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Trabajo científico

Resumen

Las leucemias se caracterizan por la presencia de abundantes células precursoras o blastos en sangre periférica. Existen analizadores hematológicos capaces de determinar este tipo de células, por lo que son una herramienta diagnóstica muy eficaz para detectar este tipo de patologías de manera rápida. En este trabajo se recopilaron 22 muestras sanguíneas con una clara sospecha de leucemia en base a los parámetros gráficos (citogramas) característicos que proporcionó el analiza-dor hematológico. De todas las muestras se realizaron frotis sanguíneos para su diagnóstico citológico, el cual fue de leucemia en todas ellas. Se puede concluir por tanto, que la identificación e interpretación correcta de este tipo de gráficas, proporciona en pocos minutos una sospecha fundada de leucemia.

Palabras clave

Leucemia, citogramas, blastos, analizador hematológi-co, frotis sanguíneos.

Introducción

Actualmente muchas clínicas veterinarias y todos los laboratorios de referencia disponen de diversos analiza-dores hematológicos. Entre todos ellos, los que se basan en la citometría de flujo (con tecnología láser) son los de mayor utilidad diagnóstica, ya que son capaces de diferenciar e identificar distintos tipos de células san-guíneas incluidas las formas inmaduras o precursoras de las mismas. Esta ventaja es claramente útil en los

análisis hematológicos de rutina, ya que se puede de-tectar un proceso leucémico en sangre periférica y de forma inmediata, en base a la identificación de células precursoras por el instrumento.

Las leucemias son neoplasias malignas que proceden de los precursores hematopoyéticos de la médula ósea. Estas células neoplásicas se mantienen como un clon de células inmaduras no funcionales, al ser incapaces de sufrir procesos de diferenciación, maduración o apoptosis (1,2,5,15,19,22,23). Desde el punto de vista de la línea celular de la que proceden, las leucemias se pueden clasificar en dos grandes grupos: linfoide y mieloide. La leucemia linfoide (figura 1) se origina a partir de la estirpe medular linfoide, que se expresa en linfocitos y por otra parte la mieloblástica, que procede de la línea mieloide (figura 2), la cual en condiciones normales da lugar al resto de los leucocitos (figura 3).

Diagnóstico precoz de leucemias mediante análisis hematológico

automatizado Sánchez Visconti, G.*, Hervás Rodríguez, J. ** y Chacón-M Lara, F. *** Doctor en Farmacia. Laboratorio de Análisis Veterinarios (LAV). Madrid.** Doctores en Veterinaria. Histolab Veterinaria. Fuengirola (Málaga).

Figura 1. Leucemia linfoide. Frotis sanguíneo en el que se aprecia una población numerosa de células blásticas de estirpe linfoide. Tinción de Diff-Quick® x400.

Diagnóstico precoz de leucemias - Sánchez Visconti, G., Hervás Rodríguez, J. y Chacón-M Lara, F.

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Además, en función del curso clínico y de las caracterís-ticas citológicas de la población de células leucémicas, pueden clasificarse como agudas y crónicas (1,7,8,17,22 ,23). Así se describen dos categorías:

Además, en función del curso clínico y de las caracterís-ticas citológicas de la población de células leucémicas, pueden clasificarse como agudas y crónicas (1,7,8,17,22 ,23). Así se describen dos categorías: • Leucemia linfoide: Leucemia linfoblástica aguda (LLA)

y leucemia linfocítica crónica (LLC) como reflejo de alte-raciones linfoproliferativas (linfoide) a nivel medular.

• Leucemia mieloide: Leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia mieloide crónica (LMC), originadas por altera-ciones mieloproliferativas (mieloide) de la médula ósea. Las leucemias mieloides agudas se subclasifican a su vez en mieloblásticas (sin maduración o con maduración parcial), promielocítica hípergranular aguda, mielomo-nocítica, monocítica y megacarioblástica (1,8). Asimismo algunas leucemias se denominan como aleucémicas o subleucémicas (7,10,22), lo que significa que las células neoplásicas aparecen en médula ósea, pero raramente se observan en sangre o su número es escaso.

Las leucemias agudas se caracterizan de forma genérica por la presencia de células blásticas en médula ósea, bien sean linfo-blastos en el caso de la LLA o bien mieloblastos en caso de la LMA, y presentan en general un comportamiento biológico agresivo. Por otra parte, el curso de las leucemias crónicas es prolongado y en la mayoría de las ocasiones tarda en mani-

festarse. En estos casos es característica la presencia de algún precursor tardío bien diferenciado en la médula ósea o en san-gre, ya sean linfocitos en la LLC o neutrófilos en la LMC (1,8,23).

En los dos tipos de leucemias agudas (LLA y LMA) se pueden observar células leucémicas inmaduras o blásticas en extensiones sanguíneas, mediante técnicas rutinarias de tinción de colorantes como Giemsa, Diff-Quick® o tinción de Wright, siendo este hecho más frecuente en las LLA. En estos casos el diagnóstico de leucemia se confir-ma por la observación de abundantes blastos en sangre periférica o en médula ósea (12,18).

Sin embargo, a través del estudio de sangre periférica es difícil clasificar las leucemias como linfoides o mieloides, ya que en ambos casos las células blásticas que proliferan muestran características citológicas muy parecidas al estar normalmente poco diferenciadas (2,12,18,19). A pesar de ello la observación de un número considerable y característico de blastos en frotis sanguíneos supone un diagnóstico preli-minar de leucemia (12,18), aunque su clasificación definitiva debe hacerse por tinciones citoquímicas (2) o mediante técnicas de identificación del inmunofenotipo.

Por tanto, si el análisis automatizado de muestras san-guíneas es capaz de detectar de forma precisa un número anormal de blastos en sangre periférica, se dispondrá de una herramienta de gran utilidad para detectar un proceso leucémico con sólo el análisis visual de gráficas específicas y de algunos otros parámetros hematológicos. Esto ade-más, se podrá conseguir en un corto periodo de tiempo.

Figura 2. Leucemia mielomonocítica. Frotis sanguíneo en el que se aprecia una abundante población de células blásticas mieloides con núcleos escotados, nucleolos prominentes y seudópodos citoplasmáticos. Tinción de Diff-Quick® x400.

Figura 3. Esquema de la formación de los distintos tipos de leucocitos a partir de sus precursores. La línea linfoide daría lugar a las leucemias linfoblásticas, a partir del linfoblasto y la línea mieloide a las leucemias mieloblásticas, originada por el mieloblasto.

6

Trabajo científico

Material y métodos

El instrumento utilizado para el estudio fue un analizador hematológico dotado de un programa in-

formático para multiespecies de mamíferos (ADVIA 120, SIEMENS). Este analizador es un citómetro de flujo que consigue la identificación del diferencial leucocitario combinando un láser y la citoquímica. Con ello se obtienen dos tipos de gráficas (o citogra-mas), la de peroxidasa y la de basolobularidad.

Figura 4. Informe del ADVIA 120 en cuanto a parámetros leucocitarios. Todas las áreas están identificadas en base a la agrupación de las distintas poblaciones leucocitarias, en las 2 gráficas o citogramas. En la gráfica A se representa la actividad de las poblaciones leucocitarias, respecto a su tamaño (eje Y) y actividad peroxidásica (eje X). El área que nos interesa es la denominada LUC (células grandes no teñidas). En ella se agrupan las células mayores y que menos se tiñen con la peroxidada y es donde se localizan los blastos. En la figura B se representa el tamaño del núcleo celular (eje Y) frente a la densidad de la cromatina (eje X), de todas las poblaciones de leucocitos. En esta última gráfica los leucocitos se agrupan en mononucleados (linfocitos y monocitos), polimorfonucleados (neutrófilos y eosinófilos) y basófilos (en un canal aparte). Los blastos se pueden encontrar en el área de basófilos.

Figura 5. Resultados (gráficos y numéricos) característicos de una muestra de un perro normal. Las distintas poblaciones de leucocitos se agrupan -en la gráfica de peroxidada- en sus áreas correspondientes: 1 neutrófilos, 2 linfocitos, 3 monocitos, 4 eosinófilos y 5 LUC (células grandes no teñidas). Los porcentajes de las distintas poblaciones leucocitarias son normales. No se observa densidad de población en las áreas 5 LUC del citograma de peroxidada, ni en las demás áreas del citograma de basolobularidad (6 mononucleados, 7 polimorfonucleados y 8 basófilos).

C

M

Y

CM

MY

CY

CMY

K

AF Prensa A3 STRONGHOLD.ai 1 04/03/13 18:08

Trabajo científico

Tabla

1. Re

sulta

dos h

emat

ológic

os de

las m

uestr

as an

aliza

das.

El dia

gnós

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e tod

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n en f

rotis

sang

uíneo

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ión de

Diff-

Quick

®.

LEUC

. (x10

3/µl)

NEUT

. (%)

LINF.

(%)

MONO

. (%)

EOS.

(%)

BASO

. (%)

LUC (

%)GR

. (x10

6/µl)

HB. (g

/dl)

HCTO

. (%)

PLQ.

(x103

/µl)

Diag

nósti

co

20,82

68,30

19,50

4,20

1,30

9,30

6,60

3,38,5

27,7

211

Leuc

emia

Gran

ulocít

ica

185,4

49,8

072

,102,3

00,0

00,3

016

,104,1

8,927

,316

1Le

ucem

ia Lin

foide

29,18

9,50

53,80

6,70

0,60

0,10

30,10

2,56,7

22,8

19Le

ucem

ia Gr

anulo

cítica

26,17

43,00

46,90

2,30

2,60

0,40

4,00

6,015

,348

,723

8Le

ucem

ia Lin

focític

a

361,7

10,4

066

,207,2

00,0

00,1

026

,904,4

9,733

,970

Leuc

emia

Linfoi

de

48,37

0,30

90,30

0,70

0,00

0,30

7,50

2,76,0

20,7

19Le

ucem

ia Mi

elomo

nocít

ica

55,13

14,80

80,60

1,90

0,40

0,20

2,40

7,315

,858

,720

4Le

ucem

ia Lin

foide

34,16

7,60

89,10

0,80

0,10

0,20

2,10

4,811

,036

,615

6Le

ucem

ia Lin

foide

25,06

45,90

35,60

3,60

1,30

0,30

13,30

1,84,0

11,8

122

Leuc

emia

Gran

ulocít

ica

72,63

36,30

52,70

7,60

0,90

0,30

2,10

4,813

,538

,553

4Le

ucem

ia Lin

foide

/Gran

ulocít

ica

31,37

49,80

39,50

3,10

0,80

0,20

6,70

3,27,1

22,7

131

Leuc

emia

Mielo

mono

cítica

23,07

6,90

66,20

10,80

0,20

0,50

11,60

1,43,6

11,7

46Le

ucem

ia Lin

foide

30,19

52,40

22,30

10,00

0,10

3,40

11,70

3,07,1

22,5

218

Leuc

emia

Crónic

a

48,24

3,10

56,60

6,40

0,10

0,20

33,20

3,27,8

23,3

34Le

ucem

ia Gr

anulo

cítica

405,4

82,5

061

,602,2

00,0

01,9

031

,304,7

10,1

31,5

232

Leuc

emia

66,75

23,00

67,60

2,10

0,30

0,50

6,60

5,112

,837

,520

5Le

ucem

ia Lin

foblás

tica

197,7

06,0

074

,701,9

00,4

00,0

015

,705,9

14,0

42,6

56Pro

ceso

Miel

oprol

iferat

ivo

188,2

822

,1065

,103,7

00,2

00,3

08,8

04,0

10,8

34,8

407

Leuc

emia

Linfoi

de

202,0

39,7

051

,108,0

00,1

01,3

029

,603,1

6,518

,263

Leuc

emia

Linfoi

de

355,4

70,4

041

,1016

,900,0

02,6

042

,102,1

5,117

,737

Leuc

emia

Linfoi

de

99,23

89,30

5,20

3,30

0,10

0,30

1,80

6,014

,440

,615

6Le

ucem

ia Gr

anulo

cítica

78,57

28,10

52,50

8,20

0,20

0,10

11,20

2,05,3

20,1

190

Leuc

emia

Linfoi

de

117,5

024

,0555

,015,1

80,4

41,0

414

,613,8

89,2

729

,5415

9,50

120,9

619

,1672

,9811

,760,2

22,9

812

,041,5

73,7

511

,9812

6,75

4,6 - 1

7,442

,5 -7

7,311

,8 -3

9,63,3

- 10,3

0 - 7

0 - 1,

30 -

35,7

- 8,9

13 - 2

140

- 63

100 -

337

LEUC

. = le

ucoc

itos.

NEUT

. = ne

utróf

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LINF. =

linfoc

itos.

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. = he

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. = he

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matoc

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ratori

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Para perros y gatos

1010

Trabajo científico

En el citograma de peroxidada se representa el tamaño y la actividad peroxidásica de cada célula (figura 4). Entre las diferentes zonas de la gráfica se clasifican las distintas poblaciones de leucocitos. Así se obtiene el número o porcentaje de neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y de células gran-des que no se tiñen (del inglés large unstained cells o LUC). El área LUC de esta gráfica agrupa a células grandes y peroxidasa negativas. Usualmente las célu-las comprendidas en esta zona suelen corresponder a leucocitos grandes hiperactivos, linfoblastos, mie-loblastos y en general células precursoras (3,6,9,20,21). En estudios sobre muestras de sangre humana se ha hallado una buena correlación entre el porcentaje de LUC (respecto al número de leucocitos totales) de-terminados por el instrumento y diferentes métodos manuales (3,6,9).

El citograma de basolobularidad representa el tamaño del núcleo y la densidad de la cromatina (figura 4) de cada población leucocitaria. La gráfica comprende tres zonas donde agrupa a las células mononucleadas, poli-morfo-nucleadas y basófilos.

Los citogramas que presentan los perros normales se muestran en el ejemplo de la figura 5, sin células aparen-tes en el área LUC. En estudios de sangre de humanos con procesos leucémicos los citogramas son muy carac-terísticos (3,6,9) y similares a los hallados en perros con leucemia (20,21) (figura 6). Así, en estas patologías, en la gráfica de peroxidasa se observa una gran población localizada en el área LUC, que comienza desde la zona de linfocitos y que hace que la imagen del citograma sea claramente distinta a la de los perros normales. También se observa una población anormal y numerosa en el

Figura 6. Resultados gráficos de una muestra de un perro diagnosticado de leucemia linfoidea. Se puede observar como en el citograma de peroxidasa las células son principalmente 2 linfocitos y 5 LUC (células grandes no teñidas). En el citograma de basolobularidad se observa una amplia población de células 6 mononucleadas que invaden la zona de basófilos (8). En ambos citogramas se detectan células precursoras o blastos, que se localizan en las áreas mencionadas, con gran densidad de población celular.

Diagnóstico precoz de leucemias - Sánchez Visconti, G., Hervás Rodríguez, J. y Chacón-M Lara, F.

citograma de basolobularidad, que comienza en la zona de mononucleadas y termina en la zona correspondiente a los basófilos. La alta densidad de poblaciones celulares en ambas gráficas, con-cretamente en las áreas de LUC y de basófilos, son por tanto compatibles con la aparición de cé-lulas precursoras (blastos), como anteriormente hemos indicado.

Para la realización de este trabajo, se recopila-ron 22 muestras de perros que presentaban ese patrón de citogramas anormales (figura 6) y se archivaron todos los datos de los diferentes pará-metros hematológicos. Posteriormente, de cada una de las muestras se enviaron frotis sanguí-neos al laboratorio de histopatología y citología Histolab Veterinaria, que fueron teñidos con la técnica rutinaria de tinción de Diff-Quick,® para su diagnóstico citológico.

Resultados

Las 22 muestras objeto del estudio presentaban los citogramas típicos de leucemia, similares a los descritos en procesos leucémicos de huma-nos (3,6,9) y de perros (20,21). En todos los frotis sanguíneos analizados, el diagnóstico citológico fue de leucemia. Aunque el objeto de este artí-culo no es la clasificación del tipo de leucemia, sino su detección, ciertos patrones sugieren que la mayoría de ellas eran linfoides.

Se clasificaron los datos de los diferentes pará-metros hematológicos para ver si había alguna tendencia relevante en este tipo de patologías (tabla 1), comparándolos con los valores norma-les de nuestro laboratorio. En todas las muestras analizadas se apreció un aumento de leucocitos. La población de linfocitos también fue alta en 19 de las muestras. Además se observó neu-tropenia y monocitopenia en 16 y 12 muestras respectivamente. El porcentaje de eosinófilos y de basófilos fue normal en la mayoría de las ocasiones. Prácticamente todas las muestras (excepto 4 de ellas) mostraban anemia al pre-sentar valores bajos de hematíes, hemoglobina y hematocrito. Solo existió trombocitopenia en 8 muestras. Excepto en 4 muestras, el porcentaje

de LUC estaba por encima de los valores norma-les de referencia (0 - 3 %)

Discusión

Los resultados hematológicos aportan mucha in-formación sobre posibles patologías y alguno de sus parámetros analíticos puede indicarnos la exis-tencia de una enfermedad concreta. En el caso de las leucemias, se ha descrito que tanto las leuce-mias agudas como las crónicas presentan anemia y trombocitopenia (2). Nuestros resultados indican que la mayoría de las muestras presentaban nive-les bajos de hematíes, hemoglobina y hematocrito. Puesto que la anemia es frecuente en muchos otros procesos (ehrlichiosis, hemorragias, etc…), por sí sola no hace sospechar de una leucemia.

En cuanto a la trombocitopenia (2,9), aunque la media de plaquetas fue normal, 8 muestras presentaron un número de plaquetas bajo, por lo que no se puede concluir que en nuestros resultados exista un patrón uniforme en todas las muestras. Otras causas de trombocitopenia, como ocurre en el caso de la anemia, hacen que este dato no sea un parámetro analítico determinante frente a un posible diagnóstico preliminar de leucemia.

Al igual que ocurre en la bibliografía consul-tada (1,13,14,15,16,23), los autores hemos detectado leucocitosis en todas las muestras analiza-das y clara presencia de blastos (LUC) en la mayoría de ellas. Además, se observó que la densidad celular en las áreas LUC y de basó-filos de los citogramas fue alta en todas las muestras. Es bien sabido que la detección en un hemograma de altos niveles de leuco-citos no es un dato clave para sospechar de leucemia, puesto que procesos inflamatorios y sobre todo infecciosos producen leucoci-tosis. En la literatura también se describe la existencia de linfocitosis (1,4,15,23) en casos de leucemias, tal y como ocurrió en la mayoría de muestras analizadas en nuestro estudio. Este sí puede ser un parámetro interesante a considerar, aunque también se observa en infecciones crónicas y tras vacunaciones.

11

12

Trabajo científico

Por otra parte, la aparición de blastos en sangre peri-férica es compatible con neoplasias sanguíneas. Los analizadores hematológicos que son capaces de detec-tarlos con precisión, son una herramienta diagnóstica muy eficaz. La detección de células precursoras por ana-lizadores hematológicos ya ha sido referida en otros trabajos en muestras humanas (3,6,9). Esta capacidad se ha confirmado en el presente estudio con muestras caninas ya que excepto en 4 de ellas, el resto mostraba aumento de las LUC.

El dato más destacable es que en todas las muestras se observó un aspecto típico y característico en los ci-togramas de peroxidasa y de basolobularidad, lo que inmediatamente hizo sospechar de neoplasia sanguínea, que fue confirmada posteriormente mediante estudio citológico de los frotis sanguíneos. De esta forma, la observación de este tipo de gráficas anormales hace que, con un autoanalizador hematológico de las características antes descritas, sea posible tener una sospecha fundada de neoplasia sanguínea en menos de 2 minutos. En este trabajo, el diagnostico de leucemia se realizó mediante estudio citológico directo al microscopio óptico a partir de frotis sanguíneos, pero la realización de otras técnicas citoquímicas, de determinación del inmunofenotipo y de técnicas histopatológicas a partir de ganglios linfáticos y de médula ósea permitirán realmente la clasificación del tipo de leucemia.

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