Diagnóstico de las Enfermedades Gastrointestinales por PCR

M. en C. Roger Ivan Lopez Diaz Responsable del departamento de Biología Molecular

Laboratorios Biomédicos de Mérida

Generalidades

• Las enfermedades gastrointestinales son una de las causas principales de consulta médica.

• El grupo más vulnerable a sus síntomas son los niños pequeños y los ancianos.

• Pueden ser ocasionadas por motivos orgánicos, psicológicos o infecciosos.

• Los agentes infecciosos involucrados pueden ser virus, bacterias, hongos o parásitos.

• La principal vía de adquisición de los Microorganismos (M.O.) son los alimentos y agua contaminados con materia fecal.

• Entre los principales M.O. que las ocasionan están: la Salmonella, la Escherichia coli, la Shigella, las Giardias y las amibas.

• Las principales manisfestaciones son: Fiebre, cólicos, naúseas, vómito, diarrea, constipación o estreñimiento.

Enteropatógenos frecuentes por grupo etario infantil

Las infecciones gastrointestinales son una de las principales causas de morbimortalidad infantil

Diagnóstico por el laboratorio clínico

• Anticuerpos anti adenovirus

• Anticuerpos contra Hepatitis A

• Rotavirus y adenovirus por inmunocromatografía en capa fina

• Coprocultivo

• Coproparasitoscópico

• Azúcares reductores y pH en heces fecales

• PCR para virus y bacterias causantes de diarrea

Anticuerpos contra adenovirus y hepatitis A

• Son pruebas que buscan la exposición a estos agentes infecciosos a través de la detección de los anticuerpos de tipo IgG e IgM, que se producen en respuesta a estos virus.

• Son útiles para evaluar la presencia de infección activa, una vez que la respuesta inmune a producido la cantidad de anticuerpos suficientes para detectarse por estas técnicas.

Rotavirus y adenovirus por Inmunocromatografía en capa fina

• Permite llevar a cabo la detección de algunos antígenos de Rotavirus y Adenovirus en muestras de heces fecales.

• Es una prueba rápida que permite llevar a cabo un tamizaje en la búsqueda de estos agentes infecciosos.

Coprocultivos

• El coprocultivo cumple con la metodología adecuada para identificar las nuevas bacterias enteropatógenas, además contribuye al conocimiento de la etiología bacteriana de la EDA infantil y al buen tratamiento. Los coprocultivos son útiles en diarrea invasiva (disenteriforme) y en diarrea persistente.

• Varios factores reducen la utilidad del coprocultivo en nuestro medio: no se dispone de cultivos especiales para algunas bacterias, los resultados de los coprocultivos toman hasta tres días, por lo cual no son importantes para tomar decisiones inmediatas.

Coprológico

• Además del análisis microscópico para la búsqueda de parásitos, este estudio permite observar la presencia de hongos y leucocitos.

• La presencia de micelios sugiere la existencia de EDAs producidas por hongos.

• Los leucocitos están presentes en las heces en enfermedades intestinales inflamatorias, esto puede ser el resultado de una EDA bacteriana o parasitaria, es así que entre 10-20 leucocitos (principalmente polimorfonucleares) suele indicar EDA bacterianas invasivas.

• Es importante recalcar que el trofozoíto de la Entamoeba histolytica tiene gran capacidad citolítica y produce poca respuesta inflamatoria local, por lo tanto en el coproscópico se encuentra moco, sangre y pocos leucocitos.

Azúcares reductores y pH

• Los más comunes son: Maltosa y Lactosa. Estos carbohidratos y otros como la Sacarosa, se encuentran en materia fecal cuando existen diarreas agudas. La prueba detecta cualquier sustancia reductora en las heces, incluyendo azucares reductores, tales como lactosa, fructuosa, galactosa y/o maltosa.

• Las materias fecales para detectar azucares reductores deben ser procesadas inmediatamente porque su valor tiende a disminuir con el tiempo, debido a la degradación de los carbohidratos por parte de las bacterias presentes en las heces.

• El pH puede ser útil para la determinación etiológica, un pH ácido indica EDA de origen viral, mientras que un pH alcalino indica EDA bacteriana invasiva.

• El pH fecal esta alterado en la intolerancia de los azúcares, porque la reducción de los azúcares por las bacterias en el cólon produce ácido.

PCR para patógenos causantes de Diarrea

• Esta prueba ha sido validada deacuerdo a los estándares de la comunidad europea, para su uso en el diagnóstico de 4 virus y 10 bacterias que son causantes comunes de diarrea.

Panel viral

•Rotavirus •Adenovirus entérico •Norovirus •Astrovirus

Panel bacteriano

•Salmonella spp. (S. bongori y S. enterica). •Shigella spp. (S. flexneri, S. boydii, S. sonnei y S. dysenteriae). •Vibrio spp. (V. cholerae, V.parahamolyticus y V. vulnificus). •Campylobacter spp. (C. jejuni y C. coli). •Clostridium difficile Toxin B. •Clostridium perfringens. •Yersinia enterocolitica. •Aeromonas spp. (A. salmonicida, A. sobria, A. bivalvium y A.hydrophila). •E. coli O157:H7. •Verocytotoxin-producing E. coli (VTEC).

Ventajas de la prueba de PCR para Diarreas

• Reconoce una porción del DNA o RNA de la bacteria o virus

• Ha sido probadas contra otros microorganismos para evitar reacciones cruzadas.

• Tienen un alto grado de sensibilidad y especificidad.

• No requiere de muestras invasivas, ni condiciones especiales para la toma de muestra.

• No requiere que el M.O. este vivo, solo que este presente su ADN o ARN.

• Permite diagnosticar infecciones debidas a patógenos con requerimientos especiales de crecimiento.

• Reducen el tiempo de respuesta.

• Analizan simultáneamente virus y bacterias comunmente relacionados a nivel mundial con las enfermedades diarreicas pediátricas, según la literatura científica.

• Sirve de base para el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas y mejores estrategias terapéuticas.

Frecuencia de Parásitos observados en muestras de Coproparasitoscópico

2011

• Blastocystis hominis

• Giardia lamblia

• Endolimax nana

• Entamoeba histolytica

• Entamoeba coli

• Iodamoeba buschlii

• Trichomonas vaginalis

• Trichuris trichura

• Ascaris lumbricoides

2012

• Blastocystis hominis

• Giardia lamblia

• Endolimax nana

• Entamoeba coli

• Cryptosporidium

Frecuencia de patógenos encontrados por coprocultivo

• Se reporta como flora normal las bacterias: Proteus, Klebsiella, Enterobacter y Escherichia coli.

• Los patógenos comúnmente reportados son salmonella y shigella.

• No se acostumbra realizar cultivos especiales para el diagnóstico de bacterias de difícil crecimiento.

Frecuencia de patógenos encontrados por PCR de Diarreas

# muestras resultado Patógeno 1 Patógeno 2 1 positivo shigella spp 2 Negativo 3 positivo Aeromonas spp 4 Negativo 5 Negativo 6 Positivo shigella spp clostridium 7 negativo 8 positivo Campylobacter 9 positivo salmonella spp

10 positivo shigella spp 11 negativo 12 negativo 13 positivo E.coli norovirus III 14 positivo Clostridium perfringes 15 positivo Campylobacter 16 positivo E.coli 17 Positivo E.coli

Indicadores históricos Fiebre

Deshidratación Diarrea prolongada

Dolor abdominal Tenesmo

Heces sin sangre Duración <4 días

Apariencia no tóxica No hay fiebre

Observación Atención de apoyo

Hidratación oral, según se requiera

Sangre o moco en las heces

Polimorfonucleares fecales

Huevecillos o parásitos fecales Diagnóstico diferencial: Giardia lamblia Entamoeba histolytica Cryptosporidium

Diagnóstico diferencial Campylobacter Shigella Salmonella Aeromonas C. dificile Pleisomonas EIEC, EHEC

Diagnóstico diferencial: Virus

Yersinia Plesiomonas V. cholerae

V. parahemolyticus ETEC, EPEC

Considerar cuando sea indicado cultivos especiales o PCR para identificación de

M.O. de difícil crecimiento.

NO SI

SI NO

NO SI

NO

Algoritmo diagnóstico de ED