a la forma N-hidroxilada que lo originó,
mediante la acción de una flavoproteína en presencia de NADPH. De esta forma, el metabolismo
de la cocaína desencadena un ciclo redox fútil que consume NADPH en los dos sentidos, y que
además genera H2O2 en la oxidación de la N-hidroxinorcocaína, y O2 en la reducción de la
norcocaína nitróxido. Estos procesos tienen dos consecuencias: por un lado, la reacción de las
especies reactivas de oxígeno y otros radicales formados a partir de la cocaína con cualquiera de
140
las macromoléculas celulares, azúcares, aminoácidos, fosfolípidos, proteínas, nucleótidos o
ácidos orgánicos, causando grandes daños en la célula, a través de la peroxidación lipídica de las
membranas, lesiones al DNA u oxidación de proteínas. Por otro lado, la producción del ciclo
fútil entre los dos metabolitos oxidados de la cocaína, la N-hidroxinorcocaína y la norcocaína
nitróxido, disminuye los niveles de NADPH, y con ello la actividad de la glutatión-reductasa
dependiente de este coenzima. Este enzima se encarga de mantener los niveles de glutatión
(GSH) que la célula necesita para reducir, a través de la glutatión-peroxidasa, los peróxidos
producidos (tanto H2O2 como peróxidos orgánicos) y anular sus acciones. Si el glutatión no
puede ser regenerado, la defensa que ofrece su ciclo frente a agentes queda comprometida
(Zaragoza et al., 2000) (Sierra y Torres, 2005) (Fernández, 2015). Todo esto muestra que existen
mecanismos de toxicidad que pueden darse con la administración del extracto total de coca, el
mismo que incluye los alcaloides mencionados. En todo caso, el daño producido a altas dosis, ya
sea que ocurra como efecto de la acción de los metabolitos de los alcaloides o de otro tipo de
compuestos, no parece ser que ocurra a las dosis que la medicina tradicional propone y que aquí
se exploraron. Asimismo, la existencia de diversos procesos de detoxificación precisamente en el
hígado, da lugar a pensar en la evidente inocuidad de este extracto en las dosis equivalentes a las
recomendadas para su uso y aun en las dosis 10 veces más altas.
En el mismo orden, se puede asumir que para producir colestasis a partir de la lesión de los
hepatocitos el mecanismo sería de tipo idiosincrásico (Tejada, 2010).
Perfil renal
Los marcadores renales, no se modificaron de manera ostensible aún a dosis altas. En ese
orden, el ácido úrico, la urea y la creatinina no se vieron afectados por el extracto al menos en el
tiempo que duró su administración. De hecho, no se espera que en tiempos cortos exista
afectación funcional toda vez que los agentes tóxicos que actúan sobre el riñón habitualmente lo
hacen en tiempos largos, siempre dependiendo de la dosis (Mokhobo, 1976).
El funcionamiento orgánico que regula los minerales, parece no verse afectado por la
administración del extracto. El Ca++, Mg++, Cl-, Na+, K+ y fósforo no tiene modificaciones en
su nivel plasmático en ningún grupo. Esto último confirma que no existe daño renal, al menos
en las estructuras relacionadas con la regulación electrolítica. Asimismo, tampoco existiría
141
afectación ostensible de otros mecanismos de regulación de los niveles de electrolitos tales como
los niveles de mineralocorticoides o el metabolismo óseo.
Perfil lipídico/cardiaco
El perfil lipídico/cardiaco, tampoco se vio ostensiblemente afectado ya que el colesterol, las
lipoproteínas y los triglicéridos conservaron sus niveles en los diferentes grupos. Lo anterior
muestra una ausencia de afectación de los mecanismos de síntesis y regulación de estos
productos que cuando se modifican afectan la estructura vascular de diferentes órganos. La
escasa afectación del hígado demostrada por los otros marcadores y por las imágenes
histopatológicas ratifica este hecho.
Perfil pancreático
Con respecto al perfil pancreático los resultados muestran que no existe daño a este nivel. La
glucosa en la dosis mínima y media de administración no muestra variación significativa, aunque
se ve cierta disminución de sus valores promedio respecto al control; este podía ser un hecho
correspondiente a una de las características de la ingesta de productos de la coca cuyo consumo
ha mostrado que tiende a disminuir la glucosa (Hurtado, Cartagena y Erostegui, 2013). En la
dosis alta respecto al control, existe una leve elevación (promedio del grupo control 227±DS
28,2 mg/dL y promedio grupo máximo 258±DS 56,4 mg/dL); pero no es significativa
estadísticamente. Esta elevación es compatible con la capacidad de la coca para ser un producto
“suave energizante” y los efectos relacionados en la disponibilidad energética ya reportada para
este producto natural (Zuleta y Daza, 2018). Sin embargo el hecho de que este efecto se
encuentre a dosis 33 veces mayores que la del consumo recomendado como harina, no apoya la
idea de una perspectiva para su uso en esta línea de actividad.
Estudio hematológico
Los valores hematimétricos examinados mostraron pocas diferencias entre los grupos
experimentales; así, el hematocrito fue similar en los grupos de dosis baja, media y alta en
relación al control. Asimismo, la concentración de glóbulos rojos no vario significativamente. Lo
anterior, parece significar que, al menos en el tiempo administrado, el extracto no afecta la
hematopoyesis en la serie roja ni genera daño directo sobre las células hemáticas. El recuento de
142
plaquetas no pudo ser efectuado por el método clásico (recuento de plaquetas en cámara de
Neubauer) por el hecho de que el procedimiento de extracción por punción cardiaca en
volúmenes grandes implica un tiempo largo que conduce a una importante agregación
plaquetaria que dificulta que este parámetro sea determinado individualmente.
Respecto al número de leucocitos encontrados en los animales de los diferentes grupos
experimentales la inexistencia de cambios en el grupo de dosis baja respecto al grupo control
(promedio= 5000/mm3) muestra que a la dosis que se recomienda para su uso por la medicina
tradicional, no existen modificaciones en este marcador hemático, o sea es un indicador de su
inocuidad sobre esta serie. El leve ascenso del número de leucocitos en la dosis media, no
significativo estadísticamente (p=0.262), y mayor en la dosis alta, con variación en el límite de la
significancia estadística respecto al control (p=0.055), indica una posible respuesta del
organismo al EHAEc, de manera dosis-dependiente. Tal hallazgo es compatible con un posible
efecto de estimulación de la mielopoyesis o con la inducción de un proceso reactivo por parte del
organismo ante la presencia de este producto. Asimismo, este hecho correlaciona con hallazgos
en estudios paralelos realizados en ratas en nuestro laboratorio (datos no mostrados) en los que
se aprecia en el bazo un incremento de células esplénicas a nivel de pulpa blanca.
Lo encontrado con los granulocitos es consistente con un efecto dosis-respuesta cuyos montos
descienden en los grupos de dosis media y alta mostrando una franca tendencia, aunque las
diferencias con el control no son estadísticamente significativas. De ratificarse esta tendencia, en
estudios subsecuentes, este hecho podría significar una afectación a nivel de leucopoyesis más
que efectos citolíticos en la sangre, ya que en otra investigación paralela no hemos encontrado
efecto citotóxico del extracto sobre leucocitos humanos en cultivo aun a dosis muy elevadas
(Padilla, 2019). Por su parte, existe una leve elevación del número de monocitos en la dosis
media y alta pero tampoco es significativa; en cuanto al resto de células leucocitarias tampoco
hay diferencias significativas. Todo lo anterior muestra que no existen efectos hematotóxicos
como efecto de la administración de este extracto de hoja de coca a la dosis utilizada por la
medicina tradicional. La posibilidad de la existencia de efectos mielotóxicos, no fue evaluada en
este estudio aunque, de existir, esta podría ser detectado en la sangre siempre que tales efectos
sean agudos, para expresarse dentro de los 36 días que duro el experimento. Por lo demás, no se
143
encontraron granulaciones tóxicas que pudiera orientar sobre algún otro tipo de daño en la serie
blanca, como las drogas citotóxicas que si las producen (Manascero, 2003).
Tanto los resultados de los exámenes bioquímicos como los hematológicos muestran una gran
dispersión, en gran parte de los casos. Una de las explicaciones para este hecho es que la
variabilidad biológica en los conejos utilizados sea bastante amplia, dado que no son una cepa
homogénea en términos genéticos, aunque provienen de un mismo pie de cría. A lo anterior
puede adicionarse el hecho de que el consumo del extracto no ha sido uniforme en montos, por
los antecedentes ampliamente explicados; sin embargo, la dispersión también se evidenció en
algunos casos en el grupo de animales control, lo que conduce a considerar con cuidado esta
posibilidad. Por su parte, dados los controles internos efectuados en los procedimientos de
determinación de los analitos, no se espera que esta dispersión de datos sea producto de
imprecisión en los procedimientos bioquímicos realizados; al respecto debe considerarse que en
las determinaciones bioquímicas existe variabilidad inclusive dentro de una misma muestra en
magnitudes de ±1DS y hasta ±2 DS, en ese marco la variabilidad entre individuos diferentes
sería aún mayor, tal hecho se refleja en este estudio porque debemos asumir que los conejos
también tienen una variabilidad biológica similar a la de los humanos.
En los resultados mencionados del estudio, debe destacarse la importancia de lo encontrado
en el estudio histopatológico que se realizó en estos mismos conejos, lo cual es parte del
proyecto matriz8. Se destaca el hecho de que en el estudio de la arquitectura hepática las
imágenes en general no son drásticamente diferentes respecto al control, aunque se presentan
sinusoides levemente congestivos solo en los animales que recibieron el extracto. Esto es en
parte consistente con las alteraciones en los biomarcadores enzimáticos, aunque no se muestren
imágenes histopatológicas de daño hepático. Por su parte, estas imágenes no muestran el daño
colestásico que pudiera esperarse de acuerdo a los valores R. Es posible que el daño que ocurre
en las dosis altas para ser evidenciable en las imágenes histopatológicas debe pasar un mayor
tiempo de administración o, alternativamente hacer la extracción de los órganos bastante tiempo
8 Proyecto “INVESTIGACIÓN PRE-CLINICA DE LA TOXICIDAD /INOCUIDAD DE Eritroxylon coca: ESTUDIOS IN VITRO E IN VIVO
EN MODELOS EXPERIMENTALES” Coordinador: Roger Carvajal Saravia, M.D., M.Sc., Ph.D. Unidad de Biomedicina Experimental-
SELADIS
144
después (varios meses) aunque la administración del extracto sea por 36 días. Tal hecho es
compatible con la idea reconocida de que las imágenes histopatológicas (y en general los
procedimientos imagenológicos) se instalan como indicador de daño, de manera más tardía que
los marcadores bioquímicos (Jaimes, 2015). En el riñón estos estudios muestran que existe
integridad arquitectural de este tejido lo cual respalda los datos mostrados antes. Este hecho si
bien no correlaciona con los perfiles bioquímicos, nos muestra la posibilidad de que en dosis
altas y por tiempos prolongados este órgano sea afectado, al igual que lo que ocurre, en mayor o
menor medida, con todos los productos extraños introducidos en el organismo a dosis
extremadamente altas. En fin, este estudio muestra que, a las dosis de hoja de coca equivalentes a
lo recomendado por la medicina tradicional por vía oral, no se aprecia ningún daño o afectación
en animales experimentales. Si bien esto no puede ser automáticamente extrapolado a la especie
humana, da las líneas para indagar aspectos farmacológicos con mayor margen de seguridad,
particularmente en los estudios de seguridad clínica, en los que la administración de las dosis
mínimas (equivalente a las dosis habituales) pueden ser estudiadas con mayor efectividad en el
marco de las Normas de la Bioética.
Si bien aquí se aprecia daño significativo sólo en las dosis altas, hay que recordar que aún en
dosis bajas si el consumo es prolongado, podría evidenciarse el daño que aquí se aprecia a dosis
altas. Todos estos hallazgos deben ser necesariamente confirmados por investigaciones en la
misma especie y en otras especies.
También deberá considerarse que la dosis de material extraído y consumido por vía
sublingual o vía digestiva por parte de los acullicadores, particularmente los que llegan a montos
francamente elevados (100 gramos o más de hoja acullicada y en presencia de agentes alcalinos
para la extracción de alcaloides) pudiera acercarse (o sobrepasar en algunos casos) a la dosis que
en este estudio han mostrado toxicidad (dosis 10 y 33 veces mayor a la consumida como harina
para tales afecciones, o sea 30 a 100 g de harina por vía digestiva). En este orden, deberá
pensarse en la posibilidad de que los sujetos humanos acullicadores pudieran estar expuestos a
este tipo de daño, particularmente si los componentes responsables de dicho daño también se
extraen y se absorben durante el acullicado. Esto deberá ratificarse o rectificarse en estudios
expresos al punto.
145
Por lo demás, no debe dejarse de tomar en cuenta que en el presente trabajo se utilizó coca
exenta de aditivos químicos (agro-tóxicos), coca que no existe en el mercado. Esto lleva a pensar
que si se da el caso de consumo humano de coca del mercado por periodos largos de tiempo (aún
a dosis recomendadas por la medicina tradicional), debe esperarse un proceso sinérgico en el
cual actúen los pesticidas de manera adicional a la coca, con la toxicidad propia de este (y
cualquier) producto vegetal a dosis altas o administrada por largo tiempo.
Por tanto, el manejo de estos resultados debe necesariamente ser cuidadosamente tratado más
si se considera que en ciencia cualquier resultado debe ser ratificado por otro estudio
independiente antes que se convierta en un conocimiento definitivo y de uso social. También se
debe mencionar que no fue posible comparar los resultados del presente estudio con otros,
debido a que no existen estudios de esta índole, por lo que este trabajo vendría a ser pionero.
Además, los estudios sobre E. coca en general están referidos al alcaloide mayoritario
encontrado en su contenido. No se ha podido encontrar estudios sobre la toxicidad de la hoja de
coca entera en cualquiera de sus formas. Pero según Velarde y Risco (2016), mencionan en su
artículo: “en forma de hoja, la coca no produce toxicidad o dependencia”; también Trigo y
Suárez (2017) refiere una publicación de Ramos (1987) en la que se muestra que existen
evidencias de la no toxicidad de la hoja de coca, que ratifica lo ocurrido en su estudio (en cuanto
a su consumo); entonces mediante este estudio se reafirma tales mencionados respecto a la dosis
mínima (consumo habitual en humanos 3 g aprox.).
14. CONCLUSIONES
El objetivo de evaluar la inocuidad/toxicidad de la hoja de coca en conejos neozelandeses
como modelo experimental, ha sido cumplido en su integridad.
El material vegetal pudo ser suministrado a través de la obtención de un extracto hidro-
alcohólico que (según el conocimiento fitoquímico) contiene la mayoría de los principios
activos, el mismo que pudo ser utilizado en calidad de material soluble para la administración
por vía oral. Este material, no obstante provenir de un cultivo controlado, contenía cantidades
mínimas sin significación toxicológica de pesticidas. El procesamiento de este material vegetal
146
aseguró la ausencia de impurezas microbiológicas o físicas, toda vez que se utilizó etanol en el
lavado.
El estudio del extracto hidro-alcohólico de hoja de coca en este modelo in vivo fue realizado
explorando parámetros de comportamiento, bioquímicos y hematológicos en conejos a los que se
administró diferentes dosis del producto (mínima, equivalente a las dosis humana recomendada
por la medicina tradicional y dosis mayores equivalentes a 10 y 33 veces este monto) por 36
días.
Fue evidente que a ninguna dosis hubo alteraciones ostensibles en el incremento de peso, en
el consumo de agua y alimentos, ni en el comportamiento.
En el perfil hepático se encontró que a las dosis altas se incrementa significativamente la GPT
y se aprecia gran variabilidad de la GOT así como de la GGT. No obstante, los niveles del índice
de riesgo de daño hepático (R) solo se elevaron en niveles compatibles con una leve colestasis,
en dichas dosis. Tales hallazgos no correlacionan con los estudios histopatológicos que se
realizaron en el proyecto matriz, en los que solo se vieron imágenes congestivas en los
sinusoides hepáticos de los conejos que recibieron el extracto, sin la presencia de imágenes de
colestasis. Los otros biomarcadores hepáticos, no mostraron alteraciones ostensibles. Se puede
concluir que en dosis altas (10 veces) o extremadamente altas (33 veces mayores a la equivalente
a la utilizada en humanos) existen alteraciones hepáticas que deben ser consideradas como parte
de un efecto tóxico claro. Tal efecto no se observó en las dosis equivalentes a las que recomienda
la medicina tradicional y que es la que se ha definido para los estudios farmacológicos
consiguientes.
La exploración del perfil electrolítico, no mostró alteraciones importantes en animales que
recibieron el extracto, en comparación con los controles. En lo referente al perfil lipídico no se
observaron variaciones con tendencia definida, pero si una gran variabilidad de resultados
especialmente en las dosis altas; esto es compatible con la idea de que la harina de coca no afecta
el proceso de regulación del metabolismo de los lípidos. El perfil renal, por su parte, tampoco
mostró modificaciones significativas a ninguna dosis.
147
Los órganos del sistema endocrino explorados no mostraron alteraciones de importancia ya
que a todas las dosis, de administración el páncreas exocrino (α-amilasemia) y el páncreas
endocrino (glicemia) exhibieron imágenes similares a las de los controles.
Los valores hematimétricos no se alteraron a las dosis equivalentes al consumo humano, a
excepción de un incremento significativo del número de leucocitos totales en los conejos que
recibieron la dosis máxima; asimismo, se observó un incremento de monocitos y reducción de
segmentados en las dosis altas (sin ser estos últimos significativos estadísticamente). Estos
últimos hallazgos no se reflejan en los resultados de investigación paralela realizados en nuestro
laboratorio sobre la viabilidad de los leucocitos en humanos in vitro (48 hs) lo que hace ver la
aparente inocuidad de la hoja de coca en los elementos formes de la sangre.
En fin, como puede advertirse, a las dosis equivalentes a las recomendadas para el consumo
en humanos (3g diarios de harina por vía oral), la coca no tiene efectos deletéreos en modelos
experimentales in vivo, A dosis mayores (10 y 33 veces superiores) se observaron diferentes
cambios en hígado, detectados por marcadores bioquímicos pero no histopatológico en conejos.
Se puede concluir que este estudio ha permitido establecer el cinturón de seguridad necesario
para iniciar protocolos de investigación en seguridad clínica y posteriores estudios
farmacológicos experimentales.
Por lo demás el hecho de que estos resultados hayan sido obtenidos con coca exenta de
pesticidas y de que este tipo de coca no existe en el mercado, obliga a pensar en la necesidad de
contar con este tipo de productos para su utilización en el ámbito farmacológico. En caso
contrario se debiera esperar que el consumo de grandes cantidades de hoja de coca en cualquiera
de sus formas (tal como ocurre por algunas personas) podría tener efectos que se acerquen a lo
encontrado con las dosis altas en este estudio. A lo que podría adicionarse la sinergia
toxicológica producida por la presencia de pesticidas en el producto consumido.
15. RECOMENDACIONES
Es destacable el hecho de que este estudio aporta información pertinente para desarrollar
protocolos de seguridad clínica, así como estudios clínicos controlados en diferentes patologías.
148
Asimismo, se recomienda que la utilización médica de este producto deba ser necesariamente
en la dosis a la cual no se observó ningún efecto tóxico en este estudio.
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ANEXOS
ANEXO 1
Exámenes diagnósticos iniciales en el abordaje de DILI
Prueba Utilidad clínica
Hematológicos
Hemograma (incluidos eosinófilos) Reacciones de hipersensibilidad
Bioquímicos
AST/ALT Definición del patrón de daño hepático Lactato deshidrogenasa
Gammaglutamil transpeptidasa
Fosfatasa alcalina
Bilirrubina total y directa Gravedad de la lesión
Albúmina
Coagulación
Protrombina Gravedad de la lesión
INR
Serológicos (autoinmunidad)
IgG, IgA, IgM Diagnóstico diferencial
Anticuerpos anti-nucleares(ANA) (solicitar de acuerdo con la
Anticuerpos anti-mitocondriales(AMA) sospecha clínica)
Serología viral
IgM anti-HA Diagnóstico diferencial
HBsAg,IgM-HBc,anti-HBc,HBV-DNA (solicitar de acuerdo con la
Anti-HCV,HCV-RNA sospecha clínica)
Anti-HDV,HDV-DNA
Anti-HEV,HEV-RNA
IgM-EBV
IgM-CBV
Imágenes
Ecografía transabdominal Diagnóstico diferencial
(solicitar de acuerdo con la
sospecha clínica)
ALT:Alanino aminotransferasa; AST: aspartato aminotransferasa; CMV: citomegalovirus; HA: hepatitis A; HBc: hepatitis B core; HBsAg:
antígeno de superficie de hepatitis B; IgA: inmunoglobina A; IgG:
inmunoglobina G; IgM:inmunoglobulina M;VEB: virus de Epstein-
Barr;VHC: virus de la hepatitis C; VHD: virus de la hepatitis D; VHE:
virus de la hepatitis E.
Fuente: Morales, Vélez y Muñoz, 2016.
ANEXO 2. CAUSAS DE COLESTASIS
I. Colestasis intrahepáticas II. Colestasis extrahepáticas
A. Sin obstrucción mecánica con daño A. Obstrucción de los conductos biliares
hepatocelular predominante -Coledocolitiasis
a) Agudas -Síndrome de Mirizzi
-Virus de la hepatitis: A,B,B+D,C,E; virus de -Cuerpos extraños
Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus -Parásitos (áscaris y fasciolas)
-Hepatitis autoinmune
-Hepatitis isquémicas B. Enfermedad de los conductos biliares
-Congestiva: síndrome de Budd-Chiari, a) Enfermedad biliar benigna
valvulopatías e insuficiencia cardíaca -Estenosis de la vía biliar (quirúrgica,
-Hepatitis tóxicas traumática, isquémica)
-Infecciones bacterianas, leptospiras, salmonelas -Sección o ligadura de colédoco o de los
-Enfermedad hereditaria (de Wilson) conductos hepáticos
b)Crónicas -Úlcera duodenal cicatrizada con daño en la
-Virus de las hepatitis B,C,D; citomegalovirus, Papila
VEB b) Enfermedad biliar neoplásica
-Hepatitis autoinmune -Colangiocarcinoma
-Lesiones primarias de los conductillos biliares -Carcinoma ampular
intrahepáticos (cirrosis hepática biliar primaria y -Cáncer vesicular infiltrante
colangitis esclerosante primaria inicial) c)Enfermedad biliar inflamatoria
-Hereditarias (enfermedad de Wilson, -Colangitis esclerosante primaria
insuficiencia de alfa-1-antitripsina) -Colangitis por sida
-Papilitis y odditis estenosantes
B. Sin obstrucción mecánica con mínimo o nulo
daño hepatocelular C. Comprensión extrínseca de los conductos biliares
-Colestasis recurrente del embarazo -Cáncer de páncreas
-Alimentación parenteral -Pancreatitis
-Por drogas: estrógenos y esteroides anabólicos -Linfadenopatías en el hilio hepático Colestasis benigna recurrente -Diverticulitis yuxtapapilar del duodeno
C. Obstrucción mecánica al paso de la bilis
a) Infiltrativas
-Infecciosas (tuberculosis, microabscesos)
-Granulomatosas (sarcoidosis, granulomatosis de
Wegener)
-Neoplasias (hepatocarcinoma, metástasis
hepáticas, linfomas)
b) Lesiones primarias de conductillos biliares
-Cirrosis biliar primaria
-Colangitis esclerosante
-Fármacos (eritromicina, alfametildopa)
Fuentes: Del Valle et al., 2017.
ANEXO 4
Material y equipos para la Bioterio:
Balanza Olimpus
Probeta de capacidad: 100 L, 1L.
Indumentaria de bioseguridad
Jaula para conejos
Termómetro higrómetro
Receptáculos de alimento de los conejos
Dispositivos de suministro oral
Termómetro rectal
Para esterilización: mechero de alcohol para flamear las jaulas
Material y equipos para la Eutanasia:
Instrumental quirúrgico
Tanque de Dióxido de carbono CO2
Balanza Olimpus
Cámara de inducción para eutanasia
Jeringas
Indumentaria de bioseguridad
Halotano
Algodón
Reactivos y material para pruebas bioquímicas:
Tubos vacutainer con heparina
Tips de calibre: 10-200 L. y 100-1000 L.
Los reactivos a utilizar son la línea comercial LABKIT y consta de lo siguiente: los
reactivos de trabajo para las pruebas de perfil: hepático, renal, lipídico, pancreático y
electrolitos.
Standard para: Proteínas totales, albumina, creatinina, urea, ácido úrico, colesterol,
triglicéridos, HDL-colesterol, glicemia, calcio, magnesio, fosforo, Cloro, potasio y sodio.
Controles de calidad interno de la línea comercial LABKIT: normal y patológico.
Equipos:
Analizador químico semi-automático ERWA Mannheim, Modelo: CHEIM-7, con
software incorporado.
Centrifugadora “Eppendorf
Refrigerador
Cronómetro
Micropipetas “Eppendorf”
Vortex
Reactivos y materiales para hemograma completo:
Tubos vacutainer con EDTA3K
Diluyente para recuento de glóbulos blancos
Aceite de inmersión
Plastilina
Lector de hematocrito
Cámara de Neubauer
Equipos:
Microscopio Olimpus
Contador hematológico
Micropipetas “Eppendorf”
ANEXO 5
(PROCEDIMIENTOS PARA EL ESTUDIO FISICO-QUÍMICO DE LAS HOJAS DE
COCA)
Informe Científico: Avances del estudio bromatológico de hojas de coca para establecer las
características de composición química de minerales y proteína tratados en extracto
alcohólico y hojas no tratadas
Laboratorio de Bromatologia, Instituto SELADIS
Jefe de lab. Dra. Maria Torrez
INTRODUCCIÓN
Los análisis bromatológicos son la evaluación química de la materia que compone a los
nutrientes. La importancia de conocer la composición química de los alimentos radica en
establecer los aspectos nutricionales y químicos que brindan los alimentos y otros como
productos naturales que tienen un aporte de componentes químicos biológicamente activos.
Así, el conocimiento de esta composición química de los alimentos y productos naturales permite
su utilización de forma racional.
OBJETIVO.- Establecer las características de composición química de minerales y proteína de
la hoja de coca tratada en extracto alcohólico y hojas de coca natural
MATERIALES Y MÉTODOS
EQUIPOS Y MATERIALES
Espectrofotómetro Javas
Fotocolorímetro
Balanza analítica
Mufla
Equipo de destilación
Campana de seguridad química
Material de laboratorio
METODOLOGÍA ANALÍTICA
DETERMINACIONES ESPECTROFOTÓMETRICAS DE ELEMENTOS MINERALES
El espectro de absorción de una sustancia es característico de la misma y se obtiene
representando gráficamente en el eje de las abscisas las longitudes de onda y en el eje de las
ordenadas las absorbancias medidas, trabajando siempre a la misma concentración. A las
longitudes de onda en las que existe mayor absorción se le denomina de mayor absorbancia de la
sustancia. Estas longitudes de onda de máxima absorción tienen mucha importancia en los
estudios analíticos de los alimentos tanto en lo referente a la cuantificación como a la
identificación de aditivos y adulterantes alimentarios.
El análisis químico espectrofotométrico está basado en la posibilidad de desarrollar un compuesto
absorbente a partir de una reacción química concreta entre la muestra y los reactivos. Dado que la
absorción de un compuesto depende de la longitud de onda del haz de luz incidente, se debe
seleccionar una anchura de banda espectral estrecha así como una longitud de onda central
adecuada para optimizar las mediciones.
Este proceso se lleva a cabo a través de reacciones de oxidación y reducción generando un
complejo coloreado del que se mide su espectro de absorción para luego ser cuantificado.
FÓSFORO
El método se basa en la reacción del ión fosfato con molibdato(MoO42-
) que da lugar a
fosfomolibdato([PO412MoO3]3-
). Este último por reducción origina un compuesto cuya estructura
exacta se desconoce, denominado “azul de molibdeno”. Como reductores se pueden utilizar
muchos compuestos, de los cuales el sulfohidrato de hidrazina, el cloruro estannoso, el ácido
1,2,4-aminonaftosulfónico y el ácido ascórbico son los más empleados.
HIERRO
La detección de hierro se realiza a partir de una adaptación del método tiocianato La reacción
entre el hierro y el reactivo causa una coloración roja en la muestra, cambios de color que se
producen por una reacción química reversible y coloreada. La reacción elegida es la formación
del ión complejo hexa(tiocianato)ferrato (III), [Fe(SCN)6] 3 ¯ de color rojo sangre. Este ión
complejo se forma mezclando una disolución transparente de tiocianato de potasio, KSCN, con
otra de cloruro de hierro (III), FeCl3, de color amarillo claro. Los iones tiocianato, SCN¯,
reaccionan con los iones hierro (III), Fe+3, dando lugar al ión [Fe(SCN)6] 3 ¯ de color rojo. El
equilibrio dinámico que se establece entre los tres iones está dado por: Fe3+ (ac) + 6 SCN(ac)
[Fe(SCN)6] 3 (ac) amarillo claro transparente rojo La intensidad del color rojo nos indica, de
manera cualitativa, la cantidad del ión [Fe(SCN)6] 3 ¯ en la mezcla en equilibrio
DETERMINACIONES FOTÓMETRICAS
El análisis químico fotométrico está basado en la posibilidad de desarrollar un compuesto
absorbente a partir de una reacción química concreta entre la muestra y los reactivos.
Dado que la absorción de un compuesto depende de la longitud de onda del haz de luz incidente,
se debe seleccionar una anchura de banda espectral estrecha así como una longitud de onda
central adecuada para optimizar las mediciones.
ALUMINIO
El sistema óptico del sistema HJ 83200 de Hanna está basado en lámparas de tungsteno
subminiatura especiales y filtros de interferencia de banda estrecha para garantizar tanto su
perfecto funcionamiento como resultados fiables. Utilizando el kit de aluminio se genera un
complejo coloreado de color naranja
MANGANESO
El sistema óptico del sistema HJ 83200 de Hanna está basado en lámparas de tungsteno
subminiatura especiales y filtros de interferencia de banda estrecha para garantizar tanto su
perfecto funcionamiento como resultados fiables. Utilizando el kit de manganeso se genera un
complejo coloreado de color rojo
CROMO
El sistema óptico del sistema HJ 83200 de Hanna está basado en lámparas de tungsteno
subminiatura especiales y filtros de interferencia de banda estrecha para garantizar tanto su
perfecto funcionamiento como resultados fiables. Utilizando el kit de cromo generando un color
verde.
DETERMINACIONES VOLUMÉTRICAS
NITRÓGENO TOTAL Y PROTEÍNA
El contenido en nitrógeno, que se expresa como nitrógeno total y que se obtiene mediante una
combustión líquida en la que, en un primer paso, el nitrógeno de la muestra se convierte en
sulfato amónico, el cual luego se transforma en amoniaco. Este amoniaco se destila y se valora en
una solución ácido normalizada.
Esta técnica desarrollada por Kjeldahl, se ha convertido en método de referencia con múltiples
modificaciones. Determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto al nitrógeno proteico
como al no proteico.
Este método se trata de una volumetría de retrovaloracion. El método puede resumirse en tres
etapas:
MÉTODO KJELDAHL a) Digestión de la muestra con ácido sulfúrico concentrado en presencia de catalizadores que
aceleran el proceso, aumentando el punto de ebullición del ácido. Con esta digestión,
transformamos el nitrógeno (en su mayor parte orgánico) en sulfato amónico (nitrógeno
amoniacal).
b) Pasamos a medio alcalino mediante la adición de hidróxido sódico concentrado, y se destila el
nitrógeno en forma de amoniaco en corriente de vapor de agua.
c) Titulación por retro valoración con ácidos y bases de concentraciones 0,1 N.
Con este método, podemos calcular el porcentaje de nitrógeno en la muestra. Multiplicando por
un número que varía según el alimento, podemos estimar el porcentaje de proteínas.
Factor General: 6,25
Leche y Derivados: 6,38
Harina de Trigo: 5,70
Gelatina: 5,55
Arroz: 5,95
Huevos: 6,68
Productos de soja: 6,00
RESULTADOS
Tabla 1.- Resultados de composición química de proteína* y minerales en hojas de coca y
otras hojas (mg/100g)
Elemento Proteina Calcio Hierro Fosforo Cromo Aluminio Manganeso
Hojas de
coca
Negra
20,19 851,61 8.099 306.86 0,14 - -
Hojas de
coca
Verde
22,42 826,36 42,25 951,36 0,23 - 0,42
Hojas de
coca
Chapare
24,59 1055 117,42 747,99 0,11 1,22 17,16
g/100g
Fuente: Laboratorio Bromatología Instituto SELADIS
Tabla 2.- Comparación de resultados de composición química de hojas de coca con hojas
comestibles (mg/100g)
Elemento Proteína Calcio Hierro Fosforo Cromo Aluminio Manganeso grasa Carbohidratos Fibra
bruta
Hojas de
coca
Negra
20,19 851,61 8.099 306.86 0,14 - -
Hojas de
coca
Verde
22,42 826,36 42,25 951,36 0,23 - 0,42
Hojas de
coca
Chapare
24,59 1055 117,42 747,99 0,11 1,22 17,16
Hojas de
perejil
3,0 138 6,20 50 0,80 6,30
Hojas de
apio
1,50 43 0,70 115 0.158
Hojas de
alfalfa
24 3,1 45,80 14,40
g/100g
Fuente: Base de datos de nutrientes de USDA
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
El presente estudio nos permitió establecer que las hojas de coca tratados con solventes
orgánicos como alcohol influye en la disminución de componentes minerales como Hierro y
Fosforo y cromo de 42,25 mg/100; 951,36 mg/100g y 0,23 mg/100g respectivamente a 8,099
mg; 306,86 mg/100g; 014mg/100g respectivamente lo cual representa datos de diferencia
significativamente importantes. Estas diferencias se observaron en hojas procedentes de los
Yungas. En cuanto a la comparación de composición de hojas de coca de Yungas y el Chapare
los resultados muestran que las hojas del chapare tienen mayores porcentajes en proteína, calcio,
hierro. Las hojas de coca de los Yungas tienen mayores contenidos de fosforo y cromo. Tabla 1.
Respecto a comparación de la composición química de hojas de coca y hojas comestible como
apio y perejil podemos concluir que la hoja de coca tiene mayores contenidos de proteína y
minerales como calcio Hierro y Fosforo que supera ampliamente a los aportes de estos minerales
en hojas comestibles. Tabla 2.
Se puede concluir que la hoja de coca tiene importantes aportes de minerales como Calcio y
Fosforo. En cuanto a su contenido de Proteínas los resultados refieren a valores de Proteína por el
cálculo del nitrógeno total multiplicado por el factor general de conversión de nitrógeno a
proteína 6,25, sin embargo puede ser que el nitrógeno total obtenido por el método de Kheljdhal
corresponda a nitrógeno no proteico por lo que es importante todavía continuar con el estudio de
este elemento para descartar a aquellos elementos que no forman parte de las proteínas.
BIBLIOGRAFÍA
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Maria Luisa; Alminger, Marie; McChesney, James; Alcaraz, Franklin; Reddy, Manju B.
(2009). «Can coca leaves contribute to improving the nutritional status of the Andean
population?
ANEXO 6
Estandarización del preparado del extracto de Erythroxylum coca
Lavado de la hoja de coca
Estandarización del lavado de la hoja de coca
Para eliminar las impurezas, partículas de polvo y fragmentos de insectos que se asientan durante
el secado de la hoja de coca al aire libre, se realizó el lavado de la hoja de coca con agua corriente
para posteriormente ser sumergida en el etanol, para su descontaminación. Ante la necesidad de
realizar una desinfección con etanol sin afectar las características físicas de la hoja de coca, se
realizó una preparación de etanol al 70% en la cual se sumergieron hojas de coca por 5 min, 10
minutos y 15 minutos. Se encontró menor oxidación a los 5 minutos
Secado:
Posterior al lavado se realizó el secado de la hoja de coca en un ambiente limpio, libre de
humedad y de la luz solar ya que podrían oxidar las hojas. Las hojas fueron extendidas en todo el
ambiente para que haya un secado rápido y uniforme.
Conclusión.- Se realiza el lavado de la hoja de coca con agua corriente para ser después
sumergida tres veces en etanol al 70 % sin dejarla en reposo, para posteriormente ser secada al
aire a temperatura ambiente, en un ambiente seco.
Una vez llegada la coca orgánica que fue entregada por el VCDI (Viceministerio de la Coca y
Desarrollo Integral) en fecha 28 de Agosto año 2016, se realizó el lavado y desinfección de la
misma en las condiciones mencionadas.
Molido de la hoja de coca:
Estandarización del molido de la hoja de coca.- Para la estandarización del molido de la hoja
de coca se utilizó en primera instancia una moledora de alimentos (granos), el cual no dio los
resultados esperados ya que la maquina solo desmenuzo las hojas de coca pero no las convirtió en
harina.
Posteriormente se probó con una licuadora industrial del laboratorio de Bromatología del
Instituto SELADIS, en la que como resultado se obtuvo harina de coca fina y homogénea, como
indica el protocolo. El molido fue durante 2 min a temperatura ambiente con la velocidad
máxima.
Maceración de la harina de coca
Para la preparación de con extracto hidro-alcohólico de la hoja de coca, se realizaron dos
macerados a diferentes concentraciones. En la primera se maceraron 30 gramos de harina de coca
con 600 mL de alcohol al 50%; en la segunda preparación se maceraron 60 gr de harina de coca
con 600 mL de alcohol al 50 %.
Se midió el pH inicial para evitar cambios de ph de las preparaciones y se dejó macerando por 72
horas.
Nota. Todos los siguiente pasos no presentaron estandarización, se siguieron de acuerdo al
protocolo.
Centrifugación:
Pasada las 72 horas se colocó el extracto en tubos falcón de 50 mL y se centrifugo a 1500 rpm
por 15 min.
Filtración: El sobrenadante de la centrifugación se filtro con papel filtro Watman.
Evaporación:
El alcohol que tiene el macerado fue evaporado colocando el extracto en bandejas, a temperatura
ambiente en condiciones libres de contaminación hasta obtener extracto + agua
Congelación:
Terminada la evaporación se congeló el extracto en frascos (previamente pesados vacíos) a -80º
C por 24 horas.
Liofilización:
Posteriormente se realizó la liofilización que es un método de desecación en el que se elimina el
agua por congelación del producto húmedo y posterior sublimación del hielo en condiciones de
vacío. Al suministrar vacío el hielo sublima y se evita el paso por la fase líquida.
Se realizó el cálculo del rendimiento
%Rendimiento=
x100%
=
x100%= 16%
TEST DE IRWIN MODIFICADO
FASE SUB--CRÓNICA EN CONEJOS
Nombre del evaluador/a: Fecha:
Animal COD: Tiempo de pos-tratamiento:
Sexo: Nivel de dosis
Principio: Extracto Erytrhoxylum coca Vía de administración:
Cocentración:
B DIAS
0
SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
1 Actividad motora
2 Ataxia
3 Analgesia
4 Anestesia
5 Perdida de reflejo corneal
6 Perdida de reflejo Pineal
7 Parálisis patas anteriores
8 Parálisis patas posteriores
9 Parálisis de la cabeza
10 Reacciòn de alarma
11 Temblores finos del cuerpo
12 Temblores fuertes del cuerpo
13 Fasciculaciones
14 Convulsiones clónicas
15 Convulsiones tónicas
16 Convulsiones mixtas
OJOS
17 Ptosis palpebral
18 Nistagmus
19 Lacrimación
OREJAS
20 Palidez
21 Hiperemia
22 Cianosis
EFECTOS GENERALES
23 Salivación
24 Erección de cola
25 Erección pilo motora
26 Micciòn
27 Diarrea
EFECTOS SUBJETIVOS
28 Agresivo
29 Pasivo
30 Temeroso
OTROS
31 Temperatura rectal ºC
32 Peso corporal
ANEXO 7
Fuente: Avellaneda, 2011.
ANEXO 8
Parámetros histopatológicos
La tabla siguiente es un condensado de las observaciones en riñón, hígado, ciego y bazo; para
esto se acumularon (sumaron) los datos expresados en cruces en los órganos de cada grupo.
En el caso del riñón, no se observaron cambios en la arquitectura tisular, la congestión vascular
fue algo mayor en el grupo de dosis mínima, observándose que esta era menor en las dosis
mayores. Un leve infiltrado linfocitario focal en parénquima se observó en un solo animal del
grupo control y en tres de cada grupo que recibió el extracto. Los demás parámetros de
observación no muestran variaciones ostensibles.
En el caso del hígado no se observaron tendencias mayores con excepción de los sinusoides
congestivos que estaban ausentes en los animales del grupo control y eran ostensibles, aunque
escasos, en los grupos experimentales, sin una tendencia clara.
En referencia al ciego, parte del intestino donde permanecen los alimentos más tiempo, se pudo
observar que no hubo cambios en la arquitectura tisular respecto al control (ni tampoco en el
tamaño y forma macroscópica, según reporte del patólogo), los linfocitos, en lámina propia, que
son parte constitutiva fundamental para la función inmunitaria de esta región, no se modificaron
con la administración del extracto. Los plexos ganglionares disminuyeron en número de forma
leve, aunque podría ser parte de una tendencia a ser confirmada en otros estudios.
En el caso de Bazo, órgano fundamental en la función inmunitaria, no se observaron imágenes
compatibles con daño o afectación toxica sobre la arquitectura tisular ni sobre los componentes
celulares. Los sinusoides permanecieron congestionados, como si fuera una imagen propia de la
especie, ya que los controles también presentaban dicha congestión.
*valoración en cruces
Tabla .-DESCRIPCION HISTOPATOLOGICA DE RIÑON*
Grupos de conejos Arquitectura Congestión
Vascular en
Parénquima
Infiltrado
Linfocitario
Focal en
Parénquima
Dilatación de
Túbulos
N° células
mesangiales
agrupadas en
glomérulo
Grupo 1 (control) Sin Cambios 5 1 0 4
Grupo 2 (Dosis
mínima)
Sin Cambios 7 3 1 5
Grupo 3 (Dosis media) Sin Cambios 3 3 0 4
Grupo 4 (Dosis
máxima)
Sin Cambios 2 5 0 4
Tabla .- DESCRIPCIÓN HISTOPATOLÓGICA DE CIEGO
Grupos de conejos Arquitectura Linfocitos en
lámina propia
N° de plexos ganglionares por
cada 1,5 cm de intestino
Grupo 1 (control) - Sin Cambios 4 11
Grupo 2 (Dosis mínima) - Sin Cambios 4 9
Grupo 3 (Dosis media) - Sin Cambios 4 3
Grupo 4 (Dosis máxima) - Sin Cambios 3 7
Tabla .-DESCRIPCIÓN HISTOPATOLÓGICA DE BAZO
Grupos de conejos Congestión Sinusoides Folículos Reactivos en pulpa
blanca
Grupo 1 (control) 12 5
Grupo 2 (Dosis mínima) 12 4
Grupo 3 (Dosis media) 12 5
Grupo 4 (Dosis máxima) 12 6
Tabla .-DESCRIPCIÓN HISTOPATOLÓGICA DE HÍGADO*
Grupos de
conejos
Arquitectura Edema en
cito-plasma
de
hepatocitos
Infiltrado
Linfocita-
rio Peri-
vena-
centrolobul
ar
Infiltra-
do
Linfoci-
tario en
espacio
porta
Colesta-
sis
Vacuoliza-
ción
Citoplas-
mática en
Hepato-cito
Sinu-
soi-
des
Con-
gesti-
vos
Apoptosis
(control) Sin Cambios 0 0 5 0 1 0 0
(Dosis
mínima)
Sin Cambios 0 0 6 0 0 2 0
(Dosis media) Sin Cambios - 2 0 7 0
0
3 0
(Dosis
máxima)
Sin Cambios - 0 0 5 0 1 2 0
ANEXO 9
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
CONTROL NORMAL LABTROL DE LABKIT
ANALITO RESULTADO VALOR MEDIO RANGO UNIDADES
FOSFATASA ALCALINA 154,6 140 122-158 UI/L
GOT/AST 49,5 43,4 36,7-50,1 UI/L
GPT/ALT 60 52,6 43,1-62,1 UI/L
γ-GT 36,89 44 36,1-51,9 UI/L
PROTEÍNAS TOTALES 6,97 6,32 5,53-7,11 g/dL
ALBÚMINA 4,04 4,87 3,85-4,89 g/dL
COLESTEROL 182,8 177 157-197 mg/dL
TRIGLICÉRIDOS 121,7 109 95,5-122 mg/dL
CREATININA 2,0 1,71 1,47-1,95 mg/dL
UREA 35,0 39,5 34,9-44,1 mg/dL
ÁCIDO ÚRICO 6,61 6,11 5,37-6,85 mg/dL
CLORO 96,6 97,5 85,8-109 mmol/L
POTASIO 4,25 4,15 3,32-4,98 mmol/L
SODIO 161,4 137 110-164 mmol/L
CALCIO 9,15 9,75 8,58-10,9 mg/dL
FÓSFORO 4,30 4,58 3,99-5,17 mg/dL
MAGNESIO 2,21 2,37 1,96-2,78 mg/dL
GLUCOSA 105,5 108 92,3-124 mg/dL
AMILASA 154,6 134 110-158 UI/L
BILIRRUBINA DIRECTA 1,22 1,12 0,93-1,31 mg/dL
BILIRRUBINA TOTAL 2,37 2,03 1,68-2,38 mg/dL
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
CONTROL PATOLÓGICO LABTROL DE LABKIT
ANALITO RESULTADO
VALOR
MEDIO RANGO UNIDADES
FOSFATASA ALCALINA 441,9 457 394-520 UI/L
GOT/AST 173,3 164 139-189 UI/L
GPT/ALT 113,8 122 100-144 UI/L
γ-GT 92,58 106 87,1-125 UI/L
PROTEÍNAS TOTALES 6,97 7,6 6,65-8,55 g/dL
ALBÚMINA 4,38 4,67 4,12-5,22 g/dL
COLESTEROL 244,3 232 205-259 mg/dL
TRIGLICÉRIDOS 245,3 243 213-273 mg/dL
CREATININA 5,54 5,19 4,47-5,91 mg/dL
UREA 117,9 129 114-144 mg/dL
ÁCIDO ÚRICO 9,14 8,93 7,85-10,01 mg/dL
CLORO 106,6 106 93-119 mmol/L
POTASIO 5,04 5,52 4,42-6,62 mmol/L
SODIO 171,3 166 133-199 mmol/L
CALCIO 6,59 6,45 5,68-7,22 mg/dL
FÓSFORO 6,69 7,32 6,37-8,27 mg/dL
MAGNESIO 2,93 3,51 2,91-4,11 mg/dL
GLUCOSA 222,6 256 219-293 mg/dL
AMILASA 424,8 457 394-520 UI/L
BILIRRUBINA DIRECTA 2,1 2,43 2,01-2,85 mg/dL
BILIRRUBINA TOTAL 4,89 5,77 4,78-6,76 mg/dL
VALORES NORMALES PARA DETERMINADOS COMPONENTES BIOQUÍMICOS EN LA SANGRE DE CONEJOS
Valores normales del grupo control del presente estudio
Mensurado Raza del conejo Sexo Nº de conejos Muestra X±DS Rango Sexo Nº Muestra X±DS FAL** (UI/L) Cruce: Nueva Zelanda blanco M 72 Suero X: 214,03 172-219 MF 8 Plasma 567,5 ± 55,4
X Californiano 36 (9,3 hs) 218,0 ± 24,64
36 (16,3 hs) 209,80 ± 25,91
AST**(UI/L) Cruce: Nueva Zelanda blanco M 72 Suero X: 25,09 15-36 MF 8 Plasma 82,3 ± 17,8
X Californiano 36 (9,3 hs ) 22,11 ± 4,64
36 (16,3 hs ) 28,05 ± 5,05
ALT ***(UI/L) Nueva Zelanda blanco 19-73 MF 8 Plasma 93,0 ± 29,3
γ-GT**(UI/L) Cruce: Nueva Zelanda blanco M 72 Suero X: 5,60 5,0-8,0 MF 8 Plasma 22,0 ± 9,0
X Californiano 36 (9,3 hs ) 5,56 ± 1,054
36 (16,3 hs ) 5,64 ± 1,175
BILIRRUBINA** Cruce: Nueva Zelanda blanco M 72 Suero X: 0,2 0,10-0,30 MF 8 Plasma BT: 2,0 ± 0,15
(mg/dL) X Californiano 36 (9,3 hs ) 0,20 ± 0,033 BD: 0,1 ± 1,4E-17
36 (16,3 hs ) 0,205 ± 0,033
PROTEINAS Nueva Zelanda blanco M 29 Suero 6,3 ± 0,1 5,3-7,9 MF 8 Plasma 6,4 ± 0,4
TOTALES* F 25
(g/dL) Dutch Belted M 26 Suero 7,2 ± 0,2 5,7-9,7
F 19 7,1 ± 0,1 6,4-9,0
Polish F 4 Suero 8,5 ± 0,5 7,7-9.8
ALBUMINA***(g/dL) Nueva Zelanda blanco 2,7-5,0 MF 8 Plasma 3,5 ± 0,4
COLESTEROL* Nueva Zelanda blanco MF 89 Plasma 45 ± 18 MF 8 Plasma 112,75 ± 30,8
(mg/dL) Nueva Zelanda blanco MF 142 Suero 26.7 ± 1.3 5.7-71.0
Nueva Zelanda blanco M 29 Suero 42 ± 3 20-83
F 26 Suero 76 ± 3
Dutch Belted M 25 Suero 55 ± 3 35-82
F 18 60 ± 2 39-70
Polish MF 3 Suero 64 ± 14 50-92
TRIGLICERIDOS ****(mg/dL) Nueva Zelanda blanco M 30 Plasma 130 ± 54 MF 8 Plasma 115,5 ± 57,8
HDL-COL*****(mg/dL) Nueva Zelanda blanco F 12 Plasma 29,7 ±2,3 MF 8 Plasma 25 ± 6,2
UREA**** (mg/dL) Nueva Zelanda blanco M 30 Plasma 42± 9,36 MF 8 Plasma 51 ± 5,5
Fuente: *Weisbroth, Flatt y Kraus, 2013; ** Piquer, 1987; ***Saquinga, 2017; ****Abugarade, 1998; *****López, Márquez y Mendoza, 2000.
ANEXO 10
Mensurado Raza del conejo Sexo Nº de conejos Muestra X±DS Rango Sexo Nº Muestra X±DS
CREATININA* (mg/dL) Nueva Zelanda blanco MF 165 Suero 1,59 ± 0,34 0,80-2,57 MF 8 Plasma 1,4± 0,2
Nueva Zelanda blanco M 31 Suero 1,4 ± 0,04 1,0-1,9
F 26
1,2 ± 0,02 1,0-1,4
Dutch Belted M 26 Suero 1,22 ± 0,03 0,8-1,7
F 19
1,25 ± 0,05
Polish MF 5 Suero 1,78 ± 0,28 1.3-2.9
ACIDO URICO** (mg/dL) NZW X Californiano M 72 Suero X: 0,18 0,10-0,30 MF 8 Plasma 1,8± 0,3
POTASIO* (mEq/L) Nueva Zelanda blanco MF 143 5,06 ± 0,93 3,00-7,20 MF 8 Plasma 5,6± 0,9
Nueva Zelanda blanco M 31 Suero 5,1 ± 0,1 3,6-6,9
F 26 Plasma 5,3± 0,1 4,2-6,6
Nueva Zelanda blanco MF de 4 grupos Plasma 4,00 ± 0,2
Dutch Belted M 26 Suero 5,9 ± 0,1 4,4-7,4
F 19
Polish MF 3 Suero 5,4 ± 0,2 5,0-5,7
Nueva Zelanda blanco MF 150 10,0 ± 0,2
Nueva Zelanda blanco M
Suero 14,2 ± 0,6 11,8-16,5
F
Suero 15,9 ± 0,4 13,1-18,9
Dutch Belted M 26 Suero 14,5 ± 0,3 9,5-17,3
F 19
15,0 ± 0,3 13,5-16,7
Polish MF 3 Suero 15,6 ± 1,4 13,5-18,3
Nueva Zelanda blanco MF 99 9,65 ± 0,69
Nueva Zelanda blanco M 31 Suero 10,6 ± 0,8 97-114
F 25
10,2 ± 1,0 93-110
SODIO*(mEq/L) Nueva Zelanda blanco MF 148 Suero 125,41 ± 0,79 100-145 MF 8 Plasma 178± 10,4
Nueva Zelanda blanco M 31 Suero 141,0 ± 0,8 133-153
F 25
139,0 ± 0,7 131-145
Nueva Zelanda blanco MF 24 Plasma 131,47± 7,12
Dutch Belted M 26 Suero 147,3 ± 0,9 138-156
F 18
147,7 ± 0,8 144-158
Polish MF 3 Suero 133,0 ± 10,0 114-146
Fuente: *Weisbroth, Flatt y Kraus, 2013; ** Piquer, 1987. NZW: Nueva Zelanda blanco
Mensurado Raza del conejo Sexo Nº de conejos Muestra X±DS Rango Sexo Nº Muestra X±DS
CLORO** (mEq/L) Cruce: Nueva Zelanda blanco M 72 Suero X:103,74 96,3-112,9 MF 8 Plasma 108 ±4,4
X Californiano
36 (9,3 hs )
100,52±2,27
36 (16,3 hs )
106,87±3,14
CALCIO** (mg/dL) Cruce: Nueva Zelanda blanco M 72 Suero X: 14,66 13,0-15,9 MF 8 Plasma 13 ±1,9
X Californiano
36 (9,3 hs )
14,59± 0,59
36 (16,3 hs )
14,74±0,62
FOSFORO * (mg/dL) Nueva Zelanda blanco MF 148 5,47 ± 0,10 MF 8 Plasma 7,2 ±0,9
MAGNESIO* (mg/dL) Nueva Zelanda blanco MF 24 Plasma 1,27 ± 0,07 MF 8 Plasma 4,4 ±1,5
GLUCOSA* (mg/dL) Nueva Zelanda blanco MF 98 Suero 73,39 ± 0,97 50,0-93,18 MF 8 Plasma 227±28,2
Nueva Zelanda blanco MF 6 Plasma 98,7 ± 8,6
Nueva Zelanda blanco M 30 Suero 144,0 ± 2,0 127,0-156,0
F 25
135,0 ± 3,0 112,0-160,0
Dutch Belted M 24 Suero 129,0 ± 3,0 69,0-159,0
F 18
126,0 ± 3,0 102,0-149,0
Polish MF 4 Suero 104,0 ± 6,0 87,0-115,0
AMILASA ****** (UI/L) -- -- -- -- -- 166,5-314,5 MF 8 Plasma 227±28,2
Fuente: *Weisbroth, Flatt y Kraus, 2013; ** Piquer, 1987;****** Parámetros conejo, s.f.
VALORES HEMATOLÓGICOS DE NORMALES DE CONEJOS ADULTOS NUEVA ZELANDA BLANCO
Estudio presente del grupo control
Parámetro Sexo Nº de conejos X±DS Rango Sexo Nº de conejos X±DS
Hematócrito (%) MF 182 36,3 ± 3,2 29,8 - 42,7 MF 8 44,75 ± 4,81
Glóbulos rojos x 106/mm3 MF 169 4.84 ± 0.49 3.86 - 5.82 MF 8 4.92 ± 5.21
Glóbulos blancos x 103/mm3 MF 179 7.25 ± 2.31 2.63 - 11.87 MF 8 5.09 ±2.15
Neutrófilos (%) MF 158 33,5 ± 10,8 11,9 - 55,10 MF 8 44 ± 21
Linfocitos (%) MF 160 62,6 ± 11,4 39,8 - 85,4 MF 8 49 ± 17
Monocitos (%) MF 112 1,6 ± 1,9 0 - 5,4 MF 8 7 ± 3
Eosinófilos (%) MF 96 0,74 ± 0,93 0 - 2,6 MF 8 0
Basófilos (%) MF 158 2,46 ± 1,99 0 - 6,4 MF 8 0
Mieloblastos (%) MF 24 0,08 ± 0,28 0 - 0,6 MF 8 0
Normocitos (%) MF 24 0,33 ± 0,56 0 - 1,5 MF 8 0
Weisbroth, Flatt y Kraus, 2013
