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Di sana e robusta Costituzione? Indagini biologiche e ambientali su e "attorno" la copia originale della Costituzione

Italiana, conservata presso l'Archivio Centrale dello Stato a Roma

MATTEO MONTANARI1

PIETRO LIVI2

CLELIA ISCA3

ANTONELLA CASOLI3

GLORIA INNOCENTI4

'Bioresarts.r.l 2Froti&LMs.r.l. 3Dipartimento di Chimico, Università degli Studi di Formo 'Dipartimento di Scienze Agrarie, Università degli Studi di Bologna

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Introduzione

L'opinione pubblica spesso ignora l'importanza cruciale che hanno gli archivi cartacei storici per la nostra memoria e la no­stra identità di nazione.

Questa mancanza di attenzione purtroppo rischia, in periodi di recessione e crisi economica, di far mancare le minime risorse ne­cessarie per lo svolgimento delle corrette pratiche di conservazione dei beni archivistici e librari.

Tra queste, oltre alle comuni misure di manutenzione ordinaria

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(pulizie e climatizzazione) e straordinaria (spolverature, restauri e condizionamento dei documenti), si possono annoverare le analisi biologiche e ambientali sui materiali e nei locali di conservazione.

Le analisi biologiche hanno lo scopo di evidenziare il potenziale rischio biodeterio-geno nell'ambiente, attraverso l'identifica­zione degli agenti eziologici, della loro quantità e attività in relazione alle condi­zioni microclimatiche e chimico-fisiche dei substrati.

Il materiale cartaceo infatti è un mate­riale molto sensibile all'attacco di agenti di biodeterioramento (Florian, 2002): in con­dizioni ambientali favorevoli (umidità e temperature elevate, presenza di polveri or­ganiche) le comunità microbiche e animali tipiche degli ambienti indoor rappresen­tano una delle minacce più gravi per l'inte­grità dei supporti cartacei e membranacei.

Tra i più importanti biodeteriogeni della carta, pergamena, pelli e altri materiali as­sociati a documenti e faldoni ci sono prin­cipalmente i funghi microscopici (Zyska, 1997) e diverse specie di insetti tra cui co­leotteri (anobidi e dermestidi), psocotteri, tisanuri e blattoidei (Ruschioni et al., 2008).

Le infestazioni e le contaminazioni in ar­chivio possono essere molto invasive ma anche, specie nelle prime fasi, silenziose e invisibili.

Affrontare i problemi biologici in emer­genza, comporta quasi sempre elevati costi di indagine e bonifica, con risultati non sempre ottimali per l'integrità dei beni.

La conservazione preventiva invece, che comprende monitoraggi ambientali stagio­nali o check-up saltuari sui materiali da af­fidare a biologi esperti del settore, rappresenta la soluzione migliore per met­tere in luce i fattori ambientali e biologici potenzialmente dannosi per la salvaguardia dei beni, e favorisce quindi interventi di ri­pristino mirati, molto meno invasivi e one­rosi (Montanari e/ al., 2013).

L'archivio centrale dello Stato all'EUR di Roma è senza dubbio l'archivio più grande presente nella nostra nazione e contempla al suo interno documenti che sono vere e

proprie pietre miliari per la nostra storia. In occasione della I Conferenza Beni Cultu­rali promossa dell'Ordine Nazionale dei Biologi, si è deciso di impiegare tecniche diagnostiche innovative (Pinzari et al., 2011 ) per la valutazione dello stato di salute fisico e biologico del documento simbolo della nostra storia repubblicana: la copia origi­nale della Costituzione Italiana.

L'approccio diagnostico ha comportato la caratterizzazione dei diversi parametri ambientali e biologici, non solo sull'oggetto in questione, ma anche nell'ambiente che lo circonda: nell'aria e sui documenti limi­trofi.

Materiali e metodi

Descrizione dell'ambiente di conservazione La copia originale della costituzione ita­

liana si trova all'interno di una cassaforte metallica al secondo piano di un ala del­l'Archivio Centrale dello Stato all'EUR, Roma, in un locale ad uso ufficio, frequen­tato stabilmente da impiegati amministra­tivi. Il locale è provvisto di ampie finestre orientate a est e di normali caloriferi in ghisa per il riscaldamento invernale.

Non è dotato invece di climatizzazione di T e UR, né di trattamento dell'aria in en­trata.

Descrizione dello stato conservativo della copia originale della Costituzione Italiana conservata presso l'Archivio centrale dello Stato a Roma

Il manufatto, conservato all'interno di un faldone contenente altri documenti storici, è stato esaminato da un restauratore pro­fessionista in tutte le sue parti con l'aiuto di un microscopio digitale 50-200x a luce bianca e NUV (Dino Lite prò).

Contestualmente è stato determinato il pH di superficie (Residori, 2008) con un pHmetro specifico per carta (Hanna, HI 99171N), sulle pagine a contatto con i piatti della carpetta di protezione, su un pagina interna e su un imbrunimento presente lungo tutta la piega centrale.

Sulle stesse pagine è stato determinato il contenuto idrico della carta tramite igro­metro di superficie (Aqua-Boy PMII) e pre­levate in modo micro invasivo alcune fibre di carta mediante l'uso del Fungi-Tape (ade­sivo trasparente non tenace, Did, Milano). Frammenti provenienti da ciascuno dei campioni sono stati osservati al microsco­pio elettronico SEM ed ottico.

Le immagini al SEM sono state effet­tuate in alto vuoto su campioni metallizzati con oro o grafite.

Le osservazioni al microscopio ottico sono state effettuate in un range d'ingran­dimento 200 - 600 x, con colorazioni spe­cifiche per la visualizzazione del contenuto in lignina (saggio del fluoroglucinolo, Cam­panella L, 2007) e di eventuali strutture fungine con colorazione al blu cotton in lat-tofenolo.

Analisi microbiologica del manufatto: ap­proccio metagenomico

L'eventuale presenza di microorganismi biodeteriogeni sulle pagine del manufatto è stata determinata con un approccio me­tagenomico, tentando cioè di verificare la presenza di DNA microbico sulla superficie cartacea ed eventualmente di caratterizzarlo per l'identificazione di tratti di sequenze specie- specifiche.

Negli stessi punti del manufatto nei quali sono state effettuate le analisi de­scritte sopra (per un totale di 3 punti cam­pione), attraverso l'uso di un marginatore (10 x 10 cm) è stato prelevato il particolato presente sulla superficie della carta stri­sciando più volte un tampone sterile umet­tato con acqua sterile per PCR (fig. 1).

Il DNA ambientale è stato estratto dai campioni utilizzando un kit d'estrazione specifico (Nucleo spin tissue, MN) e suc­cessivamente amplificato tramite PCR uti­lizzando specifici primers per una porzione della regione 18s del DNAribosomialefun-gino o per una porzione della regione 16 s del DNA ribosomiale batterico.

Entrambe le porzioni contengono re­gioni altamente variabili utili per differen­ziare gli amplificati a livello tassonomico di

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Figura 1. Prelievo superficiale con lampone.

specie (White et al., 1990; Gardes and Bruns,1993;Marchesi et al., 1998).

Le sequenze ottenute, previa separa­zione delle stesse tramite tecniche di scree­ning (Montanari et al., 2012), possono essere confrontate con quelle presenti nei database online forniti dal NCBI usando il programma BLAST (Altschul et al., 1997).

Analisi ambientale e microbiologica del­l'ambiente conservativo

Due sensori termoigrometrici datalogger (RHT10 Extech) sono stati posti nell'am­biente di conservazione per la misurazione mensile di temperatura, umidità e punto di rugiada, uno esternamente e uno interna­mente alla cassaforte.

Nello stesso giorno del campionamento sui manufatti è stato effettuata un'analisi aerobiologica per la determinazione della qualità igienica sanitaria dell'aria presente nell'ambiente (fig. 2).

Per la valutazione della carica microbica batterica e fungina e per la determinazione degli indici di qualità dell'aria (secondo le procedure dell'INAIL, 2010), si è utilizzato un campionatore aereo ad impatto in due

punti campione, uno all'interno del locale e uno all'esterno, utilizzando i terreni Piate count agar (PCA, per la carica batterica) e Saburau agar (S, per la carica fungina). La somma delle due cariche ha permesso l'elaborazione degli indici IGCM (indice ge­nerale di contaminazione microbica) e IA (indice di amplificazione, che rappresenta il confronto interno-esterno delle cariche).

Altri due terreni, il dichloran glicerol agar (DG18) e il dichloran rose bangal cloram-phenicol agar (DRBC) sono stati utilizzati per la quantificazione selettiva di funghi biodeteriogeni.

I ceppi fungini dominanti ottenuti su DRBC e DG18 sono stati isolati in coltura pura e identificati tassonomicamente me­diante estrazione del DNA fungino, ampli-

Figura 2. Analisi aerobiologica nell'ambiente conservativo.

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ficazione di una porzione variabile del DNA ribosomiale e successivo sequenziamento confrontando le sequenze ottenute, come descritto precedentemente.

Anche i morfotipi batterici dominanti ot­tenuti su PCA sono stati isolati e caratteriz­zati come sopra utilizzando in questo caso primers specifici per un porzione della re­gione 16s del DNA ribosomiale batterico, come già riportato.

Descrizione dello stato conservativo dei do­cumenti contigui al manufatto

I documenti contenuti all'interno dello stesso faldone in cui è conservata la copia della Costituzione sono stati esaminati in­sieme al restauratore per la valutazione del loro stato conservativo da un punto di vista strutturale e biologico.

Questa indagine è stata condotta in quanto l'eventuale presenza di contamina­zioni nei documenti limitrofi potrebbe rap­presentare una sorgente di contaminazione interna.

In generale i documenti presenti risa­lenti a periodi diversi compresi tra la metà del XIX secolo e la metà del XX secolo erano tutti in buon stato conservativo, ad ecce­zione di un plico di fogli manoscritti di Ga­ribaldi che presentavano molte macchie da foxing di sospetta origine biologica (Florian, 2002).

Le macchie di foxing sono state esami­nate con una lampada di Wood per veri­ficare l'emissione di fluorescenza spesso testimone di un origine fungina delle macchie.

Su questi fogli sono stati effettuati di­versi prelievi non invasivi per la valutazione di parametri chimico-fisici e biologici.

Per il prelievo di potenziali propaguli mi­crobici presenti sulle macchie di foxing si è mutuato un metodo utilizzato nel restauro per la rimozione non invasiva di sostanze indesiderate dalle superfici (Isca C, 2014), applicando sui margini delle macchie gocce solidificate di agar-acqua sterile (agar drop) con la parte convessa aderente alla super­ficie della carta per assicurare il minimo contatto dell'agar con la matrice.

Il prelievo con agar per contatto infatti, pur assicurando il totale rispetto per l'inte­grità delle fibre, se troppo ampio e insistito potrebbe umidificare troppo la matrice, provocando nelle carte antiche e ingiallite la comparsa di gore colorate.

Dopo un minuto di contatto, le agar drop sono state trasferite asetticamente su diversi tipi di terreno agarizzato per la coltura di microrganismi fungini o batte­rici con particolare attenzione ai biodete­riogeni: PCA, DRBC, DG18 e Agar cellulosa (CELL).

Quest'ultimo è stato preparato con cel­lulosa amorfa preparata secondo il proto­collo di Walseth (1952), addizionando al terreno il colorante congo red che consente di evidenziare l'attività cellulosica degli or­ganismi in crescita.

Contestualmente negli stessi punti cam­pione sono stati prelevati strip adesivi Fungi Tape per l'osservazione delle fibre e delle eventuali strutture fungine al SEM e al mi­croscopio ottico, come descritto preceden­temente.

Infine in diversi punti è stato determi­nato pH e contenuto idrico della carta.

Risultati

Descrizione dello stato conservativo della copia della Costituzione

Le 19 pagine fronte e retro che costitui­scono il corpo del manufatto mostrano l'im-brunimento tipico di carte invecchiate con alto contenuto di lignina. L'ingiallimento è causato principalmente dall'ossidazione della lignina.

La presenza di lignina è confermata dalle immagini delle fibre ottenute al mi­croscopio ottico ed elettronico.

Nel primo caso la lignina si evidenzia nell'eterogeneo impasto fibroso della carta grazie alla colorazione violacea ottenuta col saggio del fluoroglucinolo, nel secondo si evi­denziano molto bene le caratteristiche stria-ture dei vasi del tessuto legnoso (fig. 3).

Il pH della carta si dimostra essere piut­tosto acido soprattutto nelle pagine interne

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Figura 3. Presema di lignina evidenziato al microscopio ottico con colorazione al fluoroglucinolo (nel tondo), e al SEM dove si no­

tano elementi tipici dellImpasto legnoso

con valori inferiori a 5. Da un punto di vista strutturale la carta

è in discreto stato conservativo. Anche le firme autografe dei padri costituenti non mostrano problemi di ossidazioni.

È da segnalare un imbrunimento nelle due pagine centrali causato dal rilascio di pigmento da parte di una bretella di pelle color testa di moro che un tempo le attra­versava.

La bretella faceva parte della carpetta in pelle imbottita che tuttora riveste il manu­fatto.

Il contenuto idrico della carta si attesta attorno al 7-8 %.

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microrganismi dominanti nell'aria habitat interesse sanitario interesse biodeteriogeno terreno di coltura indoor

BATTERI

gastroenteriti Acinetobocter Iwofiii cute, acqua, suolo in pazienti

immunocompromessi PCA

Micrococcus luteus acqua, suolo, cute PCA

Stophylococcus epidermidis cute PCA

FUNGHI

Aspergillus ochroceus esterno/interno micotossine emicellulose DRBC

A. versicolor interno allergogeno cellulosa DRBC

Penicillium brevicompoctum

xerofilo micotossine/ allergogeno

cellulosa DG18

Tabellal. Ceppimicrobicidominanti nell'aria.

Analisi microbiologica del manufatto Nonostante l'uso di svariati primers non

è stato possibile amplificare alcun fram­mento genomico da nessuno dei tre cam­pioni prelevati.

Indagini condotte con spettrofotometro NanoDrop non hanno permesso di rilevare quantità misurabili di DNA negli estratti.

Anche l'osservazione al SEM e al micro­scopio ottico con coloranti specifici non hanno permesso di visualizzare alcuna struttura microbica sulle fibre.

Analisi ambientale e microbiologico nel­l'ambiente conservativo

Le analisi aeree sulla componente mi­crobica del locale hanno restituito un indice generale di contaminazione microbica (IGCM) poco superiore a 103 UFC/m3 di aria e un indice di amplificazione (IA) pari

a 1,64 che testimonia una maggiore conta­minazione interna rispetto all'ambiente esterno.

Come previsto considerando la frequen­tazione assidua di personale nel locale, la carica batterica risulta essere superiore al­l'interno rispetto all'esterno.

La carica fungina è invece leggermente più alta all'esterno, come spesso accade, salvo nei casi di sorgenti interne di conta­minazione.

L'uso dei terreni PCA, DRBC e DG18 ha permesso di isolare alcuni ceppi batterici e fungini dominanti che sono stati identificati tramite analisi del DNA (vedi tabella 1 ).

In tabella è descritto anche l'habitat ti­pico della specie, il suo interesse da un punto di vista sanitario, le sue capacità de­gradale nei confronti delle principali com­

ponenti della carta e i terreni di coltura dai quali sono stati isolati.

Descrizione dello stato conservativo dei do­cumenti contigui al manufatto

In fig. 5 è possibile osservare la risposta delle macchie di foxing alla luce di wood, che evidenzia un intensa fluorescenza gialla ai margini delle macchie. Questa caratteri­stica insieme alla propagazione del foxing da una pagina all'altra del plico suggerisce un origine biologica del fenomeno.

In effetti osservazioni al microscopio ot­tico con colorazioni al blu cotton in lattofe-nolo permettono di evidenziare strutture di natura quasi certamente fungina: fram­menti di ife e forse spore (fig. 6).

Il tentativo di isolamento con agar drop a contatto non ha invece restituito alcuna

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Figura 5. Macchie di foxing fluorescente sulle lettere di Garibaldi evidenziate sotto luce di Wood.

colonia fungina o batterica vitale. Da un punto di vista strutturale, il sup­

porto cartaceo delle lettere si presenta in un buon stato di conservazione con nes­suna traccia di lignina.

Al SEM si riconoscono infatti solo fibre di cotone o di canapa/lino ancora in buone condizioni. L'acidità della carta tuttavia anche in questo caso si dimostra essere ab­bastanza elevata, attorno a 5 con punte anche inferiori a livello delle macchie di fo­

xing. Il contenuto idrico della carta si attesta anche in questo caso a valori inferiori a 8%.

Conlusioni

Le analisi microbiologiche hanno dimo­strato l'assenza di attività biologica sulle pa­gine che compongono la copia originale della Costituzione italiana.

Alcune tracce di attacchi biologici sono

state invece riscontrate con l'aiuto del mi­croscopio ottico ed elettronico a scansione in corrispondenza di macchie di foxing pre­senti su documenti conservati nello stesso faldone in cui è conservato il manufatto, tuttavia le analisi colturali non hanno rile­vato la presenza di propaguli microbici vi­tali. Il foxing di natura biologica infatti è solitamente un effetto tardivo di un attacco biologico condotto da funghi xerofili spe­cializzati, i cui resti interagendo con alcuni

w -

9 o

10pm

10nm # Figura 6. Fibre prelevate dalle macchie di foxing osservate al microscopio ottico e colorate con blu di lattofenolo che evidenzia strutture fungine (frecce).

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componenti endogeni della carta e con in­quinanti esogeni portano alla formazione delle macchie color ruggine (Florian, 2002). Solitamente quindi esse sono testimoni di un attacco pregresso non più attivo.

Se da un punto di vista prettamente bio­logico i materiali sono quindi intrinseca­mente salubri, altrettanto non si può dire per quanto riguarda l'aspetto chimico: la carta risulta essere ricca di lignina e come prevedibile mostra un pH acido.

Ossidazione e acidità, se non tamponate con opportuni trattamenti, potrebbero col tempo infragilire i supporti provocando rot­ture e perdite di materiale.

Anche l'ambiente di conservazione pre­senta alcune criticità dovute ad una pre­senza troppo assidua da parte del personale.

L'aria all'esterno dell'armadio blindato che ospita la Costituzione presenta infatti una carica fungina e batterica elevata (IGCM superiori a 1000 UFC/m3), forte­mente influenzata dall'assenza di filtrazione e trattamento dell'aria proveniente dal­l'esterno e dalla presenza assidua del per­sonale, come dimostra la presenza elevata di batteri tipici della cute umana.

Sebbene solitamente non infettivi, al­cuni di questi organismi, come ad esempio Acinetobacter Iwoffii (Regaldo et al. 2009), possono provocare problemi sanitari a in­dividui immunodepressi.

L'andamento termoigrometrico mensile mostra il tipico andamento a picchi degli ambienti indoor privi di condizionamento climatico. Sebbene durante l'osservazione (condotta in un periodo mite) l'andamento tremoigrometrico non abbia mai superato valori critici, è possibile che durante la sta­gione più fredda soprattutto nelle ore not­turne si possano verificare picchi di umidità superiori al 65%, cioè oltre la soglia del ri­schio biologico.

È interessante notare tuttavia che l'ar­madio blindato che ospita la Costituzione rivela un efficace effetto tampone nei con­fronti delle variazioni termoigrometriche esterne: il microclima al suo interno è rima­sto infatti pressoché stabile per tutta la du­

rata dell'osservazione, nonostante le varia­zioni esterne.

In conclusione si può affermare che la Costituzione da un punto di vista biologico versa in buona salute ma mostra i segni del tempo da un punto di vista chimico.

Ulteriori indagini potrebbero essere ef­fettuate per valutare altri parametri chimici, che insieme al pH dovrebbero essere mo­nitorati nel tempo per scongiurare il de­grado fisico della carta.

Anche l'ambiente che circonda il manu­fatto mostra diverse criticità: ai fini della sua ottimale conservazione si dovrebbe consi­derare l'opportunità di spostare il manu­fatto in un locale meno frequentato, soggetto a climatizzazione e a trattamento dell'aria.

Aknowledgments: si ringrazia il sovrin­tendente dell'Archivio Centrale dello Stato Dott. Agostino Attanasio per l'accesso ai do­cumenti e il Dott. Gianfranco Filippini del Dipartimento di Scienze Agrarie dell'Univer­sità di Bologna per il supporto tecnico. •

©Riproduzione riservato

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