DIAGNOSIS PENYAKIT VIRUSBAHAN AJARMIKROBIOLOGI VETERINER

OLEHG NGURAH K MAHARDIKAFAKULTAS KEDOKTERAN HEWANUNIVERSITAS UDAYANABUKIT JIMBARAN2004

KENAPA PERLU DIAGNOSIS YANG BENAR DAN TEPAT?Penyakit eksotikPenyakit zoonosisSertifikasi status bebas penyakit tertentuKeperluan Inseminasi Buatan, Transfer Embryo, transfusi darahProgram pengendalian test and slaughterInvestigasi KesmavetManagemen Klinik

DASAR-DASAR DIAGNOSISKlinisEpidemiologiPatologi AnatomiDIAGNOSE SEMENTARApengambilan sampelISOLASI DAN PROPAGASIbiakan seltelur bertunashewan percobaanDeteksi VirusDeteksi Protein VirusDeteksi genomDeteksi AntibodiDIAGNOSE DIFINITIVDi LapanganDi LaboratoriumPOSTULATKOCH**Keraguan & Penyakit BaruLesi Histopatologi

EpidemiologiEpidemi=wabahIlmu tentang wabahGeografiMusimSpesiesUmurKelaminMorbitas, mortalitas, dan case fatality rate

Pengambilan SpesimenTepat Spesimensesuai gejala klinissesuai perubahan PAsesuai pathogenesis penyakit yang didugaTepat WaktuPada fase akutTepat pengirimanDalam transport mediumEs/es keringTertutup rapatBerlabelDisertai data penyakit, diagnosis sementaraIjin pengiriman (Luar Negeri)

Transport mediumLarutan fisiologisPBS, NaCl 0,9%, Media Biakan SelAntibiotika (Penisilin dan streptomisin)Antijamur+/- Gliserol (terutama untuk transportasi jarak jauh tanpa kondisi dingin)

MACAM SPESIMEN

Gejala

Spesimen

Pernafasan

Pencernaan

Kelamin

Mata

Kulit

Syaraf Pusat

Sistemik

Nekropsi/Biopsi

Semua Penyakit

Usapan Hidung, Kerongkongan, aspirasi naso-faring

Feses

Usapan kelamin

Usapan Konjungtiva

Kerokan Kulit, Epitil, Usapan kapas

Cairan serebrospinal, feses, usapan hidung (tergantung penyakit)

Usapan hidung & feses (tergantung penyakit), darah dalam antikoagulan

Potongan organ yang sesuai

Darah tanpa antikoagulan ---- serum

BERBAGAI METODE DIAGNOSTIK VIRUSMETODEisolasi virus mikroskup elektron Serologi (deteksi Protein)Pelacak DNA/RNA Histopatologi Deteksi AbKEUNGGULANsensitif, bahan baku kajian lebih lanjutcepat, deteksi virus yang sulit ditumbuhkancepat, peka, informasi serotipe, KITcepat, peka, untuk semua viruscepat, mudah, tersedia berguna untuk wabahKEJELEKANlambat, sering sulit mahal, tak tersedia tidak untuk semua virus sulit interpretasitak selalu tersedia kontaminasi DNA tinggiterbatas untuk virus tertentu dg perubahan khasLambat, sulit interpretasi

ISOLASI VIRUSspesimensuspensiBiakan seltelur bertunashewan labPanen dan IdentifikasiTujuan:Memisahkan suatu virus dari agen yang lainMemperbanyak virusIdentifikasi awal

Fisik-KimiawiSecara AseptisPenggerusanPencairan-pembekuan berulangLarutan isotonis berpenyanggaSentrifugasi Ultra SentrifugasiUltrafiltrasiPenambahan Antibiotika sprektrum luasPenambahan Agen Anti Jamur dan anti mikoplasma

Pengamatan Klinis, Patologis, Mikroskopis,

DETEKSI VIRIONElektronmikroskupImuno-elektronmikroskup

Gambar Elektron Mikroskopis berbagai virus

Gambar Elektron Mikroskopis berbagai virus

Panel Contoh Imuno-Elektron MikroskopiInfeksi Virus Hepatitis C pada biakan sel (Barba dkk. 1997)sel terinfeksi yang direaksikan dengan serum negatif (E) dan serum positif VHC (F)Perhatikan N : inti sel, ER retikulum endoplasmik, M mitokondria; LD lipid droplet

LDLD

DETEKSI PROTEIN VIRUSELISA Enzim linked Immunosorbent assayIMUNOFLUORESENSFluorescence Antibody Test (FAT)WESTERN BLOTHambatan hemaglutinasi (HI)Uji Fiksasi KomplemenUji NetralisasiAgar Gel Precipitation AssayDll.

PENGUKURAN ANTIBODISerum tunggalPenyakit baruPenyakit endemik --- deteksi IgMSera sepasangSerum fase akut dan fase kesembuhan (2-4 minggu)Terjadi peningkatan antibodi yang signifikan

DETEKSI DNA/RNAPCR (polymerase chain reaction)Amplifikasi (perbanyakan) DNA secara invitro (dlam tabung reaksi)RT - PCR (Reverse Transcriptase PCR) untuk virus RNA

Histopatologi (Lesi Patognomonik)Contoh pada Rabies

INTERPRETASIKesesuaian Klinis, epidemiologi, Patologi & Diagnosis labSering keliru banyak infeksi sub-klinisDalam hal ragu-ragu --- Postulat KochAgen dapat ditumbuhkanIsolat dapat menimbulkan penyakit yang sama pada infeksi percobaanAgen dapat diisolasi kembali dari infeksi percobaan

KEAMANAN LABBiosafety Level 1 Biosafety Level 2Biosafety Level 3Propagasi penyakit zoonosis pada hewan percobaanBiosafety Level 4Eksperimen infeksi penyakit zoonosis yang berbahaya

ELISA

ELISAEnzyme Linked Immunosorbent AssayUji serologi dalam cairan dimana antigen atau antibodi dilapiskan pada lubang plastik (microplate), dan antigen atau antibodi yang menempel dilacak dengan antibodi lain yang berpenanda enzimKepekatan warna diukur dengan alat ELISA READER

Skema Prosedur ELISA indirek untuk pemeriksaan antibodi terhadap HIVBaca (optical density)Kromogen/substratCuciAnti Ig-Human dilabel enzimCuciSerum pasienCuciProtein-protein virus HIV dilapiskan pada microplate polysterene

Contoh Microplate ELISA

Western BlotDeteksi antigen atau antibodi dimana antigen dielektroforesis dalam media poliakrilamid dan kemudian dipindahkan ke permukaan membran nitroselulosa, ikatan antigen-antibodi dilacak dengan entibodi lain yang berpenanda enzim

Contoh WB

Western Blot HIVLane 1, HIV+ serum (positive control) Lane 2, HIV- serum (negative control) Lane A, Patient A Lane B, Patient B Lane C, Patient C

FATFluorescence Antibody TestUji serologi untuk deteksi antigen atau antibodi dengan menggunakan antibodi lain yang berpenanda FITC (fluorescence Iso-Thio-Cyanate)Signal dilihat dibawah mikroskup UVDigunakan untuk deteksi rabies baku

FAT: Skema Mikroskup

Skema FATFAT direkFAT indirek

Mikroskup fluoresensSlides are read under a fluorescence microscope in a dark room

FAT direk dari preparat sentuh otak anjing penderita rabiesPositif (atas) dan negatif (bawah).

FAT biakan sel terinfeksi Spuma Virus.Perhatikan juga intensitas signal danbentukan sinsitia

Complement FixationAg mixed with test serum to be assayed for AbStandard amount of complement is addedErythrocytes coated with Abs is addedAmount of erythrocyte lysis is determinedAg AgMethodology

IMUNOHISTOKIMIAFiksasi jaringan pada glas obyekAntigen un-masking Ensimatis Microwave Autoklaf atau pressure cookerBlockingPenambahan antibodi terhadap Ag yang dicari Berlabel enzim (direk) Tak berlabel (indirek)Penambahan antispesies Ab (indirek)SubstratBackground stainingPengamatan dengan mikroskup cahaya

Contoh ImunohistokimiaBadan Inklusi pada intrasitoplasmik pada sel Syaraf tertular Rabies (Negri bodies).

Agar Gel Precipitation Test (AGPT)

Agar Gel Immunodiffusion assay

Uji Hambatan Hemaglutinasi (Hemaglutination inhibition/HI)AktifVirus yang mempunyai hemaglutininInfluenza, Newcastle Disease/ND, ParvovirusPasifDidahului dengan uji HA (hemaglutination assay)

Uji Hemaglutinasi (HA)

Uji Hemaglutinasi (HA)Virus yang Mempunyai hemaglutininSel Darah Merah

Virus yang Mempunyai hemaglutininSel Darah MerahAntibodiUji Hambatan Hemaglutinasi (HI)

Contoh Mikroplate uji HI dengan 4 Serum (S1 S4)Virus 4 unit HA yang digunakan diperlihatkan dibagian bawah

Uji NetralisasiBiakan SelTelur BertunasHewan LabSel SehatEmbryo SehatHewan SehatVirus tidak dapat direisolasiSel Sakit/MatiEmbryo Sakit/MatiHewan Sakit/MatiVirus dapat direisolasi

Uji Netralisasi Enterovirus Babi pada biakan sel ginjal babi.A. Virus ditambahkan dengan antibodi positif sebelum diinokulasikan pada biakan selB. Virus ditambahkan dengan antibodi negatif

SKEMA PCR (Animasi) Komponen PCRDNA targetPrimer (Oligonukleotida pendek, komplementer dg target) dalam konsentrasi berlebihandNTP (dA, dC, dG, dTTP)Mg2+Enzim Polimerase DNA Taq-polymerase

Contoh Hasil PCR

RT-PCRTarget RNA dikopi menjadi cDNA dengan menggunakan primer dan enzim reverse transkriptase, setelah itu baru PCR

RT-PCR pada Rabies