DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR LA TÉCNICA DE MILLER (DNS).

Bibián L. M. E., Rojas R. M. A.

Resumen

Los azúcares reductores poseer un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere la característica de poder reaccionar con otros compuestos. La determinación de estos azúcares se realizó con el objeto de obtener una curva de calibración aplicando la técnica de Miller o DNS (ácido dinitrosalicílico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de 575nm.

Palabras clave: carbohidratos, azucares reductores. Abreviaturas empleadas: DNS, ácido dinitrosalicílico.

Introducción

Los carbohidratos son moléculas formadas por carbono, hidrogeno y oxígeno. Todos los carbohidratos son azucares pequeños, solubles en agua (glucosa y fructosa, por ejemplo) o bien cadenas, como el almidón y la celulosa, que se elaboran enlazando subunidades de azúcar. (Audesirk,Audesirk, & Byers, 2003)

En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacáridos (azucares simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades monosacáridas) y polisacáridos (glúcidos poliméricos más grandes). Los monosacáridos se clasifican en aldosas si tienen grupo aldehído y cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los monosacáridos, aldosas o cetosas y la mayoría de los disacáridos son azucares reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anoméricos no está formando enlace glucosídico. (Berg,Stryer, & Tymoczko, 2008)

Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehído o cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. (Armstrong & Bennet,1982)

El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. Por lo tanto, se aplicará esta técnica para la construcción de una curva

patrón de glucosa que será una referencia para próximos experimentos.

Método

Reactivo DNS

Se disolvieron 2.5g de DNS, 2.5g de NaOH, 0.125g de Na2SO4 y 0.5g de C6H6O en 200mL de agua destilada. Se aforó a 250mL con agua destilada, y la solución se en un frasco ámbar previamente etiquetado.

Solución patrón de glucosa

Se preparó una solución de glucosa con una concentración de 1.0g/L, para lo cual se disolvió 0.1g de glucosa en 90mL de agua destilada, y se aforó a 100mL.

Curva patrón

A partir de la solución patrón de glucosa y agua destilada se prepararon 10 tubos con diferentes concentraciones como lo indica la Tabla 1. El trabajo se hizo por triplicado. A cada uno de los tubos, se le adicionó 1mL del reactivo DNS y se agitó con el Vórtex. Se pusieron en un baño María durante 15 minutos, se dejaron enfriar y se agregaron 8mL de agua destilada. Utilizando como blanco una solución de agua con el reactivo DNS, se determinó la absorbancia de cada tubo a 575nm.

Tabla 1. Se muestra el volumen de solución patrón y agua destilada añadidos a cada tubo, así como la concentración final de cada uno.

Resultados

En la Tabla 2 se reportan las absorbancias obtenidas de las tres muestras. Utilizando las formulas Tabla 3 se obtuvieron la media (Y°) de cada duplicado y la desviación estándar. Se muestra también la curva patrón obtenida y ajustada con regresión lineal, así como la ecuación de la curva.

Tabla 2. Se muestran las absorbancias medidas a una longitud de onda de 575nm, así como el promedio de las tres.

Tabla 3. Se enlistan las fórmulas utilizadas para el cálculo del promedio y la desviación estándar.

Tabla 3. Fórmulas

Media( y °)

y1+ y2+ y N

N

Donde:N= número de valoresy= Abs 575nm

DesviaciónEstándar σ=√

1N∑i=1

N

( y i− y ° )2Donde:N= número de valoresy i= Abs 575nmy °= media

0 200 400 600 800 1000 12000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

f(x) = 0.000446242424242424 x − 0.00933333333333333R² = 0.990266653274063

Curva Partrón de Glucosa

Concentración (mg/L)

Absorbancia (575 nm)

Gráfico 1. Se muestra la curva patrón obtenida de glucosa. Se grafica la concentración en miligramos por litro contra el promedio obtenido de las absorbancias de las tres muestras. Se observa la ecuación dada por la regresión lineal.