Noiuni elementare de microbiologie special Genul Staphylococcus
Diagnostic de laborator = diagnostic bacteriologic 1. Recoltare
puroi din leziuni deschise recoltare cu pipeta Pasteur, ansa
bacteriologic, tampon, instrumente chirurgicale sterile din leziuni
nchise se colecteaz prin puncie cu o sering steril cu ac gros
exsudate nazale & faringiene, secreii otice, conjunctivale,
sput, urin, secreie vaginal / uretral / de col uterin, snge, lichid
peritoneal, LCR, lichid de puncie articular, material necroptic,
materii fecale, vomismente probe de aliment incriminat n declanarea
toxiinfeciei alimentare (TIA) pt depistarea purttorilor de
stafilococ patogen n rinofaringe EF i EN cu tampoane sterile
Precauii evitarea contaminrii (prezena natural a stafilococilor pe
piele poate duce cu uurin la apariia unor dificulti n interpretarea
datelor de laborator) 2. Transportul probei proba recoltat trebuie
nsmnat n cel mult 2 ore de la recoltare. valoare orientativ, n
special n produsele normal sterile (LCR, lichid articular, secreie
bronic recoltat prin puncie traheal) diagn. de certitudine rmne cel
prin cultivare i identificare se fac frotiuri colorate
albastru-de-metilen i Gram Frotiuri Gram coci Gram-pozitivi, grupai
n ciorchine, intra-/extracelulari, alturi de ali germeni
Gram-pozitivi, Gram-negativi, leucocite, detritusuri celulare 4.
Izolare i identificare mediul pe care se face nsmnarea trebuie ales
n funcie de tipul probei clinice (intens/moderat contaminat sau
necontaminat) intens contaminate fecale, vom, alimente moderat
contaminate sput 3. Examenul direct microscopic al produsului
patologic -
-
necontaminate
LCR,
lichide
de
puncie,
urin,
snge
(hemocultur) probele intens i moderat contaminate se nsmneaz pe
medii cu proprieti selective: mediul hiperclorurat lichid i
hiperclorurat solid (Chapman), ulterior fcndu-se dispersie pe
geloz-snge celelalte probe pot fi nsmnate direct pe bulion sau
geloz - snge bulion stafilococii tulbur uniform mediul, formnd
depozit la fundul tubului geloz colonii mari, 1-2mm diametru,
bombate, opace, rotunde, cu margini regulate, cu suprafa neted sau
uor neregulat, de consisten moale, care se detaeaz uor de pe mediu
geloz-snge S. aureus colonii rotunde, de tip S, alb-cremoase, cu
zon de hemoliz complet; S. epidermidis colonii mai mici,
non-hemolitice; S. saprophiticus colonii ceva mai mari. Pe mediu
Chapman Staf. patogeni manito-pozitivi colonii galbene care vireaz
i culoarea mediului n galben. ! identificarea stafilococilor doar
pe baza morfologiei coloniei nu este recomandat Identificare Testul
catalazei - stafilococii = catalazo-pozitivi (efervescen la
contactul cu o pictur de perhidrol diluat) Cercetarea caracterelor
de patogenitate a) in vitro pigmentogeneza nsmnarea stafilococilor
pe mediu cu ser (mediu Lffler) sau pe geloz nutritiv cu 10% lapte,
n prezena aerului, favorizeaz producerea de pigment 3 tipuri de
pigment- S. aureus pigment galben-auriu - S. saprophyticus -
pigment citrin - S. epidermidis - pigment alb testul hemolizei pe
medii geloz-snge hemoliz total la S. aureus Citire i interpretare:
-
fermentarea manitei stafilococii patogeni fermenteaz manita pe
mediu Chapman solid sau ap peptonat turnesolat cu manit 1%,
fermentarea manitei obiectivndu-se prin acidifierea mediului i
virajul culorii indicatorului. Stafilococii patogeni (S. aureus)
dezvolt pe medii solide colonii galbene, cei care nu fermenteaz
manita (SCN) produc colonii rozrocate. testul coagulazei permite
diferenierea S. aureus (= coagulazo-pozitiv) de ceilali stafilococi
coagulazonegativi (SCN) - coagulaza - liber enzim eliberat n mediu
acioneaz asupra factorilor coagulrii - legat (clumping factor,
receptor pentru fibrinogen) Testul pe lam o pictur de ap distilat n
care se suspend o colonie de stafilococi (suspensia s fie foarte
dens i uniform) se adaug o pictur de plasm nediluat, proaspt reacie
pozitiv n 15-20 secunde apar aglutinate reacie negativ absena
aglutinrii n 2-3 minute trebuie confirmat rezultatul prin testul n
tuburi Testul n tuburi 0,5ml plasm oxalatat + 0,1ml cultur de
16-20h n bulion 2 martori Stafilococ coagulazo-pozitiv (S. aureus)
- SCN (S. epidermidis) pstrare la 37C examinare la 30 min, 60 min,
4 h pentru constatarea coagulrii reacie pozitiv coagulare,
indiferent de gradul ei (n mas, vl de fibrin) reacie negativ absena
cheagului
testul fibrinolizinei stafilococii patogeni secret fibrinolizin
care lizeaz coagulul de plasm format de coagulaz prezena enzimei se
pune n eviden prin nsmnarea tulpinii de stafilococ ntr-un mediu cu
7 pri geloz nutritiv i 1 parte plasm oxalatat incubare 12-18h la
37C
n jurul coloniilor de stafilococi se observ o zon clar datorit
topirii coagulului de plasm produs de coagulaz. testul fosfatazei
stafilococii patogeni secret fosfataz scindeaz molecula de
fosfat
b) in vivo inoculare la animale de laborator aciunea
dermonecrotic a toxinei stafilococice.; iepurele este animalul cel
mai sensibil injectat iv septicemie mortal; injectat sc sau im
abcese localizate. Cercetarea sensibilitii la aciunea
bacteriofagilor - lizotipia principiu = o celul bacterian poate fi
sensibil la unul sau mai muli bacteriofagi aceasta presupune att
existena unor receptori pentru fiecare bacteriofag pe suprafaa
celulei bacteriene (care asigur posibilitatea de fixare a
acestuia), ct i permisivitatea celulei bacteriene fa de toate
etapele ciclului litic de multiplicare a bacteriofagului.
Susceptibilitatea diverselor tulpini la aciunea litic a
bacteriofagilor este sistematizat ntr-un sistem de lizotipie
bacteriofagic. Receptorii pentru bacteriofagi existeni n peretele
celular al microorganismelor aparinnd aceleiai specii bacteriene
variaz n funcie de tulpin; celulele bacteriene care posed aceiai
receptori se ncadreaz n acelai grup fagic. Lizotipia poate fi
aplicat numai tulpinilor patogene de stafilococ coagulazo-pozitiv
(SCN nu sunt susceptibili la aciunea preparatelor bacteriofagice
folosite n lizotipie) n practic, lizotipia stabilete mai mult un
diagnostic individual de tulpin i mai puin un diagnostic de tip,
pentru c o tulpin de stafilococ izolat ntr-un produs patologic
poate fi lizat de civa din bacteriofagii standard folosii n
lizotipie nu e metod de clasificare, ci doar epidemiologic ! o
tulpin de stafilococ i pstreaz constant tipul bacteriofagic, chiar
i n condiiile trecerii succesive de la bolnav la purttor i invers e
posibil urmrirea filiaiei cazurilor Tehnic de lucru se pune n
contact tulpina de cercetat cu un set de bacteriofagi standard;
notarea sensibilitii se face prin numrarea plajelor de liz; dac
tulpina e sensibil la bacteriofagul respectiv apar plaje de
liz.
Bacteriocinotipie (tipizarea tulpinilor dup capacitatea de a
produce bacteriocine) Genotipie Antibiograma obligatorie
Genul Streptococcus Diagnosticul de laborator n angina
streptococic determinat de S. pyogenes (streptococul -hemolitic de
grup A) Diagnostic bacteriologic Recoltare - exsudat faringian
(pacientul nu trebuie s fi mncat, s fi but, s se fi splat pe dini
sau s fi mestecat gum nainte de recoltare) transport 4 ore (se
poate transporta n mediu Pike mediu selectiv i de mbogire) valoare
orientativ (nu se face de rutin) diagn. de certitudine rmne cel
prin cultivare i identificare (pe frotiu colorate Gram streptococii
apar sub form de coci Gram-pozitivi, sferici, izolai sau grupai n
perechi / lanuri, alturi de ali germeni Gram-pozitivi,
Gram-negativi, leucocite (PMN), detritusuri celulare) Izolare i
identificare - epuizare pe geloz-snge 24 h la 37 C se urmrete
prezena i numrul coloniilor hemolitice (suspiciune de S. pyogenes)
dac sunt prezente se face testul la bacitracin. frotiu din cultur
coci Gram +, sferici sau ovalari, dispui n lanuri de diferite
lungimi Testul catalazei streptococi = catalazo-negativi difereniaz
streptococii de grup A de cei non-A streptococii grup A sunt
sensibili la bacitracin (0,04U) zon de inhibiie mai mare sau egal
cu 10mm nu este test de certitudine 100% (exist tulpini non-A care
pot fi sensibile la bacitracin) identific prezumptiv un izolat de
S. pyogenes. Se folosete doar pentru culturi pure (cultur nsmnat
uniform pe agar-snge; disc de bacitracin n contact complet cu
agarul; incubare la 35C, 18-24h) Susceptibilitatea la bacitracin
Examenul direct microscopic al produsului patologic -
-
Interpretare
- pozitiv zon de inhibiie n jurul discului de bacitracin -
negativ cretere uniform a culturii pn la marginea discului.
Diagnosticul de grup de certitudine punerea n eviden a Ag
specific de grup reacie de aglutinare pe lam Antibiograma - S.
pyogenes sensibil la Penicilin tratament de elecie (antibiograma nu
e obligatorie atunci cnd se izoleaz un streptococ -hemolitic)
Diagnostic serologic Reacia ASLO = determinarea anticorpilor
antistreptolizin O - metod standardizat folosit pt diagnosticarea
infeciilor poststrepto (inclusiv complicaii tardive) Materiale
necesare: -ser limpede i nehemolizat, inactivat 30 min la 56C -
hematii de iepure recoltate pe perle din vena marginal a urechii
resuspendate n sol. clorurat izotonic 5% - SLO (streptolizin O) -
Se fac diluii 1/100 i 1/500 din serul de cercetat, se repartizeaz n
tuburi, se completeaz cu sol. clorurat izotonic ad 1ml i se adaug n
fiecare tub cte o unitate combinant de SLO n volum de 0,5ml. - 37C
15 min - se adaug sol. de hematii de iepure, se agit, se las la
baie nc 45 min - se face o prim citire imediat, apoi se las peste
noapte la frigider - ultimul tub n care hemoliza lipsete complet
indic titrul exprimat n uniti /ml. Interpretare Se consider pozitiv
un titru > 200u/ml Streptococcus pneumoniae (pneumococul)
Recoltare - exsudat nazo-faringian, LCR, snge, sput.. Transport -
nsmnare rapid pe mediu sau transport n mediu Stuart. Examen
microscopic al produsului patologic diplococi Gram-pozitivi, cu
capete ascuite (aspect ovalar sau lanciolat) capsula evideniabil cu
coloraia Hiss sau albastru de metilen
Izolare Caractere de cultivare - medii de cultivare: bulion
infuzie cord-creier, agar-tripticaz de soia, agar chocolat; unele
izolate au nevoie de atmosfer de CO2.
-
streptococ -hemolitic coloniile tinere rotunde, umede, mucoide,
bombate, strlucitoare coloniile mai vechi autoliz colaps al
centrului coloniei.
Identificarea important este diferenierea S. pneumoniae de S.
viridans (tot -hemolitic) Sensibilitatea la optochin test ce
difereniaz S. pneumoniae de ali -hemolitici nsmnez colonia deja
izolat pe agar-snge plasez un disc de optochin (=etil hidrocuprein
hidroclorid) n centrul plcii apariia unei zone de inhibiie n jurul
discului denot sensibilitate la optochin, ceea ce i este
caracteristic lui S. pneumoniae (diametrul zonei de inhibiie depete
14mm). Un rezultat negativ (adic lipsa zonei de inhibiie = cretere
bacterian pn la marginea discului, sau diametrul zonei sub 14mm)
este caracteristic celorlali streptococi -hemolitici. Testul
bilolizei principiu inducerea i accelerarea autolizei pneumococilor
de ctre bil sau sruri biliare reacia se face n tuburi tulpin
capsulat de S. pneumoniae n bulion + dezoxicolat de Na liz soluia
se clarific ali streptococi -hemolitici + dezoxicolat de Na NU liz
soluie cu aspect floconos
Testul (reacia) de umflare a capsulei poate fi folosit pentru
identificarea direct a pneumococului n sput, LCR se amestec
produsul patologic (specimen clinic sau colonie izolat) cu ser
antipneumococic + albastru de metilen se examineaz cu obiectivul cu
imersie reacie pozitiv cnd pneumococii sunt amestecai cu antiserul
capsular omolog capsula devine umflat i retractil Teste de
apreciere a virulenei inoculare la oareci Identificare de tip
reacii de aglutinare cu seruri specifice Antibiograma ! -
multirezisten la antibiotice
Genul Neisseria Diagnosticul de laborator n infecia cu
meningococ (Neisseria meningitidis)
Caractere generale - coci ovalari, cu diametru de 0,6-1m, dispui
n diplo, cu feele adiacente aplatizate sau uor concave. Pot fi
dispui n tetrade (n cultura foarte tnr) sau izolai. In cultura
veche, datorit procesului de autoliz, pe frotiu necapsulai. Sunt
imobili, nesporulai. Diagnostic de laborator Recoltare - LCR, snge,
lichid de puncie, exsudat nazofaringian Transport - bacterii extrem
de fragile e bine s se izoleze n cultur ct mai repede (ideal n
maximum 15 minute de la recoltare). Pn atunci se pstreaz la
temperatura camerei, nu n termostat unde e grbit procesul de
autoliz, nici n frigider unde sucomb. Dac se tie c nsmnarea nu
poate fi fcut rapid se pstreaz n mediu de transport (Stuart)
maximum 3 zile. Examen microscopic al produsului patologic -
diplococi Gram-negativi, ca boabele de cafea, intra sau extra
celulari.. Izolare i identificare LCR mod de lucru: se recolteaz
prin puncie lombar, suboccipital, ventricular (la copiii f. mici).
5-10ml la adult, 2-3 ml la copil se examineaz macroscopic: LCR n
tensiune, tulbure-purulent, aspect de zeam de varz. Se
centrifugheaz se separ supernatantul de sediment Din supernatant se
fac reacii biochimice proteine (hiperalbuminorahie), glucoz
(hipoglicorahie), electrolii (hipoclorurorahie) - i se ncearc
determinarea direct a polizaharidului capsular (exist truse
comerciale pt reacii de aglutinare sau coaglutinare care conin
reactivi bazai pe polizaharidele celor 3 germeni cel mai frecvent
incriminai n etiologia meningitelor: S. pneumoniae, N.
meningitidis, Haemophilus influenzae). Din sediment frotiu colorat
Gram / albastru de metilen / Giemsa Pe frotiul Giemsa se analizeaz
celularitatea PMN 100%, ntregi i alterate. se pot observa bizarerii
(frotiu necaracteristic). Capsulai n produsul patologic (LCR, snge)
n exsudate sunt
nsmnare pe medii neselective (geloz-snge, geloz-chocolat), mediu
Mueller-Hinton, sau medii selective (Thayer-Martin, New York city
modificat). Pt izolarea neisseriilor din
prelevate contaminate e recomandat s se utilizeze n paralel dou
medii (unul selectiv i unul neselectiv). Se nsmneaz pe medii
nclzite. Se incubeaz la 37C, n atmosfer de 5-8% CO2. - neisseriile
patogene dezvolt colonii vizibile dup 24h, ns citirea optim este la
48h, iar plcile nu trebuie aruncate dect dup 72h de observaie. dac
sunt cultivai pe mediu fr snge colonii transparente, cu diametru de
1-2 mm (sau mai mic), suprafa convex, neted, n cultur proaspt
emulsioneaz uor cu ser fiziologic pe medii cu snge colonii cu
aspect gris-lucios (unele glbui, altele albicioase). Obs: dac se
recolteaz snge (n septicemii) se fac minimum 2 hemoculturi
(recoltare n febr i frison) i se nsmneaz pe mediu BHI (bulion
cord-creier) Identificare Reacia oxidazei metoda Kovacs - se
folosete un reactiv lichid (tetrametil p-fenilendiamina) se
impregneaz o hrtie de filtru cu ansa sau pipeta Pasteur se ia o
cantitate de cultur i se descarc pe hrtia de filtru. Reacie pozitiv
culoare rou-purpur (mov-albastru) n 5-10 secunde. Diferenierea
speciilor de Neisseria prin caractere metabolice utilizarea
oxidativ a zaharurilor (glucoz, fructoz, maltoz, zaharoz, lactoz)
fermenteaz glucoza i maltoza reducerea nitrailor i a nitriilor
producerea de dezoxiribonucleaz sinteza de polizaharid din
zaharoz
Serogrupare la noi circul serogrupurile A, B, C, D, X, Y, Z.
iniial fac testarea cu 2 seruri polivalente (ABC, DXYZ) i cu ser
fiziologic dac se produce aglutinare cu serul fiziologic tulpin
autoaglutinabil cu ambele seruri polivalente tulpin poliaglutinabil
cu 1 ser polivalent se testeaz cu serurile monovalente
corespunztoare
se obine grupul.
- Serotipaj & serosubtipaj ELISA cu anticorpi monoclonali -
MLST (multilocus enzyme electrophoresis) la nivelul membranei
citoplasmatice exist enzime pe baza crora, prin aceast tehnic,
meningococii sunt clasificai n electrotipuri. Se poate stabili
clona din care au provenit. - PCR detecteaz direct meningococii din
LCR. Antibiograma Diagnostic de laborator n infeciile gonococice
(Neisseria gonorrheae) Diagnostic microbiologic Recoltare la femei
din canalul endocervical, uretr, vagin (din fundul de sac posterior
numai la femeile histerectomizate), rect, orofaringe. La brbai
heterosexuali din uretr La homosexuali din uretr, rect i
orofaringe. Transport tamponul cu produsul patologic trebuie
introdus imediat n mediu de transport (mediu nonnutritiv de tip
Stuart sau Amies sau un mediu selectiv), nu nainte de a fi ntins un
frotiu (din produs patologic). Rata de izolare a gonococului dup
transport n medii nonnutritive la 25C ajunge la 100% n primele 12 h
de la recoltare. Examinare microscopic frotiu colorat albastru de
metilen diplococi + celule inflamatorii frotiu colorat Gram
diplococi Gram-negativi n boab de cafea intracelulari + PMN. Atenie
aa arat un frotiu n faza acut a bolii. Cnd boala e cronicizat
frotiul e dificil de interpretat (gonococi cu morfologie atipic)
Izolare - se face pe medii selective Thayer-Martin sau New York
City (NYC) plcile nsmnate se incubeaz la 34-36C n atmosfer umed cu
3-10% CO2. Se examineaz dup 18-24h, apoi dup 48h. Dup 1 zi de
incubare coloniile tipice vor avea diametru de 0.5-1mm, culoare
variabil (alb/gris), de la transparente la opace, ridicate convex
ad plate. Dup o incubare suplimentar pot ajunge la 3mm i pot deveni
mai puin netede. De multe ori apar ambele tipuri de colonii
descrise mai sus
Identificare prezumptiv a coloniilor gonococ-like: frotiu Gram +
testul oxidazei (detecteaz citocrom C oxidaza) Teste de confirmare
pe mediu CTA (cystine tryptic agar), mediu Hill - fermentarea
zaharurilor doar glucoza n vog mediile cromogene pt ambele tipuri
de Neisserii patogene (att meningococ ct i gonococ)
Antibiograma
Diagnostic imunologicdetectare de antigen prin metode
imunoenzimatice - au specificitate i sensibilitate mare i se obine
rezultatul n 4 ore. Dar:
nu pot fi aplicate unor produse patologice extra-genitale (se
lucreaz doar cu secreie uretral / cervical) antibiograma rmne
nefcut.
imunofluorescen direct folosind anticorpi monoclonali
anti-proteina I. diagnostic serologic se folosete doar n studii de
cohort (nu diagnostic individual); nu difereniaz infeciile recente
de cele vechi; nc nu a aprut un test suficient de sensibil i de
specific. Familia Enterobacteriaceae Caractere generale - BGN
(bacili Gram-negativi) nesporulai, mobili (flageli peritrichi) sau
imobili, nepretenioi nutritiv (cersc pe medii cu pepton n prezena
bilei), fermenteaz glucoza, oxidazo-negativi, produc catalaz, reduc
nitraii n nitrii.
Diagnostic de laboratorrecoltare n funcie de sediul infeciei
(urin, materii fecale, snge, bil, lichid de vom, sput, alimente
suspecte, piese necroptice, tampoane plgi, puncii aseptice..)
transport pe mediu Cary-Blair care inhib microbiocenoza i permite
viabilitatea germenilor patogeni aproximativ 4-6 zile. Frotiu din
produs patologic +/nsmnare n scopul izolrii & identificrii -
identificare preliminar (sisteme multitest) ncadrare gen/specie
- identificare de certitudine ncadrare specie/tip - biologic
teste convenionale, kituri microtest - serologic (lam / tub) -
tipizare bacteriofagic (lizotipie), bacteriocinic
(bacteriocinotipie), biochimic (biotip), antibiotic (rezistotip),
molecular genetic (ribotip, tip plasmidic) Cultivare pe medii
nutritive simple bulion simplu (bulion glucozat) - colonii S cultur
tulbure, uniform, fr depozit - colonii R limpede ori tulbure n
grade diferite, cu inel sau vl, cu depozit agar nutritiv - colonii
S 2-3 mm, rotunde, bombate, umede, cu suprafaa neted i margini
regulate - colonii R 2-3 mm, rotunde, plate, cu suprafaa rugoas i
margini neregulate - pot exista colonii mucoide (4-5 mm, rotunde,
bombate, margini neregulate, tendina la confluare) Klebsiella, +/-
Escherichia - colonii pigmentate - fenomen de cretere invaziv n
jurul coloniilor se dezvolt zone de migrare concentric (Proteus)
agar-snge - aspectul coloniilor ca pe agarul nutritiv +/-
dezvoltare de hemoliz Medii de mbogire - bulionul selenit de sodiu
selenitul inhib n special bacteriile lactozo-pozitive se folosesc n
diagnosticul salmonelozelor bulionul pt. BGN inhib cocii, +/-
bacilii Gram-pozitivi. Mediul Mller-Kauffman (mediu lichid cu verde
briliant ca indicator) pt izolarea Salmonella typhi Medii selective
slab selective
-
de obicei inhibitorii pt toi cocii Gram-pozitivi i bacilii
Gram-pozitivi i pt fungi permit creterea difereniat a unor BGN
oxidativi-fermentativi ex: Mac Conkey (inhibitor = sruri biliare,
zahr = lactoza, indicator = rou neutru), EMB (inhibitor = albastru
de metilen) pe Mac Conkey Salmonella, Shigella i Proteus dezvolt
colonii lactozo-negative semitransparente ce modific culoarea
mediului enterobacteriile condiionat patogene lactozo-pozitive
cresc sub form de colonii mari cu centru rou; pot fi nconjurate de
un halou opac roz prin precipitarea srurilor biliare
-
-
moderat selective inhibitori pt toat flora Gram-pozitiv, ali BGN
care nu sunt enterobacterii (excepie: Vibrio) i chiar parial pt
enterobacterii lactozo-pozitive cresc bine lactozo-negativii
(Salmonella, Shigella) mediul ADCL (Leifson) agar, dezoxicolat,
citrat, lactoz pt izolarea Salmonella - unele bacterii (Salmonella,
+/- Proteus) au capacitatea de a metaboliza citratul: citrat de
fier se elibereaz Fe - n prezena H2S - colonii cu centru negru
(Salmonella colonii transparente; Proteus colonii mate) -
lactozo-pozitivii (E. coli, Klebsiella), dei parial inhibai, apar
de culoare roie. mediul SS (Salmonella Shigella) cu sruri biliare
nalt selective inhib toate enterobacteriile cu excepia Salmonella
intite pe bacilul tific mediul Wilson-Blair glucoz, tiosulfat de
sodiu, citrat amoniacal de bismut, verde briliant, sulfat feros
coloniile de Salmonella typhi colonii negre, cu suprafa rugoas R,
margini crenelate, dezvolt n jur un halou negru cu reflexe metalice
- pt investigarea purttorilor cronici sau a contacilor mediul CIN
(cefsulodin = antibiotic, Irgasan = inhibitor, novobiocin) pt
izolarea Yersinia Medii difereniale AABTL agar, albastru de
bromtimol, lactoz + hiposulfit de sodiu - coloniile apar sub form
de colonii - verzi-albstrui lactozo-negative
- galbene lactozo-pozitive - pe acest mediu, Proteus nu produce
fenomen de invazie (datorit prezenei hiposulfitului de sodiu)
Coloniile suspecte de pe mediile selective se retesteaz pe medii
multitest. n paralel se fac teste biochimice adiionale. TSI MILF
MIU TSI = triple sugar iron agar tripluzaharat ( glucoz, lactoz,
zaharoz), sulfat feros, rou fenol - panta fermentare lactoz-zaharoz
- poriunea dreapt fermentare glucoz - fragmentare mediu, mpingere
mediu spre suprafa (poate sri dopul!) producere de gaz prin
degradarea glucozei - nnegrirea poriunii drepte elaborare de H2S
(formare de sulfur de fier) nensmnat culoare roz-rou !!!! Dac nu se
nglbenete poriunea dreapt nu e enterobacterie!!!! nsmnarea se face
cu firul se neap partea dreapt a mediului, apoi se traseaz pe pant
micri n zig-zag. se citesc dup incubare 18h la 37. MILF =
mobilitate / indol / lizindecarboxilaz / fenilalanil-dezaminaz
nensmnat mov geloz, substrate difereniale (pepton cu triptofan,
L-lizin, fenilanin), indicator brom cezol purpur i rou crezol hrtie
impregnat cu reactiv de culoare (Ehrlich) - mobilitate =
turbiditate pe toat coloana de mediu - indol se coloreaz hrtia n
rou-violet (triptofanul metabolizat la stadiul de indol) -
lizindecarboxilaza vireaz culoarea mediului n violet intens -
virare n galben
- lizin-negativ se nglbenete mediul - fenilalanin dezaminaza
apariia unui inel verde la adugarea de soluie apoas 10% de clorur
feric acidifiat
MIU mobilitate / indol / ureenensmnat roz-portocaliu mobilitate
& indol idem MILF culoare alcalinizat (roie) ureaz prezent
culoare nemodificat ureaz absent
Dac se lucreaz cu MILF se testeaz ureea separat mediu
Black-Christensen incolor la neutralitate; dac produce ureaz
cyclamen Citrat Simmons nensmnat verde bacteria utilizeaz citratul
culoare albastr.
Modern pt identificare sistemul API n kituri (20-24 de teste)
Identificarea serologic (serotipia) pt tulpinile de E. coli izolate
pe AABTL din materiile fecale de la nou-nscut cu sindrom
toxico-septic epidemic r. de aglutinare pe lam / confirmare n
tuburi seruri polivalente anti E. coli seruri monovalente
- alternativ: imunofluorescena n materii fecale Shigella pt
ncadrarea ntr-una din subgrupele antigenice A Sh. dysenteriae 10
serotipuri B Sh. flexneri 6 serotipuri C Sh. boydi 15 serotipuri D
Sh. sonnei 2 serotipuri
- aglutinarea pe lam (de pe TSI), confirmat de aglutinarea n tub
Salmonella de pe mediu TSI sau AABTL Se folosesc truse cu seruri
imune de diagnostic Ser anti Vi Ser polivalent O anti-Salmonella
Seruri de grup O (AO, BO, CO, DO, EO.) Seruri monovalente flagelare
anti-H
- pentru identificare se folosete schema Kauffmann White
Tipizarea lizotipia principiu tulpina de cercetat se nsmneaz pe
geloz repartizat n cutii Petri pe care n prealabil s-au desenat
ptrele notate. n ptrele se dispune cu ansa setul de bacteriofagi,
se incubeaz la 37 / 18 h i se citesc reaciile litice (liz
confluent, semiconfluent, opac, plaj). Se compar spectrul de
lizosensibilitate al tulpinii testate cu cele incluse n scheme
standardizate este necesar pentru stabilirea sursei de infecie i a
filiaiei cazurilor n enterobacteriozele epidemice Genul Escherichia
- Escherichia coli ****Urocultura prelevare recoltare dup toalet;
prelevare din jetul mijlociu direct n recipient steril cu gt larg,
nainte de instituirea trat Ab n situaii speciale recoltare direct
din vezic prin puncie suprapubian ex direct macro aspect (limpede /
tulbure) - micro centrifugare ex. sediment urocultur cantitativ -
metoda diluiilor seriale din urina omogenizat se fac diluii
zecimale n ser fiziologic (1/10, 1/100, 1/1000) Din fiecare diluie
se depun cte 0,1ml pe suprafaa a dou plci Petri cu urmtoarele medii
de cultur: geloz snge i un mediu diferenial (Mac Conkey sau AABTL).
Dup incubare 18-20h la 37 se numr coloniile izolate, iar rezultatul
se calculeaz dup formula: nr. germeni = nr. colonii dezvoltate x 10
x diluia
Negu: nr. germeni = nr. colonii x factor de corecie x inversul
diluiei / nr. de plci f. de corecie = 5 la 0,1ml i respectiv 10 la
0,2 ml. Interpretare 105 germeni/ml = bacteriurie ce denot sigur o
infecie urinar 104-105 germeni/ml = bacteriurie suspect se repet
1/160) ELISA, immunoblotting Genul Pseudomonas Diagnostic de
laborator Recoltare n funcie de sediul infeciei
Caractere morfologice, culturale, biochimice -
Frotiu produs patologic BGN polimorfici, nesporulai, necapsulai
+ celule Izolare nsmnare pe geloz i bulion; cresc bine la 42 pe
agar infuzie cord-creier - n bulion turbiditatea mediului; apariia
la suprafa a unei membrane cenuii, aderent de pereii eprubetei; dup
incubare 18-24h la 37 mediul devine vscos, la suprafa apare un
pigment albastru verzui + degajare de miros de flori de salcm / de
iasomie - pe geloz colonii izolate rotunde, lucioase, convexe, cu
reflexe metalice, de culoare albastru-verzui, care coloreaz i
mediul; frecvent prezente plaje de autoliz - pe agar-snge multe
tulpini sunt puternic hemolitice; tardiv coloreaz mediul n brun -
pe Mac Conkey / Istrati-Meitert (medii slab selective) colonii
mici, lactozo-negative, aderente la mediu - subcultivarea pe mediu
King se folosete pentru evidenierea pigmentogenezei (stimuleaz
sinteza piocianinei / pioverdinei) Culoarea albastru-verzuie este
dat de pigmentul piocianin. Bacilul mai produce i pioverdina
(galben-verde, galben-brun) Germenul prezint mobilitate printr-un
flagel unic testarea mobilitii se face ntre lam i lamel, din
cultura n bulion. Oxideaz glucoza Reduce nitraii Serotipia,
lizotipia, piocinotipia utile n investigarea epidemiologic
Antibiograma
Genul Vibrio Diagnostic de laborator Recoltare materii fecale i
lichid de vom Transport se nsmneaz n maximum 1-3h; dac nu se poate
se pstreaz la frigider 24-48h sau se conserv n mediu de transport
Frotiu din produs patologic BGN ncurbai, cca 2 lungime, cu
polimorfism foarte accentuat (forme cocoide ad filamentoase) +
leucocite + hematii Preparat proaspt bacilul are micri de
rostogolire
Izolare pe medii BSA (Bile Salts Agar) i TCBS (Thiosulphate
Citrate Bile Salts - Sucrose) = medii selective pentru vibrioni dac
se folosesc medii de mbogire = ap peptonat alcalin opacifiere
omogen, pot produce vl pe BSA colonii transparente ca picturile de
rou pe TCBS mediu verde albstrui, colonii galbene pe medii cu snge
- uzual tulpinile non O:1 produc -hemoliz dup 24h incubare frecvent
-hemolitice sunt i tulpinile biovarului El Tor - V. cholerae poate
crete pe Mac Conkey colonii lactozo-negative
Testul oxidazei pozitiv Izolatele cu colonii galbene pe TCBS i
cu testul oxidazei pozitiv se supun aglutinrii pe lam cu ser
anti-holeric O:1 i O:139. Aglutinarea se confirm ulterior prin
teste biochimice (fermentarea glucozei fr producere de gaz este
esenial pt diagnostic) Biotipia diferenierea biovarurilor clasic i
El Tor Serotipia n cazul Vibrio cholerae O:1, indiferent de biovar,
exist trei serovaruri definite prin factorii antigenici a, b i c
(Ogawa, Inaba i Hikojima) Lizotipia Prin biologie molecular se pot
identifica unii markeri epidemiologici pentru biovarul El Tor.
Antibiograma
Genul Helycobacter
Diagnostic de laboratorse investigheaz infecia cu H. pylori n
scop de: - diagnostic la persoanele cu simptomatologie digestiv
superioar - verificare a eradicrii bacteriei la persoanele care au
urmat tratament - studii epidemiologice (aprecierea incidenei) -
prelevare biopsie gastric atenie: bolnavul s nu fi urmat tratament
antibiotic n ultima lun. Examinarea sucului gastric NU este util,
bacteria fiind foarte rar prezent. - Din materialul bioptic, un
fragment va fi plasat direct n mediu cu uree i indicator de pH
pentru evidenierea ureazei preformate, alte dou fragmente vor fi
destinate frotiului i culturii (se vor depune ntr-un flacon cu
soluie salin izoton pentru a evita desicaia i contactul cu aerul
atmosferic) i un alt fragment va fi destinat examenului
histopatologic. Testul ureazei (test comercial = Helicotest)
deceleaz prezena ureazei produse de H. pylori n fragmentul bioptic
prin plasarea n mediu tamponat cu uree i indicator de pH (rou
fenol). Ionii de amoniu rezultai alcalinizeaz mediul i modific
culoarea indicatorului (de la galben la roz-rou). Timpul de reacie
variaz n funcie de numrul de bacterii prezente. Citirea se face la
30 min, o or, 3h i 24h. Incubarea la 37 accelereaz reacia.
Microscopia - frotiu colorat Gram sau Giemsa - bacili ncurbai n
form de virgul sau sub forma literei S, uneori spiralai. Cultura -
se omogenizeaz fragmentul prelevat, se depune pe suprafa unor medii
selective i neselective (dispersie cu ansa) incubare la 37, n
condiii de microaerofilie i atmosfer umed examinarea culturilor se
face din ziua a treia pn ntr-a aptea colonii mici, transparente
identificare microscopic i biochimic -
Diagnostic serologic - avantaj metod neinvaziv - ELISA
sensibilitate i specificitate bun, dar posibil reacii fals-pozitive
n infecii cu Campylobacter jejuni. Se mai poate face testul
respirator cu uree marcat (i se administreaz pacientului o soluie
ce conine uree marcat, anterior unui prnz cu coninut bogat n lipide
sau cu acid citric care ntrzie evacuarea gastric). Se determin
cantitatea de CO2 marcat (se folosete 13C neradioactiv) n aerul
expirat de bolnav. Dezavantaj costisitor, necesit echipament
special. Genul Bordetella Recoltare tampon nazal, metoda plcilor
tuite Cultivare - germeni pretenioi nutritiv - pe mediu
Bordet-Gengou (coninut crescut n amidon) incubare la 35-37C n
atmosfer umed, pn la 7 zile, cu citire zilnic dup 48 h de incubare
- B. pertussis formeaz dup 3-4 zile colonii f. mici, convexe, uor
transparente, cu strlucire metalic n lumin oblic transmis apar ca
picturile de Hg sau ca jumti de perle f. aderente, nconjurate de o
zon ngust de hemoliz difuz, vizibil n special cnd coloniile sunt
confluente. Dup 5-6 zile coloniile pot atinge 2-3 mm diametru. - pe
geloz-snge coloniile aparinnd tulpinilor virulente sunt hemolitice
Caractere microscopice - cocobacili Gram-negativi, 0,2-0,5m, izolai
sau n perechi, rar n lanuri scurte, cu tendin la pleomorfism,
filamentare i form bacilar prin subcultivare. Se coloreaz bipolar,
n general palid (se observ mai bine dup prelungirea recolorrii pn
la 2 minute). n primoculturi prezint capsul (vizibil doar prin
coloraii speciale). Imobili (excepie B. bronchiseptica n culturi la
temperatura camerei) Identificare preliminar suspiciune de
Bordetella teste adiionale mobilitate, catalaz, oxidaz, utilizare
citrat, reducere nitrai, ureaz. Reacia de aglutinare pe lam cu
seruri anti B. pertussis, anti B. parapertussis confirm identitatea
izolatelor i identific serovarurile de B. pertussis ca markeri
epidemiologici. Antibiograma - util n faza cataral Examen serologic
Ac precipitani apar n sptmna a 3-a de boal (serologia nu este util
la nceputul bolii). Se face testare n dinamic. Dup unii nu este
test diagnostic. Vaccinarea DTP. Exist i tetravaccin DTPH (+
Haemophilus tip B). Doar la copiii sub 7 ani. Anticorpii se elimin
n aproximativ 10 ani, lsnd adolescenii i adulii mai
susceptibili la boal. Infecia este mai puin sever, dar bolnavii
reprezint o surs de infecie pentru copiii neimunizai. Genul
Brucella Caractere generale - cocobacili sau bacili scuri
Gram-negativi, imobili, nesporulai, strict aerobi,
catalazopozitivi, uzual oxidazo-pozitivi. Hidrolizeaz ureea i reduc
nitraii. Diagnostic de laborator - evideniere: lapte, fecale, bil,
urin, puroi, ganglioni, splin, ficat, LCR, lichid articular, snge,
embrion avortat - frotiu produs patologic bacili scuri sau
cocobacili Gram-negativi. n general se coloreaz palid (este indicat
prelungirea recolorrii cu fucsin). - nsmnare pe medii lichide sau
solide (agar triptoz cu 5% ser bovin = mediul standard pentru
izolarea brucelelor) - izolarea brucelelor din prelevate
contaminate impune suplimentarea mediilor cu amestecuri selective:
bacitracin, polimixin B, vancomicin, acid nalidixic, nistatin - la
izolare, creterea brucelelor este lent culturile incubate aerob n
atmosfer de 510% CO2 trebuie urmrite pn la 10 zile, iar
hemoculturile pn la 3 sptmni. Caractere culturale - n bulion - la
cteva zile dup nsmnare tulbur uniform mediul, dup care crete mai
abundent, face sediment cu supernatant clar - pe medii solide
colonii izolate, rotunde, opace, lucitoare (seamn cu coloniile de
enterobacterii) - pe medii glicerinate cretere mai rapid Inoculare
pe ou embrionat (n sacul vitelin) sau la cobai (1ml subcutanat). Se
tritureaz (embrionul dup 120h, cobaiul sacrificat dup 60 de zile)
se nsmneaz pe medii de cultur Identificarea biochimic - producerea
de H2S - prin introducerea unor colorani n mediu (fucsin bazic,
verde malachit) diagostic diferenial de specie Antibiograma - este
limitat la cteva Ab Genul Haemophylus Diagnosticul de laborator
Recoltare - H. influenzae sput, LCR, lichid pleural, pericardic,
snge - H. ducreyi din ancru (leziunea genital) Frotiu produs
patologic ! - frotiul colorat Gram pentru depistarea hemofililor
trebuie decolorat 20sec (hemofilii nedecolorai corect se confund cu
S. pneumoniae), iar recolorarea nu se face cu safranin (care nu
coloreaz bine hemofilii) ci numai cu fuxin bazic 0,1% sau cu fuxin
Ziehl diluat 1/10, timp de 10min sau 20-30 min la frotiurile din
secreii ancroide.
-
-
H. influenzae cocobacili Gram-negativi n fazele de debut &
stare; polimorfismul apare n convalescen; n LCR apar polimorfi,
majoritatea bacteriilor fiind extraleucocitare. Tulpinile capsulate
izolate din LCR sunt cocobacili, tulpinile mencapsulate, izolate
din sput sunt pleomorfe i apar deseori sub form de filamente sau
acicular. H. ducreyi cocobacili intra / extraleucocitari, colorai
bipolar (capete mciucate), dispui n lanuri scurte sau medii (lan de
biciclet)
Fenomenul de umflare a capsulei - pe o lam: 3 picturi de ser
anti H. influenzae + 3 picturi produs patologic + 1 pictur albastru
de metilen examinare la microscop: umflarea capsulei. relativ
frecvent rezultate fals-negative. Caractere de cultivare -
Hemofilii au nevoie de factorul X (hemina, protoporfirina IX) i
factorul V(NAD nicotin-adenin-dinucleotid sau NADPH) - incubarea: n
atmosfer umed, preferabil n aer cu 5-10% CO2, cu suplimentarea
mediilor agarizate cu Ab (bacitracin, linco, oxa) - medii speciale
care conin factori de cretere X i V. Obinuit geloza-snge conine
factori X i V, dar cantitatea de factor V e foarte mic creterea
foarte slab. Dac se traseaz un striu de stafilococ pe geloz,
hemofilii vor crete n imediata apropiere a stafilococului, deoarece
acesta i furnizeaz factorul V necesar (fenomen de satelitism) -
infuzie de cord bovin pentru hemoculturi - geloz cu snge de cal /
iepure, geloz chocolat (prin adugare de snge la o geloz la 80C),
HTM (Haemophilus Test Medium)... - pe medii solide colonii
nepigmentate gris-lucioase sau uor glbui, plate ori convexe, cu
suprafa neted, diametru maxim 2 mm dup 48 h la 37C. - pe medii cu
snge hemofilii hemolitici produc -hemoliz - medii lichide
turbiditate uniform (cu excepii) Aspectul coloniilor variaz n
funcie de mediul de cultur, specia i serovarul / biovarul
tulpinilor H. influenzae - pe geloz-chocolat cretere cu aspect de
condens tulpinile capsulate produc colonii mai mari (1-3mm) i mai
mucoide, cu tendin la confluare) - pe medii transparente (HTM,
Levinthal) colonii rotunde, convexe, transparente sau
albastru-verzui, 1-2mm; tulpinile capsulate examinare n lumin
transmis oblic strlucire aparte (iridescen) - pe medii cu snge
hemoliz . H. ducreyi - se dezvolt slab pe majoritatea mediilor -
geloz chocolat dup 72h colonii de diametru 0,5mm, plate, netede,
gris-lucioase, translucide
-
se dezvolt mai bine incubate n atmosfer de 10%CO2 la 33C medii
cu snge hemoliz dup 2-3 zile coloniile se mresc pn la 2mm diametru,
centrul devine crateriform.
Identificare serologic - reacia de precipitare cu ser imun
preparat pe iepure (1ml lichid de cercetat + 1ml ser anti- H.
influenzae specific de tip) la limita de contact ntre cele 2
lichide apare un inel alb de precipitare dac reacia este pozitiv.
Identificare definitiv - determinarea caracterelor metabolice
necesitatea de factor de cretere X i V - producerea de indol,
ureaz, ornitin decarboxilaz, producere de H2S, reducere nitrai.
Tiparea antigenic a izolatelor pt H. influenzae - tipare capsular
prin reacia de umflare a capsulei, IF, ELISA, RIA, immunoblotting,
reacie de aglutinare, coaglutinare, latexaglutinare - tipare pt Ag
OMP (outer membrane proteins) electroforez n gel de poliacrilamid -
tipare pt. lipooligozaharide (AgLOSs) Western blot,
imunoprecipitare - tipare pt. proteinele fimbriale - tipare &
caracterizare ADN. Antibiograma - pe geloz chocolat. Profilaxie -
exist vaccinuri se recomand administrarea lor ncepnd cu luna a doua
de via. De regul vaccinarea nu mai este necesar la copiii peste 5
ani sau la aduli i btrni (excepie siclemici, cei cu transplante
medulare, HIV-SIDA, splenectomizai, neoplazici sub tratament).
Genul Corynebacterium - bacili gram-pozitivi, polimorfi, mciucai,
aezai n litere chinezeti sau n palisad, imobili, nesporulai,
necapsulai, aerobi. Corynebacterium diphteriae - Difteria =
toxiinfecie grav. Bacilul rmne cantonat la poarta de intrare unde
determin leziunile specifice (= false membrane), iar toxina
difuzeaz n organism. Celelalte specii ale genului bacterii
difteromorfe sunt n general comensale, putnd ns determina mbolnvire
la imunodeprimai. Caractere culturale - Medii de cultur
Gundel-Tietz ( agar-snge, telurit de potasiu, L-cistin) - mediu
selectiv pentru izolarea i diferenierea biovarurilor de C.
diphteriae - gravis - colonii negre, late, cu margine translucid,
uor crenelat, cu striaii radiare i suprafa granular, friabile; dup
48h - aspect de margaret - mitis - colonii negre, convexe,
lucioase, cremoase - intermedius - colonii negre, netede, cu
margine circulare i centru uor mamelonat Tinsdale (agar, ser,
cistin, telurit, tiosulfat)
- mediu selectiv-diferenial pentru bacilii difterici -colonii
negre, mici, nconjurate de halou cafeniu Agar-snge - colonii cu
aspect alb-gris perlat OST (ou, ser, telurit) - mediu de mbogire
Loeffler - mediu selectiv pe care C. diphteriae crete cu morfologie
caracteristic Diagnostic de laborator # la bolnav - se recolteaz 3
tampoane faringiene i un tampon nazal - tampoanele faringiene se
nsmneaz pe geloz-snge, Tinsdale i OST. Tamponul care urmeaz a fi
nsmnat pe geloz-snge servete i la efectuarea frotiului din produs
patologic (se coloreaz Gram). - Tamponul nazal se nsmneaz pe OST. -
Dup 24 h se face o prim citire, cu frotiu din cultur i repicarea
coloniilor cu halou de pe Tinsdale pe Loeffler i geloz-snge, urmat
de identificare - Din mediul de mbogire (OST) se fac treceri pe
Tinsdale, cu continuarea diagnosticului. # la purttor - se
recolteaz un tampon din faringe i unul nazal - se nsmneaz pe OST,
se face trecere pe Tinsdale, dup 24 de ore se repic pe Loeffler i
pe geloz-snge coloniile cu halou, urmat de identificare. Se poate
face o purificare i repicare pe Gundel-Tietz, urmat de repicare pe
Loeffler. Identificare Testul pirazinamidazei - hidrolizarea
pirazinamidei cu apariia culorii portocaliu la developarea prin
sulfat feriamoniacal Testul cistinazei - pe mediu PISU - C.
diphteriae - halou brun n lungul traiectului de nsmnare (cistinaz
hidrolizarea cistinei din mediu eliberare H2S n prezena acetatului
de plumb se produce sulfur de plumb de culoare neagr) Testul
catalazei - tulpinile catalazo-pozitive - apariia bulelor de gaz la
adugare de peroxid de hidrogen Testul ureazei - pe mediu
Black-Christensen; ureaza hidrolizeaz ureea cu formare de NH3 i
CO2; NH3 alcalinizeaz mediul cu virarea indicatorului rou fenol de
la galben la rou-cyclamen. C. diphteriae - ureazo-negativ.
Reducerea nitrailor - C. diphteriae reduce nitraii n nitrii Teste
biochimice adiionale - pe mediu His cu indicator Andrade;
API-CORYNE - glucoz, zaharoz, dextrin, glicogen, maltoz.... -
variaii ntre biotipuri Toxigeneza Capacitatea de a produce toxina
difteric = caracteristic doar tulpinilor de C. diphteriae
lizogenizate de bacteriofagul purttor de gen tox+ - in vivo -
inoculare la cobai
- in vitro - testul ELEK (reacie de precipitare n gel)
Antibiograma Genul Listeria Recoltare produs patologic (LCR, lichid
amniotic, placent, esuturi fetale, materii fecale, secreii
vaginale, alimente etc) Frotiu produs patologic: bacili scuri,
drepi/ncurbai sau cocobacili, extracelulari sau fagocitai. n LCR
dispui n perechi sau n lanuri scurte nsmnare pe agar triptozat cu
5% snge de berbec, eventual suplimentate cu glucoz sau lichid de
ascit Repicare pe medii agarizate selective Cultivare optim la
20-37C Aspectul coloniilor Colonii netede, rotunde, uor bombate,
transparenete (picturi de rou), centru cu aspect cristalin sticlos,
consisten apoas Irizaie bleu-verzuie la examinarea n lumin oblic
Dup repicare las amprent pe agar L. monocytogenes zona ngust de
-hemoliz Miros caracteristic de lapte acidulat (culturile pe medii
solide) Culoare albstruie pe medii cromogene Teste preliminare
Mobilitatea n preparat umed / coloan de agar moale nsmnare prin
nepare Listeria crete sub forma unei umbrele la 3-5 mm de suprafaa
agarului mobilitate marcat. Fermenteaz glucoza Produce oxidaz,
catalaz, ureaz, H2S pe mediu TSI. Teste de identificare definitiva
pt L. monocytogenes Producerea de hemoliz Testul CAMP Se
insamanteaza un striu din tulpina de S. aureus pe un diametru al
placii Tulpinile de testat si tulpinile martor se nsamanteaza
perpendicular pe striul de S. aureus, fara a-l atinge Incubare
peste noapte la 37 C Test pozitiv largirea cuneiforma in varf de
sageata sau in flacara a ariei de hemoliza produsa de cultura de
stafilococ Test negativ nicio modificare a hemolizei Identificare
serologic cu seruri imune (1a, 4b) pe lam i n tuburi Testarea
serologic Test de screening - Util la gravide pt estimarea riscului
- Determinarea prezenei i a titrului anticorpilor n snge Valori
pozitive: titru > 1/160 Valorile indeterminate (1/160) necesit
repetare n dinamic
Genul Bacillus Bacilus anthracis - bacili Gram-pozitivi, mari,
dispui n lanuri sau izolai, cu spori centrali sau subterminali, mai
mici dect grosimea bacilului, mobili sau imobili, ncapsulai n
produsele patologice, aerobi Diagnostic de laborator Recoltare n
funcie de afeciunea clinic (serozitate din vezicula cutanat sau din
pustul, lichid de edem, sput, materii fecale, snge, material
necroptic, alimente) Examinarea direct (macroscopic i microscopic)
a produsului patologic - serozitate & lichid de edem caracter
hemoragic; sput hemoptoic; materii fecale sanguinolente. - Frotiu
bacili Gram-pozitivi, cu capete drepte, ncapsulai n produs
patologic proaspt, izolai sau dispui n lanuri scurte (2-3 germeni),
cu spori centrali sau subterminali (pe medii agarizate sau n
cadavrele deschise ale animalelor decedate prin antrax; n
prelevatele patologice de la bolnavi sau cultivat n bulion apare
nesporulat) Izolare - nsmnare pe medii simple (bulion, geloz) +
geloz-snge + medii selective - tulpinile virulente sunt de tip R -
n bulion flocoane care se depoziteaz pe pereii eprubetei, mediul
rmnnd limpede - pe medii solide colonii mari, diametru 4-5 mm,
alb-cenuii, turtite, opace, cu suprafaa rugoas, marginile
neregulate aspect de cap de meduz sau coam de leu (periferia
coloniei, examinat cu lupa, apare nconjurat de prelungiri laterale
ondulate ca uviele de pr) - pe medii cu snge colonii nehemolitice
sau slab hemolitice - pe mediu Loeffler (cu ser coagulat de bou)
colonii albicioase care lichefiaz mediul Caractere biochimice -
elaboreaz catalaz - fermenteaz glucoza fr producere de gaz - aciune
proteolitic pe medii cu gelatin lichefiaz mediul dup aprox. 10 zile
- produce lecitinaz - asimileaz citratul Teste de patogenitate
inoculare la oarece animalul moare prin septicemie crbunoas cu edem
gelatinos la locul inoculrii (faa intern a coapsei) i
hepatosplenomegalie) Diagnostic retrospectiv cadavre umane sau
animale = reacia Ascoli evidenierea antigenului crbunos din
organele cadavrelor printr-o reacie de precipitare n inel cu ser
anticrbunos - antigenul de cercetat = filtrat de organ (preparat
prin mojararea fragmentelor de splin sau ficat cu soluie izotonic
de NaCl i fierbere 5-10 minute)
- serul anticrbunos ser de cal - metod ntr-un tub de precipitare
se pun 0,5ml ser i se adaug 0,5ml filtrat cu opipet Pasteur, avnd
grij ca cele 2 lichide s nu se amestece. Extractul e mai uor, deci
rmne deasupra serului, iar prin difuziunea lent a celor dou
lichide, n 5-10 minute apare un inel de precipitare la zona de
echivalen.
Genul Clostridium Clostridiile gangrenei gazoase - bacili mari,
mobili, necapsulai (excepie: Cl. perfringens imobil, capsulat) -
spori mari centrali sau subterminali - Gram-pozitivi, anaerobi
Diagnostic de laborator - recoltare snge pt hemocultur, secreii din
plgi, lichid peritoneal sau din alte caviti nchise, materii fecale,
alimente. - nsmnare n maximum 1 h de la recoltare nu se pstreaz la
rece deoarece Cl. perfringens n stare vegetativ e f. puin rezistent
la temperaturi joase. - Bacterioscopia direct (frotiu din produs
patologic) obligatorie pt. diagnostic - nsmnare pe medii selective
(f. frecvent este prezent flor de asociaie) - Inactivarea
produsului patologic la 70 30 de minute pt distrugerea formelor
vegetative, cu meninerea viabilitii sporilor nsmnare pe medii
speciale n condiii de anaerobioz - nsmnarea pe medii selective
lichide / solide = bulion VF - nsmnare n profunzime n geloz VF n
tuburi Weinberg - Cl. perfringens colonii biconvexe, cu margini
bine delimitate - Celelalte clostridii colonii sub form de grenad
explodat (centru opac, avnd la un pol numeroase filamente) -
nsmnarea se face n condiii de anaerobioz (amestec reductor +
parafin) - nsmnarea pe mediu Willis (glbenu de ou + lactoz) -
elaborarea de lecitinaz n jurul coloniilor mediul se opacifiaz
(lecitinaza desface lecitina din glbenuul de ou) - reacie intens
pozitiv Cl. perfringens - reacie pozitiv Cl. oedematiens -
fermentarea lactozei virarea culorii coloniilor n galben - nsmnarea
n lapte turnesolat d indicaii cu privire la reducerea, acidifierea,
coagularea & digestia coagulului din lapte; Cl. perfringens
laptele se nroete datorit fermentrii lactozei i coaguleaz. Datorit
producerii de gaze cheagul se rupe, se lipete de pereii eprubetei i
n spaiile libere apare un lichid limpede (cheag alveolar) Teste de
patogenitate pe animale sensibile la toxinele histotoxice ale
clostridiilor (oarecele alb i cobaiul) Antibiograma obligatorie
Toxiinfeciile alimentare cu clostridii - botulismul - Cl.
botulinum = bacil mare, cu spor central / subterminal, cu diametru
mai mare dect grosimea bacilului, anaerob. Diagnostic de laborator
- scop = evidenierea i identificarea tipului de toxin +/- izolarea
Cl. botulinum din produsul patologic (vrstur, materii fecale,
produse necroptice) + alimente incriminate. - Evidenierea toxinei =
toxinotipie = test biologic pe oareci sau cobai - Se centrifugheaz
alimentul / produsul patologic n care se presupune c exist toxin
botulinic. Se adaug antibiotic pt inhibarea florei de asociaie. Se
urmrete evidenierea tipului de toxin A sau B (circulante la noi)
Lot animal Prob de cercetat 1 Inoculare supernat ant (0,5ml la
oarece, 1ml la cobai Animalul moare exist toxin botulinic 2
Inoculare supernatant inactivat 15 minute la 100, aceleai cantiti 3
4 Inocularea aceleiai cantiti de supernatant + 0,1 ml ser
antibotulinic anti-B Identificarea tip B toxin (dac animalele
supravieuiesc n lotul 4 i mor n lotul 3)
Scop
Inocularea aceleiai cantiti de supernatant + 0,1 ml ser
antibotulinic anti-A Animalul Identificarea supravieuiete tip A
toxin (dac exist toxin animalele botulinic (e supravieuies
termolabil). c n lotul 3 i Diagnostic mor n lotul 4) diferenial cu
toxinele vegetale (termorezistente)
Clostridium tetani - bacili Gram-pozitivi lungi, cu spor ovalar
sau rotund, mai mare dect grosimea germenului, dispus la una din
extremiti, dnd bacililor aspectul de b de chibrit sau rachet. Sunt
mobili, necapsulai. Diagnostic de laborator - recoltare puroi de la
nivelul plgilor, fragmente de esuturi, cordon ombilical - frotiul
din produs patologic este frecvent neconcludent (examen negativ,
rata de multiplicare a bacilului este redus) - nsmnare pt izolare n
condiii de anaerobioz, n plci Petri, pe geloz cu glbenu de ou sau
geloz Willis (glbenu de ou + lactoz) antibiotice cu caracter
selectiv
- condiiile de anaerobioz sunt asigurate prin mijloace chimice
(amestec reductor carese fixeaz pe capacul plcii) i fizice
(etaneizarea plcii Petri cu parafin solid) - identificare pe baza
caracterelor morfologice frotiu colorat Gram germeni Grampozitivi,
dispui n lanuri, cu spor terminal. - n medii lichide (bulion V.F.)
tulbur uniform bulionul cu producere de gaze i degaj un miros de
con ars - Pe geloz V.F. n tuburi lungi i subiri, nsmnat n
profunzime colonii cu aspect de puf de ppdie cu un centru opac
(germeni mobili) + prezena unor bule de gaz - Pe medii geloz snge
hemoliz Caractere biochimice - lihefiaz gelatina - produce H2S -
produce hemoliz testul biologic tetanos experimental la oarece sau
cobai inoculare de prob prelevat din plaga tetanigen sau filtrat de
cultur. La un lot de animale se administreaz doar produsul, la
cellalt lot se administreaz produsul i ser antitetanic. Test
pozitiv animalele din primul lot fac tetanos experimental
(contractur muscular cu generalizare rapid i deces n 3-4 zile), iar
animalele din al doilea lot supravieuiesc. Genul Treponema
Diagnosticul de laborator Diagnostic etiologic = frotiu din
produsul patologic - leziunea tipic = ancrul dur evidenierea
treponemelor n serozitatea obinut de la nivelul ancrului dur. -
Examinarea se face ntre lam i lamel (produs proaspt recoltat) la
microscopul cu fond ntunecat (form specific, spiralat, spire
uniforme i subiri la extremiti, 7-13 spire strnse i regulate,
mobilitate, micare de flexiune caracteristic treponemelor patogene)
Diagnostic serologic - teste - netreponemice de depistare RBW,
VDRL, RPR - treponemice de confirmare TPHA, FTA-Abs RBW = reacia
Bordet-Wasserman VDRL = Venereal Diseases Research Laboratory RPR =
Rapid Plasma Reagin TPHA = Treponema pallidum Haemagglutination
Assay FTA-Abs = Fluorescent Treponemal Antibody Absorption. Testele
netreponemice sunt teste nespecifice care identific anticorpi IgM i
IgG anti-lipoidali (anti-cardiolipin) Testele treponemice au
specificitate nalt, confirm serurile reactive cu VDRL. Identific
anticorpii treponemici (FTA-Abs Treponema Reiter)
Titrul este variabil cu stadiul infeciei, scznd spre stadiul
tardiv, dar rmnnd pozitiv ani de zile (martor de infecie).
Seroreversia se produce foarte rar (excepie: pacienii HIV-pozitivi
tratai).
Protocol de diagnosticPentru depistare se face VDRL & TPHA -
VDRL negativ, TPHA negativ exclude infecia / repet peste 21 zile. -
VDRL pozitiv, TPHA negativ debut de boal repet peste 21 zile reacie
fals-pozitiv dac dup 21 zile rezultatul este identic - VDRL
pozitiv, TPHA pozitiv sifilis confirmat, n evoluie - VDRL negativ,
TPHA pozitiv sifilis confirmat, tratat (?). Serurile VDRL-pozitiv
trebuie repetate cantitativ. n neurosifilis VDRL-LCR pozitiv
confirm diagnosticul LCR-TPHA pozitiv nu este diagnostic pentru
neurosifilis LCR-FTA-Abs negativ diagnostic de neurosifilis
improbabil. Urmrirea gravidelor se face prin testare obligatorie la
prima vizit ante-natal i n trimestrul III. Dac prima vizit
ante-natal coincide cu internarea n maternitate, atunci se face
testarea gravidei i a copilului la natere. Pacienii confirmai cu
sifilis sunt urmrii prin VDRL cantitativ. Tratamentul trebuie
continuat pn cnd titrul scade de minimum 4 ori (dou diluii) fa de
cel iniial. Genul Borellia Diagnostic - principiul de baz n toate
cazurile de borrelioz Lyme este diagnosticul clinic, criteriile
clinice (istoricul cazului, simptomele, datele clinice) reprezentnd
factori decisivi pentru diagnostic i pentru evaluarea datelor de
laborator. - Criterii de laborator pentru diagnostic: - Izolarea B.
burgdorferi dintr-un specimen clinic sau - Demonstrarea prezenei
anticorpilor IgM sau IgG anti B. burgdorferi n ser sau LCR. Se
recomand identificarea prezenei anticorpilor prin test ELISA sau
imunofluorescen i continuarea cu Western blot. (seruri pozitive sau
dubioase). - dup 3-6 spt. Apar Ac IgM, mai trziu apar i IgG
decelabil titrul timp de luni / ani ! la pacienii cu titru mare la
testarea cu Ac treponemici fluoresceni s nu aib de fapt o borrelioz
Tratament amoxicilina i ceftriaxona sunt nc antibiotice de elecie.
Rspunde bine i la penicilin i tetraciclin Genul Leptospira
Diagnostic de laborator Diagnostic bacteriologic - prezena
leptospirelor se poate cerceta n snge, LCR, urin, apa de but - n
prima perioad a bolii (primele 10 zile) se caut germenul n snge,
LCR. La cadavre se examineaz fragmente de organe interne (ficat,
rinichi). Examinarea se face prin: - examen direct, preparat nativ
(ntre lam i lamel) - cultivare i izolare pe medii speciale sau prin
inoculare la animale - n a doua perioad a bolii (ziua 10-21)
leptospirele se caut n urin sau n ser. Se asociaz diagnosticul
serologic. Cultivarea pe medii simple, lichide / semisolide,
suplimentate cu ser de iepure (mediu Korthof, Uhlenhuth), n
aerobioz, la 28-30C. nsmnarea trebuie fcut n primele 2 ore de la
recoltare (dup 2-4 ore leptospirele se lizeaz i dispar). Culturile
se urmresc 60 de zile (se incubeaz o parte la 28C, restul la 37C).
Culturile care se tulbur nu conin leptospire (creterea i nmulirea
leptospirelor nu modific mediul de cultur, care rmne limpede). Din
mediile de cultur se fac din 5 n 5 zile frotiuri colorate May
Grnwald Giemsa (leptospirele apar colorate n violet) sau cu
coloraie argentic Fontana Tribondeau (leptospirele apar colorate n
negru pe fond galben) - reacia oxidazei - pozitiv Diagnostic
serologic - reacia de aglutinare anticorpii aglutinani apar din
ziua a 8-a de boal, titrul fiind maxim n sptmna 3-4, apoi scznd
treptat, meninndu-se un titru mic ani de zile. - Reacia de fixare a
complementului are valoare practic pt precizarea diagnosticului
pozitiv precoce (diagnostic diferenial ntre o boal recent i una mai
veche) ; reacii pozitive foarte precoce (din ziua a 3-a de boal);
titrul crete n paralel cu evoluia bolii, fiind maxim n ziua 20 -
ELISA - decelare IgG sau IgM indic stadiul infeciei. Diagnostic
biologic inoculare la animale de laborator (cobai, hamster, iepure,
oarece) recoltare de snge prin puncia cordului; prezena
leptospirelor n peritoneu; la moartea animalului, leptospirele se
gsesc n leziunile hemoragice din organe. Tratament elecie
penicilina / alternative: tetra, eritro, strepto. Genul Chlamydia
morfologie corpii elementari = forme extracelulare infecioase,
dense, inerte metabolic ader la celulele int induc internalizarea n
acestea (Macrofage, cel epit) la ptrunderea n celul corpul
elementar este nconjurat de o vacuol-fagozom chlamidiile viabile
mpiedic fuzionarea fagosomului cu enzimele lizozomale n vacuol
corpul elementar se transform n corp reticular (celul mai mare, cu
perete celular mai puin rigid) care se divide vacuola capt aspectul
unei incluzii dup 18-20h de la ptrunderea corpilor elementari n
celul AND-ul corpilor reticulari se condenseaz i se constituie noi
corpi elementari n interiorul vacuolei sunt eliberai odat cu liza
celulei gazd corpii elementari se coloreaz n purpuriu cu Giemsa i n
rou cu Machiavello vizibili n citoplasma albastr a celulei
gazd.
-
Cultivare n lab pe ou embrionat / culturi de celule Dg lab -
prelevare: secr conjunctival, secr uretrale, vaginale, aspirat ggl
n LGV, EF, aspirat traheobronic, sput, snge pt serologie - ex
microscopic (Giemsa, Machiavello) - cultivare ou embrionat /
inoculare la oarece / culturi de celule - serologie RFC evid Ac fa
de Ag de grup Chlamidia Semnif dg la titru >= 1/64 sau mrirea de
4x ntre 2 determinri // hemaglutinare, ELISA Genul Rickettsia
Diagnosticul de laborator n tifosul exantematic Diagnostic
bacteriologic - pe frotiurile colorate apar n lanuri de bacili, dnd
aspectul de filament - bacterii Gram-negative. Pot fi colorate cu
coloraia Giemsa sau Machiavello. - Izolarea doar n laboratoare
specializate inocularea sngelui de la bolnav pe culturi celulare,
embrion de gin, cobai. - Toate tulpinile de rickettsii izolate n
culturi celulare / embrion / cobai se identific prin metode
imunologice: - Reacia de microaglutinare - Reacia de
seroneutralizare a puterii patogene cu seruri de referin Diagnostic
serologic 1. reacii cu antigen specific Reacia de hemaglutinare
pasiv deceleaz IgG i IgM poate deosebi tifosul primar de recdere -
reacie pozitiv depozit mic de hematii, uneori cu inel central de
eritrocite sedimentate, la agitare aprnd grunji fini. - Titrul
hemaglutinant al serului de cercetat este dat de ultima diluie care
determin reacie pozitiv - Reacia de hemaglutinare pasiv este
pozitiv din ziua a 4-a de la debutul bolii; titrul crete progresiv
pn n sptmna a 3-a de boal, apoi scade la valori mici. RFC ca
antigen specific se folosete o suspensie de Rickettsia prowazeki -
titru pozitiv 1/16 1/32 - crete n cursul bolii - titrul pozitiv
este titrul indicat de ultima diluie care determin o reacie de
fixare a complementului pozitiv (hemoliz parial 50%, sediment de
eritrocite mici, lichid supernatant colorat n rou). - reacia se
repet de 2-3 ori n cursul bolii pentru a se urmri dinamica
anticorpilor. - n cursul bolii RFC cu antigen rickettsian este
pozitiv din ziua a 6-a a 7-a de boal, crete progresiv i are valoare
maxim n ziua 20-25 de boal - n tifosul de recdere, RFC cu antigen
rickettsian este pozitiv din a 4-a a 6-a zi de boal, titrul fiind
maxim n ziua 8-10 de boal. 2. reacii cu antigen nespecific
-
Reacia de aglutinare n tuburi (reacia Weil-Felix) - Rickettsia
prowazeki conine un polizaharid comun cu antigenul somatic al
bacilului Proteus OX 19. titruri mari 1/1000 1/10000 la prima
mbolnvire titruri mici 1/25 1/250 sau negative n boala
Brill-Zinsser (tifosul de recdere)
Genul Candida
Diagnostic
recoltarea produsului patologic (fir de pr, scuame, unghii,
exsudate, puroi, urin, secreii vaginale, uretrale, materii fecale,
LCR, lichid pleural, bil, material bioptic.) examen microscopic
direct - produs patologic lichid preparat direct lam/lamel - produs
patologic solid n hidroxid de potasiu - poate evidenia celule
levuriforme nmugurite +/- pseudomicelii permite diagnosticul de
grup - n cazul puroiului recoltat n micozele profunde se examineaz
aspectul i structura filamentelor diagnostic de gen - frotiuri
colorate Albastru de metilen, Gram nsmnarea pe medii de cultur
mediul Sabouraud (solid / lichid) (glucoz, ap peptonat, agar, ap
distilat + streptomicin care inhib dezvoltarea bacteriilor) - se
urmresc: timpul de dezvoltare, forma, consistena, pigmentaia
coloniilor - frotiu din cultur morfologia fungilor difereniere de
grup (levuri sau mucegaiuri) + prezena de micro/macroconidii, spori
studii biochimice pt identificare de specie - fermentarea
zaharurilor (glucoz, maltoz, zaharoz, lactoz, rafinoz) - asimilarea
zaharurilor Infecia experimental - pt dermatofii cobai, oarece alb
- pt levuri - iepure - pt ali ageni micotici (n special n cazul
micozelor profunde) cobai, obolani, oarece Antifungigrama
