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工學碩士學位請求論文

감귤주스 가공폐기물을 이용 Bacillus subtilis LS 1-2 배양을 통한 항균사료첨가제의 개발

Development of antimicrobial feed additive by Bacillus subtilis LS 1-2 fermentation

on citrus-juice processing wastes

2005年 2月

指導敎授 金 殷 基

仁荷大學校大學院

生物工學科(生物工學專攻)

李 重 鎭

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工學碩士學位請求論文

감귤주스 가공폐기물을 이용 Bacillus subtilis LS 1-2 배양을 통한 항균사료첨가제의 개발

Development of antimicrobial feed additive by Bacillus subtilis LS 1-2 fermentation

on citrus-juice processing wastes

2005年 2月

指導敎授 金 殷 基

이 論文을 工學碩士學位 論文으로 提出함

仁荷大學校大學院

生物工學科(生物工學專攻)

李 重 鎭

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이 論文을 李重鎭의 碩士學位論文으로 認定함.

2005年 2月

主審 :

副審 :

委員 :

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요 약

본 연구에서는 감귤주스 가공폐기물(폐감귤박)을 이용 pellet 사료를 생산하고 공정 중에 발생하는 폐수: 폐감귤박 가공폐수(Citrus-waste processing waste water)를 제거하는 방법으로 균을 배양하고자 한다. 균은 pectin 성분의 유사성으로 콩과발효식품에서 분리하였으며, 균의 생균제로써의 가치를 판단하고, 생산하는 항균물질의 특성을 조사, 최종적으로 통계학적 방법을 이용하여 이 두 가지를 최적화하였다. 균 분리를 위해 Anti-S. aureus, 균수, protease 활성에 50 : 25 : 25의 가중치를 두는 RPI 통계학적 방법을 이용하여 LS 1-2를 선발하였고, 분자동정결과 Bacillus subtilis임을 알 수 있었다.B. subtilis LS 1-2는 재래 고추장으로부터 분리된 non-toxin 균주이며, protease, amylase, 항균물질을 생산한다. 109 CFU/mL 이상의 균수를 가지며, 담즙에 대한 내성은 TDOC에 대한 MIC는 1.0ppm 이상, DOC는 0.27ppm 이였다. B. subtilis LS 1-2가 생산하는 항균물질은 폐감귤박 배지에서만 항균물질을 생산하여 폐감귤박 유래 생합성물질로 예측되고, 그람양성, 그람음성에 광범위 항균 스펙트럼을 갖고, 산업용 항생제 1000ppm과 비슷한 항균력을 가지고, pH 2~ pH10범위에서 안정하며, 100℃, 2hr 후 활성이 감소하고, pronase E에 의해 활성이 감소하는 것으로 protein 항균물질로 추측하였다.복합배지인 폐감귤박에서는 배양조건의 최적화를 Response surface methodology(RSM) 통계학적 방법을 이용하여 균의 가치(RPI)의 3.1배 증가, Anti-S. aureus 활성 1.2배 증가를 얻을 수 있었다.

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Abstract

During citrus juice processing, waste peel is produced after the extraction of juice from citrus fruits. The citrus peel waste was separated into the solid phase(27%) and liquid phase(73%) using grinding and pressing process. From the solid phase, citrus pulp pellet(CPP, a.w. 5%) could be produced by using pelleting and kiln drying process. The liquid phase was used as the culture medium. Several strains were selected from soybean paste foods. Twenty nine strains hydrolyzed the pectin and their probiotic characteristics were evaluated by measuring cell growth, antibiotic activity and enzyme activity. Bacillus subtilis LS 1-2 is selected among 29 strains based on cell growth, antimicrobial activity and enzyme activity by Relative Performance Index (RPI) statistical method. LS 1-2 grew upto 109 CFU/mL and showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and E. coli O-157. Also, LS 1-2 produced amylase and protease. Bacteriocin-like substance was produced by Bacillus subtilis LS 1-2. In addition, a factorial design was performed for optimal production of the bacteriocin-like substance as well as the cell's RPI, using response surface methodology (RSM).

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목 차

요약..................................................................................................................I Abstract..........................................................................................................Ⅱ목차................................................................................................................IIIList of Tables and Figures...........................................................................IV

I. 서론 I-1. 감귤주스 가공폐기물을 이용한 사료화....................................................1I-2. 사료첨가제로써의 생균제와 생산하는 항균물질 .....................................3I-3. 반응표면설계를 통한 배양조건의 최적화.................................................9

II. 연구목적....................................................................................................10

III. 재료 및 방법............................................................................................11

III-1. 감귤주스 가공폐기물의 압출 건조 공정..............................................11III-2. Citrus waste의 배양균주, 배지, 배양조건 및 균수 측정....................12III-3. 시험균주(피검균), 배지조제 및 배양조건...........................................12III-4. Citrus waste의 항균활성 측정............................................................13III-5. 균주분리 및 균주선발 (RPI)...............................................................13III-6. 선별 균주의 분자적 균주 동정............................................................14III-6-1. Chromosomal DNA 분리................................................................14III-6-2. PCR (polymer chain reaction)에 의한 16S rDNA 증폭...............15III-6-3. 전기영동 ........................................................................................16III-6-4. 정제 및 재조합...............................................................................16III-6-5. 전기적 형질전환 (Electrotransformation)......................................17III-6-6. 제한 효소 처리...............................................................................17III-7. 항균 활성 측정....................................................................................17III-8. Total protein 정량..............................................................................18

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III-9. 효소 활성 측정....................................................................................18III-9-1. Protease Assay..............................................................................18III-9-2. Amylase Assay..............................................................................19III-10. 여러 배지별 성장시 항균능 비교......................................................19III-11. 담즙에 대한 MIC(Minimal Inhibitory Concentration) 측정.............20III-12. 5L fermentation...............................................................................22III-13. 항생제와 항균능 비교.......................................................................22III-14. 효소처리, 열처리, pH 안정성 test...................................................23III-15. SDS-PAGE......................................................................................23III-16. Response surface methodology(RSM; 반응표면설계법)을 이용한 Factorial Design............................................................................................25

IV. 결과 및 고찰...........................................................................................28

IV-1. 신규 생균제의 특성연구.....................................................................28IV-1-1. 감귤가공부산물에서의 Bacillus sp. 성장.......................................28IV-1-2. 균주 분리 및 RPI 분석방법을 이용한 균주선발............................29IV-1-3. 선별 균주 동정...............................................................................30IV-1-3-1. 생화학적 균주동정 (API kit)....................................................30IV-1-3-2. 분자적 균주동정 (16S rDNA sequencing)...............................30IV-1-4. 선발된 균주의 항균활성.................................................................31IV-1-5. LB 배지와 감귤가공부산물 배지에서의 균의 성장 및 항균활성 비교........................................................................................................................32IV-1-6. 성장에 따른 효소생산.....................................................................32IV-1-7. 성장에 따른 항균물질 생산............................................................33IV-1-8. 담즙에 대한 내성............................................................................33IV-1-9. 5L 배양...........................................................................................34IV-1-10. 여러 성장배지에서의 항균물질 생산.............................................34

IV-2. Bacillus subtilis LS 1-2가 생산하는 항균물질 (Bacteriocin-like substance) 특성연구.......................................................................................52

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IV-2-1. 감귤가공부산물의 항균활성............................................................52IV-2-2. 항균 스펙트럼.................................................................................53IV-2-3. 상업용 항생제와 항균능 비교.........................................................53IV-2-4. 효소처리 영향.................................................................................54IV-2-5. 열처리 영향....................................................................................54IV-2-6. pH의 영향.......................................................................................55

IV-3. Response surface methodology(RSM)를 이용한 배양조건 최적화....63

IV-3-1. 배양조건에 따른 균의 성장, 항균활성 및 RPI값............................63IV-3-1-1. Initial pH의 영향.......................................................................63IV-3-1-2. 온도의 영향................................................................................64IV-3-1-3. 고형분 (%)의 영향....................................................................64IV-3-1-4. Working volume (mL)의 영향..................................................64IV-3-1-5. RPI을 이용한 각각의 배양조건의 범위설정...............................65IV-3-2. Box-Behnken Experimental Design (실험설계)...........................65IV-3-3. 실험설계를 통한 RPI 값 최적화.....................................................66IV-3-3-1. RPI 값에 대한 반응표면............................................................66IV-3-3-2. 최적화를 통한 RPI 최대값.........................................................66IV-3-4. 실험설계를 통한 Anti-S. aureus 활성 최적화..............................67IV-3-4-1. Anti-S. aureus 활성에 대한 반응표면......................................67IV-3-4-2. 최적화를 통한 Anti-S. aureus 활성.........................................67

V. 결 론........................................................................................................78

VI. 참고문헌...................................................................................................79

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List of Tables and FiguresTable 1. Minimal Inhibitory Concentration of bile saltsTable 2. Bile acids formsTable 3. Properties of some well characterised bacteriocinsTable 4. Preparation of AntibioticsTable 5. Identification of LS 1-2 using Biochemical analysis (1) Table 6. Identification of LS 1-2 using Biochemical analysis (2)Table 7. Tolerance of B. subtilis LS 1-2 against bile acids Table 8. Comparison of antimicrobial activity in several culture mediumTable 9. Antimicrobial spectrum of Bacteriocin-like substance produced by B. subtilis LS 1-2Table 10. Enzyme treatment of Bacteriocin-like substance produced by B. subtilis LS 1-2Table 11. Selected range of 3 factorsTable 12. Experimental design and results of the 23 factorial designTable 13. Optimized RPI valueTable 14. Optimized Anti-S. aureus value

Fig. 1. Recommended scheme for the testing Bacillus species intended for use as feed additive or for other purpose for toxin productionFig. 2.Circulation of bile acid in bodyFig. 3. Kiln-drying processing of citrus by-productsFig. 4. MIC method of slant plate mediumFig. 5. A cube plot for three factor factorial designFig. 6. Interation of variablesFig. 7. Growth of Bacillus sp. on the citrus waste agar platesFig. 8. Antimicrobial activity of total selected strains against S. aureusFig. 9. Viable cell number of total selected strainsFig. 10. Relative protease activity of total selected strainsFig. 11. RPIoverall values of total selected strainsFig. 12. Agar well diffusion test of 5 selected strainsFig. 13. Database of Genebank for B. subtilis MO5Fig. 14. Complete sequence of Bacillus subtilis strain MO5 16S ribosomal RNA

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gene which were deposited in GenBankFig. 15. Complete sequence of Bacillus subtilis LS 1-2 16S ribosomal RNA geneFig. 16. Comparision growth and antimicrobial activity of B. subtilis LS 1-2 in LB medium and Citrus waste mediumFig. 17. Comparison viable cell growth and spore cell growthFig. 18. Increase amount of total protein as growth timesFig. 19. Production protease and amylase as timeFig. 20. Production bacteriocin-like substance as timeFig. 21. 5L fermentation of B. subtilis LS 1-2Fig. 22. Inhibition zone of E. coli O-157 as time Fig. 23. MIC test from MeOH extracts of citrus waste against 3 pathogensFig. 24. Comparison of commercial antibiotics and Bacteriocin-like substance produced by Bacillus subtilis LS 1-2Fig. 25. Stability of Bacteriocin-like substance against temperature and pHFig. 26. SDS-PAGE profile of proteins produced by B. subtilis LS 1-2 as time in citrus waste medium and commercial mediumFig. 27. Effects of Initial pHFig. 28. Effects of TemperatureFig. 29. Effects of Solid phase (%)Fig. 30. Effects of Working volumesFig. 31. RPIoverall values for changed Initial pHFig. 32. RPIoverall values for changed TemperatureFig. 33. RPIoverall values for changed solid phase % Fig. 34. RPIoverall values for changed working volume(mL)Fig. 35. Response surface contour plots 1Fig. 36. Response surface contour plots 2

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I. 서 론1. 감귤주스 가공폐기물을 이용한 사료화

국내에서 생산되는 대부분의 감귤(Citrus retiula)은 년간 10만톤이 제주도에서 생산되며 생과용으로 80%, 가공용으로 20% 소비되고 있는데 최근 감귤의 과잉생산체계로 인하여 소득성이 낮아지면서 부가가치를 높일 수 있는 가공식품 개발이나 기능성식품으로서의 가치를 개발하는데 관심이 높아지고 있다. 그 예로써 균 발효를 이용한 감귤식초, 감귤요쿠르트, 혼합 과실음료 등을 들 수 있고, 그중에서는 90%가 주스용으로 이용되고 있다.1)이런 주스 제조 공정중의 50%의 감귤주스 가공폐기물이 얻어지고 있다. 이는 년간 5만톤의 양이다. 이들 부산물은 극히 일부만이 사료 또는 한약재로 사용될 뿐 대부분이 해양 투기되어 토양, 수질오염의 원인이 되고 있는 실정이다. 따라서 감귤주스 가공폐기물을 처리하기 위한 방안으로써 감귤박이 가지고 있는 많은 유효성분들에 대해 활발히 연구되고 있다.2) 그 중 큰 부분을 차지하는 것이 pectin과 bioflavonoid이다. Pectin은 잼, 젤리 등의 제조에 이용되어왔고, 겔화, 증점, 유화안정 등의 목적으로 사용될 뿐 아니라, 의학적 효능으로써 대장운동 속도를 높이고, 포만감을 주기 때문에 다이어트 식품으로써의 가치가 크며 체내에 있는 중금속 성분을 해독, 혈중 콜레스테롤 함량을 저하, 면역력을 높여주는 효능을 나타내므로 그 중요성이 강조되고 있다.3,4,5) 또한 bioflavonoid, essential oil 성분에는 생리활성, 항산화 활성을 보이는 d-limonene, 항균, 항암작용을 하는 hesperidin, 지방대사 개선, 항균, 항암작용을 하는 naringin등이 보고되고 있어 다양한 기능성을 보여주고 있다.6) 하지만, 이런 유효성에도 불구하고, 하루 400톤이라는 엄청난 양을 처리하기

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위한 방안으로 다량의 공급과 수요를 가지는 사료개발이 활발히 이루어지고 있다. 현재 대부분이 pellet 형태의 건조 사료로써 사용이 되고 있다.7) 그 이유는 감귤 가공부산물의 90%가 수분으로 장기간 저장이 힘들고, Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti 등에 감염 되어 부패되기 쉽기 때문이다.8) 하지만 pellet 생산공정은 압출식 탈수과정 중에 고농도 유기물 액상(BOD 50,000 ppm)이 발생하고 이는 수질환경에 문제가 될 수 있는 폐수이며 또한 pectin 및 기능성 물질이 다량함유 되어 있기 때문에 이를 재활용 하려는 노력이 요구된다.

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2. 사료첨가제로써의 생균제와 생산하는 항균물질(Bacteriocin-like substance)

이런 문제의 방안으로써 균 발효를 통해 고부가가치의 생균제 사료를 생산하는데 목적을 두었다. 기존의 사료시장은 축산업에서 성장 촉진, feed conversion 효율성 증대, 그리고 장내 감염방지 등을 목적으로 항생제를 광범위하게 사용하여 유익한 장내 미생물 생태계의 불균형과 항생제 내성 균주의 출현을 초래하였다. 최근 European commission은 동물의 성장 촉진제로 사료에 첨가되는 항생제의 사용을 금지하여 특히 양게에서는 병원균 차단을 위해 항균력을 갖는 정장제를 적극 권장하고 있는 실정이다.9) 이런 문제점에 대한 방안으로 항생제 대체제로써 항균성물질을 생산하는 생균제가 대두 되고 있다. 생균제는 probiotics라 하고, 장내 미생물 균형에 도움을 주는 미생물, 항균활성과 효소활성을 가진 미생물, 그들이 내는 생산물을 말한다.10) 더불어 probiotics는 사람이나 동물에 건조된 세포형태나 발효산물 형태로 급여되어 사람이나 동물숙주의 장내균총을 개선함으로서 좋은 영향을 주는 단일 또는 복합균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 이들이 갖추고 있어야하는 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성, 장으로 가는 동안 살아남아야한다. 더 나아가서 전달식품안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지, 감염예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 갖고 있지 않아야 한다. 또한 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성를 갖추고 있어야한다.11) 이런 생균제들로는 소화효소(amylase, protease, lipase, cellulase, phosphatase) 생성능력이 우수한 Bacillus sp., 유기산을 생성하여 저분자 탄수화물을 분해하는 Lactobacillus sp., 젖산으로 전환시켜 장내 흡수를 용이하게 하고 Vitamin B의 합성, Vitamin E의 흡수를 촉진하는 Saccharomyces

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sp., 가축의 분변에 남아있는 악취 유발물질(암모니아, 황화수소, 아민류 등)을 대사과정에 이용하여 악취유발을 막는 Photosynthetic bacteria,등의 균들이 이용되고 있다.특히 Bacillus sp. 와 Lactobacillus sp. 들은 lactic acid bacteria(LAB) 이라하고, 식품으로부터 분리되는 데 이는 식품부패를 방지를 위해 부패균에 대한 항균물질을 생산하는 균주들이 존재하기 때문이다.12) 항생제 내성기작과는 관련이 없는 항균기작을 가지는 Bacteriocin이라는 항균펩타이드를 생산한다. Bacteriocin은 전통적인 항생제와는 다르기 때문에 정확한 정의는 없다고 할 수 있다. 분자량, 생화학적 성질, 숙주에 대한 항균범위나 기작이 상당히 다른 다형적인 성질을 가지고 있다. Klaenhammer에 따르면 “Bacteriocins은 생산하는 박테리아와 근접한 종들에 대한 직접적인 항균활성을 가진 단백질 또는 단백질복합체 이다” 라고 정의하고 있다.13) 이런 전형적인 정의와 맞지 않지만, 항균능을 가진 물질들은 ‘Bacteriocin-like substance' 라 제시한다.12) Antibiotics, bacteriocins, microcins를 나누는 뚜렷한 경계는 없지만, Bacteriocins은 좁은, 광범위 활성 차이로 bacteriostatic(정균제), bacteriocidal(살균제)로 나누고, peptide antibiotics의 그룹에 포함시킨다. Antibiotics는 여러단계의 효소 기작에 의한 nonribosomal 합성이다. 반면, bacteriocin은 ribosomal 합성에 의해 이루어지고, 내성 발생이 드물다, 그러나 내성 가능성은 제시되고 있다.14,15,16) 많은 antibiotics 들이 화학합성 되지만, bacteriocin은 화합합성에 대한 보고는 없다. 하지만, 유전공학 기술에 의해 bacteriocin의 유사체들이 재구성, 재조합되고 있다. Lipid 나 carbohydrate 부분이 bacteriocin 복합체의 부분을 이루고 관련되어있다. 세포에 붙어 있거나 외부로 방출 될 수 있고, growth cycle 전 후에 생성될 수 있으며, protease등 효소에 저항력을 가지며, pH, 온도에서도 안정적이다. 이런 Bacteriocin의 항균기작은 거의 알려져 있지 않다. Cell membrane channel 에 박혀 cell

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lysis를 유도하는 정도 이다. Cell lysis는 곧 cell death와 관련되어 있고, 비특이적 receptor site 와 특이적 receptor site를 가진 민감한 박테리아에 의존하는 편이다.17) 이러한 성질을 갖는 Bacteriocin은 항생제 대체제로써 부각되고 있다. 또한 식품의 부패방지제로 사용되는 항균물질이기 때문에 더욱 안정한 항균제라 할 수 있다. Bacillus 는 항균활성에 관한 흥미로운 속이다. 왜냐하면, Bacillus spp. 들은 많은 peptide antibiotics를 생산하고, 다양한 산업에 중요한 종으로써 식품과 산업용으로 안정성을 가지고 있다.18) Bacillus cereus, Bacilllus subtilis 그리고 Bacillus thuringiensis 등 이미 많은 Bacillus 종들이 bacteriocins 과 bacteriocin-like substances을 생산하는 것으로 알려져 있다.18,19,20)

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Fig. 1. Recommended scheme for the testing Bacillus species intended for use as feed additive or for other purpose for toxin production

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Table 1. Minimal Inhibitory Concentration of bile salts 38)

Table 2. Bile acids forms39) Fig. 2.Circulation of bile acid in body39)

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Table 3. Properties of some well characterised bacteriocins.11)

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3. 반응표면설계를 통한 배양조건의 최적화Bacteriocin의 생산은 종종 복합배지에서 수행된다. 성장과 높은 bacteriocin level 과 관련된 풍부한 유기물이 되며, 균배양 배지의 기본이 되는 천연원료로써 식품산업의 폐기물이 보다 경제적으로 사용될 수 있다. 예를 들어 Whey(유장: 치즈찌꺼기)은 전통적으로 폐수로 버려져 왔다. 그러나 치즈 산업의 성장과 더불어 오염물의 폐수를 감소시키려는 노력과 더불어 새로운 생산물을 만들기 위한 천연원료로 재활용하려는 노력이 증대되고 있다.21) Bacteriocin의 생산은 균의 성장 pH 와 온도가 중요한 역할을 한다. 예를들어 Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroides 등이 연구되고 있다.22,23,24) 이런 배양조건의 최적화는 다른 여러개의 factors를 일정 level로 고정하고, 하나의 factor의 level를 변화시키는 고전적인 방법이 사용된다. 하지만, 극도로 시간소모가 많고, 많은 변수들 때문에 비용도 많이 들고, 잘못된 결과를 얻을 수도 있다.25,26) 이런 문제점을 해결하고자 Response surface methodology(RSM)을 이용하게 된다. 이는 실험설계, 실험모델구축, factor들 간의 효과를 평가, 희망하는 결과에 대한 factor들의 최적조건을 찾는 통계학적인 기술이다. 또한 이 방법은 bacteriocin 생산에 관한 최근연구를 포함하여 Biotechnology의 많은 분야에 성공적으로 적용되었다.21,27)

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II, 연구 목적

본 연구에서는 제주도 감귤주스 가공폐기물의 해양투기 문제를 해결하고자 이를 사료화하고자 하였고, 사료화 공정은 압출 가공 공정을 통해서 고상 27%, 액상 73%으로 분리한다. 고상은 Citrus pulp pellet(CPP)을 생산하고, 액상은 고농도의 유기물로써 BOD 50,000ppm에 해당하는 폐수로서 이를 재활용하기 위해 고농도의 pectin성분의 액상을 분해하여 성장할 수 있는 균을 선발하여 사료첨가제인 생균제로서의 가치를 판단하고, 이 균이 내는 항균물질에 대한 특성을 연구하였고, 마지막으로 균의 가치와 항균물질의 생산을 높이기 위해 통계학적 배양조건 최적화를 목적으로 하였다.

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III. 재료 및 방법

III-1. 감귤주스 가공폐기물의 압출 건조 공정(시험용 CPP제조시 발생하는 침출수의 생산) 제주도 감귤주스 공장에서 나오는 가공폐기물; 폐감귤박(제주도, 감귤가공복합처리단지)을 1차 2차에 걸친 분쇄와 압출공정과 Ca(OH)2의 처리를 통해 수분제거 공정을 최적화하여 27%의 고상은 수분함량 55%로 감소한다. 이 고상부분을 열풍건조와 pellet 성형을 통하여 수분함량 5%의 CPP(citrus pulp pellet)을 생산하고, 73%정도의 액상이 나왔고, 이 액상, 즉 폐감귤박 가공폐수(Citrus waste processing waste water; Citrus waste)를 이용하여 본 시험을 수행하였다(Fig. 3)Citrus by-products 1kg

Press shatteringM ixing0.5% Ca(OH)2

Solid-Liquid seperation

Partic le shattering

Solid phase 270g (< 55% aW )

Liquid phase730g( > 95% aW )

Pelleting & Kiln drying270g( < 55% aW )

CPP130g( < 5% aW )

Fermentation(109 cfu/m l)

Fermentation(antim icrobial feedstuffs)

(1011/g, 20g)

Bulk feedstuffs(109/g, 2kg)

Fig. 3. Kiln-drying processing of citrus by-products

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III-2. Citrus waste의 배양균주, 배지, 배양조건 및 균수 측정

Citrus waste의 배양균주는 Bacillus subtilis ATCC 21332, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus sp. 65#, Bacillus sp. 55#, 재래장으로부터 분리한 29종 그리고 최종선발된 균주 Bacillus subtilis LS 1-2를 사용하였다. 그리고, 배지는 전배양을 위해 TSB(Tryptic Soy Broth, Difco. Co.)를 사용하였고, 본배양은 위에서 언급한 감귤가공부산물 압출 건조공정에서 발생한 액상부분을 고형분 5%, initial pH 7(5N, Ca(OH)2 용액으로 pH 보정)에 맞추어 사용하였다.선별균주 29종 및 생균제로 이용되는 Bacillus sp. 3종을 TSB배지 5ml(w/v) test tube 에 1% 접종하여 30℃, 250rpm shaking incubator에서 전배양 후 CPW를 50ml(w/v), 250ml Flask에 1% 접종하여 30℃, 1day 동안 배양하여 배양 sample을 serial dilution방법으로 희석 후 TSA plate 위에 20ul를 spotting하고, 37℃ incubator에서 12hr동안 방치 후 성장하는 colony 수를 세서 viable cell number(CFU(colony forming unit)/mL))를 측정하였다.

III-3. 시험균주(피검균), 배지조제 및 배양조건

가축의 질병을 일으키는 병원성균주인 Staphylococcus aureus, E. coli O-157, Salmonella gallinarum, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis ATCC 6633, E. coli 를 이용사용하였다. 그리고 배지는 TSB를 사용하였고, 30㎖ test tube에 5㎖ w/v으로 제조 후 병원성균주의 전배양용으로 사용하였다. 배양조건은 shaking incubator에서 pH 7, 30℃, 250rpm, 12hr동안 배양하였다.

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III-4. Citrus waste의 항균활성 측정

Citrus waste를 5g을 250㎖ flask에 MeOH 100 ㎖과 혼합 후 24hr 동안 37℃ shaking incubator에서 교반 후 원심분리를 통해 상등액을 얻고, 상등액은 다시 vaccum evaporator에서 MeOH를 날린 후 얻은 추출물을 DW에 녹여서 사용하였고, 96well plate에 250~50,000ppm 까지 농도에 따라 배지에 첨가하였다. 그 다음 MIC(minimal inhibitory concentration) test를 위한 피검균은 병원성균(Staphylococcus aureus, E. coli O-157, Salmonella gallinarum)를 사용하였고, 전배양된 피검균을 미리 준비된 96well plate에 TSB 배지 200㎕ w/v에 1% 접종하였다. 이를 30℃ incubator에서 배양하여 2hr마다 미생물성장을 A600 에서 microplate reader(Molecular devices Co. USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

III-5. 균주분리 및 균주선발 (RPI)

재래된장, 재래고추장 등의 콩과 발효식품의 25% 희석액을 Citrus waste(수분함량 95%, 100ml(w.v)/500ml)에 1% 접종하여 37℃, 250rpm, 2일 동안 배양하고, ROGOSA, MRS, TSB, LBS 배지에 도말하였다. 12시간동안 37℃ incubator에서 배양한 후 성장한 colony들을 단일 colony로 분리하였다. 그 다음 Citrus waste(수분함량 95%)과 agar 2.0%를 이용하여 citrus agar plate를 제조하여 분리한 균을 접종함으로써 Citrus waste를 분해, 성장할 수 있는 균을 29종 선발하였다. 최종적으로 고활성 균주를 선발하기 위해 통계학적 선발방법인 RPI (Relative Performance Indies) method를 이용하였다.

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이 방법으로 선별된 분해균주 29종과 생균제 대표균주 3종에 대하여 Staphylococcus aureus 에 대한 항균활성능을 50%, 가축의 장내에 소화효소역할을 하는 효소활성능(protease)을 25% 그리고 생균제로써 108 이상의 균수를 가져야 하므로 viable cell number를 25%로 균의 효율성에 대한 가중치를 두었다. 이 가중치는 아래와 같은 식을 이용하여 계산하였고, 최종적으로 고활성 균을 선별하였다.28)1) RPIefficacy for antimicrobial activity(Anti-S. aureus)[ ( )X− Xa /σ + 2 ] 25

X : single observation value of a strainXa : average of all observation from all strains being ranked σ : standard deviation of all observation from all strains being ranked

2) RPIkinetics for viable cell number[ ( )X− Xa /σ − 2 ] 25 0.8

3) RPIactivity for enzyme activity(Protease)[ ( )X − Xa /σ − 2 ] 25 0.2

RPIefficacy +( RPIkinetics + RPIactivity ) = RPIoverall

III-6. 선별 균주의 분자적 균주 동정 (16S rRNA gene sequencing)

III-6-1. Chromosomal DNA 분리 균주를 TSB에 접종하여 30℃에서 12시간 배양하고 microcentrifuge

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tube에 옮긴 후 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 배지성분을 제거하기 위해 TEN buffer [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 8.0] 600㎕ 첨가하여 완전히 현탁시킨 후 다시 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. TE buffer [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0] 400㎕를 첨가하여 cell pellet을 현탁시킨 후 세포벽을 손상시키기 위해 40㎕의 lysozyme solution (50 mg/mL)을 혼합하여 37℃에서 40분간 처리하였다. 그 후 EDTA 0.5M 을 60㎕, proteinase K(Amersham) 2mg/mL을 7㎕, SDS 10%을 30㎕ 첨가하여 37℃에서 1시간동안 처리하였다. 동량의 phenol: choloform : isoamyl alcohol (25:24:1, sigma) 혼합액을 넣어 잘 섞은 후 15,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액 450㎕를 취해 새로운 tube로 옮긴 후 10㎕의 RNase solution (10mg/mL; sigma) 과 15㎕의 5N NaCl을 첨가한 후 2시간 처리하여 RNA를 제거하였다. Phenol extraction을 반복하여 RNase를 없앤 후 200㎕의 상등액을 취하고 DNA를 침전시키기 위해 2.5배의 100% EtOH를 첨가하여 -20℃에서 30분간 처리하고 15,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. EtOH를 제거한 후 DNA를 세척하기 위해 70% EtOH 1mL을 첨가한 후 다시 원심분리하였다. DNA는 진공 건조기에서 건조시킨 후 200㎕의 TE buffer에 녹여 4℃에서 보관하였다.

III-6-2. PCR (polymer chain reaction)에 의한 16S rDNA 증폭

Bacillus sp. 의 분자적 균주 동정을 위해 universal primer인 UNI I (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')과UNI II (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')을 이용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 16S rDNA 염기서열은 Bacillus 속을 정의하는 전형적인 표시방법이며, 알고 있는 16S rRNA 2차 구조 정보를 이용하여 분류된다(Weisbug 1991).

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PCR의 반응액 조성은 Bacillus sp. DNA 시료 50 ng, dNTP 2.5 nM, 각각의 primer 1.62 nM과 1.58 nM, Taq polymerase 1.25 U, 10× buffer (MgCl2) 5㎕이며 전체 부피는 50㎕로 하여 PCR을 수행하였다. Thermal cycler (Techne Ltd. England)를 이용하였으며, PCR 반응 조건은 다음과 같다. Predenaturation을 95℃에서 5분간 수행하고 denaturation을 95℃에서 1분, annealing을 56℃에서 1분, elongation을 74℃에서 2분간 처리하기를 총 35회 수행하였다. 마지막으로 final elongation을 74℃ 5분간 수행하였다.

III-6-3. 전기영동

Agarose gel 0.7%을 이용하여 Horizon 58 (GIBCO BRL : Life Technologies, INC.)와 WIDE MINI-SUB CELL GT (BIO-RAD)에서 전기영동 하였고, 사용 buffer는 1×TAE buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA, pH 8.0)를 사용하였다. 전기영동 조건은 80-100 voltages, 50-80 mA에서 1시간동안 수행하였다.

III-6-4. 정제 및 재조합

전기영동 결과 확인된 원하는 크기의 16S rDNA는 High pure PCR product purification kit (Roche, Germany)을 이용하여 정제되었다. Vector를 이용하여 정제된 증폭된 DNA를 재조합하기 위해 insert DNA 20nM, pGEM-T vector (Promega, Madison) 50nM, T4 ligase 1㎕, 2×buffer 3㎕를 혼합하여 실온에서 24시간 처리하였다.

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III-6-5. 전기적 형질전환 (Electrotransformation)

E. coli JM109를 LB broth 3㎖에 접종하여 12시간 배양 후 새로 준비한 LB broth 100㎖에 1% 접종하여 37℃에서 교반(200rpm)배양하여 OD600 값이 0.6-0.8 이 되도록 배양하였다. Cell을 수거하여 4℃의 멸균 증류수로 3회 세척한 후, 4℃의 10% glycerol로 125배 농축시켰다. 이렇게 준비된 competent cell은 -70에서 보관하여 사용하였다. 형질전환시 competent cell 40㎕에 pGEM-T vector에 재조합된 plasmid DNA를 6㎕와 혼합한 후, 4℃에서 10분간 처리한 후 12.5 kV/cm, 7.1 millisecond (ms ; 150 ㎌, 50Ω)의 전기충격을 가한 후 고영양 배지(SOC)에 접종하여 2시간 배양하였다. 항생제(Am, 150㎕/㎖)가 포함된 선별배지에 도말하여 형질전환 균주를 선별하였다.

III-6-6. 제한 효소 처리

재조합 plasmid DNA를 분리하고 pGEM-T vector에 삽입된 16S rDNA는 Sal I 처리하여 절편 크기로 확인하였으며, 16S rDNA 염기서열을 결정하여 National Center for Biotechnological Information(NCBI); http://www.ncbi.nlm.nih.gov//BLAST/)의 자료를 검색하여 균주를 종 수준에서 동정하였다.

III-7. 항균 활성 측정

Agar disk diffusion test(Kirby-Bauer) 방법을 기초로 TSB agar(1.5%) plate 위에 병원성균(106-107 CFU/ml) Staphylococcus aureus, E.coli O-157를 soft agar(0.8%, 100ml)에 1.0ml를 희석하여 배양된 plate 위에 평

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평하게 깐다. 30min 정도 실온에서 말린 후 steel well를 soft agar 위에 4~5개를 올려놓고, 멸균 filtering 된 선별균주의 배양액을 농도별로 나누어 steel well에 100ul를 떨어뜨린다. 그런 후 37℃, 12시간동안 배양하고, 저해환를 관찰하여 그 크기로 항균활성을 비교하였다.

III-8. Total protein 정량

Bradford 단백질 정량법(Bio-rad protein assay kit; Bio-rad, USA) 이용하였다.

III-9. 효소 활성 측정

III-9-1. Protease Assay

Enzyme activity 1U은 pH 11, 60℃에서 protease가 Casein(sigma. USA)을 가수분해하여 1분동안 tyrosine 1.0 umole이 생성되는 것으로 정의한다. Casein은 0.1M glycine-NaOH(pH 11) buffer에 0.5% 농도로 녹인 후 사용하였고, Enzyme solution은 15000rpm에서 10분간 centrifugation한 후, 0.1M glycine-NaOH(pH 11) buffer에 10배 희석해서 사용하였다. Stop solution은 1.888% acetic acid, 2.992% Sodium acetate, 1.8% TCA를 혼합하였다. assay 과정은 0.5mL substrate를 각 1.8mL eppendorf tube에 넣고 60℃, 10분 preincubation 시킨 후 enzyme solution 0.01mL을 넣고, 10분간 반응시킨다. 다음 stop solution 0.5mL 첨가 후 4℃, 10분 방치한다. 다음 15000rpm, 10분 동안 centrifugation 후 상등액을 A275에서 흡광도를 측정한다.7)

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III-9-2. Amylase Assay

25℃, pH 4.8 Soluble starch(Sigma, USA)를 분해하여 1분동안 maltose(Sigma, USA)를 1mole 생산하는 것을 amylase 1 unit으로 한다. 25℃ water bath에서 starch solution 25㎕를 enzyme solution을 넣고, 3분 반응 후 Dinitrosalicylic acid reagent(Sigma, USA)를 50㎕ 첨가 하고, 5분동안 boiling water bath에서 반응하였다. 그런 후 0.9mL 증류수를 추가하고, 540nm에서 OD값을 측정하여 amylase 활성을 측정하였다.

III-10. 여러 배지별 성장시 항균능 비교

Citrus waste(No cell; Control), Citrus waste(Cell culture), Citrus waste +Ca(OH)2 , LB(Luria-Bertani; 1.0% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl), LBS(Luria-Bertani w/Starch; 1.0% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.0% Starch), TSB(Tryptic soy broth; 1.5% Tryptone, 0.5% Soytone, 0.5% NaCl), and LB/LBS/TSB+pectin, only pectin 배지를 제조(50mL/250mL(w/v) Erlenmeyer flask)하여 TSB 배지(5mL test tube)에 전 배양된 선발균주 LS 1-2를 2% 접종 후 shaking incubator에서 250rpm, 30℃에서 24시간동안 배양한 후 배양 상등액을 0.2um Syringe membrane filter K 16534(sartorius, USA)로 균을 제거한 crude 항균물질을 가지고 피검균 S. aureus 와 E. coli O-157에 대한 항균활성을 측정하였다.

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III-11. 담즙에 대한 MIC(Minimal Inhibitory Concentration) 측정

사면배지를 이용하여 대략적인 MIC를 구하는 방법(빠르고, 정확하고, 선행실험용도로 사용용이, 또한 reference가 존재하므로 data로 사용가능하다.)

균성장 균 성장저해물질

O ppm 100 ppmMIC ppm

균성장 균 성장저해물질

O ppm 100 ppmMIC ppm

Fig. 4. MIC method of slant plate medium

MIC = Xmm84mm

× Final conc. X : growing strain (length)84mm : petri dish diameter

ex) Final 농도=100ppm, X=50mm, 총 길이 = 100mm, A=1/2 ---> 50mm100mm

× 12

×100 = 25ppm(MIC 농도) 실험순서① 균 성장저해물질 100ppm(원하는 Final 농도)을 TSA (tryptic soy agar 1.5%, 50℃)에 섞은 후 petri dish를 굵은 자 2개정도 높이로 높인 후 준비된 TSA를 15mL 붓는다.② clean bench에서 완전히 굳힌다. 하루 이상 보관시 냉장실 보관, 하루정도는 실온 보관한다.③ 시험균주는 성장 조건에 맞추어 배양 후 OD 1.0(107cfu/mL)에 맞추어 100mL TSA (agar 0.7%, 50℃)에 섞은 후 1.에서 준비된 agar plate 위에 붓는다.

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④ 시험균주의 성장 조건에 맞는 온도에서 12hr incubation 한다.⑤ 적당히 균이 자란 것을 확인 후 사진을 찍고, 대략적인 MIC 농도를 계산한다.

96-well plate method (세부적인 MIC 농도를 구하고자 할때 사용)

① 균 108 CFU/mL 로 준비한다.② 원심분리 후 상등액 버린다.③ 0.85% saline으로 1mL volume을 맞춘다.④ 원심분리 후 상등액 버린다.⑤ 0.85% saline으로 1mL 맞춘 후 mixing 한다.(이상은 MIC 측정전에 배지를 washing 해주는 과정)

McFarland Standard = 0.09 ~ 1.00 = 107 CFU/mL

OD 값 × X1000 ul

= 0.09(고정값)X = well plate에 접종할 균 sample 양ex) 0.5× X

1000ul = 0.09 --> X= 180 ㎕

⑥ 1mL tube에 ⑤번에서 sample 180㎕ 와 saline 820㎕를 혼합한다.⑦ 배지 800㎕ + 균 성장저해물질(미리 농도별 제조) 200㎕ + ⑥번 sample 100㎕(10%접종) = total 1mL⑧ 96-well plate에 200㎕ 씩 분주한 후 24hr incubation 후 OD값을 측정한다.

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Antibiotics Concentration (mg/mL) SolventAmpicillin 1 H2O

Vacomycin 1 H2OSpectinomycin 1 H2O

Novobiocin 1 H2OStreptomycin 1 H2OTetracycline 3 MeOH

Kanamycin 3 H2O

III-12. 5L fermentation

Citrus waste 배지(50mL/250mL(w/v), Erlenmeyer flask)에서 24시간동안 전배양된 선발균주 LS 1-2는 5L fermentor system(Korea fermentor, Korea)에 5% 접종하였다. 5L fermentor의 배양은 2L working volume, 600 rpm, 1 vvm의 산소공급, 24시간 동안 배양하였다. 배양 중에 발생하는 거품발생을 제거하기 위해 Antiform 204(Sigma, USA)를 100배 희석, filtering 하여 주입하였다.

III-13. 항생제와 항균능 비교

항생제 7종(Sigma, USA)은 다음과 같이 농도로 제조한 후 미리 제조된 피검균 agar well plate에 100㎕를 떨어뜨리고, 37℃, incubator에서 12hr 배양 후 저해환을 측정하였다.

Table 4. Preparation of Antibiotics

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III-14. 효소처리, 열처리, pH 안정성 test 효소 4종(Proteinase K, Pronase E, Lipase, α-amylase; Sigma, USA)을 4mg/mL 농도로 제조하여 15mL falcon tube(Falcon, )에 선발균주의 항균물질과 1:1 (final 농도, 2mg/mL)로 혼합 후 2시간 30분동안 37℃ incubator에서 배양하였다. 효소의 활성을 제거하기 위해 100℃, 5분간 열처리 후 항균활성을 측정하여 잔존활성을 비교하였다. 열처리는 121℃ 에서 -70℃까지 범위를 나누어 24hr 동안 처리 후 잔존항균 활성을 측정하였다. pH 처리는 pH 2에서 pH 10까지 26hr 동안 처리하였고, 중화(pH 7) 후 잔존활성을 측정하였다. III-15. SDS-PAGE

Running Gel 농도는 12%(0.25 M Tris-HCl, pH 8.8) 4배 농축하여 만들었다.

Volume (㎕) 시약: (5010)

30% Acrylamide stock: 2000증류수 16501 M Tris-HCl pH 8.8 125010% SDS 50Ammonium persulphate 10% 50TEMED 10

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Stacking Gel 농도는 4.5%(0.125M Tris-HCl pH 6.8)로 제조한다.

Volume (㎕) 시약: (3000)

30% Acrylamide stock: 450증류수 7501 M Tris-HCl pH 8.8 175010% SDS 30Ammonium persulphate 10% 30TEMED 5

Electrophoresis buffer196mM glycine/ 0.1% SDS/ 50mM Tris-HCl pH 8.3 의 조성으로 10배 농축 제조한다.

Sample 준비TCA 침전을 통한 단백질 침전법이용냉각 TCA 20%(500㎕) + 항균물질(500㎕)을 혼합 후 얼음 위에 15분간 방치한다. 원심분리기를 이용 10,000×g에서 15분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 ethanol 1mL과 혼합한다. 다시 10,000×g에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 버린다. 이를 두 번 반복하여 washing하여 TCA를 완전히 제거하여 준다. 마지막으로 남아있는 enthanol을 제거하기 위해 건조하여 날려버린다.여기서 얻어진 Sample은 loading dye에 녹여 5분 끊인 후 Gel에 15㎕ loading하였다.

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III-16. Response surface methodology(RSM; 반응표면설계법)을 이용한 Factorial Design 생균제 가치(RPI 값)와 항균물질 생산(Anti-S. aureus)을 최적화시키기 위해선 3개 변수(Initial pH, Temperature, Solid phase %)의 최적 level을 결정하여야한다.

x1 →

↗ x2

↑ x3

Fig. 5. A cube plot for three factor factorial design.

3개의 변수(factor)를 가진 실험을 factorial design에 의해 수행하는 과정을 설명하기 위해 정육면체를 가정하자. 정육면체의 각 변은 각각의 변수 x1, x2, x3를 나타내고 각 변수를 두개의 단계(level)-높음, 낮음-으로 나누면 이와 같은 형태의 디자인을 23( lp : l - number of level, P - number of factor) factorial이라 한다. 변수 x1은 정육면체의 왼쪽에 있는 4개의 꼭지점에 낮음, 그리고 오른쪽에 있는 4개의 꼭지점에 높음이 할당되고, x2, x3의 경우에는 전면과 밑면에 낮음과 후면과 윗면에 높음이 배정된다. 결과적으로 정육면체와 그의 내부공간은 실험에 사용될 수 있는 변수의 변화공간이 된다. 이와 같은 2단계(two-level) factorial은 각 변수의 주요효과(main effect)와 변수간의

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상호작용을 결정할 수 있다. x1에 의한 주요 효과는 정육면체의 왼쪽 면과 오른쪽 면의 결과를 비교하여 구할 수 있다. 정육면체의 정면 아래의 모서리에는 x2, x3의 값이 일정하기 때문에 x1값의 변화에 따른 OFAT(One Factor at A Time)에 의한 실험치를 구할 수 있고, 이와 평행을 이루는 나머지 3개의 모서리에서도 마찬가지로 x1의 주요효과를 구할 수 있게 된다. 결과적으로, x1의 주요효과는 4개의 모서리에서 구한 효과의 평균치가 될 것이다. 이러한 결과는 고정된 x2, x3값에서만 결과를 얻게되는 OFAT의 접근방법에 단점을 보완하게 되고, 동시에 x1의 주요효과를 측정하기 위해 8개의 실험치 모두가 사용되어 자연스러운 반복효과(hidden replication)를 갖게 되는 것이다. Factorial design에서 각 변수간의 상호작용(interaction)의 정도 또한 확인할 수 있다. 두개의 변수간의 상호작용이란, 하나의 변수에 의한 효과가 다른 변수의 높고 낮음에 따라 다르게 나타남을 말한다. Fig. 은 두개의 변수에 의한 효과가 다른 변수의 높고 낮음에 따라 다르게 나타남을 보여준다. (A)와 같이 x2의 높고 낮음에 관계없이 x1의 변화에 대한 효과 Y가 동일한 기울기를 갖는 경우는 상호작용이 없고, (C)와 같이 x2의 높고 낮음에 의한 효과 Y의 변화가 극명하게 나타나는 경우는 상호작용이 강한 경우고 (B)는 그들의 중간의 경우이다. 이러한 상호작용의 정도는 2단계 실험디자인으로는 그 관계가 선형일 것으로 가정하고 분석할 수밖에 없으므로, 선형이 아닌 관계를 탐색하기 위해 정육면체 디자인의 중앙에 하나의 실험을 할당하여 총 15개의 실험으로 2단계 3변수의 실험 디자인을 구성할 수 있다. 실험설계에서 선정된 중앙값(0 level) : Initial pH, 7; Temperature, 30℃ 그리고 Solid phase %, 5 이다. 이 변수들은 다음과 같은 식에 따라 적용된다.xi =

Xi − Xo∆Xi

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xi 는 i 번째 독립변수의 미지수, Xi 는 I 번째 독립변수의 자연수, Xo 는 중앙값에서의 I 번째 독립변수의 자연수, ∆Xi 는 단위변수(∆Xi : Initial pH, 2; Temperature, 4; Solid phase %, 2)3 factor에 대한 모델식은 다음과 같은 식에 따라 적용된다.(K = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b11x

21 + b22x

22 + b33x

23 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 )

K, 이론적 예상 결과값; b0, intercept; b1, b2, b3, 선형계수; b11 , b22 , b33 , 2차계수; b12 , b13 , b23 , 상호작용계수결과값은 Minitab release 14(Minitab, USA)에 의해 분석된다.이 모델은 선정된 독립변수에 대한 선형, 2차, 상호작용의 효과를 나타낸다.3차원 표면 곡선은 RPI값과 Anti-S. aureus값에 대해 독립변수 간의 주효과, 상호작용효과를 표현해준다. 따라서 선택된 변수들의 최적값은 위 식과 반응표면곡선 분석을 통해 구한다.

x1 x1 x1

(A) (B) (C)high x2

low x2Y

x1 x1 x1 A B C

.Fig. 6. Interation of variables

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IV. 결과 및 고찰

IV-1. 신규 생균제의 특성연구

IV-1-1. 감귤가공부산물에서의 Bacillus sp. 성장 대부분의 Bacillus sp. 은 폐감귤박의 주성분인 pectin을 분해하는 pectinase를 분비하고(R), 유리된 당을 성장을 위한 Carbon source로 사용한다. 따라서 폐감귤박을 분해할 수 있는 균을 Bacillus sp.에서 찾으려 하였다. Bacillus sp. 8종을 폐감귤박으로 제조된 agar plate 위에 접종하여 배양하였고, 처음에 감귤박만으로 제조시 Bacillus sp.가 성장하지 않았다. 그 이유는 폐감귤박의 pH는 3.3이고, Bacillus sp. 가 성장하기 위해선 적어도 pH 5 이상은 되야하기 때문에 성장하기 힘든 조건인 것이다. 선행실험에서 C, N, mineral source를 1% 첨가 실험하였을 때 K2HPO4를 첨가 시에만 Bacillus sp. 가 성장하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2). 유일하게 약염기성인 K2HPO4만이 폐감귤박 agar 배지의 pH를 5.6으로 증가 시켰다. 이를 통해 폐감귤박에서 Bacillus sp. 가 자랄 수 있는 주요 인자는 pH임을 알 수 있었다. 후 실험을 통해 폐감귤박의 압출 건조 공정에서 폐감귤박의 섬유질을 경화시켜 압출 시 섬유질과 물이 분리하게 도와주는 Ca(OH)2 0.5% 화학처리 시 pH는 8이상으로 올라간다는 것을 알았고, 결과적으로 압출건조공정에서 발생한 침출수는 Bacillus sp. 성장할 수 있는 배지가 되는 결과를 얻을 수 있었다.

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IV-1-2. 균주 분리 및 RPI 분석방법을 이용한 균주선발 생균제로 사용할 수 있는 Bacillus sp. 균주를 얻기 위해 식품으로부터 균주분리를 생각하였고, 폐감귤박의 주성분인 pectin성분을 가지고 있는 콩과 발효식품을 선택하였다. 우리나라 재래된장과 고추장은 과거부터 그 제조방법상의 특이점으로 Aspergillus niger 와 Bacillus sp. 균주가 주를 이룬다. 특히 고추장을 발효 초기에는 Bacillus licheniformis 가 우점종이고, 발효 말기에는 Bacillus subtilis 가 우점종을 이룬다(R). 이런 배경으로 고추장으로부터 폐감귤박에서 성장하는 29종의 균주를 선발하였고, 선발된 29종의 균주에 대하여 생균제로써의 가치 factor로 항균활성, 생균수 그리고 효소활성에 50: 25: 25의 가중치를 두어 통계학적 방법인 Relative performance Indice 법으로 계산하였다. 이 때 기존의 생균제인 B. subtilis, B. coagulans, B. licheniformis와 활성비교를 하였고, 전체적으로 Staphylococcus aureus에 대해 15~30mm의 높은 항균활성을 나타냈고, protease 활성은 B. coagulans를 100으로 하여 상대활성을 측정하였다. 균의 성장 또한 109 CFU/mL 이상의 생균수를 보이는 것으로 보아 많은 균주들이 폐감귤박에서의 성장이 좋은 것으로 판단된다. 따라서 최종적으로 선발된 균주는 LS 1-2이다. RPI 방법은 여러 가지 factor들에 대한 결과값에 대해 가중치를 설정함으로써 많은 양의 Screening을 하는 데 적합한 방법이라고 할 수 있다. 특히 이번 실험에서 균의 선발과 최적화 실험의 선행실험인 균 배양조건의 최적범위를 설정하는데 유용하게 적용하였다.

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IV-1-3. 선별 균주 동정

생균제는 사료첨가용, 식품첨가용으로 사용되기 때문에 동물과 사람에 무독해야한다. 따라서 균주의 동정을 통해 non-toxin 균주임을 확인하는 것이 필요하다. Bacillus sp. 은 동정을 통해 크게 Bacillus cereus group 과 Bacillus subtilis group 또는 다른 종으로 나눌 수 동물세포에 대한 독성 test와 전임상 test까지 거쳐야한다(R). 본 연구에서는 선별균주의 생화학적, 분자적 동정방법을 통해 non-toxin 균주 이어야하는 1차적인 생균제의 기준에 부합되는지 실험하였다. IV-1-3-1. 생화학적 균주동정 (API kit) 최종 선별된 LS 1-2는 한국미생물 보존센터(KCCM)에 의뢰하였다. 미생물 대사와 생화학적 반응을 이용하여 색깔 판정하는 방법으로 균주의 생화학적 표현형질을 알 수 있는 API kit를 통하여 균주에 대한 결과를 얻을 수 있었고, 이를 통하여 Bacillus 속에 속하는 것을 알 수 있었다.

IV-1-3-2. 분자적 균주동정 (16S rDNA sequencing)

최종 선별된 LS 1-2는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 균주 동정 결과 GeneBank에 AY112743로 등록된 Bacillus subtilis strain MO5의 16S ribosomal RNA 유전자의 부분 염기서열과 98% 일치하였다. 이 결과로 동정된 Bacillus subtilis LS 1-2는 생균제로써의 1차적인 기준에 부합함을 알 수 있었다.

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IV-1-4. 선발된 균주의 항균활성 항균활성이 높은 5개의 균주에 대하여 피검균, Staphylococcus aureus, E. coli O-157에 대한 항균활성을 agar well diffusion test 방법으로 실험하였다. 그 결과 E. coli O-157에 대해선 5개 균주가 20~22mm로 비슷한 저해환을 보였고, Staphylococcus aureus 에 대해선 LS 1-2가 28mm에 해당하는 가장 큰 저해환을 보였다. 최종 선별된 LS 1-2가 항균활성도 가장 높은 것을 확인할 수 있었고, 이 밖에 Data를 싣지 않았지만, E. coli 와 Salmonella gallinarum 에 대해서도 다른 균주들에 비해 비교적 높은 활성을 나타냈다. IV-1-5. LB 배지와 감귤가공부산물 배지에서의 균의 성장 및 항균활성 비교

선발균주 LS 1-2의 복합배지에서의 성장을 알아보기 위해 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48hr 시간 때에 sampling을 하여 생균수와 항균활성을 측정하였다. Bacillus sp. 의 상업용 복합 배지가 되는 LB배지에서 선발균주의 성장은 6~8hr에서 지수성장기를 거쳐 기존의 Bacillus sp. 과 비슷한 빠른 성장을 보이고 12hr 이후에 사멸기로 접어든다. 그러나 감귤가공부산물로 제조된 배지에서는 2hr 늦은 8hr 후에 지수성장기로 접어들고 12hr 이후 2일동안 생균수를 유지하였다. 이 결과는 LS 1-2가 100% 포자로 전환되었을 것이라고 예측하였고, 포자수를 측정하기 위해 80℃, 15분동안 열처리 후 생균수를 측정하였다. 그 결과 포자수와 생균수는 비슷하였고, 24hr 이후 100% 포자로 전환됐음을 알 수 있었다. 이런 결과로 우리는 감귤가공부산물 배지의 어떤 성분이 빠른 포자전환을 유도하여 생균을 포자로 유지하게 만들었을 것이라 추측하였다. 빠른 포자의 전환은 생균제 생산에 문제가 되고 있는 포자로의 전환를 해결할 수 있는 좋은 이점이라 할 수 있다. 포자형성은 생균제의

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제형화 과정에서 발생하는 100℃이상의 고온에서도 균수를 유지할 수 있게 한다. 또한 동물과 인간의 생균제 섭취, 소화과정에서 발생하는 산과 효소에서 견딜 수 있도록 보호막 역할을 한다. 이러한 포자는 장내보다는 림프관과 같은 면역기관에 많은 수가 존재하게 되고 면역관련 기작에 관련한다는 보고가 있다. Bacillus sp.의 포자전환은 여러 가지 cell signaling 이라는 cell 간 communication작용을 함으로써 유전자 level에서부터 protein expression까지 다양한 기작과 현상이 존재한다. 이런 과정 중에 발생한 signal분자들에 의해 면역기작을 돕는 역할을 하는 것이라 할 수 있다. 포자는 pH, 열과 같은 환경인자와 포자유도 물질들에 의해 이루어지게 되고, 이런 인자를 조절하여 포자 전환율을 높이는 것이 생균제 생산의 관건이라 할 수 있다. 항균활성 측정시 LB 배지에서는 항균물질을 생산하지 않았고, 감귤가공부산물 배지에서만 항균물질을 생산하였다. 이를 통해 B. subtilis LS 1-2가 생산하는 항균물질이 감귤가공부산물 유래 항균물질임을 예측할 수 있다. Bacillus sp.를 산업부산물을 이용하여 Bacteriocin을 생산하는 보고가 있는데 이 경우는 LB와 같은 상업용 복합배지에서도 Bacteriocin을 생산한다. 또한 식물체와 같은 생리활성물질을 가지고 있는 경우, 미생물 발효를 통해 생리활성물질의 생합성과정으로 구조적인 변화로 인해 새로운 물질로 변환시킨 다든지, 생리활성이 증가하는 보고들이 있다. 예를 들어 Lactobacillus sp. 는 MSG를 GABA(항암제)라는 물질로 전환시킨다. IV-1-6. 성장에 따른 효소생산

성장에 따른 total protein양을 측정하여 효소생산 생산시기와 항균물질 생산시기와 비교하였다. total protein 양은 12hr 때 균 성장이 최고 점에 달했을 때부터 증가하기 시작해 2일, 3일째 최고치를 나타낸다. 이는 2차 대사

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산물을 내고 있다는 결과이고, SDS-PAGE를 통해 18~72hr 까지 여러가지extracellular enzyme 들이 생산된다는 것을 band로 확인할 수 있었다. 또한 생균제로써 필요한 protease와 amylase의 생산되는 시기와 동일하였다. protease와 amylase는 생균제가 장내에서 활동할 때 정장작용을 돕는 효소이므로 생균제가 갖추어야 할 조건이고, B. subtilis LS 1-2가 이 조건을 만족함을 알 수 있었다.

IV-1-7. 성장에 따른 항균물질 생산

균의 성장이 끝난 후 에 역시 항균물질이 생산되었다. Staphylococcus aureus 와 E. coli O-157에 항균력을 갖는 항균물질 또한 2차대사산물로써 생산이 된다는 것을 실험을 통해 확인하였다. 생균제의 시장의 확대는 항생제 금지로 인해 항생제 대체제의 요구에 의해 생겨난 현상이다. 따라서 기존의 생균제는 항균능력을 가지고 있는 균주개발로 연구가 진행되고 있다.

IV-1-8. 담즙에 대한 내성

상업용 생균제인 Bacillus sp. 과 흙으로부터 분리된 Bacillus sp. 과 비교하여 담즙에 대해 비교적 좋거나 비슷한 내성을 보였다. 간 내에서 분비되는 담즙형태인 TDOC의 경우 MIC 1.0 mM 이상으로 높은 편이고, 보다 강력한 장내에서 분비되는 담즙형태인 DOC의 경우 아주 낮은 MIC 0.2 mM를 보였다. 보고에 의하면, Bacillus sp.들이 장내에서 살아남기 힘든 이유가 담즙에 대한 내성이 다른 균에 비해서 훨씬 약하다고 한다. 하지만, Bacillus sp. 은 장이 아닌 면역을 담당하는 림프기관에서 많이 존재으로써 면역기작과 연관되어 있다. 이에 대한 연구는 아직 미흡하다. 대부분의 생균제제들은 소화작용에

- 34 -

서 위의 강한 산성조건에서 많은 죽고, 간에서 분비되는 담즙이라는 산에 의해 타격을 입게 되고 장까지 살아왔다하더라도 장내에 존재하는 더 강력한 형태의 담즙과 소화효소들에 의해 살아남기 힘들다. 장내에 상주하고 있는 미생물군과의 상호작용과 장에 부착하는 성질을 가지고 있어야 비로소 생균제의 본래의 목적을 달성할 수 있다. 하루 사람으로부터 분비되는 담즙의 양은 3 mM ~ 45 mM로 알려져 있다.38)

IV-1-9. 5L 배양

5L 배양기를 통하여 대량생산 가능성를 알아보기 위해 선발균주의 성장과 항균활성을 측정하였다. 5L 배양 시 균의 성장은 별 차이가 없었으나, E. coli O-157에 대한 항균활성이 flask 배양 시 165±5.5 AU/mL에서 255±5.8 AU/mL로 약 1.6배가 증가되었다. Bacillus sp. 의 특성상 Aeration의 영향이 크다. 5L fermentor는 flask 환경과는 달리 직접산소와 교반기를 통해 산소의 전달을 돕는다. 따라서 이러한 효과가 항균활성의 증가에 영향을 준 것이라 추측된다.

IV-1-10. 여러 성장배지에서의 항균물질 생산 감귤가공부산물과 상업용 복합배지를 이용하여 균의 항균물질 생산을 비교하고자 하였다. 상업용 복합배지인 LB/LBS/TSB/MRS에서는 항균물질을 생산하지 않았고, 감귤가공부산물에서만 항균물질을 생산하였다. 이 결과는 감귤가공부산물의 어떤 물질에서 유래되어 Bacillus 에 의해 생합성 된 항균물질로 추측할 수 있다. 감귤가공부산물의 주성분은 pectin 이므로 이 물질이 항균물질 생산의 주요성분이 아닐 까라는 의문에서 복합배지에 pectin을 첨가하였고,

- 35 -

pectin만으로 배지를 제조하여 균 배양하였다. 결과는 항균물질이 생산되지 않았다. 이 실험으로 선발균주가 pectin을 분해하면서 내는 pectinase에 의한 항균력이 아닐까라는 의문에도 아니라는 결과를 보여주는 실험이었다.결국, 감귤가공부산물 유래의 성분이라는 얘기가 되고, 여러 생리활성물질에 대해 발효시 생합성되는 성분에 대한 연구가 없으므로 앞으로 연구필요성이 있다.

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Fig. 7. Growth of Bacillus sp. on the citrus waste agar platesBacillus sp. are incubated during 24hr on the agar plate made of citrus waste. From the left upside to right watch direction : B. cereus, B. licheniformis, *B. subtilis 55#, Bacillus sp.ATCC 21332, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterium, *B. subtilis 65#* Isolated culture strains of lab from soil

- 37 -

Staphylococcus aureus

StrainsB.

sub

B. lic

hB.

coa

LS1-1LS

1-2LS2LS

4LS

5LS

10LS

ch2

LSch

3LS

ch4TS

1TS

2TS

3TS

4TS

5TS

6TS

7TS

9TS

10TS

ch1

TSch

3TS

ch4MR

1MR

2MR

3MR

4MR

5MR

8

Bac

terio

cin

Act

ivity

Uni

t (A

U/m

L)

50

100

150

200

250

300

350

StrainsB.

sub

B. lic

hB.

coa

LS 1.

1LS

1.2LS

2LS

4LS

5LS

10

LS ch

2

LS ch

3

LS ch

4TS

1TS

2TS

3TS

4TS

5TS

6TS

7TS

9TS

10

TS ch

1

TS ch

3

TS ch

4MS

1MS

2MS

3MS

4MS

5MS

8

Via

ble

cell

num

ber (

CFU

/ml)

0

1e+9

2e+9

3e+9

4e+9

5e+9

6e+9

Fig. 8. Antimicrobial activity of total selected Fig. 9. Viable cell number of total selected strains against S. aureus strains

StrainsB.

subB.

lichB.

coaLS

1.1LS

1.2LS 2LS

5LS

10LS

ch1

LS ch

2LS

ch3

LS ch

4TS

1TS

3TS

4TS

5TS

6TS

7TS

8TS

9TS

10TS

ch1

TS ch

2TS

ch3

TS ch

4MS

2MS

4MS

5MS

7MS

8MS

ch1

MS ch

2

Rel

ativ

e Pr

otea

se P

rodc

utio

n R

atio

Con

trol :

B. c

oagu

lans

(100

%)

0

20

40

60

80

100

120

140

Strains

LS 1.

2TS

4LS

10MS 2LS

1.1TS

7TS

6B.

coaTS

ch3MS

5LS

ch4TS

9TS

3TS

ch4

LS ch

3TS

5MS

4TS

ch1TS

1LS

2MS

1TS

10TS 2B.

subLS 4LS

ch1LS

5MS

3B.

lichMS 8

RP

IOve

rall

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Fig. 10. Relative protease activity of total Fig. 11. RPIoverall values of total selected selected strains strains

- 38 -

Blank

Anti-S. aureus Anti-E. coli O-157

LS 1-2

TS 7LS 1-1 LS 10

TS 4

BlankLS 1-2

TS 7LS 1-1 LS 10

TS 4

Blank

Anti-S. aureus Anti-E. coli O-157

LS 1-2

TS 7LS 1-1 LS 10

TS 4

BlankLS 1-2

TS 7LS 1-1 LS 10

TS 4

Fig. 12. Agar well diffusion test of 5 selected strains Agar well diffusion test showing antimicrobial activity from 5 selected strains against indicator Staphylococcus aureus, E. coli O-157. Each well contained 100㎕ of crude antimicrobial agents prepared by Filtered cell-culture supernatants. Numbers of selected strains : TS 4, LS 1-1, TS 7, LS 10, LS 1-2. (Blank : no culture medium; only citrus waste supernatant)

- 39 -

Table 5. Identification of LS 1-2 using Biochemical analysis (1)

- 40 -

Table 6. Identification of LS 1-2 using Biochemical analysis (2)

- 41 -

NCBI accession No. AY112743LOCUS AY553098 1506 bp DNA linear BCT 06-JUN-2004DEFINITION Bacillus subtilis strain MO5 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.ACCESSION AY553098VERSION AY553098.1 GI:47834652KEYWORDS .SOURCE Bacillus subtilis ORGANISM Bacillus subtilis Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.REFERENCE 1 (bases 1 to 1506) AUTHORS Caton,T.M., Witte,L.R., Nguyen,H.D., Buchheim,J.A., Buchheim,M.A. and Schneegurt,M.A. TITLE Halotolerant Aerobic Heterotrophic Bacteria from the Great Salt Plains of Oklahoma JOURNAL UnpublishedREFERENCE 2 (bases 1 to 1506) AUTHORS Buchheim,J.A. and Buchheim,M.A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-FEB-2004) Department of Biological Science, The University of Tulsa, 600 South College Avenue, Tulsa, OK 74104-3189, USAFEATURES Location/Qualifiers source 1..1506 /organism="Bacillus subtilis" /mol_type="genomic DNA" /strain="MO5" /db_xref="taxon:1423" rRNA1506 /product="16S ribosomal RNA"Fig. 13. Database of Genebank for B. subtilis MO5

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ORIGIN 1 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc 61 tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg 121 ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg atggttgtnt gaaccgcatg gttcagacat 181 aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag 241 gtaacggctc accaaggcna cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg 301 gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac 361 gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt 421 tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa 481 agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg 541 aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc 601 tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt 661 ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct 721 ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 781 ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct 841 gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg 901 aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 961 accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc1021 agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc1081 cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac1141 tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc1201 tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc1261 aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg1321 aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca1381 ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag1441 ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg1501 aaggtgFig. 14. Complete sequence of Bacillus subtilis strain MO5 16S ribosomal RNA gene which were deposited in GenBank

- 43 -

AAGCGTTGTCCCGGAATTATTGGGCCGTAAAGGGCTCGCAGGCCGGTTTCTTAAGTCTGAATTTGAAAGCCCCCCGGCTCAACCCCCAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAAACCCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGNTCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGCCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGGTATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCFig. 15. Complete sequence of Bacillus subtilis LS 1-2 16S ribosomal RNA gene

- 44 -

Bacillus subtilis LS1-2

Time (hr)

0 10 20 30 40 50 60

Viab

le c

ell n

umbe

r (C

FU/m

l)

1e+6

1e+7

1e+8

1e+9

1e+10

Bac

terio

cin

Act

ivity

Uni

t (A

U/m

L)

0

50

100

150

200

250

300

LB mediumCitrus waste mediumAnti-E.coli O157 (citrus)Antimicrobial activity (LB)Anti-S.aureus (citrus)

Fig. 16. Comparision of growth and antimicrobial activity of B. subtilis LS 1-2 in LB medium and Citrus waste medium

- 45 -

Time (hr)

0 20 40 60 80

Cel

l num

ber (

CFU

/mL)

0.0

5.0e+8

1.0e+9

1.5e+9

2.0e+9

2.5e+9

3.0e+9

3.5e+9

Viable cellSpore

Fig. 17. Comparison of viable cell growth and spore cell growth

- 46 -

Time (hr)

0 20 40 60 80

Viab

le c

ell n

umbe

r (C

FU/m

L)

0.0

5.0e+8

1.0e+9

1.5e+9

2.0e+9

2.5e+9

Tota

l pro

tein

(mg/

mL)

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

GrowthTotal protein

Fig. 18. Increase amount of total protein as growth times

- 47 -

Time (hr)

0 20 40 60 80

Prot

ease

act

ivity

(U/m

L)

3000

3200

3400

3600

3800

Am

ylas

e ac

tivity

(IU

/mL)

200

220

240

260

280

300

Fig. 19. Production of protease and amylase during growth

- 48 -

Time (hr)

0 20 40 60 80

Bac

terio

cin

Act

ivity

Uni

t (A

U/m

L)

0

50

100

150

200

250

S. aureus (Gram +)E coli O157 (Gram -)

Fig. 20. Production of bacteriocin-like substance during growth

- 49 -

Table 7. Tolerance of B. subtilis LS 1-2 against bile acids

TDOC : bile acid form existed in river DOC : bile acid form existed in intestinal

- 50 -

Time (hr)

0 5 10 15 20 25 30

Viab

le c

ell n

umbe

r (C

FU/m

L)

2.0e+8

4.0e+8

6.0e+8

8.0e+8

1.0e+9

1.2e+9

1.4e+9

DO

(%)

70

80

90

100

110

120

130

Bac

terio

cin

Act

ivity

Uni

t (A

U/m

L)

50

100

150

200

250

300

Viable cell numberDOBacteriocin Activity Unit (AU/mL)

Fig. 21. 5L fermentation of B. subtilis LS 1-2

Fig. 22. Inhibition zone of E. coli O-157 as time

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Table 8. Comparison of antimicrobial activity in several culture medium

-N o c e l l / C it r u s w a s te+C itru s w a s te +C it ru s w a s te + C a ( O H ) 2

-L B /T S B /M R S + p e c t in-P e c t in-M R S-T S B-L B S-L B

A n t im ic ro b ia l a c t iv ityM e d iu m-N o c e l l / C it r u s w a s te+C itru s w a s te +C it ru s w a s te + C a ( O H ) 2

-L B /T S B /M R S + p e c t in-P e c t in-M R S-T S B-L B S-L B

A n t im ic ro b ia l a c t iv ityM e d iu m

+ : Antimicrobial activity O

- : Antimicrobial activity X

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IV-2. Bacillus subtilis LS 1-2가 생산하는 항균물질 (Bacteriocin-like substance) 특성연구

IV-2-1. 감귤가공부산물의 항균활성

감귤가공부산물에 있는 성분이 항균활성을 가지고 있는지에 대한 실험을 진행하였다. 그람음성균인 E. coli와 Salmonella gallinarum 에 대해선 10,000ppm 이상에서 항균능을 보였다. 하지만, 그람양성균인 50,000ppm 에서도 Staphylococcus aureus에 대해서는 효과가 없었다. 감귤가공부산물은 감귤껍질성분에 bioflavonoid 계열의 생리활성물질을 가지고 있는데 이 성분에는 항균활성을 가지는 물질을 포함하고 있다. 하지만, 감귤주스 가공공정상에서 미세한 바늘에 의해 감귤껍질의 오일성분은 제거가 되기 때문에 오일성분에 있는 bioflavonoid 계열의 생리활성물질은 감귤가공부산물에는 있다하더라도 많은 양은 아닐 것이라 추측하였다. 따라서 항균성을 나타내는 생리활성물질이 감귤껍질에 존재하는 연구보고가 많음에도 불구하고, 감귤가공부산물을 이용한 항균활성 실험에서는 큰 효과가 없었다고 사료된다.

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IV-2-2. 항균 스펙트럼

선발균주가 생산하는 항균물질의 항균범위. 즉, 항균 스펙트럼을 알아보기 위해 그람양성균 3종, 그람음성균 3종을 실험하였다. 이 피검균은 가축병을 유발시키는 병원성 세균을 이용하였다. 그람양성균인 Staphlococcus aureus, 에만 20mm이상의 저해환을 형성 강한 항균력을 보였고, 그람음성균에 대해선 모두 10mm 이상의 항균력을 보였다. 이 결과로 선발균주가 생산하는 항균물질은 광범위 항균물질임을 알 수 있다.

IV-2-3. 상업용 항생제와 항균능 비교

사료첨가제로 사용되는 항생제와의 항균능을 비교하기 위해 피검균 4종S. aureus, E. coli O-157, E. coli, 그리고 S. gallinarum에 대한 저해환 test를 실험하였다. Blank는 균을 배양하지 않은 감귤가공부산물을 이용하였다. 항생제의 농도는 Tetracycline과 Kanamycin의 3mg/mL, Ampicillin, Vancomycin, Sepctinomycin, Novobiocin 그리고 Streptomycin은 1mg/mL의 농도로 제조하였다. 선발균주 LS1-2 배양 상등액을 control로 하여 100ul의 양에 대한 항균활성을 비교하였다. S. aureus에 대해선 Ampicillin이 405 ±8.0 AU/mL로 가장 높았고, LS 1-2 배양 상등액이 265±5.5 AU/mL로 두 번째 높았다. E. coli O-157에 대해서도 Ampicillin 다음으로 높은 활성(240 ±10 AU/mL)을 보였고, Novobiocin의 경우는 효과가 없었다. E. coli에 대해선 비교적 낮은 활성(120±6.0 AU/mL)을 보였지만, Vancomycin 과 Streptomycin은 효과가 없었다. S. gallinarum 에 대해서도 낮은 활성(125± 5.5 AU/mL)보였다. 하지만, Vancomycin(85±5.0 AU/mL)과 Novobiocin(85±5.0 AU/mL)보다는

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높은 활성이다. 이 결과를 통해 선발균주가 생산하는 항균물질이 기존의 항생제를 대체할 수 있는 가능성을 보여주었고, 생산단가나 판매단가 등을 고려하여 산업화시키는 것은 앞으로 더 조사가 필요한 내용이다.

IV-2-4. 효소처리 영향

선발균주의 항균물질에 Proteinase K, Pronase E, Lipase 그리고 α-Amylase 를 2mg/mL이 되도록 첨가하여 37℃에서 2시간 30분 동안 반응시킨 후 열처리를 통해 효소의 활성을 잃게 하여 항균물질의 잔존활성을 측정하였다. 그 결과 pronase E에 의해서만 활성이 50% 감소하였다. pronase E는 무작위적인 단백질 분해 효소로써 항균물질이 단백질 계열일 가능성을 나타내었다. 한편 Lipase, α-Amylase를 처리한 경우에는 활성이 그대로 유지되어 항균활성을 나타내는 물질에는 당이나 지질 결합이 크게 영향을 미치지 않는 것으로 추정할 수 있었다.

IV-2-5. 열처리 영향

선발균주의 항균물질을 열처리하였을 때 나타나는 항균활성변화를 측정하였다. 24시간동안 -70~121℃까지 범위에서 잔존항균활성을 측정하였다. 본 항균물질은 100℃ 1시간 동안 그 활성이 유지되었다. 121℃처리시 15분만에 급격히 항균활성이 감소하기 시작하여 반응 1 시간만에 활성이 완전히 상실되었다. 65℃에서는 4시간까지는 항균활성에 별 차이가 없었으나 6시간 이후부터 50%로 활성이 감소하였다. 이에 반해 37℃이하의 온도 -70℃까지는 24시간동안 활성이 그대로 유지되었다. 미생물로부터의 항균물질은 대부분 저분자의 단백질분자로써 열에 안정한 것으로 알려지고 있다. 그 예로써

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Lactobacillus acidophilus가 생산하는 lactacin B(R)은 120℃에서 1시간동안 열처리하여도 그 활성에는 변화가 없었으며, Lactococcus lactis subsp. diacitilactis의 bacteriocin S5041)과 Lactobacillus plantatum LPC010의 plantaricin S42)도 100℃에서 각각 1시간과 30분 열처리 시 안정하여 내열성이 크게 나타났다. 반면, 열에 안정하지 못한 항균물질에 대한 보고로는 Lactobacillus helveticus 균주로부터 helveticin V-1829는 60℃에서 불활성 되가 시작하여 100℃에서는 30분 안에 활성을 잃어 열에 민감한 것으로 보고되고 있다.43) L. acidophillus AC1으로부터의 항균물질은 분자량 5,200의 저분자 단백질물질로서 실온이나 냉장온도94~8℃)에서는 안정하나 50℃처리에서는 20분 안에 항균활성의 대부분이 상실된다고 보고되었다.44) 본 실험에서는 B. subtilis LS 1-2로부터 생산된 항균물질은 100℃에서 1시간동안 활성이 유지되어 내열성이 강한 물질이고, 100℃에서 2시간이후에는 활성이 완전히 상실되어 단백질물질로의 가능성을 또 한번 나타내었다.

IV-2-6. pH의 영향

항균물질의 활성에 대한 pH 영향을 알아보기 위해 선발균주 배양 상등액을 pH 2에서 pH 10의 범위에서 4℃에서 26시간 동안 방치하면서 상대활성을 측정하였다. 그 결과 pH2~pH10까지 26시간 동안 활성의 변화가 없었으므로 넓은 pH 범위에서 매우 안정하였다. 기존의 보고에 의하면 nisin을 비롯한 대부분의 미생물 유래의 항균물질이 일정 pH 범위내에서만 안정한 것으로 알려지고 있는데, pH에 의하여 항균물질이 활성을 상실하는 이유는 pH가 높을 경우 hydroxides ions, deprotonated amines, deprotonated hydroxyl group과 같은 nucleo-phile은 dehydro residue와 반응하여 분자간 혹은 분자

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내 cross-linkage를 형성하여 화학적 변형을 일으킨다고 보고하였다.45) Dehydro잔기가 존재하는 nisin의 경우에도 이와 같은 반응이 일어나 여러 종류의 반응물이 생성되면서 nisin의 항균력은 급격히 손실되었다고 보고 되었으며 nisin은 pH 2.0에서의 용해성이 57mg/mL인 반면 pH 8~12에서는 0.25mg/mL의 낮은 용해성을 보여 알칼리 영역에서의 불안정성이 보고 되었고45), L. plantarum C-11이 생산하는 plantaricin A는 pH 4~6.5사이의 좁은 범위에서만 활성을 나타내었다.46) 이에 반해 소수에 불과하나 넓은 pH범위내에서 비교적 안정한 항균물질에 관한 보고들도 있는데, Carnobacterium piscicola47)가 생산하는 항균물질은 pH 2에서 pH 11에 결쳐 항균력을 손실하지 않았고, B. cereus48)가 생산하는 항균물질도 pH3~12까지에서 항균활성을 갖고 있는 것으로 보고 되고 있다. 본 항균물질도 거의 전 pH영역에서 (pH 2 ~ pH10) 26시간 이상동안에도 그 활성을 잃지 않아 후자의 보고들48)과 유사한 pH 안정성을 보였다. 항균물질들 간의 이러한 안정성 차이는 구조적인 차이나 cofactor 등에 의한 작용으로 사료되며 보다 정확한 이유는 이 두 항균물질들의 구조적 기능적 특이성의 비교 연구에 의하여 규명되어야 할 것이다.

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Anti-E. coli

Time(hr)

0 5 10 15 20 25

OD

(600

nm)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

control250ppm500ppm1000ppm2500ppm10000ppm50000ppm

Anti-S. gallinarum

Time(hr)

0 5 10 15 20 25O

D(6

00nm

)0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

control250ppm500ppm1000ppm2500ppm10000ppm50000ppm

Anti-S. aureus

Time(hr)

0 5 10 15 20 25

OD

(600

nm)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

control250ppm500ppm1000ppm2500ppm10000ppm50000ppm

Fig. 23. MIC test from MeOH extracts of citrus waste against 3 pathogens.3 Pathogens' growth curves showing Inhibition from MeOH extracts of citrus waste against indicator E. coli, Salmonella gallinarum and Staphylococcus aureus. Ranges of extracts' concentrations are 250 ~ 50,000 ppm. Gram - : E. coli, Salmonella gallinarum Gram + : Staphylococcus aureus

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Table 9. Antimicrobial spectrum of Bacteriocin-like substance produced by B. subtilis LS 1-2

G ra m +

-B a c i l lu s s u b t i l is A T C C 6 6 3 3

+S a lm o n e l la g a ll in a r u m+ +E . c o l i O - 1 5 7+E . c o l i

G r a m --L is t e r ia m o n o c y to g e n e s

+ + +S ta p h y lo c o c c u s a u r e u s

A n t im ic ro b ia l a c t iv ityIn d ic a to r s tr a in sG ra m +

-B a c i l lu s s u b t i l is A T C C 6 6 3 3

+S a lm o n e l la g a ll in a r u m+ +E . c o l i O - 1 5 7+E . c o l i

G r a m --L is t e r ia m o n o c y to g e n e s

+ + +S ta p h y lo c o c c u s a u r e u s

A n t im ic ro b ia l a c t iv ityIn d ic a to r s tr a in s

Zone of inhibition diameter over 20mm : +++ " 15 ~ 20mm : ++

" under 15mm : + No clear zone : -

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B la n k : c i t r u s w a s te s u p e r n .L S 1 - 2 : L S 1 - 2 s u p e r n . 1 0 0 u l A m p : A m p ic i l l in , 1 m g /m LV a n : V a n c o m y c in , 1 m g /m LS p e c : S p e c t in o m y c in , 1 m g /m LN o v o : N o v o b io c in , 1 m g /m LS t r e p : S t r e p to m y c in , 1 m g /m LT e t r a : T e t r a c y c l in e , 3 m g /m LK a n a : K a n a m y c in , 3 m g /m L

Antibiotics

Blank Control Amp Van Spec Novo Strep Tet Ka

Bac

terio

cin

Act

ivity

Uni

t (A

U/m

L)

0

100

200

300

400

500

Anti-S. aureusAnti-E. coli O-157Anti-E. coliAnti-S. gallinarum

Fig. 24. Comparison of commercial antibiotics and Bacteriocin-like substance produced by Bacillus subtilis LS 1-2

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Table 10. Enzyme treatment of Bacteriocin-like substance produced by B. subtilis LS 1-2

100100No treatment

Antimicrobial activity (%)Enzyme

10010010050100

Anti-S. aureus

100Proteinase K50Pronase E

100Catalase100Amylase100Lipase

Anti-E. coli O-157100100No treatment

Antimicrobial activity (%)Enzyme

10010010050100

Anti-S. aureus

100Proteinase K50Pronase E

100Catalase100Amylase100Lipase

Anti-E. coli O-157

- 61 -

0

50

100

150

200

250

300

24 12

6 4

2 1

0.5 0.25

121 100

65 37

25 4

-20 -70 B

acte

rioci

n A

ctiv

ity U

nit (

AU

/mL)

Time (hr) Temp

eratur

e 0

50

100

150

200

250

300

26 22 18 14 10

8 6

4 2

0Control(7.3)

2 3

4 5

6 7

8 9

10 Bac

terio

cin

Act

ivity

Uni

t (A

U/m

L)

Time (hr)

pH

Fig. 25. Stability of Bacteriocin-like substance against temperature and pH

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LBSLBS1818BLBL 2424 3636 4848 7272 MM TSBTSB

BL : Citrus waste supernatant

18 ~ 24 : Culture times (hr), cultured cell supernatant using Citrus waste medium

M : Marker 15 kDa ~ 120 kDa

TSB : cultured cell supernatant using TSB medium

LBS : cultrued cell supernatant using LBS medium

BL : Citrus waste supernatant

18 ~ 24 : Culture times (hr), cultured cell supernatant using Citrus waste medium

M : Marker 15 kDa ~ 120 kDa

TSB : cultured cell supernatant using TSB medium

LBS : cultrued cell supernatant using LBS medium

Fig. 26. SDS-PAGE profile of proteins produced by B. subtilis LS 1-2 during growth in citrus waste medium and commercial medium

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IV-3. Response surface methodology(RSM)를 이용한 배양조건 최적화IV-3-1. 배양조건에 따른 균의 성장, 항균활성 및 RPI값

B. subtilis LS 1-2의 성장과 항균활성을 증가시키기 위해 배양조건을 최적화시키기 위한 선행실험으로 One factor at a time 실험을 하였다. 선정된 배양조건은 초기 pH, 온도, 고형분 % 그리고 Working volume 4가지 factor이다. 기준이 된 배양조건은 pH 7, 30℃, 5% 그리고 50mL 이다. 3 factors를 고정하고 1 factor를 변화시키는 방법으로 실험을 설계하였다.

IV-3-1-1. Initial pH의 영향

선발균주의 성장과 항균활성에 대해 초기 pH 변화가 주는 영향을 알아보았다. 30℃, 고형분 5%, 50mL(w/v) 으로 고정하고, pH 4~10 까지 변화시켰다. 그 결과 pH 4에서 가장 낮은 항균활성과 성장을 나타냈는데, Bacillus sp.의 성장은 pH 5이상에서 가능하기 때문이다. S. aureus에 대한 항균활성은 pH 9에서 E. coli O-157에 대해선 pH 5, 생균수는 pH 7에서 가장 높은 것을 알 수 있다. 특정 pH에서 균의 성장과 항균활성이 다른 이유는 초기 pH의 영향