L as infecciones fúngicas son los grandes imitadores en la medicina humana y veteri-naria. Los agentes fúngicos que originan enfermedad clínica pueden afectar a cual-quier órgano y presentar un amplio espectro de signos clínicos y clinicopatológicos.

Como en cualquier enfermedad, para la identificación de la enfermedad fúngica es necesariohaber incluido al agente etiológico en el diagnóstico diferencial inicial. El reto no acaba aquí;si se sospecha enfermedad fúngica, se limitan mediante la historia clínica las opciones dediagnóstico definitivo. Los métodos tradicionales de diagnóstico de las diferentes micosis sebasan en la detección de una respuesta serológica a un agente, la identificación del agente enlas muestras citológicas o histopatológicas, o en el cultivo del organismo causante. La inter-pretación de cualquier prueba serológica fúngica no es directa; las pruebas disponibles tienensensibilidad y especificidad diferentes. Por el contrario, la especificidad de la citología, lahistopatología y los cultivos se aproxima al 100%, según la experiencia del patólogo y dellaboratorio, mientras que la sensibilidad es baja debido a la gran variabilidad en el número deorganismos dentro de las lesiones.

Los métodos tradicionales para el diagnóstico de enfermedad fúngica han sido útiles enla medicina humana y veterinaria durante décadas. Sin embargo, con los avances de losmétodos de biología molecular para la detección de ADN y ARN específicos de especie enlas muestras clínicas, los métodos tradicionales se complementan con técnicas molecularesnuevas. Ha tenido lugar la transición de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) –quese basa en la ampliación y secuenciación del ADN fúngico– desde el laboratorio de investi-gación al laboratorio diagnóstico, y son pocos los laboratorios veterinarios que ofrecenpruebas basadas en la PCR con o sin secuenciación. Los métodos histológicos ordinarios sehan potenciado con el desarrollo de técnicas de tinción inmunohistoquímica específica quepermiten la identificación de especies en tejidos incluidos en parafina y fijados con forma-lina. Estas técnicas no sustituirán a los métodos tradicionales en un futuro cercano, y pro-bablemente nunca. Deberían mejorar la capacidad de identificación de un tipo de agentesque, a menudo, es difícil. La necesidad de identificar especies de hongos miceliales puedeconducir al desarrollo de tratamientos antifúngicos más dirigidos a las especies y más inno-vadores. Un abordaje global del diagnóstico de la enfermedad fúngica que relacione los sig-

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CLÍNICAS VETERINARIASMEDICINA DE PEQUEÑOS ANIMALES

Diagnóstico fúngico: técnicas actuales y tendencias futurasSharon M. Dial, DVM, PhDDepartment of Veterinary Science and Microbiology, Arizona Veterinary Diagnostic Laboratory, University of Arizona, 2831 North Freeway, Tucson, AZ 85705, USA

Dirección electrónica: sdial@u.arizona.edu

nos clínicos con la exploración física, la patología clínica y los hallazgos histopatológicoscon la serología, el cultivo y las técnicas moleculares e inmunohistoquímicas más innova-doras, cuando están disponibles, es el mejor método para optimizar la identificación delagente subyacente.

PRESENTACIÓN CLÍNICALos agentes fúngicos tienen un repertorio extremadamente variado de signos clínicos: enfer-medad dérmica primaria, masas subcutáneas únicas o múltiples, masas en las cavidades corpo-rales, enfermedad diseminada con disfunción orgánica múltiple, y enfermedad diseminada quese presenta con la disfunción de un solo órgano o como causa de muerte súbita. La coccidioi-domicosis, por ejemplo, puede presentarse con cualquiera de los cuadros descritos anterior-mente. La coccidioidomicosis que afecta al corazón y al pericardio en el perro puede ser elevento final de la enfermedad diseminada, originando el colapso súbito y la muerte sin previossignos de enfermedad [1]. La enfermedad fúngica puede clasificarse en patógenos primarios(Blastotmyces, Histoplasma, Coccidioides, Cryptococcus) y patógenos oportunistas (Aspergi-llus, Cladosporium, Conidiobolus, Basidiobolus). Los patógenos oportunistas incluyen un grannúmero de hongos saprófitos del suelo, que pueden originar enfermedad cuando se introducenen los tejidos por traumatismo local. Tienen una tendencia mínima a la enfermedad disemina-da. Cuando aparece la diseminación de los patógenos oportunistas, se asocia con frecuencia conuna disminución de la inmunocompetencia.

Existe cierto grado de presentación «típica» de varios agentes fúngicos: la coccidioidomi-cosis, la histoplasmosis y la blastomicosis son patógenos principalmente pulmonares. La histo-plasmosis también se asocia al tracto gastrointestinal, mientras que este sistema raramente seafecta en la coccidioidomicosis o la blastomicosis. Por el contrario, Coccidioides spp se dise-minan con mayor frecuencia en el hueso. Conocer las presentaciones frecuentes de cada uno delos agentes fúngicos primarios los coloca en primera línea del diagnóstico diferencial. Conocerla capacidad de dichos agentes infecciosos para imitar muchas enfermedades hace que el clíni-co siempre los tenga en mente, y se incline por ellos cuando existe una respuesta inadecuada altratamiento en un caso difícil.

PATOLOGÍA CLÍNICADebido a la gran variedad de órganos que pueden afectarse en la enfermedad fúngica dise-minada, no existen cambios químicos séricos o en sangre periférica «típicos» asociados acualquier agente fúngico. La evidencia de una inflamación crónica, como la leucocitosis conuna monocitosis importante o una hipergammaglobulinemia policlonal con proteínas infla-matorias aumentadas con o sin hipoalbuminemia, apoyaría la sospecha de enfermedad fún-gica. Debido a la naturaleza crónica de la mayoría de las infecciones fúngicas, no es habi-tual una desviación hacia la izquierda importante de los neutrofilos. Sin embargo, existencambios inespecíficos que pueden observarse en múltiples lesiones inflamatorias. La eosi-nofilia periférica no es un hallazgo frecuente en la enfermedad fúngica, aunque los eosinó-filos son un componente importante de la respuesta inflamatoria tisular a los elementos fún-gicos. La anemia de enfermedad crónica es frecuente en cualquier enfermedad inflamatoriacrónica, así como la hipoalbuminemia leve. La hipercalcemia se ha asociado con la enfer-medad granulomatosa en medicina humana y veterinaria, con una asociación específica a lahistoplasmosis [2,3], criptococosis [6,7], neumocistosis [8,10], candidiasis [11] y cocci-

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dioidomicosis [6,12-14]. El mecanismo de hipercalcemia se debe a un aumento de la 1,25-dihidroxivitamina D circulante en varios casos en humanos, y se asocia más a menudocon un proceso inflamatorio granulomatoso que con el organismo en sí [7,15]. En los huma-nos, se observa también hipercalcemia importante en la sarcoidosis, beriliosis y tubercu-losis [16]. Los macrófagos en estas lesiones interfieren con la regulación normal de la 1,25-dihidroxivitamina D; la hipercalcemia se resuelve cuando disminuye la respuesta infla-matoria granulomatosa [16].

La citología es una de las técnicas de patología clínica más útiles para la identificaciónde la enfermedad fúngica. Las características citológicas de la mayoría de los patógenos fún-gicos se describen bien en varios libros de texto de veterinaria [17,18], y no se repetirán eneste artículo. La exploración citológica de los líquidos corporales, masas de la piel y tejidosubcutáneo y aspirados de órganos internos, líquidos del lavado transtraqueal o broncoalve-olar, orina y heces, pueden originar el diagnóstico definitivo de enfermedad fúngica si elorganismo fúngico existe en cantidades suficientes en los tejidos (figs. 1 y 2). La orina y lasheces se ignoran a menudo como muestras citológicas. Se pueden encontrar Histoplasmacapsulatum, Prototheca zopfii, y Cryptococcus neoformans [19] en citologías fecales, siexiste afectación gastrointestinal en la enfermedad diseminada o como patógeno gastroin-testinal primario. Se han identificado Aspergillus spp [20] y Candida spp [21] en la citología oen el cultivo de orina en casos de enfermedad diseminada o enfermedad urinaria primaria. Aun-que la especificidad de estas técnicas es alta, la sensibilidad varía considerablemente.La ventaja principal de la citología es su facilidad y rapidez. El conocimiento de los antece-dentes individuales del portaobjetos es la principal variable de la citología en el contexto clínico. Se requiere una buena calidad de tinción citológica. Las tinciones de Wright Giemsa yde Wright Giemsa modificada tiñen correctamente la mayoría de los organismos fúngicos enlas preparaciones citológicas. Existen pocas excepciones, como los oomicetos (únicos pató-genos similares a los hongos) Pythium y Lagenidium, que tienen una afinidad baja para la

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Fig. 1. Aspirado pulmonar de un gato. Existen numerosos macrófagos epitelioides grandes yneutrófilos no degenerativos. Los macrófagos contienen hongos pequeños de 1 a 2 µm, que seseñalan con las flechas (tinción de Wright Giemsa, ampliación original 3400). (Esta figura seencuentra en color al final del libro)

mayoría de las tinciones citológicas e histológicas. Los organismos que no se tiñen bien apa-recen como elementos no teñidos que se pasan por alto fácilmente (fig. 3). Se recomienda latinta India para la identificación de criptococos, ya que muestra la cápsula de mucina de esteorganismo. En la práctica, las proteináceas y las células inflamatorias que le rodean son nor-malmente muy útiles para demostrar la cápsula, y tienen una menor tendencia al artefacto

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Fig. 2. Ampliación mayor de un macrófago que ilustra el aspecto citológico característico deHistoplasma capsulatum. Los hongos tienen un núcleo basófilo denso y un «halo» claro o seu-docápsula (tinción de Wright Giemsa, ampliación original 31.000). (Esta figura se encuentraen color al final del libro)

Fig. 3. Aspirado de una masa torácica de un perro. La flecha señala micelias con tinción nega-tiva en una célula gigante multinucleada (tinción de Wright Giemsa, ampliación original31.000). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

(fig. 4). Además, la falta de cápsula no descarta Cryptococcus spp, ya que existen cepasacapsulares que pueden dificultar la diferenciación de Candida spp [22]. Cuando se exami-na la preparación citológica, es importante saber que a veces los hongos pueden presentar-se con morfología atípica. Las esférulas de Coccidioides pueden confundirse fácilmente conblastomicosis si son pequeñas y están muy unidas (fig. 5). Además, raramente, sólo lasendosporas de las esférulas rotas pueden existir y fácilmente ignorarse o confundirse conotros agentes [23]. La figura 6 ilustra un caso de coccidioidomicosis con esférulas pequeñasraras y grandes cantidades de endosporas libres, algunas de las cuales pueden confundirsecon agentes como Prototheca spp. Como muchas de las infecciones fúngicas profundas tie-nen distribuciones regionales, la historia de los recorridos realizados puede ser especial-mente importante al valorar presentaciones atípicas de estas enfermedades.

En muchos casos, el aspecto más útil de una preparación citológica es la identificaciónde la respuesta inflamatoria típica a los agentes fúngicos; inflamación granulomatosa a pio-granulomatosa con o sin eosinófilos, mastocitos, células gigantes multinucleadas, y fibroci-tos reactivos (fig. 7). La enfermedad fúngica debe sospecharse enormemente cuando seidentifique este tipo de respuesta inflamatoria, se observe o no el agente etiológico. Comopueden producirse infecciones mixtas, fúngicas y bacterianas, las lesiones inflamatoriassépticas que no responden a tratamiento médico adecuado deben investigarse más a fondopara descartar la enfermedad micótica subyacente. En los seres humanos, el 25% de las neu-monías «bacterianas» que no responden son efectivamente fúngicas, con enfermedad bacte-riana secundaria [24]. La identificación de un agente bacteriano no descarta el agente fún-gico. Esto es particularmente cierto en la cavidad nasal, en la que la enfermedad fúngicaprimaria se asocia a menudo con infección bacteriana secundaria. En el caso de los hongosmiceliales, como Aspergillus spp, las características citológicas no pueden identificar defi-

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Fig. 4. Aspirado de un nódulo subcutáneo de un gato. La gran cápsula clara de Cryptococcusneoformans queda bien definida por los eritrocitos adyacentes. Obsérvese el citoplasma basó-filo con un núcleo excéntricamente colocado que aparece clásicamente en este organismo (tin-ción de Wright Giemsa, ampliación original 31.000). (Esta figura se encuentra en color al finaldel libro)

nitivamente las especies, y el cultivo es necesario para su identificación final. La caracteri-zación morfológica de los hongos que crecen en el tejido puede ser muy diferente de la mor-fología de los hongos cuando crecen en un medio fúngico. Estructuras como las clamidos-

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Fig. 5. Aspirado de una lesión cutánea supurativa de un perro. Dos esférulas pequeñas de Coc-cidioides spp (flecha) muy próximas pueden imitar fácilmente a las formas del hongo Blas-tomyces dermatitidis. Se observaron esférulas grandes y raras, y endosporas libres, en toda lapreparación para ayudar a identificar el organismo como Coccidioides spp. (Recuadro)B. dermatitides (punta de flecha) (tinción de Wright Giemsa, ampliación original 3400). (Estafigura se encuentra en color al final del libro)

Fig. 6. Aspirado de una lesión cutánea supurativa de un perro (misma muestra que en la fig. 5). En este pequeño agregado de Coccidioides spp, las endosporas con septos prominen-tes entre las endosporas individuales recuerdan un Prototheca zopfii (punta de flecha). Ésta fuela forma predominante del organismo observada en la preparación. Sólo se encontraron algu-nas esférulas al examinar con detalle todas las muestras derivadas. (Recuadros) P. zopfii (fle-chas) (tinción de Wright Giemsa, ampliación original 31.000). (Esta figura se encuentra encolor al final del libro)

poras (fig. 8) se forman con frecuencia en tejidos por varios agentes fúngicos, pero no seforman fácilmente en el cultivo.

HISTOPATOLOGÍAEl diagnóstico histológico de la enfermedad fúngica comparte la misma especificidad y sensi-bilidad que las preparaciones citológicas. Así, la sensibilidad depende en gran medida de la

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Fig. 7. Aspirado pulmonar de un perro. Inflamación piogranulomatosa con células gigantesmultinucleadas (flecha) y agregados de fibroblastos (punta de flecha) característicos de la res-puesta inflamatoria de muchas lesiones fúngicas. Se cultivó Coccidioides spp de líquido pleurí-tico enviado con este aspirado (tinción de Wright Giemsa, ampliación original 3200). (Estafigura se encuentra en color al final del libro)

Fig. 8. Raspado corneal de un caballo. La flecha señala la inflamación terminal tipo chlamy-doconidium al final de un micelio septal. Estas estructuras pueden ser abundantes o infrecuen-tes, según la especie fúngica, y, posiblemente, según factores del huésped que influyen en elcrecimiento fúngico en los tejidos (tinción de Wright Giemsa, ampliación original 31.000).(Esta figura se encuentra en color al final del libro)

cifra de organismos que existe en el tejido derivado. La figura 9 ilustra una esférula única deCoccidioides spp encontrada en uno de los 10 cortes de una biopsia ósea. El corte original valo-rado por el patólogo tenía una lesión inflamatoria típica de osteomielitis coccidioidal que pro-vocó la obtención de los demás cortes para buscar el organismo. El tamaño de la muestra sueleser el factor determinante para proporcionar el diagnóstico histológico. Como con la citología,aunque no se identifiquen agentes etiológicos en las tinciones ordinarias, las características dela respuesta inflamatoria requieren a menudo la aplicación de tinciones especiales que ayudena encontrar a los agentes fúngicos presentes en pequeñas cantidades. El empleo ordinario de lastinciones de ácido-Schiff (PAS) y plata-metenamina de Gomori (GMS) confirman con fre-cuencia la sospecha de enfermedad fúngica. Con los hongos dimórficos, como Coccidioidesspp, el aspecto histológico de la fase tisular habitualmente permite la identificación de las espe-cies. Esto no ocurre con los agentes fúngicos miceliales. Aunque existen detalles que puedenayudar a clasificar el agente fúngico identificado dentro de grandes grupos de hongos(Zygomycetes, Hyalohyphomycetes y Phaeohyphomycetes), no existen características histoló-gicas diagnósticas de ningún patógeno micelial. Una excepción a la regla puede ser la tenden-cia de Aspergillus niger a formar cristales de oxalato en el tejido periférico (fig. 10) [25]. Losdos oomicetos patogénicos Pythium insidiosum y Lagenidium spp no pueden diferenciarsefácilmente de Zygomycetes en el tejido, y son difíciles de aislar en el cultivo [26]. Los patóge-nos fúngicos se describen según su pigmentación (hongos dematiáceos), grado de tabicación yamplitud y grado de paralelismo del micelio. Con estas características, el patólogo puede pro-porcionar una lista de posibles agentes etiológicos. Aunque son infrecuentes, las infecciones dobles con dospatógenos fúngicos pueden producirse. La figura 11 ilustra una infección simultánea en un perro con Coccidioides spp y hongo dematiáceo. El perro tuvo un diagnóstico ante mór-tem de coccidioidomicosis, pero no respondió al tratamiento antifúngico. Como con la iden-tificación citológica de los agentes fúngicos, suele ser necesario el cultivo para realizar laidentificación final.

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Fig. 9. Biopsia ósea de una lesión lítica y proliferativa en el fémur distal de un perro. Existeun gran foco de inflamación piogranulomatosa con una única esférula de Coccidioides sppseñalada por la flecha (tinción de hematoxilina-eosina, ampliación del original 340).(Recuadro) Mayor ampliación de la esférula (tinción de hematoxilina-eosina, ampliación ori-ginal 3400). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

SEROLOGÍAEl empleo de la serología en el diagnóstico de la enfermedad fúngica reta los conocimientos delclínico para la interpretación de los datos de laboratorio. El primer paso para comprender la

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Fig. 10. Biopsia nasal de un perro. Existen abundantes cristales birrefringentes de oxalato cálci-co junto con una gran alfombra fúngica adherida al tejido del cornete nasal. El cultivo fúngicooriginó un importante crecimiento de Aspergillus niger (tinción de hematoxilina-eosina bajo luzpolarizada, ampliación original 3100). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

Fig. 11. Tejido tisular de un perro. Abundantes esférulas viables (punta de flecha) y vacías (aste-risco) de Coccidioides spp, y dos granulomas pequeños bien definidos (esquina inferior dere-cha) (tinción de hematoxilina-eosina, ampliación del original 3100). (Recuadro A) Ampliaciónmayor del granuloma que contiene hifas fúngicas pigmentadas (dematiáceo) (tinción de hema-toxilina-eosina, ampliación del original 3400). (Recuadro B) Tinción GMS que muestra ambostipos de hongos (negro) en el tejido esplénico (ampliación original 3100). (Esta figura seencuentra en color al final del libro)

serología es estar seguro de la metodología y de sus limitaciones, como la sensibilidad yla especificidad de las pruebas individuales. Un conocimiento firme de estos factores es necesa-rio para emplear la serología en su máxima capacidad. Ello es particularmente cierto en la sero-logía fúngica, ya que cada prueba serológica para cada agente tiene sus problemas. La dificul-tad para determinar la verdadera sensibilidad de una prueba serológica para una enfermedadfúngica es evidente por la falta de referencias que pueden proporcionar dichos datos, segúnensayos epidemiológicos veterinarios amplios. Se han publicado datos de sensibilidad y espe-cificidad de las pruebas serológicas frente a blastomicosis [27], histoplasmosis [28] y criptoco-cosis [29]. La especificidad de las pruebas serológicas fúngicas puede valorarse más fácilmen-te en el contexto clínico y de laboratorio. La tabla 1 enumera las pruebas serológicasactualmente disponibles para varios agentes fúngicos y sus características. La mayoría de laspruebas serológicas fúngicas actualmente en uso en medicina veterinaria detectan la respuestahumoral (anticuerpo) a la exposición. Por el contrario, las pruebas que detectan los antígenosfúngicos pueden proporcionar un diagnóstico definitivo si la prueba del antígeno es lo sufi-cientemente específica. La prueba de la aglutinación en látex basada en antígeno disponiblepara C. neoformans es la prueba serológica fúngica basada en antígeno más empleada. Se handesarrollado los inmunoensayos unidos a enzima (EIA) para la antigenemia o antigenuria en eldiagnóstico de histoplasmosis [30] y aspergilosis [31] en seres humanos, y para el diagnósticode blastomicosis [32] en perros. Como con cualquier prueba serológica, se debe valorar la reac-tividad cruzada, ya que muchos agentes fúngicos comparten antígenos estructurales. La pruebaEIA para H. capsulatum puede tener una reacción cruzada con varios agentes fúngicos, comoParacoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Penicilliummarneffei [33]. Actualmente, las puebas basadas en antígenos están disponibles para C. neofor-mans, B. dermatitidis y Aspergillosis spp [18].

Con las puebas serológicas basadas en anticuerpos, la sobreinterpretación es un problemaimportante. Los títulos persistentes tras la exposición con la eliminación del agente son fac-tores de confusión para el diagnóstico preciso de blastomicosis y coccidioidomicosis. Pocaspruebas serológicas proporcionan un diagnóstico definitivo. La serología positiva debe con-siderarse evidencia de exposición que apoya los hallazgos clínicos. Las muestras de sueroemparejado (2-3 semanas de diferencia) deben analizarse simultáneamente. Un aumento odescenso de cuatro veces el título es una gran evidencia de enfermedad activa. Es importan-te destacar que las muestras emparejadas deben analizarse a la vez, debido a la variabilidadinterensayo de las puebas serológicas. Esto requiere guardar una parte de la muestra de sueroinicial para derivarlo con una segunda muestra. La excepción puede ser la prueba de ELISApara pitiosis. Al emplear un valor positivo del 40% en comparación con el suero de controlpositivo analizado simultáneamente con el suero del paciente, Grooters et al [34] demostra-ron una sensibilidad y una especificidad del 100% de esta prueba al comparar muestras deperros clínicamente sanos, perros infectados por P. insidiosum, perros con enfermedad fún-gica no pitium y protozoica, y perros sin enfermedad gastrointestinal infecciosa. Además,esta prueba serológica puede emplearse para el seguimiento posquirúrgico, originando la rea-gudización de la enfermedad títulos séricos en aumento.

Una única prueba serológica puede conducir a error a la hora de diferenciar la enfermedadfúngica de otras enfermedades inflamatorias y neoplásicas en zonas con enfermedades fún-gicas endémicas. En un estudio serológico reciente de Coccidioides spp en el Suroeste deEstados Unidos se encontraron títulos de 1:16 en la inmunodifusión en gel agar positiva

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(AGID) en perros clínicamente normales [35]. Los títulos de fijación del complemento se hanempleado en el pasado para la serología frente a Coccidioides spp. Por desgracia, hasta el25% de las muestras de suero canino son anticomplementarias y no pueden titularse con estemétodo. Como resultado, la mayoría de los laboratorios con serología de Coccidioides sppemplean la prueba AGID.

Como con todas las puebas diagnósticas, la historia, los hallazgos de la exploración física ylos resultados de pruebas diagnósticas son fundamentales para la interpretación de una serolo-gía positiva o negativa. La escasa especificidad de las pruebas serológicas disponibles frente ahistoplasmosis niega esencialmente el valor de la serología en esta enfermedad. El uso incre-mentado de agentes inmunosupresores para el tratamiento de la neoplasia y de la enfermedadautoinmunitaria origina un gran campo fértil para el aumento de la enfermedad fúngica en losanimales de compañía. Esto es evidente en medicina humana, y puede ocurrir también en medi-cina veterinaria [36]. En estos pacientes, un sistema inmunitario que no responda puede con-ducir a enfermedad seronegativa.

CULTIVOEl «patrón oro» para la identificación específica de la enfermedad fúngica es el cultivo del orga-nismo sospechado en líquidos o en tejidos. Además, la sensibilidad es el aspecto principal quedepende sólo del cultivo para el diagnóstico. La sensibilidad para el cultivo de H. capsulatumen la histoplasmosis pulmonar en los humanos varía del 15 al 85% según el tipo de enfermedad(enfermedad aguda frente a enfermedad crónica) [37]. La probabilidad de un cultivo con éxitode agentes fúngicos depende de varias variables: la concentración de los hongos en la muestra,la integridad de la muestra, las necesidades del cultivo del agente fúngico, y la experiencia dellaboratorio que realiza el cultivo.

El primer paso y el más importante es la obtención y derivación de la muestra adecuadapara el cultivo. Al proporcionar al laboratorio una historia detallada, una fuente precisa, y eldiagnóstico clínico, se puede contribuir enormemente al éxito del cultivo y a la identificacióndel agente fúngico. Aunque se emplean a menudo culturettes para el envío, las muestras parael cultivo bacteriano y fúngico no son el método de elección de la mayoría de los laboratoriosde microbiología. Las muestras de líquidos corporales, orina y exudados pueden enviarse entubos de suero estériles (tapón rojo) y concentrarlos en el laboratorio para facilitar el cultivode los agentes. Se recomienda hasta 10 ml de líquido. La orina se ignora a menudo comomuestra para la identificación de la enfermedad fúngica diseminada. Se han recuperado ele-mentos de Cryptococcus y Aspergillus en muestras de orina de perros con enfermedad dise-minada [20,21,38]. Si la lesión es una masa, se debe derivar tejido fresco dérmico, subcutá-neo, o interno en un contenedor estéril para el cultivo. Es útil derivar tejido fijado enformalina para la histopatología simultánea. Muchas especies fúngicas crecen muy lenta-mente; la identificación del organismo en cortes histológicos justifica a menudo la retenciónde cultivos durante largos períodos de tiempo o provoca el empleo de medios enriquecidospara facilitar la identificación del agente. P. insidiosum, un oomiceto, es difícil de distinguirde Zygomycetes en los cortes tisulares, y requiere un manejo específico para disminuir elefecto del sobrecrecimiento bacteriano sobre la viabilidad y crecimiento del organismo [39].Se debe advertir al laboratorio de la posibilidad de infección con este agente, lo cual facilita-rá su crecimiento e identificación.

La identificación de agentes fúngicos en los cultivos requiere paciencia. Los cultivos

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deben madurar y formar cuerpos fructíferos, conidios y artrosporas característicos, para per-mitir la identificación morfológica del hongo. Para algunas especies fúngicas, se necesitanlos medios específicos para promover la producción de un estadio asexual y su morfologíacaracterística. Además, ciertas especies de hongos son tan parecidas que se han estudiadolas características de crecimiento en diferentes medios para la identificación definitiva de lasespecies [40].

La fase tisular de la mayoría de los hongos patógenos supone poco riesgo para los pacientescon enfermedad activa. La excepción es el hongo saprofítico Sporothrix schenckii, un agente deenfermedad zoonótica que puede transmitirse a los individuos que manejan al paciente si no setoman las medidas de precaución adecuadas. Por el contrario, una vez que se ha aislado el agen-te en los medios microbiológicos y ha formado esporas o conidias, existe una gran posibilidadde inhalación por parte del personal de laboratorio. Se recomienda que el cultivo fúngico se dejesólo para el laboratorio diagnóstico (todos excepto las dermatofitosis). Todos los cultivos fún-gicos de la Arizona University se sellan para limitar la exposición del personal de laboratorio alas partículas potencialmente infecciosas. Los cultivos se abren expresamente para su examenen una campana de biocontención, ya que es fácil la aerosolización de las esporas cuando seabren las láminas de cultivo. El hongo se trata con formalina antes de la evaluación microscó-pica. La identificación de las estructuras fúngicas es similar a la de la citología; el conocimien-to individual se desarrolla a través de la experiencia. Todos estos factores aconsejan confiar elaislamiento fúngico y la identificación a un micólogo con experiencia, en vez de crear un labo-ratorio de micología dentro de la propia clínica.

INMUNOHISTOQUÍMICAEn la última década, la inmunohistoquímica (IHC) se ha convertido en un método ordina-rio para la detección e identificación de agentes infecciosos en tejidos de biopsia y necrop-sia en medicina veterinaria. La mayoría de los agentes identificados con este método son bacterias, virus y protozoos. Existe un mayor número de laboratorios diagnósticos veteri-narios que ofrecen la IHC como método para determinados organismos fúngicos en los tejidos derivados para histopatología ordinaria. Actualmente, los laboratorios diagnósticosde la Michigan State University y de la Kansas State University ofrecen pruebas IHC para enfermedades fúngicas, como aspergilosis, blastomicosis, histoplasmosis, coccidioi-domicosis y candidiasis. Aunque los informes de la literatura veterinaria son escasos, dadoque cada vez más laboratorios desarrollan IHC como parte de su oferta diagnóstica ordina-ria, su utilidad se ha documentado mejor. Así, se ha documentado la IHC para la deteccióne identificación de pseudomicetoma atribuible a Microsporum canis [41] y pitiosis equina[42] y canina [43].

El principio de la IHC es similar al de ELISA indirecta en los cortes tisulares. La sensi-bilidad y la especificidad de la tinción con IHC depende, en gran medida, de los anticuerposprimarios dirigidos contra el antígeno objetivo. Los anticuerpos individuales varían deforma importante en afinidad por el antígeno, y tienen diferentes niveles de reactividad cru-zada para antígenos asociados o similares. Los laboratorios individuales deben estandarizary validar todas las tinciones IHC. La American Association of Veterinary Laboratory Diag-nosticians Subcommittee on Immunohistochemistry ha desarrollado unas guías para laestandarización de la IHC. Aunque se puede emplear la IHC como única prueba, en la mayo-ría de casos, la IHC y la histopatología normal deben valorarse en pareja para proporcionar

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más información. Como con todas las pruebas diagnósticas, la integridad de la muestra es esencial para el

diagnóstico. Un factor que puede afectar a la tinción IHC es el tiempo que el tejido ha estado enformalina. Una unión cruzada de proteína antigénica con formalina interfiere con la identifica-ción del antígeno por parte del anticuerpo primario en el proceso de la IHC. Un amplio interva-lo de tiempo de exposición a formalina origina interferencias significativas con las interaccio-nes individuales anticuerpo-antígeno. Si se han mantenido los tejidos en formalina antes dederivarse para la valoración histopatológica, el tiempo en formalina debe incluirse en la histo-ria. En la mayoría de los laboratorios de referencia, los tejidos se procesan en 24 horas tras reci-bir la muestra.

Existen muchas variables que deben definirse en el marco del laboratorio para cada tin-ción de IHC, como el tipo de corte tisular previo al tratamiento que puede ser necesario parapotenciar la afinidad del anticuerpo primario por el antígeno, el tiempo de incubación delanticuerpo primario, y el sistema de detección empleado. Estos problemas, como la tincióninespecífica o una tinción excesiva, pueden dificultar la interpretación de las tinciones deIHC. Un buen ejemplo de la reactividad cruzan entre los anticuerpos y los agentes infeccio-sos es el anticuerpo policlonal del bacilo Calmette-Guérin (BCG) frente al componente dela pared celular de Mycobacterium bovis. Este anticuerpo es altamente reactivo frente avarios agentes infecciosos bacterianos y no bacterianos, como B. dermatitidis, Coccidioidesspp, Cryptococcus spp, H. capsulatum, Malassezia spp, Sporothrix spp, Pythium spp, Pro-totheca spp, dermatofitos, y Phaeohyphomycetes [44,45]. El anticuerpo del BCG puede serútil para identificar los hongos que no se tiñen bien con las tinciones tradicionales, comoGMS o PAS (fig. 12), y como tinción «estudio» para las lesiones que pueden contener varios

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Fig. 12. Masa gástrica de un perro. Micela de amplitud variada de Pythium insidiosum(marrón) teñida con anticuerpo BCG policlonal anti-Mycobacterium bovis. El perro era seroló-gicamete positivo por el método ELISA, y los cortes de la masa también se tiñeron positivamentepara P. insidiosum con IHC (anti-M. bovis de conejo policlonal, 1:1.000; sustrato de diamino-benzidina [DAB], Dako [Carpinteria, CA]; contratinción de hematoxilina, ampliación original31.000). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

agentes etiológicos. Una ventaja principal de la IHC sobre el cultivo y las tecnologías puramente moleculares es

la identificación visual del organismo en el contexto del tejido enfermo. La interpretación delcultivo sin la visualización histológica de los elementos fúngicos en los tejidos es difícil cuan-do están involucrados agentes oportunistas, ya que estos agentes pueden ser contaminantes. Lavaloración histológica puede proporcionar simplemente un contexto inflamatorio que indiquela posibilidad de enfermedad fúngica. Ocurre lo mismo con los métodos moleculares. Encon-trar ADN de Aspergillus en un raspado corneal es una evidencia mucho más fuerte de querati-tis fúngica cuando existe una evidencia histológica o citológica de inflamación típica asociadaa enfermedad fúngica. Una web de Internet excelente para revisar el número de laboratorios queofrecen actualmente IHC para el diagnóstico de enfermedades infecciosas es la base de datosde IHC desarrollada y mantenida por el laboratorio diagnóstico de la South Dakota State Uni-versity [46].

TÉCNICAS MOLECULARESCada vez más clínicos en medicina humana y veterinaria consideran las pruebas diagnósticasbasadas en PCR como ordinarias. Para la mayoría, el desarrollo de técnicas moleculares enmedicina veterinaria se ha centrado en la enfermedad bacteriana y vírica. Sin embargo, en laliteratura veterinaria y humana existe un mayor número de comunicaciones sobre el empleo deestas pruebas en organismos más complejos, como protozoos u hongos. Puede accederse alboom de técnicas diagnósticas mediante PCR a través de Internet, en la web del laboratorio dediagnóstico por IHC de la South Dakota State University [47]. Actualmente, están disponiblespruebas específicas para Candida spp y Blastomyces spp y una prueba de PCR «panfúngica»para las pruebas diagnósticas. Las técnicas para el diagnóstico molecular fúngico se han em-pleado principalmente para los patógenos de las plantas [48]. Las principales ventajas de losmétodos moleculares basados en PCR son la sensibilidad, el desarrollo de técnicas innovado-ras con PCR a tiempo real, y la velocidad. El principal inconveniente es el control de calidad dela prueba diagnóstica.

El empleo de pruebas moleculares en el contexto médico humano está siendo sometidaa examen para desarrollar un método adecuado de control de calidad y estandarización de métodos [48-50]. La sensibilidad de estas técnicas, la contaminación de las muestras y la comunicación posterior de falsos positivos son los principales inconvenientes dentro del contexto del laboratorio; son necesarias prácticas de laboratorio estándar cuidado-sas para garantizar resultados precisos. Además, cuando se comparan las muestras biológi-cas con cultivos puros pueden contener sustancias inhibitorias que pueden originar falsosnegativos [48,51]. Los primers «específicos» empleados en PCR pueden ser menos queespecíficos, con una ampliación de ADN que no es el ADN diana, originando resultadosdifíciles de interpretar.

Por otra parte, el continuo desarrollo de protocolos estandarizados y probados para la iden-tificación de patógenos fúngicos puede progresar, además de la necesidad del clínico de undiagnóstico más exacto. El desarrollo de un protocolo de PCR para cualquier agente es un pro-ceso de tres pasos: 1) primers de diseño para identificar el segmento diana de ADN específicodel agente; 2) optimización del ADN total de la muestra biológica, y 3) determinar las condi-ciones óptimas para la ampliación del ADN diana por los primers.

Existen varios abordajes para optimizar el resultado. La selección de un ADN diana con

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múltiples copias en el genoma puede potenciar la sensibilidad. Anidar una reacción median-te dos procesos de ampliación empleando primers «universales» cuyo objetivo es un tipo deorganismo, es otra posibilidad. En los diagnósticos fúngicos, los primers universales son laszonas del ADN ribosómico del espaciador transcrito interno altamente conservado (ITS) quelimita más genes ribosómicos específicos de especie: 25S, 18S y 5.8S. Empleando dos de lascinco zonas de ITS conocidas como reacción inicial, los primers más específicos para losgenes ribosómicos 18S o 5.8S pueden «anidarse» para proporcionar la especificidad nece-saria. Por otro lado, la ampliación inicial del producto originada por el empleo de primersITS puede secuenciarse y compararse con las bases de datos genómicas disponibles. Se hadescrito la detección de Aspergillus fumigatus [52], C. neoformans [53], Pythium y Lageni-dium [54], y H. capsulatum [55] en muestras clínicas con el gen de ADN ribosómico 18S olas zonas ITS.

Es importante saber que la identificación mediante la secuenciación con ADN del gen 18So ITS no siempre es definitiva. La capacidad de identificar un organismo fúngico depende deque el ADN del hongo en cuestión se haya secuenciado previamente y derivado a las basesde datos genómicas. Millar et al [56] comunicaron el posible error de identificación de uncultivo fúngico desconocido como C. immitis cuando la identificación se basaba sólo en lasecuencia de ADN 18S. Este error se producía porque la secuencia de ADN de 18S paraChrysosporium keratinophilum no estaba disponible en la base de datos genómica, y estosdos hongos eran idénticos en la secuencia de la zona de 18S en un 99,4%. La secuencia parael ADN 5.8S era más específica; la muestra clínica tenía una identidad en la secuencia del100% en la secuencia de ADN 5.8S publicada de C. keratinophilum y sólo del 84,7% en lasecuencia del ADN 5.8S publicada para C. immitis. Este caso sugiere que la identificaciónfúngica basada en la secuenciación de ADN debería incluir la comparación de, por lo menos,dos zonas de ADN.

A diferencia de la identificación de los agentes fúngicos en los tejidos, los métodos basadosen PCR se emplean habitualmente para confirmar la identificación de los hongos en el cultivo.Debido al riesgo del personal de laboratorio al manejar los cultivos tras haber formado lasestructuras asexuales específicas morfológicamente, se han desarrollado sondas de ADN quepueden emplearse en cultivos inmaduros para identificar el agente fúngico. Las sondas de ADNson segmentos de ADN marcados, complementarios, y de una sola cadena, específicos para unaúnica zona de ADN fúngico, normalmente el gen de ARN ribosómico. El principio de la prue-ba es parecido al de la prueba de ELISA. La sonda de ADN marcada y de única cadena seemplea en el lugar del anticuerpo marcado y se alinea con el ADN complementario, si existe,en la muestra que se analiza. Gen-Probe (SanDiego, CA) ha desarrollado equipos de identifi-cación fúngica para Blastomyces, Coccidioides e Histoplasma empleando sondas de ADN mar-cadas con quimioluminiscencia. Estos equipos que emplean sondas de ADN pueden tener unmayor empleo futuro en laboratorios microbiológicos que identifiquen ordinariamente patóge-nos fúngicos.

La tecnología de microarray emplea la PCR a fondo. Hay técnicas de microarray en los que las sondas específicas de ADN de varios agentes infecciosos se fijan a pequeñaszonas en una fase sólida, como un portaobjetos de cristal, y así las muestras clínicas pue-den analizarse para varios organismos simultáneamente. Esta técnica se ha desarrolladopara el análisis de antígenos bacterianos [57] y víricos [58] en nuestras clínicas en sereshumanos. Actualmente, la técnica de microarray en micología se ha centrado en el examen

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del genoma de determinados patógenos para la identificación de genes relacionados con lapatogenicidad [59] y determinación de la expresión génica durante las fases de crecimien-to saprofítico y parasitario [60]. A medida que se conoce mejor el genoma de los patógenosfúngicos, el desarrollo de sondas específicas de especie debe facilitar que la técni-ca de microarray se emplee también para la detección de enfermedad micótica en muestrasclínicas.

RESUMENEl diagnóstico de la enfermedad fúngica es un reto que requiere una especial atención a la his-toria y los signos clínicos, además de una capacidad astuta para interpretar los datos de labora-torio. Dado que la enfermedad fúngica puede imitar otras enfermedades infecciosas y neoplá-sicas en su presentación clínica, el clínico debe conocer las enfermedades fúngicas habitualesen su región, además de las de otras zonas del país. Los métodos tradicionales para la identifi-cación del patógeno fúngico mediante citología, histopatología, el cultivo y el empleo de laserología para confirmar la exposición a determinados agentes han servido al veterinario duran-te décadas, y deberían seguir siendo útiles durante muchas más. Sin embargo, existen nuevastécnicas que proporcionan métodos adicionales para identificar patógenos fúngicos determina-dos en muestras en las que los métodos tradicionales fracasaban. La IHC puede ayudar cuandono existe tejido fresco para el cultivo, y las técnicas de PCR pueden ser útiles para la identifi-cación de agentes en muestras con escaso número de organismos. Con el continuo desarrollo detécnicas moleculares, nuevos métodos, como el microarray, permiten la dirección de variosagentes de infecciosos en muestras clínicas, y puede que esto sea en un futuro tan habitual comolos métodos tradicionales. Sin embargo, todos los resultados de las pruebas diagnósticas debeninterpretarse en el contexto del paciente.

Bibliografía

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DIAGNÓSTICO FÚNGICO: TÉCNICAS ACTUALES Y FUTURAS 391

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