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DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA

RINOTRAQUEÍTIS INFECCIOSA BOVINA (IBRV)

Puede haber sospecha de la IBR por la sintomatología de la enfermedad,

basándonos en datos epidemiológicos, clínicos y lesiones, pero dado que no son

definitivos y pueden confundirse con otras enfermedades e incluso, en muchas

ocasiones presentarse sin sintomatología, se necesita un examen de laboratorio para

llegar a un diagnóstico definitivo. El diagnóstico de laboratorio se basa en la detección

del virus causante o de sus componentes y/o de los anticuerpos específicos que

induce. Se hace referencia a las técnicas de diagnóstico más utilizadas en los

laboratorios de análisis rutinarios.

Diagnóstico de la IBR en un brote sintomático

En estos casos se intentará detectar el virus a partir de las lesiones que

presenten los animales. Estas muestras serán hisopos de exudados nasales o

traqueales en el caso de sintomatología respiratoria y de hisopos genitales en los casos

de vulvovaginitis y balanopostitis.

Igualmente se puede detectar la presencia de un brote mediante la serología.

Para ello es necesario tomar muestras de sangre de los mismos animales en fase aguda

y convaleciente (21 días después aproximadamente) de la infección para observar si ha

existido seroconversión.

En el caso de animales muertos o abortos pueden recogerse las muestras de los

principales órganos (tabla 1) y conservarlas refrigeradas hasta su urgente envío al

laboratorio o incluso llevar el animal o feto entero para su necropsia en el laboratorio

(ilustración1).

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Tabla 1. Muestras de elección para el diagnóstico de la IBR.

TIPO DE MUESTRA TÉCNICA

FETOS Pulmón, riñón, hígado, bazo,

timo, parótida y placenta

Aislamiento vírico, IF, PCR

Líquidos fetales ELISA-AC, SN

Suero de la madre ELISA-AC, SN

BECERROS

NEONATOS

Pulmón, riñón, hígado, bazo y

timo

Aislamiento vírico, IF, PCR

Suero de la madre ELISA-AC

ANIMALES

MUERTOS

Pulmón, riñón, hígado y bazo Aislamiento vírico, IF, PCR

Exudado torácico ELISA-AC, SN

Otras muestras según lesiones Según muestra

ANIMALES

VIVOS

Semen, lavados traqueales,

hisopos nasales, bucales, o

genitales según lesión

Aislamiento vírico, IF, PCR

Suero de animales en fase aguda

y convaleciente

SN, ELISA-AC:

Observar seroconversión

Ilustración 1.Toma de muestras en feto bovino.

Líquidos fetales

Parótida Hígado Riñón

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Es necesario que las muestras lleguen lo menos contaminadas posibles al

laboratorio para evitar la inactivación del virus en el caso de que se intente su

aislamiento. Un buen procedimiento para la recogida de muestras en el caso de

sintomatología respiratoria, que es la más común en los brotes de IBR, es la recogida

de exudados traqueales, menos contaminados que los nasales, con objeto de

analizarlos para el herpesvirus tipo-1 (BHV-1) y bacterias. La aspiración transtraqueal

(ATT) es una técnica inofensiva para el animal, pues los únicos efectos indeseables que

pueden aparecer son una ligera hemorragia en el punto de punción o la emisión de

moco sanguinolento por la nariz, remitiendo ambos signos espontáneamente en

algunos minutos. La técnica requiere entre 10 y 15 minutos y no precisa trabajar

estérilmente, pero sí con el máximo de higiene, evitando cualquier contacto del

catéter con la piel del animal o del veterinario.

Descripción de la ATT (ilustración 2): En el caso que el animal sea muy nervioso,

previamente al inicio de la técnica, se puede tranquilizar al animal con un fármaco

sedante y aplicar anestesia local con la inyección subcutánea de 5 ml. de xilocaína en el

punto de punción. Para realizar la técnica el animal debe sujetarse adecuadamente de

tal manera que la cabeza quede en posición alta con el cuello en extensión moderada.

El lugar de la punción se sitúa en la zona media del cuello, en donde la tráquea

se palpe más fácilmente. La zona de intervención se afeita se afeita y se desinfecta con

alcohol o povidona iodada. El veterinario atraviesa primero la piel con el trócar del

catéter venoso de 75 cm. de longitud, dirigiendo el bisel de éste hacia abajo.

Posteriormente, se acerca la punta del trócar contra la tráquea, perforando

ésta perpendicularmente a su orientación, bien entre dos anillos traqueales o uno de

ellos. La extremidad del trócar se orienta en dirección al pulmón y se empuja el catéter

en la tráquea. En el caso de que el animal tosa, sobre todo, al pasar el cruce traqueo-

bronquial, se interrumpe la progresión del catéter para evitar que el mismo se retuerza

en dirección a la cavidad nasal. Cuando finalice el acceso de tos, se hará introducirá el

catéter entre 40 y 70 cm. según la edad y el tamaño del animal.

Se extrae el trócar de la tráquea y de la piel para evitar heridas si el animal se

mueve. Rápidamente se inyectan 50-60 ml. de solución fisiológica isotónica estéril con

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una jeringa estéril e inmediatamente se reaspira; de esta forma se recupera entre 1 y

10 ml. de líquido (de media 2-3 ml.). El aspecto turbio y/o mucoso del líquido, a veces

teñido de sangre, indica que la toma de muestra se ha realizado correctamente; en

caso contrario, se pueden inyectar de nuevo 50 ml. de solución y aspirar sin que

suponga riesgo para el animal. Finalmente, se retira el catéter, se trasvasa el líquido

recuperado a un tubo seco estéril y se vuelve a desinfectar la zona de punción.

Técnicas para la identificación del virus

- Aislamiento vírico:

Se realiza mediante cultivo celular, para lo que hay que disponer de líneas

celulares establecidas específicas para ello. Una vez comprobado el efecto citopático

del virus (ilustración 3), hay que identificarlo mediante neutralización con un antisuero

específico frente al BHV-1 o por la demostración directa del antígeno mediante

técnicas de inmunofluorescencia (ilustración 3)o inmunoperoxidasa con un antisuero

específico.

Ilustración 2. Toma de muestra de exudado traqueal (fotografías cedidas por Javier Diéguez).

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- Detección del antígeno vírico:

Por extensión directa de las muestras de hisopos en un portaobjetos y posterior

realización de la técnica de inmunofluorescencia directa o indirecta con un anticuerpo

específico.

- Detección del ácido nucleico mediante PCR:

Técnica desarrollada en la última década, pero aún no reconocida como prueba

oficial en el comercio internacional por su falta de estandarización. Experimentalmente

es más sensible que el cultivo e incluso es posible detectar ADN vírico en ganglios

sensoriales con infección latente. Su principal utilización es para diferenciar cepas

vacunales con el gen gE deleccionado de cepas de campo.

Es posible que en ocasiones los resultados puedan parecer contradictorios al

emplear diferentes técnicas de diagnóstico, pero es necesario indicar que éstas son

complementarias y no excluyentes (tabla 2). Así por ejemplo podemos encontrar:

– Aislamiento positivo/IFD negativo: el virus es viable porque es capaz de

multiplicarse en un cultivo celular, pero no se pudo detectar en la

fracciones de tejidos analizados.

Ilustración 3. Efecto citopático en cultivo debido al BHV-1 y demostración del agente por la técnica de inmunofluorescencia. (fotografías cedidas por Carmen Eiras).

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– Aislamiento negativo/IFD positivo: el virus no es viable, pero las

partículas virales son detectadas en los tejidos.

En ambos casos la presencia del virus estaría confirmada.

Igualmente es necesario conocer la dinámica de la infección fetal para

interpretar correctamente los resultados.

Diagnóstico del IBR en estudios epidemiológicos o en programas de

control/erradicación

En la mayoría de los casos el IBR se presenta de forma asintomática o puede

estar presente en la explotación de forma silente debido a la presencia de animales

con infección latente. En estos casos, al igual que si se quiere detectar los animales

positivos debido a la implementación de un programa de control o para comercio

internacional, las técnicas serológicas de detección de anticuerpos son las de elección.

Las principales técnicas serológicas para el diagnóstico de IBR son:

- Seroneutralización (SN):

Fue la técnica gold standard durante muchos años hasta que se desarrollaron

las técnicas inmunoenzimáticas (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay), siendo

Técnicas directas Ventajas Limitaciones Observaciones

Aislamiento vírico (cultivo)

- Un resultado positivo confirma la presencia del virus

- Un resultado negativo no asegura la ausencia del virus: virus no viable - Requiere laboratorio y personal especializado - Mayor tiempo de diagnóstico

- Se recomienda el cultivo de una mezcla de órganos.

Inmunofluorescencia (IF)

- Un resultado positivo confirma la presencia del virus. - Permite el diagnóstico aunque el virus no sea viable

- Un resultado negativo no asegura la ausencia de enfermedad: fracción de tejido sin peresencia del virus - Requiere laboratorio y personal especializado

- Interpretación de resultados subjetivo

PCR - Un resultado positivo confirma la presencia del virus. - Sensibilidad elevada.

- No estandarizado - Permite diferenciar cepas vacunales de cepas de campo

Tabla 2. Técnicas de diagnóstico directas para detectar el BHV-1.

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aún una de las técnicas prescritas para el comercio internacional. Aunque actualmente

ha sido sustituida en los laboratorios de diagnóstico rutinario por las técnicas de ELISA,

dado que requiere la presencia de cultivos celulares para su realización, sigue

empleándose como referencia para el desarrollo de nuevos ELISA y como prueba de

máxima sensibilidad. No permite diferenciar anticuerpos debidos a infección de campo

de los generados por vacunas marcadoras.

- ELISAs:

Actualmente las más utilizadas en los laboratorios de diagnóstico por su

sensibilidad y especificidad, sencillez y bajo precio. Es una prueba prescrita para el

comercio internacional y se han desarrollado varios tipos que permiten diferenciar

anticuerpos debidos a vacunas marcadoras de anticuerpos debidos a infección de

campo. Igualmente pueden utilizarse para el diagnóstico en leche de tanque:

o ELISA Indirecto: detecta todo tipo de anticuerpos del virus BHV-1. Es el

más sensible para utilizar en el diagnóstico de leche de tanque, pero no

permite diferenciar animales vacunados con vacunas marcadoras.

o ELISAs de bloqueo:

ELISA-gB: detecta anticuerpos frente a la glicoproteína gB del

BHV-1 que es la de mayor intensidad en la respuesta a la

infección. Es el ELISA de elección en muestras de suero por su

elevada sensibilidad. No diferencia animales vacunados con

vacunas marcadoras de los infectados con virus de campo.

ELISA-gE: detecta anticuerpos frente a la glicoproteína gE del

BHV-1. Es la única prueba que permite diferenciar anticuerpos

debidos a vacunas marcadoras en las cuales se encuentra

deleccionada la glicoproteína gE del virus, por lo que en los

animales vacunados con estas vacunas el resultado debería ser

negativo (ilustración 4).

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Para interpretar correctamente los resultados hay que tener en cuenta la

respuesta humoral a las diferentes glicoproteínas del virus (ilustración 5).

Como muestra la ilustración, la respuesta a la glicoproteína gE es de menor

intensidad y más tardía que la producida por la glicoproteína gB, de ahí la menor

sensibilidad de los ELISAs gE. En este sentido su utilización para el diagnóstico en leche

de tanque no está recomendada de cara a declarar como libre un grupo de animales

tras un resultado negativo, ya que en ocasiones no detecta prevalencias por debajo del

20% o incluso mayores. Por eso en algunos planes de control, la monitorización en

Ilustración 4. Resultados de serología según status del animal.

IBR: INMUNIDAD HUMORAL

BH

V-1-

glic

opro

teín

as

gB

gD

gC

gE

gG

Intensidad de la respuesta inmune

Anticuerpos neutralizantes después de 8 a 10 diaspost infeccion

Anticuerpos neutralizantes después de 8 a 10 dias post infeccion

Anticuerpos después de 14 a 35 (?)dias p.i.

Anticuerpos neutralizantes después de 10 a 22 dias post infeccion

Ilustración 5. Respuesta humoral de las glicoproteínas del BHV-1.

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leche de tanque se utiliza para estimar la prevalencia en un rebaño, suplementándose

con pruebas individuales en suero de grupos de animales del rebaño (Ilustración 6).

Ilustración 6. Propuesta de diagnóstico de la IBR en explotaciones de leche.

La muestra de leche de tanque tiene mayor utilidad para monitorizar

explotaciones: partiendo de un perfil serológico inicial acompañado a su vez de un

resultado de leche de tanque que se corresponda con ese perfil, se podrá ver la

evolución de la granja. En condiciones favorables los niveles de anticuerpos tenderán a

mantenerse estables o disminuir. Si una explotación se infecta, estos niveles se

elevaran; al obtener información con única muestra el coste del análisis es bajo y en un

programa de monitorización se puede hacer cada 6 meses.

La elección de un porcentaje de animales mayores de 9 meses se debe a que los

anticuerpos calostrales pueden estar presentes en animales menores de esta edad, lo

que podría dar lugar a falsos positivos. Se incluyen los animales hasta 36 meses debido

a que el grupo de animales de primer parto es el de mayor riesgo de seroconversión

debido al estrés que produce esta situación.

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Para conocer el estatus sanitarios de una granja, una opción adecuada y

sencilla es realizar análisis de anticuerpos (normalmente mediante ELISA) a una

muestra de animales de diferentes edades (perfil serológico). Una vez introducido en

una explotación, el BHV-1 se extiende rápidamente y todos o la mayor parte de los

animales inducen anticuerpos.

Ejemplos de perfiles serológicos

Explotación con infección antigua: en este caso los animales mayores de 36 meses han

tenido contacto con el virus y tienen anticuerpos; esto indica que el virus circuló hace

tres años en la granja. Por el contrario, los de menores edades son negativos, lo que

implica que actualmente no hay contagios y no hay virus circulando. Otra posibilidad

es que se haya vacunado con vacunas no marcadoras hace tres años y posteriormente

no.

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Explotación con infección activa: hay animales seropositivos en todas las edades,

incluidos los de 9-18 meses. Esto implica que el virus circuló recientemente en la

granja y es posible que aun este circulando. Otra posibilidad es que el ganadero esté

administrando vacunas no marcadoras.

En el caso de las explotaciones de carne la realización de seroperfiles por

grupos de edad permitirá conocer el estado del rebaño y localizar el grupo o grupos de

edad donde existe mayor positividad (ilustración 7).

Ilustración 7. Propuesta de diagnóstico de IBR en explotaciones de carne.

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En función de los resultados se puede plantear la posibilidad de la erradicación

mediante la eliminación de los animales seropositivos, teniendo en cuenta que todo

animal positivo a anticuerpos frente a la glicoproteína gE es un posible portador

latente (en este sentido la legislación europea considera los animales vacunados con

vacunas convencionales igual que los infectados).