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DIAGNOSTICO DE PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES Plasmodium spp El paludismo o malaria es un problema de salud en gran parte de los países tropicales y subtropicales y una de las principales causas de mortalidad en el mundo. La enfermedad es causada por un parásito, protozoo del género Plasmodium. Existen cuatro especies de Plasmodium que causan enfermedad en el hombre: P. vivax, P. falciparum, P. malarie, P. ovale, siendo las dos primeras (P. vivax, P. falciparum), las especies más frecuentes. El P. falciparum produce las formas graves de la enfermedad y ha desarrollado resistencia a algunas de las drogas usadas para el tratamiento. Los vectores de la enfermedad son varias especies del género Anopheles, la transmisión es a través de la picadura de las hembras de estos mosquitos. La transmisión directa puede darse por transfusión sanguínea o por vía transplacentaria. El vector (Anopheles) se considera el huésped definitivo porque en él se desarrolla el ciclo sexual o esporogónico que origina los esporozoitos, formas infectivas localizados principalmente en las glándulas salivares del mosquito y que penetran a los capilares sanguíneos con la picadura. Anopheles spp El hombre se considera el huésped intermediario porque en él se desarrolla el ciclo asexual o esquizogónico que tiene dos etapas: la pre-eritrocítica y la eritrocítica. La primera sucede en el hígado, los esporozoitos inoculados por la hembra de Anopheles, infectan las células hepáticas, se multiplican formando esquizontes tisulares, que al romperse liberan merozoitos a la circulación para iniciar la segunda etapa o eritrocítica. En las infecciones por P. vivax, los hipnozoítos o formas latentes del parásito, pueden permanecer en el hígado por varios meses y son responsables de las recaídas. En la circulación, con la fase esquizogónica se desarrollan diferentes formas del parásito: trofozoítos o formas anulares, esquizontes y gametocitos que permiten hacer el diagnóstico de la enfermedad e identificar las especies de Plasmodium. Los trofozoitos y los esquizontes son los responsables de los síntomas clínicos de la enfermedad. Los gametocitos son las formas que infectan al vector al picar un enfermo con malaria Métodos Diagnósticos Frente a la sospecha clínica de un síndrome febril y teniendo en cuenta los antecedentes epidemiológicos, relacionados con las zonas endémicas, se debe realizar el diagnóstico parasitológico que consiste en observar en el microscopio los parásitos en una muestra de sangre por los métodos de gota gruesa y extendido delgado, con la coloración de Giemsa o Wright. Se recomienda estudiar varias muestras en un mismo día o en días consecutivos, si es necesario. 1. Gota gruesa. Utiliza como muestra una gota de sangre, los eritrocitos quedan unos sobre otros pero son lisados durante la coloración, dejando los parásitos libres. Esta concentración de los eritrocitos facilita la detección de los parásitos, haciendo de la gota gruesa un método más sensible que el extendido delgado. 2. Extendido delgado. Es la técnica usada en hematología para observar la morfología de los eritrocitos. Es una capa delgada, única, de glóbulos rojos que permite observar la morfología de los parásitos y las alteraciones que estos glóbulos parasitados pueden sufrir como: cambios de forma, tamaño, presencia de granulaciones. 3. Pruebas inmunológicas.

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DIAGNOSTICO DE PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES Plasmodium sppEl paludismo o malaria es un problema de salud en gran parte de los países tropicales y subtropicales y una de las principales causas de mortalidad en el mundo. La enfermedad es causada por un parásito, protozoo del género Plasmodium.Existen cuatro especies de Plasmodium que causan enfermedad en el hombre: P. vivax, P. falciparum, P. malarie, P. ovale, siendo las dos primeras (P. vivax, P. falciparum), las especies más frecuentes. El P. falciparum produce las formas graves de la enfermedad y ha desarrollado resistencia a algunas de las drogas usadas para el tratamiento.Los vectores de la enfermedad son varias especies del género Anopheles, la transmisión es a través de la picadura de las hembras de estos mosquitos. La transmisión directa puede darse por transfusión sanguínea o por vía transplacentaria. El vector (Anopheles) se considera el huésped definitivo porque en él se desarrolla el ciclo sexual o esporogónico que origina los esporozoitos, formas infectivas localizados principalmente en las glándulas salivares del mosquito y que penetran a los capilares sanguíneos con la picadura.

Anopheles spp

El hombre se considera el huésped intermediario porque en él se desarrolla el ciclo asexual o esquizogónico que tiene dos etapas: la pre-eritrocítica y la eritrocítica. La primera sucede en el hígado, los esporozoitos inoculados por la hembra de Anopheles, infectan las células hepáticas, se multiplican formando esquizontes tisulares, que al romperse liberan merozoitos a la circulación para iniciar la segunda etapa o eritrocítica. En las infecciones por P. vivax, los hipnozoítos o formas latentes del parásito, pueden permanecer en el hígado por varios meses y son responsables de las recaídas.

En la circulación, con la fase esquizogónica se desarrollan diferentes formas del parásito: trofozoítos o formas anulares, esquizontes y gametocitos que permiten hacer el diagnóstico de la enfermedad e identificar las especies de Plasmodium. Los trofozoitos y los esquizontes son los responsables de los síntomas clínicos de la enfermedad. Los gametocitos son las formas que infectan al vector al picar un enfermo con malaria

Métodos Diagnósticos Frente a la sospecha clínica de un síndrome febril y teniendo en cuenta los antecedentes epidemiológicos, relacionados con las zonas endémicas, se debe realizar el diagnóstico parasitológico que consiste en observar en el microscopio los parásitos en una muestra de sangre por los métodos de gota gruesa y extendido delgado, con la coloración de Giemsa o

Wright. Se recomienda estudiar varias muestras en un mismo día o en días consecutivos, si es necesario.

1. Gota gruesa.Utiliza como muestra una gota de sangre, los eritrocitos quedan unos sobre otros pero son lisados durante la coloración, dejando los parásitos libres. Esta concentración de los eritrocitos facilita la detección de los parásitos, haciendo de la gota gruesa un método más sensible que el extendido delgado.2. Extendido delgado.Es la técnica usada en hematología para observar la morfología de los eritrocitos. Es una capa delgada, única, de glóbulos rojos que permite observar la morfología de los parásitos y las alteraciones que estos glóbulos parasitados pueden sufrir como: cambios de forma, tamaño, presencia de granulaciones. 3. Pruebas inmunológicas.Los métodos serológicos detectan una respuesta humoral pero no pueden sustituir a la microscopía en el diagnóstico. Los métodos enzimáticos de inmunoanálisis que usan anticuerpos monoclonales pueden detectar parasitemias bajas.Las pruebas rápidas llamadas “tiras reactivas”, detectan antígenos específicos (proteínas), producidos por los parásitos.

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En la gota gruesa y el extendido delgado los parásitos se identifican por su forma y por la coloración diferencial de sus componentes, el citoplasma se colorea azul, la cromatina (núcleo) se colorea rojo y el pigmento malárico, producto del metabolismo de la hemoglobina, café - amarillo.

En sangre circulante se deben diferenciar tres formas parasitarias:Trofozoitos. El núcleo o cromatina es un punto denso, compacto que se colorea de rojo, el citoplasma en los parásitos jóvenes tiene forma anillada y en los trofozoitos maduros toma forma ameboide, se colorea de azul. Los trofozoitos maduros de P. falciparum solo se ven en las infecciones severas.Esquizontes. Tiene 2 o más gránulos de cromatina, según el grado de maduración, en el citoplasma se puede observar el pigmento malárico. Los esquizontes maduros están formados por varios granos de cromatina que forman una roseta, cada uno rodeado de citoplasma. Al ocurrir la lisis del eritrocito el esquizonte maduro se fragmenta y se liberan los merozoitos. En P. falciparum solo se observan esquizontes circulantes en las infecciones severas.Gametocitos. La cromatina es laxa o difusa, tienen un citoplasma grande de color azul que contiene pigmento malárico. En P. vivax tienen forma redondeada y en P. falciparum son alargados. En las infecciones por P. vivax, todas las formas parasitarias circulan en la sangre periférica. En P. falciparum solo los trofozoitos jóvenes y los gametocitos circulan en la sangre periférica, los trofozoitos maduros y los esquizontes quedan atrapados en la microcirculación, ocasionando la obstrucción de los capilares en varios órganos.En el diagnóstico de malaria, además de identificar la especie es importante contar el número de parásitos por microlitro de sangre, para poder seguir la evolución de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. El recuento es mas necesario en las infecciones por P. falciparum.

Trofozoitos maduros de P. vivax en extendido delgado

Esquizonte de P. vivax

Gametocito de P. vivax Trofozoitos de P. vivax gota gruesa

Trofozoitos de P. falciparum Gametocito de P. falciparum

Trypanosoma cruziLa enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es causada por el protozoario Trypanosoma cruzi y transmitida por artrópodos hematófagos de la familia Reduviidae. Los parásitos infectantes salen en las deyecciones del vector y pueden introducirse al organismo a través del orificio de la picadura, heridas o excoriaciones de la piel o atravesando directamente la mucosa ocular, nasal o bucal. En la sangre se encuentran unas formas flageladas llamadas tripomastigostes y otras formas se encuentran intracelulares en algunos tejidos conocidas como amastigotes.Tripomastigote: Se encuentra en la sangre circulante de las personas o animales infectados en la fase aguda o iniciales de la infección, es alargado, fusiforme, de 20 micras de tamaño aproximadamente. Posee un núcleo grande cerca de la parte central y a lo largo de su cuerpo poseen una membrana ondulante bordeada por un flagelo que se origina en el quinetoplasto y sale del parásito por el extremo anterior. Se diferencia de otras especies de Trypanosoma por el tamaño grande del quinetoplasto. Amastigote: Se encuentra en células como macrófagos, células del sistema retículo endotelial, tejido muscular cardíaco, muscular estriado, muscular liso y menos frecuente en tejido nervioso. Se caracteriza por ser redondeado u oval, medir de 1.5 a 4 micras de diámetro y no poseer flagelo, se multiplica por división binaria, estos amastigotes se aglomeran dentro de las células formando nidos.Epimastigotes: Constituye la forma reproductiva en los insectos vectores, hasta su maduración en formas triposmastigotas metacíclicas. Su quinetoplasto se encuentra anterior al núcleo, miden de 35 a 40 micras de largo y su flagelo se origina cerca al quinetoplasto.Estas formas epimastigotas crecen muy bien en los medios de cultivo in vitro.

Métodos Diagnósticos:Parasitológicos Directos

1. Examen en fresco: se obtiene una gota de sangre por punción digital con lanceta y se coloca entre lámina y

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laminilla para buscar los tripomastigotes moviéndose, se encuentran hasta en un 90% en la fase aguda pero solo hasta en 10% en la crónica.

2. Gota gruesa y extendido de sangre periférica: la muestra de sangre se procesa igual que para malaria y se utiliza la misma coloración (Derivados de Romanowsky, especialmente Giemsa). se buscan los tripomastigotes, su sensibilidad es aproximadamente del 70% para la gota gruesa y del 60% para el extendido.

Tripomastigote en sangre

3. Método de Strout: se obtiene sangre por punción venosa y se coloca en un tubo sin anticoagulante, se deja retraer el coágulo y los tripomastigotes salen hacia el suero, el cual se centrifuga para obtener una mayor concentración y observarlos en fresco o coloreados. Tiene una sensibilidad de 90 a 100% en la fase aguda pero no llega al 10% en la crónica.

4. Biopsia: se utiliza para comprobar las formas tisulares de T. cruzi. Se pueden ver los llamados nidos de amastigotes y se prefiere la biopsia de ganglio linfático.

Parasitológicos Indirectos1. Xenodiagnóstico: se utilizan vectores limpios de la

infección, mantenidos en el laboratorio, se prefieren ninfas de 3° a 5° estadio de Rhodnius prolixus, las cuales se alimentan de la sangre del paciente, 30 y 60 días después de la succión de sangre, se examinan las heces e intestinos de los insectos bajo el microscopio para detectar formas del T. cruzi. Este método presenta una efectividad entre el 85 y 100% en las formas agudas, 80% en las congénitas y entre 20 y 50% en las crónicas.

Rhodnius prolixus

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): es altamente sensible y con especificidad entre 85 y 95%

3. Cultivos: se utiliza el medio LIT (Liver-Infusión-Tryptose). Se puede obtener una sensibilidad muy alta en la fase aguda de la enfermedad y de un 40 a

50% en la crónica. Otros medios utilizados son NNN (Novy-MacNeal-Nicolle), BHI (Infusión de cerebro- y corazón), Noeller. A los 8 días de la siembra se debe observar el líquido sobrenadante para buscar en fresco y en preparaciones coloreadas los epimastigotes.

4. Serología: La presencia de anticuerpos indican indirectamente la existencia, presente o pasada del parásito en el organismo. Los métodos utilizados son inmunofluirescencia indirecta, ELISA, Fijación de complemento, Hemaglutinación indirecta y Prueba de látex.

Toxoplasma gondiiProtozoo intracelular de la subclase Coccidia que causa toxoplasmosis. El hombre y los animales se infectan mediante la ingestión de los ooquistes esporulados diseminados en el medio ambiente y que son excretados en las heces de los gatos y algunos felinos que son los huéspedes definitivos. El parásito adopta diferentes estados según la fase de su desarrollo.Taquizoito: llamada forma proliferativa, mide 6 micras de longitud por 2 de ancho. Su forma es alargada y un poco arqueada (como en media luna), el núcleo se tiñe con facilidad con colorantes comunes. Esta forma parasitaria se encuentra en la infección aguda.

Taquizoitos

Quistes tisulares: miden entre 20 y 200micras, tienen una membrana propia, generalmente son redondos, en su interior se encuentran cientos de parásitos conocidos como bradizoítos que se forman por multiplicación lenta y están presentes en la infección crónica.Ooquistes: salen en las materias fecales de los hospederos definitivos, son esféricos, miden de 10 a 12 micras, luego de 2 a 5 días de estar en el medio ambiente en su interior se forman dos esporoquistes cada uno con cuatro esporozoítos

Ooquiste sin esporular Ooquiste esporulado

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Métodos Diagnósticos:El laboratorio es básico para definir la etiología de la enfermedad. El diagnóstico de infección se puede establecer mediante las pruebas serológicas; para comprobar la enfermedad se requiere, además el criterio clínico. Con la prueba de amplificación de ADN por PCR, ha adquirido importancia la búsqueda de parasitemia en el paciente inmunosuprimido o en el recién nacido.Demostración directa del parásito: solo es posible hacerlo en un número reducido de casos. Se pueden encontrar en LCR, ganglios linfáticos, médula ósea y ocasionalmente en otros tejidos. En los tejidos las características morfológicas son difíciles de precisar pues la biopsia muestras formas redondeadas o partes del parásito, según sea su posición en el corte histológico. La coloración con Giemsa o hematoxilina-eosina, inmunofluorescencia directa y la inmunoperoxidasa ayudan a la diferenciación.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): amplifica el ADN de T. gondii indicando la presencia del parásito en los líquidos o tejidos inclusive en el líquido amniótico.Inoculaciones: el parásito se puede aislar de LCR, sangre, esputo y de los tejidos infectados (ganglios linfáticos, músculos, placenta, ojos enucleados y vísceras) haciendo inoculaciones en ratones y observando en el líquido peritoneal la presencia de taquizoítos después de 4 a 8 días.Métodos inmunológicos: la demostración indirecta de T. gondii se hace por la búsqueda de anticuerpos y su presencia indica infección pero no necesariamente enfermedad. Los anticuerpos detectados son principalmente IgM e Ig G, la interpretación de los títulos se hace frente al cuadro clínico y la historia del paciente. Las pruebas más utilizadas son inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA, hemaglutinación indirecta (HIA), Sabin y Feldman (S-F), fijación de complemento y toxoplasmina.

LEISHMANIASIS:

Es necesario diferenciarla de otro tipo de úlceras como las piógenas, especialmente las de evolución crónica, pioderma gangrenoso, úlcera vascular, esporotricosis, pian, lepra, infección por micobacterias no tuberculosas, cromomicosis, histoplasmosis, tumores de piel etc..

Para confirmar la leishmaniasis es indispensable identificar el parásito por cualquiera de los métodos que existen:

1. Examen directo: Se debe hacer una buena limpieza de la úlcera y luego hacer una incisión en el reborde de la úlcera para luego raspar el tejido y obtener histiocitos y macrofágos parasitados; esta muestra se extiende en un portaobjetos para hacer uno o dos extendidos de un centímetro de diámetro, que después de seco se colorea con Giemsa o Wright. Se deben tomar dos o tres preparaciones por paciente y observar en 100 X.En las lesiones iniciales sin contaminación se hallan con facilidad los amastigotes intra o extracelulares. En las úlceras más crónicas, fibróticas y altamente contaminadas

es más difícil su hallazgo. El frotis directo tiene una especificidad del 100% y sensibilidad del 90%

Amastigotes de Leishmania en un examen directo coloreado con Giemsa o Wright.

2. Biopsia:El estudio histopatológico permite hacer el diagnóstico en muchos casos al observar la presencia de amastigotes intracelulares, en las formas crónicas no siempre se logra demostrar los parásitos.

3. Cultivos:Parte del material obtenido de la úlcera se siembra en el medio de cultivo llamado NNN (Novy-MacNeal-Nicolle), el cual es un medio bifásico que permite el desarrollo de los parásitos. La incubación se hace a temperatura ambiente entre 20° y 30°C. Después de 8 días se revisa el medio para buscar los promastigotes (formas flageladas del parásito) en la fase líquida, que con frecuencia están aglomerados y entrelazados por los flagelos formando rosetas que son características.

Promastigotes en cultivo

4. Prueba de la PCR:Amplifica segmentos específicos de ADN de los parásitos en la muestra. Tiene gran valor en tejidos donde no ha sido posible detectar parásitos por otros métodos parasitológicos, especialmente en lesiones en mucosas y para comprobar la infección en los vectores

5. Intradermoreacción de Montenegro:Es un método indirecto y corresponde a una reacción de hipersensibilidad tardía, llamada de Montenegro o Leishmanina. Consiste en la aplicación de un antígeno compuesto por suspensión de promastigotes procedentes de cultivo, que se aplican intradérmicamente al paciente y se hace la lectura de la prueba a las 48 y 72 horas. Es positiva si se palpa un nódulo de > 5 mm, semejante al observado en la tuberculina. La reacción indica contacto

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previo y tiene valor en el estudio de lesiones crónicas o evaluaciones epidemiológicas.

6. Métodos serológicosLa prueba de inmunofluorescencia indirecta es la más utilizada, aunque se detectan anticuerpos circulantes los títulos son muy bajos. Tiene poco valor en las leishmaniasis cutáneas pero tienen mayor importancia en las mucocutáneas

Lutzomya sp: es el vector de Leishmaniasis. Son insectos dípteros muy pequeños que miden entre 2 y 5 mm, tienen el cuerpo cubierto de pelos, en reposo las alas las mantienen en posición erecta. Vive en sitios sombreados y húmedos como huecos de árboles, nidos de animales, madrigueras, socavones de minas, raíces de árboles, hojarasca y chozas cercanas a zonas boscosas.

Lutzomya sp

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES CAUSADAS POR INSECTOS

PEDICULOSIS

Es la infestación por ectoparásitos que se llaman comúnmente como piojos.

El diagnóstico se hace por la sintomatología y la observación de liendres o parásitos adultos. Los piojos del género Pediculus humanus variedad capitis que se localizan en la cabeza y Pediculus humanus variedad corporis que están en el cuerpo son insectos ápteros, miden de 2 a 3 mm de longitud, aplanados dorso-ventralmente y provistos de uñas terminales en forma de garra que les permiten adherirse al cabello o a la ropa. Sus huevos llamados liendres miden 600 micras y se pueden observar a simple vista, los cuales se adhieren de manera muy firme al pelo o a la ropa por una sustancia pegajosa

El otro género Phthirus pubis llamado piojo púbico, más pequeño, su longitud es de 1 a 2 mm y es casi tan ancho como largo. Las patas son cortas, fuertes y terminan en garras muy desarrolladas que le permiten fijarse a los pelos más gruesos del cuerpo, como los del pubis, periné, barba, cejas y pestañas. Son llamados ladillas.

Pediculus humanus Phthirus pubis

PULICOSIS

Es el ectoparasitismo temporal por pulgas, su picadura se observa como una mácula con un punto central rojizo y es intensamente pruriginosa

Las pulgas de importancia médica son: Pulex irritans o pulga del hombre; Ctenocephalides canis del perro; Ctenocephalides felis del gato y Xenopsylla cheopis de las ratas.

Son insectos ápteros, aplanados de 2mm de longitud. El cuerpo es quitinoso y resistente y tiene 3 pares de patas. La clasificación de las especies se basa en las estructuras quitinosas en forma de peine, llamados ctenidios (pronales y genales)

Pulex irritans Ctenocephalides canis

CIMICOSIS

Es causada por los llamados chinches de la cama, los principales son Cimex lectularius y Cimex hemipterus, miden 3 a 5mm es aplanado dorso-ventralmente, el abdomen es voluminoso, ovalado y segmentado

Reciben el nombre popular de chinches de la cama, debido a que se alojan y reproducen en los colchones y hendiduras de las camas.

Las manifestaciones clínicas de la picadura son muy variables, de acuerdo con la reacción alérgica que puede causar la saliva del chinche en el momento de la picadura.

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Cimex lectularius

MIASIS

Corresponde a los daños que causan las larvas de moscas al invadir los tejidos y órganos de los animales y el hombre.

Las miasis del ser humano se pueden localizar en diversas partes del cuerpo y por lo tanto se clasifican clínicamente en: Cutánea fija, cutánea migrante, cavitaria, de las heridas e intestinal.

Miasis por Dermatobia Dermatobia hominis

ENFERMEDADES POR ARÁCNIDOS

ESCABIOSIS

También llamada Sarna. Es producida por Sarcoptes scabiei var hominis, es un ácaro ovalado, la hembra mide 350µm y el macho 250 µm. Como todos los arácnidos, tiene cefalotórax y en la parte anterior sobresale el capítulo provisto de aparato bucal fuerte que le permite penetrar la epidermis. Posee cuatro pares de patas muy atrofiadas que terminan en filamentos largos. Las hembras forman túneles en capa cornea de la piel y allí depositan los huevos, los cuales miden 150 micras.

Adulto de Sarcoptes scabiei con KOH

El material obtenido por raspado de las lesiones se observan con KOH al microscopio en donde se observan los parásitos y

los huevos, de esta manera es confirmado el diagnóstico por el laboratorio.

La biopsia también puede hacer el diagnóstico al identificar las lesiones epidérmicas y los huevos

DEMODICOSIS

Producida por Demodex folliculorum y D. brevis, ácaros alargados de 100 a 400 micras de longitud, cuerpo segmentado, 4 pares de patas atrofiadas, carente de vellosidades.

Se toma muestra del folículo o de la secreción de la glándula sebácea principalmente de la nariz y párpados y se monta el directo con KOH donde se observa el parásito

Demodex folliculorum

PICADURAS POR GARRAPATAS

Las garrapatas son ectoparásitos principalmente de animales y ocasionalmente se encuentran en el hombre. Producen lesión local traumática a través de la cual succiona sangre o inoculan una neurotoxina que rara vez es sintomática.