DIAGNOSI SIEROLOGICA DI INFEZIONE DA EBVCONFRONTO TRA CHEMIOLUMINESCENZA(LIAISON) E IMMUNOENZIMATICA (CHORUS)Savino O., Mauro M.V., Tenuta R., Greco F. Giandomenico A.M., Giraldi C.U.O.C. di Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare Ospedale Annunziata AO Cosenza

Introduzione. Epstein Barr virus (EBV) appartiene alla famiglia degli Herpesvirus, sottofamiglia gamma-herpesvirus,con genoma a DNA lineare a doppio filamento. EBV infetta il 90%, circa, della popolazione mondiale causandoun’infezione generalmente asintomatica. È l’agente eziologico della mononucleosi infettiva (IM) ed è associato a

due neoplasie geograficamente ben definite: linfoma di Burkitte carcinoma indifferenziato naso-faringeo. La diagnosi dell’IMsi basa su tests sierologici che valutano la presenza di anticorpidiretti contro i diversi componenti di EBV: IgM/IgG VCA (ViralCapsid Antigen), IgG EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigen), IgGEA (Early Antigen). VCA-Ag ed EA-Ag stimolano gli anticorpidella fase acuta dell’infezione, mentre EBNA-Ag quelli dellafase di convalescenza. I livelli individuali degli anticorpi specificinon sono necessariamente indicativi di malattia quindi ladeterminazione parallela dei 4 gruppi anticorpali permette unamigliore discriminazione tra le diverse fasi dellíinfezione daEBV (fig.1, tab.1). Nel nostro studio abbiamo valutato la sensibilitàe la specificità degli anticorpi specifici IgM ed IgG anti-VCA edEBNA IgG rilevati con un nuovo sistema automatizzato, ChorusEIA, comparando i risultati con quelli ottenuti dal sistema inuso nel nostro laboratorio, Liaison CLIA ed immunofluorescenzainsieme al riscontro clinico di IM.Materiali e Metodi. Lo studio è stato eseguito su 146 campioni,suddivisi in due gruppi di soggetti:- I° gruppo: n. 23 campioni provenienti da pazienti con sospettoclinico di IM per febbre, astenia, faringodinia, linfadenopatia.In 8 pazienti è stata ripetuta, a distanza di 3-5 giorni, ladeterminazione di VCA IgG.

- II° gruppo: n.123 campioni di soggetti apparentemente sani di età compresa tra 3-50 anni.La diagnosi sierologica è stata eseguita dosando gli anticorpi specifici, IgG ed IgM anti VCA ed IgG EBNA, mediantei seguenti test: EIA Chorus (Diesse, Senese) sistema immunoenzimatico che utilizza Ag EBV parzialmente purificatilegati alla fase solida; CLIA Liaison (Diasorin Saluggia) sistema in chemiluminescenza che utilizza peptidi sinteticidi EBV adesi a microparticelle paramagnetiche utilizzate come fase solida.Test di immunofluorescenza indiretta (IFI), (ALIFAX/EUROIMMUNE)Risultati. Sensibilità e specificità di EIA Chrorus sono state calcolate valutando i risultati di VCA IgM e IgG ed EBNAIgG, ottenuti nel I° (malati) e II° (sani) gruppo. Il gold standard era rappresentato dai dati ottenuti, per VCA IgM eIgG ed EBNA IgG, mediante CLIA Liaison ed IFI, insieme al sospetto clinico di IM. In tab. 1 sono riassunti i risultatidel I° gruppo. I 23 pazienti con quadro clinico di IM, presentavano VCA IgM positive ed EBNA IgG negativi (CLIA eIFI), di questi n.15 e n. 8 erano rispettivamente siero positivi e negativi per VCA IgG. Questi ultimi 8 pazienti, rivalutatidopo 3-5 giorni, confermavano la sieroconversione di VCA IgG. I risultati ottenuti con EIA Chorus hanno dimostratouna buona concordanza con i dati ottenuti da CLIA/IFI. Solo n. 2 casi risultavano discordanti per negatività di VCAIgM ma concordanti per IgG VCA e EBNA negativi. Nella tab. 2 sono riassunti i risultati ottenuti nel gruppo II°.CLIA/IFI indicavano i seguenti pattern: n.100 soggetti presentavano VCA IgM negative, VCA e EBNA IgG positivi.N.3 campioni mostravano risultati discordanti per VCA-IgG (CLIA negativo e IFI positivo) e n. 20 un profilo disieronegatività. I risultati ottenuti da EIA Chorus sono stati sovrapponibili per i pattern di sieronegatività (n. 20) econ quelli VCA-IgM negativi e VCA ed EBNA IgG positivi (n.100). In n. 3 campioni si è osservata una discordanzaper VCA-IgM positive, in soggetti apparentemente sani, VCA e EBNA IgG positivi. EIA Chorus ha dimostrato unasensibilità e specificità rispettivamente del 91.3% e 97,5%.Conclusioni. Dai risultati si evince un’ottima correlazione tra CLIA/IFI e EIA Chorus. Nel gruppo dei malati, i trecasi, non rilevati da EIA Chorus, ma ripetuti a distanza di pochi giorni, confermavano la siero conversione delleIgM VCA, dimostrando la buona sensibilità del test. Ottima la specificità calcolata nel gruppo dei soggetti sani,

inoltre EIA Chorus ha confermato tre soggettiimmuni, VCA IgG positivi, con risultatodiscordante al nostro sistema di riferimento(CLIA negativi e IFI positivi). In questi tre casila migliore performance di EIA Chorus èprobabilmente spiegata dalla diversa naturadell’antigene VCA utilizzato: nativo per Choruse ricombinante per Liaison. Da non sottostimareinfine la strumentazione del sistema Chorus,in completa automazione, maneggevole eflessibile.

Bibliografia • Zeytinoglu A, Altuglu I, Karatas E, Yazan Sertoz R. www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18215427 “Comparison of immunofluorescenceassay and multiplexed microparticle-based immunoassay for detecting Epstein-Barr virus viral capsid antigen antibodies” J Virol Methods., 148 (1-2):300-2 (2008) • F. Garetto, “Epstein-Barr Virus (EBV) VCA IgG, EBNA IgG, EBV IgM, EA IgG: una diagnosi accurata delle diverse fasi dell’infezione”Ligand Assay 10 (1) 2005 • J. Middeldorp and P. Herbrink, “Epstein Barr Virus specific marker molecules for early diagnosis of infectious mononucleosis”J. Virol. Methods 21:133 (1988) • J. Luka, R.C. Chase and G. Pearson, “A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against the majorEBV-associated antigrns. I. Correlation between ELISA and immunofluorescence titer using purified antigens” J. Immunol. Methods 67:145 (1984)

Tab.1: Pattern anticorpali nella diagnostica di EBV