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Laboratorio Bioqumica

Determinacin de nitrgeno, determinacin del punto isoelctrico y cuantificacin de casena en la leche 0%grasa Yesica Natalia Lpez, Cesar David Chaparroa Campus del Puente del comn, km 7, Autopista Norte de Bogot, Cha, Cundinamarca, Colombia

INFORMACION ARTICULOOBJETIVOS

Historia del artculo:Recibido marzo 5 de 2015Recibi en forma revisada -__Aceptado-__

Identificar el punto isoelctrico de la casena que se encuentra en la leche 0% grasa por medio de mtodos experimentales Determinar la cantidad de nitrgeno presente en la muestra problema de leche 0% grasa por medio del mtodo de Kjeldhel Reconocer y familiarizarse con el mtodo de Biuret como mtodo para la cuantificacin de protenas Profundizar en el fundamento de la electroforesis y llevarla a cabo de forma apropiada

Palabras clave:macromolculaProtenasCasenaPunto isoelctricoElectroforesisMtodo de Biuret

4BIOQUIMICABIOQUIMICA

Introduccin La leche es un producto nutricional de vital importancia en la alimentacin de los mamferos en general, debido a que tiene un contenido alto y equilibrado de todos los macronutrientes (hidratos de carbono, protenas y grasas), distintos minerales, vitaminas y electrolitos1, los nicos elementos importantes en una nutricin balanceada que no posee la leche son el hierro y la vitamina c; a pesar de que la leche bovina no es conveniente durante los primeros meses de vida de los seres humanos, es una fuente nutricional de vital importancia para el optimo crecimiento de los nios, adems una gran fuente de calcio que ayuda en la prevencin de enfermedades como la osteoporosis en personas de edad avanzada; el consumo de la leche y sus derivados a dado lugar al desarrollo de la industria lctea, dando origen a productos como la leche descremada o la leche 0% grasa, objeto de investigacin de este articulo, productos desarrollados para aquellas personas que desean consumir cantidades bajas de grasa, o que tienen problema con el procesamiento de lactosa ente otros factores.El mayor componente proteico de la leche es la casena, que se encuentra casi en un 80% en forma de sal clcica caseinato clcico, la cual adems de ser esencial en una buena nutricin, debido a ser una protena conjugada de alta calidad, posee propiedades que ayudan en el desarrollo de los msculos, la perdida de grasa mediante el ejercicio y la proteccin contra el cncer de colon2.El aislamiento de la casena es un proceso de gran importancia para la industria de fabricacin de pinturas especiales y el preparacin de tejidos, clarificacin de vino, elaboracin de preparados farmacuticos, la fabricacin de plsticos (botonera, peines y mangos de utensilios), pinturas, la cual ha sido usada desde la antigedad por los egipcios, pegamento en relojera, carpintera (recomendadas para maderas terciadas), papel, vidrio, porcelana3Las macromolculas como protenas y otros biopolimeros se caracterizan porque poseen un pH con carga neta cero, o punto isoelctrico que permite que puedan ser precipitadas con facilidad, dicha carga neta cambia de acuerdo a distintos factores como por ejemplo el grado de ionizacin al pH en el que se encuentra la molcula o el contenido de una serie de aminocidos4; para la separacin de dichas protenas la tcnica ms utilizada es la electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque es una tcnica que tambin puede ser utilizada en separacin de cidos nucleicos4 este es un mtodo conveniente y rpido dado que el nivel de muestra necesario requiere solo cantidades del orden de los microgramos.Esta electroforesis funciona bajo el principio de que cuando una protena se encuentra lejos de su punto isoelctrico se encuentra cargada, lo que permite que dicha protena se desplace si es sometida a un campo elctrico, entre ms grande sea la carga por unidad de ms rpido ser la migracin de la protena.

Mtodos y MaterialesAislamiento de la casenaSe calent en un vaso de precipitado 100ml de agua con 50 ml de leche 0% grasa hasta alcanzar los 38 C, a continuacin se agrego gota a gota acido actico 1 N, en constante agitacin hasta que se observo un precipitado; la solucin obtenida tras la realizacin de estos pasos se utilizo para la obtencin de 2 soluciones masSolucin A: se tomo parte de la solucin inicial y se centrifugoSolucin B: se lavo el precipitado con 20ml de etanol y se centrifugoCasena: se le agregaron 5 ml de ter etlico al precipitado se centrifugo obteniendo un segundo precipitado blanco de fcil manipulacin (casena) y se descarto el sobrenadante de ter etlico

Preparacin de la casena Se tomaron 250mg aproximadamente de casena en un vaso de precipitado de 50 ml, se agregaron 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N, y se agito hasta completar la disolucin total de la casina, a continuacin dicha solucin fue vertida en un matraz aforado de 50 ml donde se le adiciono 5 ml de acido actico 1N y se aforo con agua destilada hasta alcanzar los 50 ml Determinacin del punto isoelctrico de la casenaEn 10 vasos limpios se realizaron disoluciones con distintos volmenes de reactivos expresados en la tabla1

Una vez obtenidas las disoluciones se procede a la medicin del pH de cada una de ellas; posteriormente se aade 1 ml de la solucin de casena a cada vaso obteniendo una fraccin sobrante de solucin nombrada como solucin C

Cuantificacin de la cantidad de protenas por el mtodo de Biuret En 10 tubos de ensayo se prepararon reacciones de acuerdo a la tabla 2Cada tubo se agito con suavidad y se dejo en la oscuridad por un rango de tiempo de 15 minutos para luego medir la absorbancia de cada uno a una longitud de onda de 595 nmElectroforesisa. Obtencin de muestras #Muestra SolucinCantidad SAzul de coomassie

1leche 0% grasa2l18L

2A10L10L

3B10L10L

4C10L10L

Tabla3: contenido de cada muestraCada muestra fue sometida a calentamiento a 100C por 5 minutos y luego se sometieron a frio en hielo; Se colocaron cuidadosamente 20L las muestras con una micro pipeta sobre los pocillos de los geles de la electroforesis; adems se incluyo 10L del estndar tris-glicina 15% del patrn de peso molecular encontrada en la primera columna de la imagen 1 en uno de los pocillos

Se sometieron las muestras a electroforesis con una corriente de 100 mA y tras 1 hora se extrajeron los vidrios del cassette cuidadosamente, de tal forma que el gel quedara posado sobre uno de ellos, a continuacin se sumergi el gel en una solucin de 1g de azul de Coomassie, 459ml de metanol, 450ml de agua destilada y 100ml de cido actico glacial por 8 das, transcurrido el tiempo el gel se sumergi en una solucin decolorante y se observaron las bandas proteicas Determinacin de nitrgeno por el mtodo de kjeldhala. Digestin Se peso una muestra de 711.9 mg para ser utilizados en la digestin b. Destilacin y Absorcin Se coloco en el equipo de destilacin el tubo de digestin con la muestra, y se programo para realizar la destilacin cono los siguientes parmetros: Agua: 50 ml cido brico: 75 ml al 2% NaOH: 80 ml al 32% o una densidad de 1.34 Tiempo de destilacin: 5 min Iy se dio inicio a la destilacin. c. Titulacin Se titul con HCl de concentracin 1 M, con una gota de indicador de Taschiro hasta que se produjo un cambio en la coloracin de la muestra Resultados y discusin de resultados Aislamiento de la casenaEl aislamiento de la casena se da debido a que una de su caracterstica es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena se encuentra cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita5 Ca 2+ Caseinato + 2HCl Casena + CaCl2

Para este laboratorio en particular se utilizaron 1.6 ml de acido actico en lugar de acido clorhdrico para lograr la precipitacin de la casena Una vez que la casena precipita en el sobrenadante utilizado para las soluciones A y B contiene otras protenas globulares, solubles en agua y susceptibles a la desnaturalizacin por calor como por ejemplo -lacto globulina, alphalactalbumina, bovine serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig)5Determinacin del punto isoelctrico de la casena TubopH absorbancia

13.490.1

23.70.079

33.920.079

44.060.183

54.280.23

64.480.216

74.830.206

85.280.207

95.820.026

106.120.0183

Tabla 4: valores de pH y absorbancia para cada solucin La grfica 1 nos muestras el grado de pH en donde la absorbancia alcanza su mximo punto, este valor es el punto isoelctrico de la casena, el cual hace referencia al pH en donde la casena se encuentra con carga neta de 0. En este caso no se obtuvo un resultado no tan distante del esperado debido a que al compararlo con resultados encontrados en literatura se diferencia en 0.42 unidades donde se encuentra que el PI es de 4,76

Grafica 1: valores de absorbancia vs pH e identificacin del PICuantificacin de la cantidad de protenas por el mtodo de Biuret Grafica 2: Curva de calibracin absorbancia contra concentracin medida en (mg/ml)Siguiendo la ecuacin de la grafica para la absorbancia obtenemos que el valor del coeficiente de extincin es igual a 0.0615Segn la grafica 2 la concentracin est dada por:

Siguiendo la ecuacin anterior obtenemosSolucin Absorbanciaconcentracin (mg/ml)

Leche 0% grasa0.0140.1056

A0.1462.252

B0.1332.04

C0.284.43

Tabla 5 valores de absorbancia para cada solucin El coeficiente de relacin de la grafica dos R = 0.9915, lo cual asegura la tendencia lineal de dicha grafica, y nos da seguridad en la utilizacin del mtodo grafico para hallar la concentracin de las protenas en las distintas muestras En otros estudios realizados se ha determinado que la leche de bovinos tiene una concentracin de protenas de 3.3 mg/ml7, analizando los datos obtenidos se evidencia que la leche 0% grasa ha perdido una gran cantidad de protenas, ya sea por desnaturalizacin, presentada cuando esta es sometida a procesos de higienizacin, los cuales se realizan llevando la leche a temperaturas de 130 C durante un rango de 2-4 segundos (pasteurizacin) , o por otros procesos requeridos para retirar la grasa de la leche, ya que existe una amplia relacin entre la cantidad de grasa que posee la leche y la cantidad de protenas Electroforesis Tras la realizacin de la electroforesis se obtuvieron los resultados mostrados en la imagen 2 que se pueden observar ms claramente en el esquema que se presenta en la imagen 3

Imagen 2: gel de electroforesis Imagen 3: esquema del gel

A partir de dichos resultados se construye una curva de calibracin con los pesos moleculares del patrn utilizado la cual se ensea en la grafica 3, con el fin de determinar el KDa (aproximado) de cada protena encontrada en las distintas muestra, obteniendo la tabla 6 de resultados

Grafica 3: curva de calibracin a partir del patrn de protenas

KDA

CALeche

21,244603710,407197347,6535905

19,1266339,6513500921,8833106

16,717218819,4905886

10,605233117,1735044

10,5199033

9,72963479

Tabla 6: valores de Kda aproximados para las protenas encontradas en distintas soluciones de leche 0% grasa

Si se observan los resultados obtenidos en la tabla 6, se evidencia la presencia de casena (alpha, beta o kappa)8 en los Kda que estn en un rango de 42-199, las cuales solo fueron encontradas en la muestra C y la muestra de Leche 0% grasa pura; este producto se esperaba dado que en ninguna de estas muestras hubo acidificacin que hiciera que la protena alcanzara un pH de 4.6 y precipitara, por el contrario el pH de la casena se mantuvo constante alrededor de 6.Otras protenas encontradas en las muestras fueron las albminas del suero; las cuales estuvieron presentes en todas las muestras, debido a que representan el 20% de las protenas contenidas en las muestras, siendo el 80% restante distintos tipos de casena; adems de que las albminas son protenas globulares, hidroflicas y fcilmente solubles en agua10

Determinacin de nitrgeno por el mtodo de kjeldhel

Peso muestra: 711.9mg

Volumen de HCl utilizado (Vm)= 17.5 mlVolumen del blanco (vb) = 205 ml

%= 100

%= 100= 36.87%

% = %6.25= 230.46

Cuestionarioa. Qu sucedera si se representa la transmitancia para la determinacin del punto isoelctrico de la casena?El valor obtenido para el punto isoelctrico no variara, sin embargo dicha grafica seria ms corta por lo que sera un poco ms difcil identificar dicho valor con exactitud b. Cul es el punto isoelctrico de la casena? Determnelo con los datos de su experimento y comprelo con el obtenido por bioinformticaEl punto isoelctrico obtenido experimentalmente es 4.28 al compararlo con la bioinformatica se encontr que existen un tipo de casena reportada que posee un punto isoelctrico cercano al obtenido llamado alfa S1 casena que tiene un punto isoelctrico de 4.7673, mientras otros tipos de casena reportados tienen un punto isoelctrico alrededor de 9.111,12 c. Por qu las protenas tienen solubilidad mnima en el pI?Debido a que el punto isoelctrico es el pH en el que la carga neta de las protenas es 0, lo que causa que no exista ninguna fuerza electrosttica13, que estabilice la molcula y cause que los iones dipolares cristalicen en forma de sales insolubles a dicho pH14 d. Cul es el peso aproximado de las protenas de la casena?De acuerdo a la bioinformatica el peso molecular de la alfa S1 casena es 24442.78 e. Cul es la concentracin de la solucin de casena?La concentracin de la solucin de casena (solucin C) es 4.43 mg/ml Conclusiones El aislamiento de determinada protena se encuentra estrechamente ligado al valor del punto isoelctrico y la solubilidad El punto isoelctrico corresponde no solo al valor de pH en el cual la carga neta sea cero sino al valor de pH en el que el compuesto presente mayor absorbancia El cambio en la concentracin de poroteinas en distintos tipos de leche puede deberse a la desnaturalizacin de dichas protenas, en procesos de higienizacin, o extraccin de grasa, dado que esta es proporcional a la cantidad de protenas en la leche La casena encontrada en la leche 0% grasa probablemente es casena S1 debido a que el dato experimental obtenido para el punto isoelctrico de esta protena no difiere en gran medida de el obtenido a travs de la bioinformatica En la muestra A no se evidenci casena, lo que nos dice que la separacin de la casena de la muestra fue eficiente En las muestras C y leche 0% grasa las corridas del gel fueron muy similares, y en ambas se logro identificar casena y albuminasBibliografa1. profesores en importancia. (s.f.). La importancia de la leche. Recuperado el 28 de febrero de 2015, de http://www.importancia.org/leche.php2. fit nasio (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de los 4 mejores beneficios de la caseina: http://www.fitnasio.com/articulos/4-suplementos/30-los-4-mejores-beneficios-de-la-caseina.html3. quimi net.com. (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de caseina, una proteina de la leche: http://www.quiminet.com/articulos/caseina-una-proteina-de-la-leche-13367.htm4. Cultek. (s.f.). protocolo y tecnicas cultek. Recuperado el 28 de febrero de 2015, de Electroforesis de proteinas5. Extraccion de la caseina y determinacion del punto isoelectrico. (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf6. Harris, D. (2003). Enfoque isoelectrico. En Anlisis qumico cuantitativo (pg. 209). New York: Reverte.7. Quesada, S. (2006). Manual de experimentos de laboratorio bioquimica . EUNED. ISBS 9968316164.8. MILK PROTEIN. (s.f.). Obtenido de http://www.milkfacts.info/Milk%20Composition/Protein.htm9. Leche descremada. (s. f). Recuperado el 3 de marzo de http://fundacionfedna.org/ingredientes_para_piensos/leche-descremada10. 10 Caractersticas de los alrgenos ms importantes en la leche de vaca. (s.f.). Recuperado el 2 de 3 de 2015, de https://nutricionpersonalizada.wordpress.com/2010/04/27/alergenos_leche_vaca/11. National Center for Biotechnology Information. (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de 10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ACG63494.112. Emboss. (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de 11. http://emboss.bioinformatics.nl/especialistas en nutricion adecuada .13. desnaturalizacion de las proteinas. (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm#3314. bioquimica de angela . (s.f.). Recuperado el 28 de febrero de 2015, de http://angela-bioqumica.blogspot.com/2011/09/punto-isoelectrico-de-aminoacidos-y.html