Diagnóstico imuno-histopatológico da paratuberculose ... ... subjected to Ziehl-Neelsen staining,…

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Transcript

Pesq. Vet. Bras. 33(12):1427-1432, dezembro 2013

1427

RESUMO.- O diagnstico precoce e especfico da paratuber-culose ainda um desafio. Isto pode estar associado bai-xa sensibilidade dos testes laboratoriais e ou variao da

resposta imunolgica frente infeco por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Mundialmente, uma enfer-midade que causa importantes prejuzos econmicos, em

Diagnstico imuno-histopatolgico da paratuberculose subclnica em bovinos no estado do Rio de Janeiro1

Elise M. Yamasaki2, Marilene de Farias Brito3, Douglas McIntosh4, Alexandre Galvo5, Tiago C. Peixoto6 e Carlos Hubinger Tokarnia7

ABSTRACT.- Yamasaki E.M., Brito M.F., McIntosh D., Galvo A., Peixoto T.C. & Tokarnia C.H. 2013. [Imuno-histopatologic diagnosis of subclinic bovine paratuberculosis in the state of Rio de Janeiro.] Diagnstico imuno-histopatolgico da paratuberculose subcl-nica em bovinos no estado do Rio de Janeiro. Pesquisa Veterinria Brasileira 33(12):1427-1432. Curso de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropdica, RJ 23890-000, Brazil. E-mail: elise_my@yahoo.com.br

The early and specific diagnosis of paratuberculosis remains a challenge due to the low sensitivity of the currently available laboratory tests and also because of variations in the immune response towards infection with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Globally this disease causes significant economic losses, primarily in dairy cattle, owing to the chronic nature of the infection. Paratuberculosis has been described in a number of Brazilian states and from a diversity of domestic ruminant species clearly demonstrating that the disease is present in the country and highlighting the requirement for the develop-ment of diagnostic techniques for confirmation of infection and for epidemiological analy-ses. The aim of this study was to characterize the anatomo-histopathological and immuno-histochemical findings in the bowel and mesenteric lymph nodes of assymptomatic cattle, derived from paratuberculosis positive herds located in state of Rio de Janeiro, Brazil. Ma-croscopic examination during necropsy revealed nonspecific changes including reddening of the gut mucosa, increased volumes for the Peyers patches and mesenteric lymph nodes and in some case dilation and whitening of the mesenteric lymphatic vessel. Histopatho-logy revealed granulomatous infiltration, occasionally with the formation of giant cells in the jejunal and ileal mucosa or sub-mucosa, and/or in the cortical region of the mesenteric lymph nodes, in 32 of the 52 cattle examined. Tissue sections from these animals were subjected to Ziehl-Neelsen staining, but the presence of acid-fast bacilli was not observed. Subsequent analysis, employing genus specific immunohistochemisty for Mycobacterium, revealed areas of immunoreactivity in sections prepared from a total of six animals. The results of this investigation highlighted the value of histopathology and particularly immu-nohistochemistry as tools for the diagnosis of subclinical paratuberculosis.INDEX TERMS: Paratuberculosis, Johnes disease, cattle, immunohistochemistry, pathology, Brazil.

1 Recebido em 12 de agosto de 2013.Aceito para publicao em 9 de outubro de 2013.

2 Curso de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias, Universidade Fede-ral Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Rodovia BR-465 Km7, Seropdica, RJ 23890-000, Brasil. *Autor para correspondncia: elise_my@yahoo.com.br

3 Departamento de Epidemiologia e Sade Pblica, Instituto de Veterin-ria, UFRRJ, Seropdica, RJ.

4 Depto Parasitologia Animal, Instituto de Veterinria, UFRRJ, Seropdica, RJ.

5 Mdico Veterinrio, Doutorado em Cincias Veterinrias, UFRRJ, Se-ropdica, RJ.

6 Departamento de Anatomia, Patologia e Clnicas Veterinrias, Esco-la de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia (UFBA), Avenida Adhemar de Barros 500, Ondina, Salvador, BA 40170-110, Brasil.

7 Departamento de Nutrio Animal e Pastagem, Instituto de Zootecnia, UFRRJ, Seropdica, RJ.

Pesq. Vet. Bras. 33(12):1427-1432, dezembro 2013

1428 Elise M. Yamasaki et al.

especial, bovinocultura leiteira, devido ao carter crnico da infeco. No Brasil, a paratuberculose j foi descrita em diversas espcies de ruminantes domsticos e em vrios es-tados, o que demonstra que a enfermidade est presente em territrio nacional e h a necessidade de elaborao de tcni-cas de diagnstico para a confirmao da infeco. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os achados antomo-histopa-tolgicos e imuno-histoqumicos em intestino e linfonodos mesentricos de bovinos assintomticos, provenientes de re-banhos positivos para paratuberculose localizados no estado do Rio de Janeiro, Brasil. O estudo macroscpico revelou alte-raes inespecficas tais como reas avermelhadas na muco-sa do intestino, aumento do volume das placas de Peyer e dos linfonodos mesentricos, alm disso, observou-se que vasos linfticos mesentricos estavam dilatados e esbranquiados. Do total de 52 vacas leiteiras avaliadas, a histopatologia re-velou infiltrao granulomatosa, por vezes com formao de clulas gigantes multinucleadas, em mucosa e ou submucosa de jejuno, leo e em linfonodos mesentricos, principalmente na regio cortical, em 32 animais. Estes bovinos foram sub-metidos colorao de Ziehl-Neelsen cujo teste no demons-trou reao positiva, no entanto, quando analisados pelo tes-te imunohistoqumico para Mycobacterium spp. observou-se imunorreao em 6 animais. Desta forma, a histopatologia e imunohistoqumica pode ser uma importante ferramenta para diagnstico da paratuberculose subclnica.TERMOS DE INDEXAO: Paratuberculose, doena de Johne, bo-vinos, imuno-histoqumica, patologia, Brasil.

INTRODUOA paratuberculose, tambm chamada de doena de Johne, causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculo-sis (Map); afeta principalmente ruminantes e responsvel por prejuzos econmicos importantes na produo animal (Timms et al. 2011). O perodo de incubao da doena de Johne longo e irregular; a maioria dos animais infectados no apresenta os sinais clnicos caractersticos da enfermi-dade ao longo de sua vida (Behr & Collins 2010) e pode eliminar, intermitentemente, a micobactria no ambiente, atravs das fezes. O diagnstico precoce e especfico da pa-ratuberculose ainda um desafio (Timms et al. 2011, Mon et al. 2012) relacionado, em parte, baixa sensibilidade dos testes laboratoriais existentes (Stabel 2010, Timms et al. 2011, OIE 2013), o que contribui para a ineficincia das medidas de controle no rebanho. O interesse pelo estudo do Map se deve, tambm, sua possvel associao com a doena de Crohn em seres humanos (Nakase et al. 2011, Van-Kruiningen 2011, Retamal et al. 2011, Chiodini et al. 2012, Singh & Gopinath 2012).

Em levantamento bibliogrfico realizado sobre a ocor-rncia da paratuberculose no Brasil, verificou-se que a en-fermidade j foi relatada em 11 estados, o que evidencia a sua importncia epidemiolgica no pas (Yamasaki et al. 2013). Diante disso, observa-se a necessidade de elabora-o de ferramentas de diagnstico confiveis para deteco de animais subclnicos dentro do rebanho e, consequente-mente, proporcionar melhorias nas medidas de controle em rebanhos positivos para paratuberculose.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar os achados antomo-histopatolgicos e imuno-histoqumicos em in-testino e linfonodos mesentricos de bovinos assintom-ticos, provenientes de propriedades positivas para paratu-berculose no estado do Rio de Janeiro.

MATERIAL E MTODOSA partir da confirmao do diagnstico de paratuberculose em re-banho bovino (por meio de informaes e dados obtidos atravs do histrico, exames antomo-histopatolgicos e imuno-histoqu-mico, isolamento de Map a partir de fezes e de raspado de mucosa intestinal e por PCR IS900 e F57), foi realizado um estudo imuno--histopatolgico em intestino e linfonodos mesentricos de vacas destinadas ao abate sem sinais clnicos da enfermidade, com o intuito de identificar animais na fase assintomtica da infeco.

Coleta de fragmentos de intestino e linfonodos mesentricosEntre 2007 e 2012 foram avaliadas 52 vacas leiteiras assinto-

mticas provenientes de dois rebanhos positivos para paratuber-culose localizados na regio sul do estado do Rio de Janeiro.

Do Rebanho A, localizado no municpio de Rio Claro, RJ, fo-ram estudados 50 vacas, as quais foram enviadas para abate por variados motivos, tais como mastite recidivante, desordens repro-dutivas, principalmente ausncia de cio, distrbios locomotores, pododermatites e fratura em membros. Durante as visitas peri-dicas ao frigorfico para acompanhamento do abate foram realiza-das avaliao macroscpica e coleta de fragmentos de diferentes sees do intestino (duodeno, jejuno, leo, vlvula leo-cecal, ceco e clon) e de linfonodos mesentricos.

Do Rebanho B, localizado no municpio de Barra Mansa, RJ, foram avaliadas duas vacas, as quais foram necropsiadas na pro-priedade e, igualmente, coletados fragmentos de diversas sees de intestino e de linfonodos mesentricos.

HistopatologiaAps a avaliao macroscpica do trato intestinal, os frag-

mentos foram coletados em frascos separados, identificados e fixados em formol a 10% neutralizado com carbonato de clcio e processados pelos mtodos usuais para anlise histolgica no Laboratrio de Histopatologia, do Projeto Sanidade Animal (PSA) do Convnio Embrapa/UFRRJ; em seguida, foram includos em parafina, cortados a 5m e corados pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os fragmentos que apresentaram leses granulomatosas foram corados pela tcnica de Ziehl-Neelsen (ZN) (Luna 1968) para evidenciao de bacilos lcool-cido resistentes (BAARs) e, em seguida, submetidos ao teste imuno-histoqumico (IHQ) para Mycobacterium spp. Controles positivos e negativos foram utiliza-dos a cada processamento.

Teste imuno-histoqumicoAs seces foram corta