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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA
FACOLTÀ DI AGRARIA
Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali
TESI DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE AGRARIE
Diagnosi molecolare e associazione di funghi di azzurramento del legno a insetti vettori in pinete
alpine
Relatore:
Prof. Andrea Battisti
Correlatore:
Dott. Massimo Faccoli
Dott.ssa Caterina Villari
Laureando:
Andrea Basso
Matricola n. 577845
ANNO ACCADEMICO 2010 - 2011
i
ii
Indice
Pag.
Riassunto ..................................................................................................................................... 1
Abstract ....................................................................................................................................... 2
1. La simbiosi ....................................................................................................................... 3
1.1. Ips acuminatus ............................................................................................................. 5
1.2. Funghi di azzurramento associati ................................................................................ 9
1.2.1. Ambrosiella macrospora ........................................................................................ 9
1.2.2. Ophiostoma ips e Ophiostoma brunneo-ciliatum................................................ 10
1.3. Danni economici da funghi di azzurramento ............................................................. 12
2. Obiettivi della tesi ......................................................................................................... 13
3. Materiali e metodi ......................................................................................................... 14
3.1. Estrazione e quantificazione del DNA ........................................................................ 16
3.2. Verifica della specificità dei primers .......................................................................... 17
3.3. Analisi dei campioni ................................................................................................... 20
3.4. Prova di sensibilità ..................................................................................................... 21
3.5. Analisi statistica ......................................................................................................... 22
4. Risultati .......................................................................................................................... 23
4.1. Quantificazione e diluizione del DNA ........................................................................ 23
4.2. Verifica della specificità dei primers .......................................................................... 23
4.3. Prova di sensibilità ..................................................................................................... 23
4.4. Risultati Nested PCR .................................................................................................. 24
5. Discussione e Conclusione ............................................................................................ 34
6. Bibliografia .................................................................................................................... 36
Ringraziamenti .......................................................................................................................... 43
1
Riassunto
Il presente lavoro, svolto presso i laboratori del Dipartimento di Agronomia
Ambientale e Produzioni Vegetali, situato nel campus di Agripolis, si pone l‟obiettivo
di studiare, tramite l‟utilizzo di tecniche molecolari, la composizione della flora
fungina associata ad Ips acuminatus nelle popolazioni dell‟arco alpino. Questo piccolo
scolitide, infatti è tipicamente associato a tre specie fungine: Ophiostoma brunneo-
ciliatum, O. ips e Ambrosiella macrospora.
In particolare, in questo lavoro si è cercato di mettere appunto una reazione di PCR di
tipo “Nested” per poter determinare la frequenza delle specie associate presenti
sull‟esoscheletro dell‟insetto, amplificando solo i funghi di interesse. I campioni sono
stati raccolti da due piante in sei diverse località dell‟arco alpino; il DNA fungino è
stato estratto mediante un protocollo di salting out per i campioni museali e quindi
amplificato mediante primers specifici. I risultati sono stati resi visibili con una corsa
elettroforetica e quindi analizzati statisticamente per mezzo di un modello lineare
generalizzato ad effetti misto. L‟analisi ha potuto riguardare solo una delle due specie
di Ophiostoma in quanto la reazione di Nested PCR non è risultata specifica per O.
brunneo-ciliatum.
L‟analisi statistica mostra come la specie A. macrospora sia significativamente più
presente rispetto O. ips. I risultati sono stati analizzati anche tenendo conto del sesso
dell‟insetto e del sito da cui provenivano i campioni, non trovando però differenze
significative. I risultati possono essere interpretatoi come una maggiore necessità da
parte dello scolitide di avere una simbiosi trofica, piuttosto che una simbiosi con un
fungo di azzurramento, coinvolto nel facilitare il successo dell‟attacco deprimendo le
difese degli alberi. La simbiosi trofica infatti è molto importante per lo sviluppo delle
larve.
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Abstract
This work, done in the laboratories of the Department of Environmental Agronomy
and Crop Science, located on the campus of Agripolis, aims at studying, using
molecular techniques, the composition of fungi associated to Ips acuminatus in in
several sites of the Alps. According to literature, this bark beetle is typically associated
with three fungal species: Ophiostoma brunneo-ciliatum, O. ips and Ambrosiella
macrospora.
In particular, this work uses a Nested PCR technique to characterize the frequency of
associated species on the insect, only amplifying the species of interest. Samples were
collected from two plants in six different locations, the fungal DNA was extracted
using a salting out protocol for the museum samples and then amplified using specific
primers. The results were visualized with electrophoresis and then analyzed using a
generalized linear mixed model. The analysis has concerned only one of the two
species of Ophiostoma because the primers designed for O. brunneo-ciliatum turned
out to be unspecific in the Nested PCR reaction.
The statistical analysis showed that A. macrospora is significantly more associated to
Ips acuminatus than O. ips. The results were also analyzed taking into account the sex
of the insect and the site from which the samples but no significant differences were
found. This can be explained as a greater need by the beetle to have a trophic
symbiosis, rather than a symbiosis with a blue stain fungus, as Ambrosiella provides
food for the larvae while Ophiostoma may reduce the tree defenses and facilitate the
colonization of the bark by the beetle. The trophic symbiosis is indeed very important
for the development of the larvae.
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Introduzione
1. La simbiosi
La simbiosi è una stretta relazione di carattere biologico che può instaurarsi tra due o
più individui. In particolare la simbiosi è di tipo mutualistico quando ognuno degli
organismi coinvolti trae beneficio dalla presenza degli altri, senza però recare danno a
quest‟ultimo.
Il mutualismo è una condizione altamente diffusa tra gli esseri viventi e coinvolge
organismi appartenenti a tutti i regni dei viventi. È provato inoltre che molte di queste
simbiosi sono necessarie per la sopravvivenza stessa degli organismi coinvolti
(Douglas, 2003).
Si sente molto spesso parlare di simbiosi fungo-pianta e in particolare si citano spesso
le relazioni che avvengono tra organismi fotosintetici e funghi come micorizze e
licheni, ma la simbiosi tra fungo e animale viene sempre meno menzionata e di solito
si pensa a tale rapporto solo come ad un rapporto ospite-parassita. Tuttavia tali
relazioni sono molteplici e il più delle volte non completamente note.
Un esempio di questo tipo di simbiosi, noto da tempo, è quella che si instaura tra
numerose specie di insetti scolitidi e funghi. Questo tipo di simbiosi è ben descritto in
letteratura, ad esempio da Schmidberger e da Hartig.
Fra gli scolitidi simbionti si distinguono due gruppi, in base all‟ambiente di crescita e
alle abitudini alimentari delle larve, fattori da cui deriva la necessità o meno della
simbiosi.
Il primo gruppo, detto “lignicolo dell‟ambrosia” o “xylomycetopagous”, nel quale
rientra anche un platipodide, si accresce nei tessuti del legno (Kirisits, 2004), ma non è
in grado di digerire lignina, cellulosa ed emicellulosa. Per ottenere il nutrimento
necessario allo sviluppo, quindi, hanno sviluppato una simbiosi con dei funghi
dell‟ambrosia, che si sviluppano all‟interno delle gallerie scavate dall‟insetto. Durante
il suo sviluppo l‟insetto si alimenta del micelio e delle spore fungine, ottenendo così un
alimento ad alto valore nutritivo. In questo caso, quindi, la simbiosi è necessaria per la
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vita dell‟insetto, e le specie che posseggono tale tipo di simbiosi hanno spesso
sviluppato un modo per trasportare i funghi associati, e cioè all‟interno di strutture
tegumentali specializzate dette micangi. Queste strutture, associate ad apposite
ghiandole secernenti sostanze utili alla sopravvivenza del fungo, consentono inoltre di
effettuare una selezione dei microrganismi trasportati, favorendo le specie
mutualistiche a quelle neutrali o detritivore (Beaver, 1989, Paine et al.,1997; Kirisits,
2004; Batra 1967).
I micangi possono essere dislocati in varie parti del corpo, dalla testa, al torace,
all‟addome.
Il secondo gruppo, più consistente del primo, è detto “corticicolo” o “phloeophagus” e
si accresce nel floema di latifoglie e conifere, alimento già di per sé sufficientemente
ricco da non rendere necessaria per l‟alimentazione dell‟insetto l‟associazione con le
specie fungine. In questo caso, quindi, la simbiosi è di tipo facoltativo. Ciononostante,
l‟associazione tra scolitidi corticicoli e funghi, soprattutto quelli appartenenti al gruppo
degli Ophiostomatoidi, è molto comune, dal momento che comunque fornisce un
notevole vantaggio. In questo caso infatti, più che per scopo nutritivo, l‟insetto ha
sviluppato la simbiosi con il fungo affinché questi interagisca con le difese dell‟ospite
indebolendole. Considerando che il successo della colonizzazione delle conifere da
parte degli scolitidi dipende in gran parte dalla loro capacità di superare la soglia
critica oltre la quale le difese dell‟ospite sono sopraffatte, l‟associazione con funghi
patogeni in grado di alterare le difese dell‟ospite e abbassare tale soglia è molto utile
per l‟insetto (Paine et al., 1997; Franceschi et al., 2005; Villari, 2008). Negli scolitidi
corticicoli i propaguli fungini non sono necessariamente trasportati in strutture
specifiche, ma possono semplicemente aderire al corpo dell‟insetto con varie modalità,
ad esempio a contatto con peli, setole, appendici boccali oppure nelle piccole
inflessioni dell‟esoscheletro (Webber e Gibbs, 1989).
In entrambe le tipologie di simbiosi, l‟associazione con gli scolitidi porta dei vantaggi
per la diffusione dei funghi ed il loro ingresso nei tessuti sottocorticali. A
dimostrazione di ciò si può considerare il fatto che le specie appartenenti al gruppo
degli Ophiostomatoidi, tipicamente associati agli insetti, producono sostanze volatili
attrattive per gli scolitidi ed hanno evoluto adattamenti morfologici, quali ascospore
adesive e periteci generalmente a collo lungo, proprio per facilitare l‟adesione dei
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propaguli al corpo dei vettori (Beaver, 1989). Le ascospore di questi funghi, inoltre,
spesso possiedono pareti particolarmente sviluppate, adatte a resistere alla digestione
nello stomaco degli scolitidi (Malloch e Blackwell, 1993).
1.1. Ips acuminatus
Il coleottero scolitide Ips acuminatus (Gyllenhal), comunemente noto come bostrico
acuminato, è fra i più comuni agenti parassitari che approfittano del deperimento delle
pinete alpine. È una specie paleartica che tra gli anni ‟70 e „80 ha causato ingenti
danni a vasti popolamenti di pino silvestre in Svezia e Norvegia (Stergulc e
Frigmelica, 1996). È presente in Asia minore, Georgia, parte della Siberia, Giappone e
Cina. Fino alla metà del „900 era considerato privo di interesse selvicolturale, ma a
causa dei forti danni economici indotti dalle prime infestazioni, si è cominciato a
prestarvi una forte attenzione (Ferraro, 2010). Questo insetto è grande solo pochi
millimetri e colonizza la parte medio - alta dei tronchi di pini continentali, con
preferenze verso il Pino silvestre, prediligendo piante già indebolite per vari motivi,
come l‟eccesiva densità del bosco, la siccità estiva, gli inverni particolarmente caldi e
siccitosi o le carenze nutritive (Faccoli et al., 2010).
Possiede una corazza chitinica a forma cilindrica di colore marrone scuro, le elitre
sono rosso brune e il declivio lucido (Fig. 1a). Si riconosce dalle altre specie di Ips per
le piccole dimensioni e per la presenza di tre denti ai bordi di ognuno dei due declivi:
nei maschi quello più in basso è a due punte mentre nelle femmine, leggermente più
grandi, tutti i denti sono semplici (Fig. 1b) (Nierhaus-Wunderwald e Forster, 2000).
La colonizzazione di una nuova pianta inizia nel periodo primaverile con l‟arrivo del
maschio che fora la corteccia e comincia a costruire una spaziosa camera nuziale
attirando numerose femmine attraverso la produzione di feromoni di aggregazione.
Queste vengono progressivamente fecondate, e a seconda del numero, vengono scavate
e ampliate delle gallerie, larghe 2-3 mm e lunghe fino a 40 cm, a forma di stella che,
vengono fornite di numerosi fori di aerazione (Fig. 1c). Da queste gallerie materne si
ramificano corte gallerie larvali dove, nella parte più distale, si impupa la nuova
generazione. Nell‟arco di un anno si hanno fino a due generazioni. La prima
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generazione sfarfalla piuttosto velocemente e sverna in nuove piante, nelle gallerie
dove si nutre, mentre la seconda, che avviene solo nel caso in cui il clima sia caldo e
secco, sverna come giovane adulto nelle gallerie in cui nasce, per poi sfarfallare
durante la successiva primavera (Nierhaus-Wunderwald e Forster, 2000).
Gli attacchi portano rapidamente a morte le piante, che nel giro di poche settimane
presentano chiome rosseggianti a seguito del disseccamento degli aghi (Fig. 2). Inoltre,
sebbene le gallerie materne e larvali incidano il legno solo superficialmente, il
materiale infestato subisce un danno tecnologico dovuto all‟invasione dell‟alburno da
parte di funghi simbionti agenti di azzurramento (Faccoli et al., 2010) (Fig. 2). I.
acuminatus è infatti una specie fleomicetofaga, regolarmente associata con tre
principali specie fungine: Ophiostoma brunneo-ciliatum, O. ips e Ambrosiella
macrospora. Le prime due specie sono patogene e interagiscono con le difese della
pianta limitando la possibilità di questa di difendersi dagli attacchi dello scolitide
(Lieutier et al. 1991). A. macrospora è invece un fungo dell‟ambrosia, fondamentale
per l‟alimentazione delle larve ma non patogeno per la pianta (Francke-Grosmann
1952), che viene trasportato dalle femmine all‟interno di micangi mandibolari.
La pericolosità di I. acuminatus sembrerebbe quindi strettamente legata alla presenza
di tali simbiosi, anche se i funghi trasportati non sono patogeni aggressivi.
Un‟eccessiva aggressività del fungo, infatti, porterebbe ad una riduzione troppo veloce
della quantità e qualità dell‟alimento disponibile per le larve. L‟insetto attacca
principalmente piante già indebolite, diffondendosi a macchia di leopardo, e
l‟infestazione nel giro di pochi anni può interessare anche un migliaio di alberi; il
paesaggio quindi può apparire molto deturpato a causa delle vistose aree rossastre che
si espandono nelle vallate (Dal Pont, 2008) (Fig. 2).
Gli attacchi sulle piante sane invece sono più rari e si manifestano solo in caso di forti
infestazioni: i pini dapprima reagiscono producendo resina, poi con l‟arrivo di nuovi
individui non sono più in grado di tollerare l‟attacco (Ferraro, 2010).
I danni prodotti dallo scolitide in assenza di interventi si ripercuotono sulla stabilità del
terreno e sulla suscettibilità agli incendi boschivi. Infatti nelle aree boscose colpite, si
formano delle vaste aree vuote che aumentano il rischio di frane e valanghe oltre a
provocare una sorta di mosaico in cui si alternano boschi sani e boschi morenti, con
delle visibili “ferite” all‟insieme del paesaggio montano.
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Oltre a ciò è rilevante anche il danno economico, in particolare per i proprietari dei
boschi infestati i quali perdono una grande quantità di legname, non più utilizzabile.
Negli anni scorsi, i censimenti condotti sulle pinete alpine mostrano come le
infestazioni da bostrico acuminato siano in continua espansione.
Figura 1: a) Ips acuminatus; b) Ips acuminatus (maschio e femmina); c) sistema di gallerie.
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Figura 2: a) Sondalo (Val di Rezzalo) 11 agosto 2005 b) Bormio (Reit - zona Gesa Rota), 11 agosto 2006
9
1.2. Funghi di azzurramento associati
I generi Ophiostoma e Ambrosiella appartengono alla divisione degli Ascomycota, tra
i quali troviamo anche tartufi, lieviti e Penicilline. Producono spore in un caratteristico
tipo di sporangio chiamato asco, cellula nella quale avviene la meiosi e che
successivamente contiene le meiospore. Gli aschi sono spesso contenuti in corpi
fruttiferi chiamati ascocarpi. Molti Ascomycota sono costituiti da ife, sottili, filamenti
di cellule spesso con uno spessore di solo 5 µm, che si diramano ripetutamente fino a
formare un intricato gomitolo, il micelio. La parete cellulare degli Ascomycota è fatta
quasi sempre di chitina e β-glucani; le singole cellule sono divise tra loro da pareti
trasversali dette setti. Questi danno all'ifa stabilità e prevengono una grossa perdita di
citoplasma nel caso in cui la membrana cellulare dovesse lacerarsi in qualche punto.
Ciò fa in modo che gli Ascomycota possano conservarsi, contrariamente ad altre
divisioni di funghi che prediligono l'umidità, anche in ambienti secchi (Whittaker,
1959).
1.2.1. Ambrosiella macrospora
Ambrosiella macrospora (Fr.-Grosmann) Batra, è un fungo dell‟ambrosia tipicamente
associato a I. acuminatus, il cui nome è proprio dovuto alle notevoli dimensioni delle
spore. È fondamentale per l‟alimentazione della larva dell‟insetto ma non patogeno per
la pianta; infatti fornisce all‟insetto tutti i nutrienti di cui ha bisogno per crescere e
svilupparsi in un ambiente notoriamente povero di sostanze facilmente assimilabili,
come il legno.
A. macrospora viene trasportato da una pianta all‟altra dall‟insetto, all‟interno di
micangi mandibolari, e sul nuovo ospite si innesta nelle ferite fresche delle gallerie
appena scavate, colonizzando e sviluppandosi nel floema e nei tessuti circostanti le
gallerie, facendogli assumere un caratteristico colore nerastro; con il tempo arriva a
formare una sottile palizzata lungo tutti i tunnel e le celle larvali prodotte dal bostrico
acuminato.
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Molti funghi dell‟ambrosia sono dimorfici, cioè presentano sia una fase miceliale sia
una fase sottoforma di lievito, o germinativa, che è la forma principale in cui A.
macrospora si trova nelle gallerie del bostrico acuminato. All‟analisi microscopica A.
macrospora si presenta ialino con ife settate. Le conidiospore sono globose o
subglobose e possono essere ramificate (Batra, 1967).
1.2.2. Ophiostoma ips e Ophiostoma brunneo-ciliatum
Ophiostoma ips (Rumb.) Nannf. e O. brunneo-ciliatum (Math.) sono funghi
debolmente patogeni, appartenenti alla categoria dei funghi di azzurramento (Fig. 3).
Questi funghi penetrano nella pianta durante la colonizzazione dell‟insetto e
interagiscono con le difese costitutive e indotte dell‟ospite, alterandone l‟efficacia
(Paine et al., 1997; Franceschi et al., 2005).
L‟inoculo penetra nell‟ospite grazie all‟attacco di I. acuminatus che funge da vettore,
si sviluppa nelle regioni esterne del tronco (cambio e alburno) e comincia a colonizzare
il sistema vascolare (Ghaioule et al., 2007), producendo enzimi litici e assorbendo
sostanze nutritive direttamente dal parenchima della pianta (Lieutier, 2004; Kirisit,
2004) senza mai andare ad intaccare il cuore del legno. (Ghaioule et al., 2007). La
colonizzazione del sistema vascolare si traduce in una riduzione della conducibilità
idrica della pianta che, a seconda della densità dell‟impianto fungino, può arrivare
anche al 60%. Sebbene questo valore possa sembrare elevato, non è sufficiente a
portare a morte la pianta, confermando quindi la debole patogenicità degli
ophiostomatoidi in questione (Guérard et al., 2000). I funghi del genere Ophisotama
associati ad insetti vettori sporulano direttamente all‟interno delle gallerie scavate dallo
scolitide il quale, nel periodo antecedente lo sfarfallamento, si imbratta con le spore,
trasportandole successivamente da un ospite all‟altro (Zhoul et al., 2002).
Gli ophiostomatoidi rappresentano una delle più importanti categorie dei funghi
infestanti; oltre a sfruttare il trasporto dei vettori, infatti, possono diffondersi attraverso
il commercio del legno non trattato e quindi coprire distanze considerevoli sfruttando
l‟esportazione di legname.
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A causa della morfologia relativamente semplice e le caratteristiche simili tra le
diverse specie, risulta spesso difficile distinguere i diversi ophiosotomatoidi
esclusivamente su basi morfologiche. L‟utilizzo di tecniche DNA-based è quindi
diventato indispensabile per un‟identificazione affidabile (Gorton et al., 2004;
Grobbelaar et al., 2009).
Morfologicamente O. ips presenta ife di colore scuro e un peritecio nero con base
globosa circondata da ife asettate di colore grigio chiaro. L‟ostiolo è privo di ife
ostiolari; le ascospore, ialine, asettate e di sezione quadrangolare, sono immerse in una
sostanza mucillaginosa per facilitare l‟adesione alla superficie dell‟insetto vettore.
Possiede tre forme anomorfe appartenenti ai generi Pesotum, Leptographium e
Hylorhinocladiella (Hunt, 1956; Upadhyay, 1981; Zhou et al., 2004b; Davidson,
1978). Questo fungo si insedia preferibilmente nei raggi del parenchima dove risulta
più facile invadere i dotti resiniferi da cui trae nutrimento (Lieutier et al., 2007).
O. ips è anche associato a numerosi altri insetti di interesse forestale come Ips
sexdentatus, Hylates ater, Orthotomicus laricis, Orthotomicus proximus, e varie specie
del genere Tomicus.
O. brunneo-ciliatum, invece, è associato solo a Ips amitinus, Ips cembrae ed Ips
sexdentatus, oltre che ad Ips acuminatus. E‟caratterizzato da ife inizialmente color
bianco crema, che si scuriscono con l‟età fino a diventare di colore scuro. La forma
teleomorfa è caratterizzata da periteci di colore nero con un collo molto allungato.
L‟apertura ostiolare è adornata da ife di colore bruno, curvate a spirale. La forma
anamorfa presenta conidiofori del genere Grapium, dalla tipica forma a pennello. I
conidi hanno sezione rettangolare e con la maturazione si posizionano lateralmente
rispetto all‟apice delle cellule conidiogene (Wingfield et al., 1993, Yamoaka et al.,
1998).
Ognuna di queste specie predilige alberi forestali, tra cui larici, diverse specie di pino
e abete rosso (Kirisit 2004).
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1.3. Danni economici da funghi di azzurramento
I funghi dell'azzurramento generano nel legno una colorazione che varia dal grigio
chiaro al blu nerastro (l'intensità del colore dipende dall'umidità del legno e dalla
profondità degli strati infestati). Non modificano le caratteristiche meccaniche del
legno (non viene distrutta la parete cellulare), ma limitano l'utilizzo di manufatti a
vista in quanto esteticamente sgradevoli. Ciò porta a un deprezzamento degli
assortimenti ricavabili (Nierhaus-Wunderwald e Forster, 2001).
Oltre a essere antiestetico, l‟azzurramento causa una serie di problemi anche per
quanto riguarda i trattamenti che vengono eseguiti sul legname. Infatti in caso di
verniciatura su legno infestato, nel giro di pochi anni, si ha uno scrostamento
progressivo della pittura. Gli strati colpiti dai funghi, inoltre, penetrano
abbastanza in profondità, non permettendone l‟eliminazione.
Sintomi dell‟azzurramento del legno appaiono durante il periodo primaverile –
estivo e si manifestano come ingiallimento e arrossamento generalizzato alle
chiome, spesso associati ad attacchi di scolitidi. Scortecciando il tronco si
osservano striature e/o macchie azzurrognole che interessano il legno giovane
(Fig. 3c) e si spingono in profondità lungo i raggi midollari. Il sintomo è più
evidente nelle sezioni trasversali di fusti tagliati (Fig. 3a).
Figura 3: a) sezione di tronchi; b) chiome di alberi; c) tronco; colpiti da azzurramento.
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2. Obiettivi della tesi
Questa tesi di laurea è inserita in un progetto più ampio che ha lo scopo di
approfondire le conoscenze riguardo alcuni aspetti della simbiosi tra Ips
acuminatus e dei funghi ad esso associati, al fine di comprendere quali sono i
fattori chiave che hanno portato ad un incremento demografico dell‟insetto in
molte località alpine.
In particolare, la tesi si pone l‟obiettivo di studiare, tramite l‟utilizzo di tecniche
molecolari, la composizione della flora fungina associata ad I. acuminatus nelle
popolazioni dell‟arco Alpino.
Le analisi condotte hanno indagato: la presenza delle specie Ophiostoma brunneo-
cliatum, Ophiostoma ips e Ambrosiella mascorpora (i); l‟esistenza di una
differenza della composizione della flora in base al sesso del vettore (ii);
l‟esistenza di una differenza della composizione della flora in base alla località
(iii).
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3. Materiali e metodi
Tutte le attività riguardanti questo caso di studio sono state svolte presso i
laboratori del DAAPV (Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni
Vegetali), nell‟istituto di Entomologia Agraria situato nel campus di Agripolis
(Viale dell‟Università, 16 – 35020 Legnaro PD).
I campioni utilizzati in questa tesi derivano da un campionamento svolto
nell‟inverno 2008-2009, nel corso di un precedente caso di studio. In totale sono
stati analizzati 217 campioni provenienti da 6 diverse località: Val Dogna (UD),
Cortina d‟Ampezzo (BL), ValVenosta (BZ), Valcamonica (BS), Valtellina (SO) e
Brusson (AO) (Fig. 4); per ogni località sono state scelte due piante provenienti da
due siti separati, e sono stati analizzati 10 maschi e 10 femmine a pianta (per un
totale di 40 insetti a località). Unica eccezione Brusson (AO), dove è stata scelta
esclusivamente una pianta, dal quale sono stati analizzati 7 femmine e 10 maschi
(per un totale di 17 insetti). La nomenclatura adottata per i campioni è riportata in
Tabella 1.
Figura 4: Siti di cattura dei campioni
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Codice Provenienza Pianta
A Val Dogna 1
B Val Dogna 2
C Val Venosta 1
D Val Venosta 2
E Valcamonica 1
F Valcamonica 2
G Cortina 1
H Cortina 2
I Valtellina 1
L Valtellina 2
M Brusson 1
Tabella 1: Schema nomenclatura campioni.
Per l‟individuazione del DNA delle tre specie fungine associate ad Ips acumintus
sono state utilizzate tre coppie di primers specie specifiche recentemente
disegnate dal gruppo di ricerca del dipartimento (Tab. 2), ciascuna delle quali
amplifica un frammento di circa 200 pb all‟interno della regione codificante per la
-tubulina, subunità che costituisce le strutture del citoscheletro. L‟analisi molecolare
è stata effettuata tramite Nested PCR, tecnica nettamente più sensibile rispetto ad
una PCR classica, che invece non è sufficientemente sensibile per questo tipo di
analisi.
Target Primer sequenza 5' - 3' Lunghezza
(nt)
%G
C
Ambrosiella
macrospora
AM f CTTGTCTTACACACCTCGAC 20 45
AM r CATGTTAGTTTCGCACATCC 20 40
Ophiostoma
ips
Oips f CTGGCACGACAACCGTGTAAC 21 57,1
Oips r CTGACCGAAAGGACCGGCAC 20 65
Ophiostoma
brunnneo-
ciliatum
OBC f TGTTGGACGTTGGACGCC 18 61,1
OBC r AAGTTGTCGGGGCGGAAC 18 61,1
Tabella 2: sequenze nucleotidiche dei primers utilizzati.
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3.1. Estrazione e quantificazione del DNA
L‟estrazione del DNA dei campioni è stata effettuata utilizzando un protocollo messo a
punto per i campioni museali (Gilbert et al., 2010).
Tale protocollo, infatti, non prevede la macinazione del campione e permette quindi
l‟estrazione del DNA fungino presente sulla superficie esterna dell‟insetto limitando
l‟estrazione del DNA di quest‟ultimo alle sole cellule epiteliali. Questo al fine di
limitare la presenza di materiale genetico estraneo all‟analisi e migliorarne quindi la
sensibilità.
Primo giorno
- Preriscaldare il bagnetto termostatico a 55°C;
- Mettere in una eppendorf da 1,5 ml 157 l di buffer di estrazione
(composizione: 3 mM CaCl2, 2% SDS, 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl pH 8,
a concentrazione finale);
- Aggiungere 6,3 l di DTT 1M (40 mM a concentrazione finale);
- Aggiungere 2 l di proteinasi K;
- Aggiungere il campione;
- Incubare overnight a 55°C.
Secondo giorno
- Togliere il campione dalla soluzione;
- Aggiungere 2 l di RNAsi e lasciare agire per 1-2 minuti a temperatura
ambiente;
- Aggiungere 40 l di soluzione satura di NaCl (> 6 M);
- Vortexare per 20 minuti;
- Centrifugare a 14000 rpm per 30 minuti;
- Trasferire il supernatante in una nuova eppendorf;
- Aggiungere un volume (200 l) di isopropanolo a -4°C;
- Far precipitare il DNA centrifugando a 14000 rpm a 4°C per 20 minuti;
- Scartare il supernatante;
- Lavare il pellet con 500 l di etanolo al 70%;
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- Scartare il supernatante;
- Asciugare il pellet in una pompa a vuoto per 15-30 minuti;
- Risospendere il DNA con 20 l di H2O sterile.
L‟utilizzo della proteinasi K serve a rompere l‟involucro proteico che protegge il
materiale genetico sull‟esoscheletro del campione. L‟utilizzo dell‟ RNAsi serve invece
per eliminare l‟RNA che altrimenti interferirebbe con la successiva reazione di PCR,
formando dimeri di RNA-DNA e duplex aspecifici. Le centrifugazioni in serie servono
per separare le proteine, l‟RNA degradato e le soluzioni tampone dal DNA, mentre
l‟utilizzo della pompa a vuoto permette di asciugare completamente il campione da
isopropanolo ed etanolo, necessari per la purificazione del DNA, ma che potrebbero
inibire la successiva reazione della polimerasi.
La concentrazione del DNA così estratto, diluito 1:50, è stata quantificata mediante
l‟utilizzo di uno spettrofotometro BioMate 3, basandosi sul fatto che in una cuvetta con
il cammino ottico di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50 g/ml
ha un assorbimento a 260 nm pari a 1. Utilizzando la media di tre letture, i campioni
sono stati portati ad una concentrazione finale di 10 ng/l.
3.2. Verifica della specificità dei primers
Prima di procedere con l‟analisi dei campioni è stato necessario verificare che i
primers, specifici in PCR classica, mantenessero la loro specificità anche durante la
reazione di Nested PCR. Tale tecnica, infatti, essendo molto più sensibile rispetto ad
una PCR classica, può presentare problemi legati al verificarsi di falsi positivi. A tal
fine è stata quindi effettuata una prova di specificità utilizzando DNA estratto da
specie fungine filogeneticamente vicine alle specie analizzate, oltre che da una colonia
batterica, da alcune delle specie fungine più comunemente associate al genere Pinus e
da alcune specie facilmente reperibili in foresta (Tab. 3). Come controllo negativo è
stata utilizzata H2O UHQ (Ultra High Quality).
18
Specie utilizzate nella prova di specificità
Ambrosiella macrospora
Ophiostoma ips
Ophiostoma brunneo-ciliatum
Leptographium serpens
Leptographium procerum
Leptographium wingfieldii
Leptographium lundbergii
Leptographium pityophilum
Sphearopsis sapinea
Diplodia scrobiculata
Ustulina deusta
Biscogniauxia mediterranea
Heterobasidion annosum
Heterobasidion abietinum
Bacillus pumilis
Tabella 3: Specie fungine e batteriche utilizzati nella prova di specificità dei primers.
La prima reazione di PCR è stata eseguita in un volume di 15μl, costituito da 2μl di
DNA stampo e 13μl di mix (Tab. 4). In questa prima reazione è stata utilizzata una
coppia di primers generici per le specie fungine, che amplifica la regione della -
tubulina all‟interno della quale sono state disegnate le tre coppie di primers specie
specifici (Bt2a, Bt2b, Glass e Donaldson, 1995).
Mix di reazione per 1 campione Concentrazione Volume (l)
Buffer 5X 3
MgCl2 25 mM 1,2
dNTPs 2 mM 0,7
Primer Bt2a 10 M 0,3
Primer Bt2b 10 M 0,3
Taq 5 U/l 0,1
DMSO 5% 0,6
H20 UHQ 6,8
DNA 10 ng/l 2
Totale 15
Tabella 4: Mix di reazione utilizzato nella prima PCR del protocollo Nested.
19
Il ciclo di reazione nel termociclatore (Eppendorf Mastercycler gradient) è stato:
L‟amplificato ottenuto è stato diluito 1/100 ed è stato utilizzato nelle tre successive
reazioni di PCR, ciascuna eseguita in un volume di 15μl, costituito da 1μl di
amplificato diluito e 14μl di mix (Tab. 5).
Ognuna delle tre coppie di primers specie specifiche (OBC f e OC r; AM f e AM r;
Oips f e Oips r) è stata utilizzata in una reazione separata.
Mix di reazione per 1 campione Concentrazione Volume (l)
Buffer 5X 3
MgCl2 25 mM 1
dNTPs 2 mM 0,6
Primer forward 10 M 0,3
Primer reverse 10 M 0,3
Taq 5 U/l 0,1
H20 UHQ 8,7
Prodotto di PCR 1/100 1
Totale 15
Tabella 5: Mix di reazione utilizzato nella seconda PCR del protocollo Nested.
20
In questo caso, il ciclo di reazione nel termociclatore è stato:
In particolare, per la coppia di primers specifica per A. macrospora la temperatura di
annealing è stata 62°C, per la coppia specifica per O. ips la temperatura è stata 65°C,
mentre per la coppia di primers specifica per O. brunneo-ciliatum, la temperatura è
stata di 67°C.
Il risultato della reazione è stato controllato tramite elettroforesi a 70V per 30minuti su
gel d‟agarosio 2% contenente lo 0,007% di Sybr Safe (InvitrogenTM, SYBR® Safe
DNA gel stain). In ogni pozzetto sono stati caricati 4μl di prodotto di amplificazione e
1μl di una soluzione di colorante e glicerolo. Il glicerolo serve per appesantire i
campioni ed evitare che fuoriescano dai pozzetti. Il colorante serve per poter
monitorare in tempo reale il procedere dell‟elettroforesi. Come marker sono stati
utilizzati 4 μl di 1KB (EuroClone®, Sharp MassTM 1 kb, DNA Ladder) .
3.3. Analisi dei campioni
Dato che la verifica della specificità dei primers ha dato esito positivo solo per le
coppie AM f-AM r e Oips f -Oips r, l‟analisi sui campioni è stata eseguita
esclusivamente con questi primers, tralasciando per il momento l‟analisi
dell‟associazione Ips acuminatus – Ophiostoma brunneo-ciliatum.
Ognuno dei 217 campioni è stato analizzato utilizzando il protocollo descritto nel
paragrafo precedente. In ogni reazione, come controllo positivo per la rispettiva coppia
di primers, è stato utilizzato il DNA estratto da due isolati certificati (ente certificatore:
Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht): A. macrospora CBS367,53 e O. ips
CBS137,36. Come controllo negativo è stata utilizzata H2O UHQ.
21
Anche in questo caso il risultato della reazioni è stato controllato tramite elettroforesi a
70V per 30 minuti su gel d‟agarosio 2% contenente lo 0,007% di Sybr Safe. Così
come per la prove precedenti, in ogni pozzetto sono stati caricati 4μl di prodotto di
amplificazione e 1μl di una soluzione di colorante e glicerolo. Come marker sono stati
utilizzati ogni volta 4 μl di 1KB.
3.4. Prova di sensibilità
Al fine di confrontare il limite di sensibilità della reazione di Nested PCR rispetto ad
una reazione di PCR classica, è stata effettuata una prova nella quale è stata ricercata la
minima quantità di estratto amplificabile con le due diverse reazioni. Il DNA fungino
estratto dalle colonie certificate è stato diluito 1/10, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500 ed
1/1000, e tali diluizioni sono state utilizzate in una PCR classica eseguita con primers
specifici per una e l‟altra specie utilizzando, il seguente ciclo di reazione nel
termociclatore:
Questa reazione è stata eseguita in un volume di 15μl, costituito da 2μl di DNA stampo
e 13μl di mix (Tab. 6).
22
Mix di reazione per 1 campione Concentrazione Volume (l)
Buffer 5X 3
MgCl2 25 mM 1
dNTPs 2 mM 0,6
Primer forward 10 M 0,3
Primer reverse 10 M 0,3
Taq 5 U/l 0,1
H20 UHQ 7,7
DNA 2
Totale 15
Tabella 6: Mix di reazione utilizzato nella PCR della prova di sensibilità.
Le stesse diluizioni di DNA sono state quindi usate per una Nested PCR eseguita con il
protocollo descritto nel paragrafo 3.2. La prima reazione di PCR per questa prova è
stata eseguita in un volume di 15μl, costituito da 2μl di DNA stampo e 13μl di mix
(Tab. 4); l‟amplificato ottenuto è stato diluito 1/100 ed è stato utilizzato nelle due
successive reazioni di PCR, ciascuna eseguite in un volume di 15μl, costituito da 1μl di
amplificato diluito e 14μl di mix (Tab. 5).
Ognuna delle due coppie di primers specie specifiche (O. ips f e O. ips r; AM f e AM
r) è stata testata separatamente.
Il risultato di entrambe le reazioni (PCR classica e Nested PCR) sono stati controllati
tramite elettroforesi a 70V per 30 min. su gel d‟agarosio 2% contenente lo 0,007% di
Sybr Safe. In ogni pozzetto sono stati caricati 4μl di prodotto di amplificazione e 1μl di
colorante e glicerolo. Come marker sono stati utilizzati 4μl di 1KB.
3.5. Analisi statistica
I dati sono stati analizzati statisticamente per mezzo del modello lineare generalizzato
ad effetti misto (GLMM). Il modello utilizza la presenza/assenza del fungo come
variabile risposta, genere e specie (O. ips vs. A. macrospora) come fattori fissi e
insetto, albero e sito come fattori random. L‟analisi statistica è stata eseguita per mezzo
del software R versione 2.12.1.
23
4. Risultati
4.1. Quantificazione e diluizione del DNA
Dalle analisi compiute con lo spettrofotometro è emerso che i valori del rapporto
dell‟assorbanza a 260 e 280 nm sono compresi nell‟intervallo 1.6-2.0, indice della
buona riuscita dell‟estrazione del DNA. Basandosi quindi sulla media delle tre letture
ottenute dallo strumento, il DNA di tutti i campioni e stato portato alla concentrazione
di 10 ng/l (Tab. 9).
4.2. Verifica della specificità dei primers
L‟esito della prova di specificità dei primers in Netsed PCR ha mostrato che i primers
per A. macrospora e O. ips sono specifici e amplificano rispettivamente solo questi
due funghi, mentre quelli per O. brunneo-ciliatum amplificano indiscriminatamente
anche specie simili. Non avendo la possibilità di riscrivere e testare nuovamente questi
inneschi si è preferito continuare lo studio esclusivamente per A. macrospora e O. ips,
tralasciando la terza specie.
4.3. Prova di sensibilità
La prova eseguita al fine di confrontare il limite di sensibilità della reazione di Nested
PCR rispetto ad una reazione di PCR classica ha mostrato che quest‟ultima, eseguita
su estratto da micelio diluito secondo le proporzioni definite nel paragrafo 3.4, risulta
poco o per niente sensibile (Fig. 5). Il materiale genetico risulta essere probabilmente
troppo poco per essere amplificato. La Nested PCR, invece, aumentando la sensibilità
oltre che la specificità, permette di amplificare quantità infinitesimali di DNA, fino
anche a 0,01ng/l (nella diluizione 1/1000); è possibile infatti identificare delle bande
nette in tutte le diluizioni amplificate con il protocollo Nested (Fig. 5).
24
Figura 5: corsa elettroforetica del test di sensibilità della PCR
4.4. Risultati Nested PCR
I dati ricavati dall‟analisi con Netsed PCR, osservati tramite elettroforesi, sono stati
schematizzati e riportati nella seguente tabella (Tab. 7). Le percentuali mostrano le
frequenze con cui le due specie di funghi sono associate agli insetti.
% di associazione Ophiostoma ips Ambrosiella
macrospora
Località Vettore
maschio
Vettore
femmina
Vettore
maschio
Vettore
femmina
Val Dogna 90 100 90 95
Val Venosta 50 45 95 80
Valcamonica 90 85 80 100
Cortina 50 70 100 100
Valtellina 70 75 75 85
Valle d'Aosta 100 85,7 90 85,7
Tabella 7: Frequenza di associazione delle specie fungine per località di origine e sesso del vettore.
25
I dati sono stati analizzati attraverso un modello lineare generalizzato ad effetti misto
(GLMM), con specie e genere come fattori fissi e insetto, albero e sito come fattori
random. Il modello, in particolare, utilizza un distribuzione binomiale con la presenza
delle due specie di fungo come variabile risposta.
Dal modello misto risulta che il test è significativo solo sulla percentuale di presenza
dei due funghi (Tab. 8). Infatti, da questa ricerca, non esistono differenze significative
sull‟associazioni tra i sessi e i siti ma solo sulla presenza delle specie fungine; risulta
quindi che A. macrospora è più presente sugli insetti di entrambi i sessi rispetto O.
ips.
Stima Errore std DF(gl) t P
Specie (O. ips) -18.986 0.33 214 -5.73 <0.001
Genere (maschio) -0.57497 0.47 204 -1.23 1,51181
Specie x Genere 0.345347 0.44 214 0,05486 3,00417
Tabella 8: Risultati del GLMM.
Al fine di rendere il risultato più leggibile, i dati sono stati espressi esclusivamente in
funzione del fattore specie fungina, per il quale si ha un effetto significativo (Fig. 6).
Figura 6: Percentuale di associazione I. acuminatus e funghi di azzurramento
a
b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ambrosiella macrospora Ophiostoma ips
%
26
pianta uno - VAL DOGNA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
A1F 59,08 20 10 3,39 16,61
A2F 28,12 20 10 7,11 12,89
A3F 30,36 20 10 6,59 13,41
A4F 12,1 16 10 13,22 2,78
A5F 46,81 20 10 4,27 15,73
A6F 11,67 16 10 13,71 2,29
A7F 24,67 20 10 8,11 11,89
A8F 34,1 20 10 5,87 14,13
A9F 36,34 20 10 5,5 14,5
A10F 39,78 20 10 5,03 14,97
pianta uno - VAL DOGNA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
A1M 10,65 16 10 15,03 0,97
A2M 15,7 20 10 12,74 7,26
A3M 237,77 20 10 0,84 19,16
A4M 37,1 20 10 5,39 14,61
A5M 22,43 20 10 8,92 11,08
A6M 23,02 20 10 8,69 11,31
A7M 14,81 20 10 13,51 6,49
A8M 17,35 20 10 11,53 8,47
A9M 20,49 20 10 9,76 10,24
A10M 21,24 20 10 9,42 10,58
pianta due - VAL DOGNA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
B3F 13,45 20 10 14,87 5,13
B4F 189,4 20 10 1,06 18,94
B5F 13,45 20 10 14,87 5,13
B6F 9,87 16 10 16,21 0
B7F 10,76 16 10 14,87 1,13
B8F 28,41 20 10 7,04 12,96
B9F 14,34 20 10 13,95 6,05
B10F 17,5 20 10 11,43 8,57
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
27
pianta due - VAL DOGNA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
B1M 11,22 16 10 14,26 1,74
B2M 13,02 20 10 15,36 4,64
B3M 16,75 20 10 11,94 8,06
B4M 23,79 20 10 8,41 11,59
B5M 17,35 20 10 11,53 8,47
B6M 24,09 20 10 8,3 11,7
B7M 23,03 20 10 8,68 11,32
B8M 20,49 20 10 9,76 10,24
B9M 23,78 20 10 8,41 11,59 B10M 21,5 20 10 9,3 10,7
pianta uno - VAL VENOSTA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
C1F 13,16 20 10 15,2 4,8
C2F 15,25 20 10 13,11 6,89
C3F 9,87 16 10 16,21 0
C4F 9,87 16 10 16,21 -0,21
C5F 10,91 16 10 14,66 1,34
C6F 15,55 20 10 12,86 7,14
C7F 12,56 20 10 15,92 4,08
C8F 9,87 16 10 16,21 0
C9F 20,49 20 10 9,76 10,24
C10F 10,17 16 10 15,73 0,27
pianta uno - VAL VENOSTA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
C1M 27,22 20 10 7,35 12,65
C2M 21,38 20 10 9,35 10,65
C3M 19,14 20 10 10,45 9,55
C4M 12,72 20 10 15,72 4,28
C5M 10,77 16 10 14,86 1,14
C6M 10,17 16 10 15,73 0,27
C7M 23,34 20 10 8,57 11,43
C8M 15,7 20 10 12,74 7,26
C9M 30,36 20 10 6,59 13,41
C10M 47,41 20 10 4,22 15,78
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
28
pianta due - VAL VENOSTA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
D1F 21,24 20 10 9,42 10,58
D2F 163,93 20 10 1,22 18,78
D3F 20,78 20 10 9,62 10,38
D4F 26,92 20 10 7,43 12,57
D5F 16,13 20 10 12,4 7,6
D6F 17,5 20 10 11,43 8,57
D7F 33,65 20 10 5,94 14,06
D8F 9,87 16 10 16,21 0
D9F 11,67 16 10 13,71 2,29
D10F 14,35 20 10 13,94 6,06
pianta due - VAL VENOSTA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
D1M 26,32 20 10 7,6 12,4
D2M 22,43 20 10 8,92 11,08
D3M 23,02 20 10 8,69 11,31
D4M 31,85 20 10 6,28 13,72
D5M 17,05 20 10 11,73 8,27
D6M 21,98 20 10 9,1 10,9
D7M 30,81 20 10 6,49 13,51
D8M 26,02 20 10 7,69 12,31
D9M 24,23 20 10 8,25 11,75
D10M 17,5 20 10 11,43 8,57
pianta uno - VALCAMONICA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
E1F 23,48 20 10 8,52 11,48
E2F 10,77 16 10 14,86 1,14
E3F 22,72 20 10 8,8 11,2
E4F 39,78 20 10 5,03 14,97
E5F 27,81 20 10 7,19 12,81
E6F 44,72 20 10 4,47 15,53
E7F 24,97 20 10 8,01 11,99
E8F 10,32 16 10 15,5 0,5
E9F 13,9 20 10 14,39 5,61
E10F 25,42 20 10 7,87 12,13
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
29
pianta uno - VALCAMONICA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
E1M 50,37 20 10 3,97 16,03
E2M 27,67 20 10 7,23 12,77
E3M 9,87 16 10 16,21 -0,21
E4M 26,32 20 10 7,6 12,4
E5M 20,64 20 10 9,69 10,31
E6M 37,04 20 10 5,4 14,6
E7M 23,77 20 10 8,42 11,58
E8M 13,9 20 10 14,39 5,61
E9M 12,56 20 10 15,92 4,08
E10M 18,4 20 10 10,87 9,13
pianta due - VALCAMONICA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
F1F 70,16 20 10 2,85 17,15
F2F 12,56 20 10 15,92 4,08
F3F 42,77 20 10 4,68 15,32
F4F 21,22 20 10 9,43 10,57
F5F 21,84 20 10 9,16 10,84
F6F 14,65 20 10 13,65 6,35
F7F 11,66 16 10 13,73 2,27
F8F 18,41 20 10 10,86 9,14
F9F 34,99 20 10 5,72 14,28
F10F 11,06 16 10 14,46 1,54
pianta due - VALCAMONICA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
F1M 18,4 20 10 10,87 9,13
F2M 12,71 20 10 15,73 4,27
F3M 23,02 20 10 8,69 11,31
F4M 15,7 20 10 12,74 7,26
F5M 14,36 20 10 13,93 6,07
F6M 18,84 20 10 10,62 9,38
F7M 15,71 20 10 12,73 7,27
F8M 24,23 20 10 8,25 11,75
F9M 16,3 20 10 12,27 7,73
F10M 23,17 20 10 8,63 11,37
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
30
pianta uno - CORTINA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
G1F 27,12 20 10 7,38 12,62
G2F 62,2 20 10 3,22 16,78
G3F 17,94 20 10 11,15 8,85
G4F 23,32 20 10 8,58 11,42
G5F 14,5 20 10 13,79 6,21
G6F 53,66 20 10 3,73 16,27
G7F 10,78 16 10 14,85 1,15
G8F 17,05 20 10 11,73 8,27
G9F 17,51 20 10 11,42 8,58
G10F 52,97 20 10 3,78 16,22
pianta uno - CORTINA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
G2M 41,12 20 10 4,86 15,14
G3M 44,12 20 10 4,53 15,47
G4M 22,72 20 10 8,8 11,2
G5M 237,7 20 10 0,84 19,16
G6M 51,6 20 10 3,88 16,12
G7M 97,86 20 10 2,04 17,96
G8M 34,99 20 10 5,72 14,28
G9M 13,9 20 10 14,39 5,61
G10M 18,09 20 10 11,06 8,94
pianta due - CORTINA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
H1F 10,33 16 10 15,49 0,51
H3F 42,62 20 10 4,69 15,31
H4F 16,16 20 10 12,38 7,62
H5F 20,79 20 10 9,62 10,38
H6F 61,61 20 10 3,25 16,75
H7F 14,35 20 10 13,93 6,07
H8F 40,37 20 10 4,95 15,05
H9F 29,45 20 10 6,79 13,21
H10F 29,15 20 10 6,86 13,14
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
31
pianta due - CORTINA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
H1M 44,71 20 10 4,47 15,53
H2M 18,85 20 10 10,61 9,39
H4M 64,01 20 10 3,12 16,88
H5M 174,97 20 10 1,14 18,86
H6M 193,67 20 10 1,03 18,97
H7M 27,37 20 10 7,31 12,69
H8M 31,7 20 10 6,31 13,69
H9M 74,33 20 10 2,69 17,31
H10M 20,92 20 10 9,56 10,44
pianta uno - VALTELLINA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
I1F 24,52 20 10 8,16 11,84
I2F 64,16 20 10 3,12 16,88
I3F 39,15 20 10 5,11 14,89
I5F 83,47 20 10 2,4 17,6
I6F 14,36 20 10 13,93 6,07
I7F 20,65 20 10 9,69 10,31
I8F 16,76 20 10 11,93 8,07
I9F 12,58 20 10 15,9 4,1
I10F 31,7 20 10 6,31 13,69
pianta uno - VALTELLINA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
I1M 34,24 20 10 5,84 14,16
I2M 35,44 20 10 5,64 14,36
I3M 14,36 20 10 13,93 6,07
I4M 42,34 20 10 4,72 15,28
I6M 15,25 20 10 13,11 6,89
I7M 35,44 20 10 5,64 14,36
I8M 59,22 20 10 3,38 16,62
I9M 101,38 20 10 1,97 18,03
I10M 11,67 16 10 13,71 2,29
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
32
pianta due - VALTELLINA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
L1F 23,04 20 10 8,68 11,32
L2F 26,03 20 10 7,68 12,32
L3F 80,92 20 10 2,47 17,53
L4F 47,27 20 10 4,23 15,77
L5F 48,01 20 10 4,17 15,83
L7F 33,65 20 10 5,94 14,06
L8F 20,19 20 10 9,91 10,09
L9F 10,92 16 10 14,65 1,35
L10F 20,19 20 10 9,91 10,09
pianta due - VALTELLINA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
L1M 24,69 20 10 8,1 11,9
L2M 58,93 20 10 3,39 16,61
L3M 27,37 20 10 7,31 12,69
L4M 15,1 20 10 13,25 6,75
L5M 25,42 20 10 7,87 12,13
L6M 25,57 20 10 7,82 12,18
L8M 19,74 20 10 10,13 9,87
L9M 32,45 20 10 6,16 13,84
L10M 34,99 20 10 5,72 14,28
pianta uno - VAL d'AOSTA - femmine
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
M1F 39,19 20 10 5,1 14,9
M2F 8,53 16 10 16,21 0
M3F 42,19 20 10 4,74 15,26
M4F 26,47 20 10 7,56 12,44
M5F 6,73 16 10 16,21 0
M6F 12,56 20 10 15,92 4,08
M7F 42,62 20 10 4,69 15,31
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (CONTINUA)
33
pianta uno - VAL d'AOSTA - maschi
Sigla Conc. media (g/ml) Vol. fin Conc. Fin. (g/ml) Vol. DNA Vol. H2O
M1M 42,62 20 10 4,69 15,31
M2M 29,45 20 10 6,79 13,21
M3M 25,57 20 10 7,82 12,18
M4M 18,69 20 10 10,7 9,3
M5M 23,77 20 10 8,41 11,59
M6M 15,7 20 10 12,74 7,26
M7M 12,42 16 10 12,88 3,12
M8M 17,05 20 10 11,73 8,27
M10M 36,61 20 10 5,46 14,54
Tabella 9: Concentrazione DNA dei campioni estratti (FINE)
34
5. Discussione e Conclusione
Da anni la simbiosi esistente tra scolitidi e funghi di azzurramento è stata oggetto di
studi approfonditi, non solo per l‟interesse biologico, ma soprattutto per i problemi
economici che può causare (Kirisits, 2004). L‟azione sinergica dei due agenti, infatti,
grazie alla possibilità di sopprimere le risposte di difesa della pianta, ha portato in vari
casi, soprattutto in assenza di interventi, al verificarsi di vere e proprie morie (Webber
e Brasier, 1984; Villari, 2008). Da questo punto di vista è bene ricordare che piante
attaccate da I.acuminatus non hanno possibilità di ripresa e sono comunque destinate a
morire entro pochi mesi. Essendo il più piccolo degli scolitidi è stato per molto tempo
considerato privo di interesse selvicolturale, ma a causa dei forti danni economici
indotti dalle prime infestazioni, si è cominciato a prestarvi una forte attenzione
(Ferraro, 2010).
Questo insetto è associato da molti autori a due specie di funghi agenti di
azzurramento, O. ips le cui forme anamorfe sono Leptographium e Hylorhinocladiella
(Hunt ,1956; Upadhyay, 1981; Zhou et al., 2004b; Davidson, 1978) e O. brunneo-
ciliatum, che possiede come anamorfo il genere Grapium (Wingfield et al. 1993,
Yamoaka et al, 1998). Inoltre è anche associato ad un fungo dell‟ambrosia, A.
macrospora, utile alla sopravvivenza delle larve .
La ricerca riguardante l‟associazione tra scolitidi e funghi è stata portata avanti, fino a
pochi anni fa, esclusivamente con tecniche tradizionali che, a causa della morfologia
molto simile dei funghi e ai limiti della coltivazione in vitro, ha spesso dato luogo a
risultati imprecisi e a volte contrastanti. Le tecniche DNA-based invece consentono di
rilevare in modo specifico piccolissime quantità di DNA target (Saiki et al.,1988,
Villari, 2008). Questo le rende quindi uno dei metodi migliori per il monitoraggio di
patogeni su piante ospiti o vettori infetti, motivo per cui sono oggi largamente
utilizzate in patologia vegetale (Kim et al., 1999; Schweigkofler et al., 2005; Roets et
al., 2006, Villari, 2008).
Questa tesi di laurea, inseritasi in un progetto che ha lo scopo di approfondire le
conoscenze riguardo alcuni aspetti della simbiosi tra Ips acuminatus e dei funghi ad
esso associati, si pone l‟obiettivo di studiare, tramite l‟utilizzo di tecniche molecolari,
35
la composizione della flora fungina associata ad I. acuminatus nelle popolazioni
dell‟arco Alpino.
In particolare, i risultati mostrano come non esistano differenze tra la percentuale di
presenza di funghi nelle diverse aree e come neanche il sesso del vettore influisca sulla
percentuale di presenza di funghi.
Nel caso in cui, invece, si analizzi la differenza tra la presenza di una specie rispetto
all‟altra i risultati mostrano che A. macrospora risulta significativamente più presente
(circa il 15% in più) rispetto O. ips, indipendentemente dal sesso del vettore. Per
valutare questi risultati bisogna però tenere presente della tecnica di campionamento
utilizzata. Gli scolitidi infatti sono stati catturati subito dopo la loro uscita dal legno
colonizzato, e portano quindi una carica di inoculo molto elevata. Ciò non vuol dire
che al momento della colonizzazione di un nuovo ospite portino la stessa carica vitale
di inoculo. Durante il volo del vettore, infatti, le spore possono essere dilavate
dall‟acqua o comunque perdere vitalità a causa degli agenti atmosferici. Il fatto che
alcuni Autori riportino che Ambrosiella macrospora sia trasportata principalmente
dalle femmine, all‟interno di micangi mandibolari (Cassar e Blackwell, 1996; Batra,
1967; Mathiesen 1950; Frncke-Grosmann 1952), può essere probabilmente interpretato
come una maggiore possibilità per le spore di Ambrosiella trasportate all‟interno dei
micangi di arrivare vitali nell‟ospite successivo.
Il fatto che Ambrosiella macrospora sia significativamente più presente di
Ophiostoma ips può essere interpretato come una necessità maggiore da parte dello
scolitide di avere una simbiosi trofica, piuttosto che una simbiosi con un fungo di
azzurramento. La simbiosi trofica infatti è molto importante per lo sviluppo delle larve.
Non dobbiamo infine dimenticare che questi sono esclusivamente dati parziali, poiché
manca la percentuale di associazione con l‟altro patogeno di azzurramento,
Ophiostoma brunneo-ciluatum.
36
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43
Ringraziamenti
Desidero innanzitutto ringraziare il Professor Andrea Battisti per la grande
disponibilità e cortesia dimostratemi e per avermi permesso di fare questa esperienza.
Un grazie di cuore alla Dottoressa Caterina Villari e al Dottor Mauro Simonato per
tutto l’aiuto fornito durante le analisi di laboratorio e le interminabili ore spese a
consigliarmi e correggere questa tesi di laurea.
Grazie a tutto il Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali, per
avermi ospitato e per avermi sempre fatto sentire a mio agio e in particolare a Daniel,
Edoardo, Isabel, Claudia, Matteo e Linda per la compagnia.
Grazie anche Valentina per avermi sempre sostenuto e creduto in me, anche nei
momenti più bui, quando tutto sembrava perduto e avermi sopportato in questo ultimo
periodo quando il tempo era ormai poco e gli impegni sempre troppi.
Grazie a Riz, Mary e Cai per le pause caffè, il sostegno nel finire gli ultimi esami e i
consigli.
Un sentito ringraziamento va anche a tutta la mia famiglia, a Massa e a Lisa che con
il loro incrollabile sostegno morale (e non…), mi hanno permesso di raggiungere
questo traguardo.
Infine, ma non di minor importanza, un grazie a tutti i compagni di corso vecchi e
nuovi e alle coinquiline.
