Título de la presentación en un máximo de dos líneasTítulo de la presentación en un máximo de dos líneasAspectos técnicos de la Tinciones y de la Técnica de IFD para diagnóstico de Pneumocystis jirovecii.

María Paz AylwinValentina Salas

Sección Parasitología2013

La pneumonía por Pneumocystis (PCP) es una enfermedad gravecausada por el hongo Pneumocystis jirovecii. PCP es una de lasinfecciones oportunistas más frecuentes y graves en personas consistemas inmunitarios debilitados, en particular las personas con VIH /SIDA, aunque, actualmente, este grupo de pacientes son menospropensos a contraer PCP, esta entidad sigue siendo un importanteproblema de salud pública.

Guzmán et al., 2007; Hauser et al., 2011; CDC, 2013

Introducción

Wang et al, 2007. CDC, 2013

Diagnóstico de Pneumocystis en el laboratorio:

a) Muestra:

El lavado broncoalveolar es la muestra recomendada a procesar,aumenta la sensibilidad diagnóstica al compararla con otro tipo demuestras respiratorias, tales como el esputo inducido.

Puede que sea necesario para obtener la muestra mediante biopsiatransbronquial o biopsia pulmonar abierta, estas técnicas dediagnóstico son más sensibles y específicos, pero también son másinvasivas.

Diagnóstico de Pneumocystis en el laboratorio:

b) Técnicas de diagnóstico:

Microscopía:Se basa en la visualización del hongo con la ayuda de

coloraciones especiales, las más utilizadas son:ÓpticaAzul de Toluidina (menor tiempo de procesamiento y menor costo)Metenamina ArgénticaGiemsa

FluorescenciaInmunofluorescencia directa (reconocida como la de mayorsensibilidad, mejor método microscópico).

Otras técnicas:

Actualmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tambiénse utiliza para detectar el ADN de P. jirovecii en muestras clínicas.

Rodiño et al., 2011; CDC, 2013

Tinción Azul de Toluidina O:

Fundamento

Tinción que permite visualizar sólo formas quística del hongo

Rodiño et al., 2011

Azul de toluidina O positivo:

Observación de formas quísticas de P. jirovecii con apariencia degránulos de tonalidad azul-lila, de 5 µm de diámetro aprox.Agrupación en forma de panal

Rodiño et al., 2011

Causas no detección con azul de toluidina O:

Defectos del reactivo utilizado. Necesidad de controlarperiódicamente la calidad de las coloraciones preparadas en ellaboratorio.

Preparación de reactivo de sulfatación crítico calidad de ácido acético glacial

Poca carga de P. jirovecii en la muestra

Infecciones mixtas (otros patógenos enmascaran el hongo).

Rodiño et al., 2011

Control de Calidad Interno• Uso de muestras Positivas

– De rutina – Comerciales

• Cada vez que se procesa una muestra• Con cambios de reactivo • Evaluación de la lectura

– Comparación entre lectores• Se sugiere graficar desempeño en el

tiempo.

EjemploInmunofluorescencia Indirecta para Enfermedad de Chagas

Inmunofluorescencia DirectaFundamento

Anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie dePneumocystis detectan no solo formas quísticas, sino tambiéntróficas y de esporozoítos.

Inmunoflurescencia positivo:

•Observación formas de color verde manzana con morfologíacaracterística de P. jirovecii: estructuras redondas, 5-8 µm de dm.

•Solas o típicamente agrupadas, con pared celular nítida, algunaspresentan fluorescencia principalmente en la periferia y otras enforma homogénea.

•Formas tróficas miden 1-5 µm, tienen núcleo redondeado ycitoplasma de contorno irregular. Matriz interquística antigénicafluorescente que rodea las formas quísticas y tróficas.

•El quiste puede contener hasta ocho esporozoitos en forma demedia luna o pleomórficos, de1-2 µm dm, y tienden a agruparse enmasas dentro de la matriz extracelular.

Rodiño et al., 2011, Merifluor®

1. Light Diagnostics™ Pneumocystis carinii DFA KIT (MILLIPORE).

• Fundamento de la prueba: Anticuerpos monoclonales anti-Pneumocystis carinni conjugados con FITC, reaccionan conantígenos de formas quísticas o trofozoítos presentes en lamuestra del tracto respiratorio (LBA, esputo o muestras debiopsia tejido pulmonar).

• Complejo Ag-Ac se evidencia utilizando luz ultravioleta, la cualal iluminar al FITC, permite visualizarle con fluorescencia colorverde manzana. Resultado Positivo: Fluorescencia verdemanzana asociada indicada asociada a morfologíacaracterística :

Quistes Matriz interquística Trofozoítos

Imunofluorescencia Directa Diagnóstico Pneumocystis jirovecii

Kits comerciales disponibles

1. Merifluor Pneumocystis KIT (MERIDIAN).

• Fundamento de la prueba: Anticuerpos monoclonalesanti-Pneumocystis carinni conjugados con FITC,reaccionan con antígenos de formas quísticas otrofozoítos presentes en la muestra del tracto respiratorio(LBA, esputo o muestras de biopsia tejido pulmonar).

• Complejo Ag-Ac se evidencia utilizando luz ultravioleta,la cual al iluminar al FITC, permite visualizarle confluorescencia color verde manzana. Material debackground se diferencia al teñirse color naranja-rojizo.Resultado Positivo: Fluorescencia verde manzanaasociada indicada asociada a morfologíacaracterística :

Quistes Matriz interquística Trofozoítos

Imunofluorescencia Directa Diagnóstico Pneumocystis jirovecii

Kits comerciales disponibles

Tiempo de procesamiento máximo de cada muestra:

TIPO DE MUESTRA CONDICION MANTENIMIENTO TIEMPO MAX. PROCESAMIENTO

LB /LBASin preservar Hasta 1 mes a 4°C

Fijada en lámina con acetona Teñir dentro de 8 horas o congelar a -20°C hasta un mes.

EI Digerido y no digerido 1 día a 4°C

Digerido y congelado 1-2 meses

TEJIDOFijada en lámina con acetona Teñir dentro de 8 horas o congelar

a -20°C hasta un mes.

No fijada Congelar inmediatamente o fijar en acetona.

Merifluor®

Puntos Críticos Técnica Inmunofluorescencia Directa

Recolección y preparación muestra previo al test. Aumentar posibilidad de hallazgo mediante concentración de muestras:

-LB y LBA: Método de centrifugación: 1.800 g x 10 min. (pellet resuspendido en 0,5 ml de sobrenadante) y Cytospin de Shandon: 900 rpm x 5 min. (< cantidad de muestra, < tiempo).

-Esputo inducido: tratamiento previo DTT-Evitar uso de muestras tratadas con formaldehído, paraformaldehído o

etanol (disminución o pérdida de inmunofluorescencia)

Procedimiento del test:-Fijación de muestras:Light Diagnostics™ Pneumocystis carinii MILLIPORE: Extensiones secadas

al aire libre a Tº ambiente, fijadas en metanol por 2 minutos, debenteñirse inmediatamente o guardarse a -20ºC con secante.

MERIFLUOR®Pneumocystis MERIDIAN: Extensiones secadas al aire libre,fijadas con dos gotas de acetona, deben ser analizadas en un términode 8 horas.

- Tiempo incubación reactivo de detección, lavado cuidadoso de láminas,evitar secado de muestras post-lavado.

Interpretación de resultados: Lectura inmediata, operadordependiente: fluorescencia y morfología característica Pneumocystisjirovecii. Lectura tardía: máx. 48 hr post procedimiento, conservarláminas en oscuridad, 2-8°C.

Control de Calidad: Light Diagnostics™ Pneumocystis

carinii MILLIPOREMERIFLUOR®Pneumocystis

MERIDIAN

INDICACIONES - Control positivo y negativo de

muestras de origen humano, en cada análisis.

-Control positivo de muestra origen humano, verificar funcionamiento del kit.

- Evaluar visualmente componentes del kit (grumos, contaminación).

Título de la presentación en un máximo de dos líneasTítulo de la presentación en un máximo de dos líneas

Recomendaciones para tratamiento de NO conformidades relacionadas con resultados insatisfactorios

Alan Oyarce F.Encargado de Calidad Sección Parasitología

¿Que hacer frente a un resultado insatisfactorio en el control de

calidad externo PEEC?

Consideraciones

• El programa PEEC no tiene fines punitivos.• Un mal resultado es una oportunidad para la mejora de

los procesos.• Permite comparar sus resultados con laboratorios

similares.• Permite monitorizar sus resultados en el tiempo y

detectar tendencias.• Bajo un SGC todo resultado insatisfactorio debe ser

tratado como una no conformidad.

¿Cómo se trata una NO CONFORMIDAD ?

• Levantamiento de la No Conformidad.• Análisis de implicancia.• Acción inmediata.• Investigación de causas.• Acción correctiva.• Seguimiento y evaluación de la eficacia.• Cierre de la no conformidad.

ANÁLISIS DE IMPLICANCIA

• Estimar la magnitud del resultado insatisfactorio.

• Analizar resultados históricos.

• Comparar mis resultados con otros laboratorios.

• Verificar que la evaluación sea adecuada al finpretendido.

• Verificar si el mal desempeño pudo haber afectado amuestras de rutina.

ACCIÓN INMEDIATA

• Destinado a corregir el problema pero no la causa raíz.

• Debe estar de acuerdo al análisis de implicanciarealizado.

• Si es posible repetir el ensayo, si el resultado essatisfactorio se podría considerar un error puntual.

• En esta etapa se puede tomar la decisión de suspendertemporalmente el desarrollo de la técnica hasta asegurarlos resultados.

INVESTIGACION DE CAUSAS

Objetivo: detectar la causa raíz.

• ¿La conservación y manipulación de la muestra fue laindicada ?

• ¿El análisis se realizó de acuerdo al procedimiento?.• ¿El informe y transcripción de datos (ambas partes) fue el

correcto?• ¿El personal esta correctamente capacitado y evaluada su

competencia?• ¿Reactivos, insumos y equipos están en óptimas

condiciones?

ACCIÓN CORRECTIVA

Objetivo: eliminar la causa raiz y evitar su recurrencia.

Ejemplos:• Solicitar una actualización del personal en el

diagnóstico de la metodología.• Modificación de los procedimientos en el desarrollo de

la metodología.• Incorporar un nuevo control de calidad interno en la

técnica.• Realizar pruebas de concordancia interlector en la

interpretación de los resultados.• Etc.

SEGUIMIENTO Y EVALUACIÓNDE LA EFICACIA

Objetivo: Evaluar la efectividad de la acción correctiva.

Ej: Resultado satisfactorio en la próxima evaluación.

De acuerdo a que tan eficaz fue la medida correctiva realizada evaluar la posibilidad de dar por cerrada la no conformidad.

Título de la presentación en un máximo de dos líneasTítulo de la presentación en un máximo de dos líneasSituación y Proyecciones del Subprograma PEEC Pneumocystis jirovecii

Ma Isabel JercicSección Parasitología

2013

Antecedentes

• Este programa comenzó en 1994• Hasta 1997 se efectuaron 2 evaluaciones

a los 15 laboratorios pertenecientes solo aServicios de Salud.

• En el año 2000 se modificó el número deláminas enviadas a los participantesaumentando a 5 en cada evaluación.

Antecedentes

• A partir del año 2002 las muestrasenviadas son analizadas por un tercermétodo diagnóstico Inmunofluorescenciadirecta con anticuerpos monoclonales.– Se envía una alícuota de lavado por

participante.• En el año 2005 se disminuyó a 1

evaluación por año por falta de material decontrol.

Metodología

Pneumocystis jirovecii 1 ANUALES LBA* HUMANO 5 LÁMINAS O TUBOS

PULMON RATA*LBA: Lavado broncoalveolar

5 Láminas con frotis de la muestra

Tubo porta láminas

Sobre encomienda

Criterios de Evaluación• Informe correcto: 100 puntos• Puntaje descontado

– Informe con resultado erróneo por cadamuestra: 20 puntos

• Puntaje Final Se suman los resultados de lospuntajes obtenidos para cada una de las 5muestras.

Puntaje Final = Σ ni

Donde ni = puntaje por cada muestra

Criterios de Aceptabilidad• El puntaje mínimo de aceptabilidad con este

método corresponde a 80 puntos y el máximo a100 puntos.

• Serán considerados resultados:– Satisfactorio: los que obtengan un puntaje

mayor o igual 80 puntos.– Insatisfactorio: los que obtengan un puntaje

menor a 80 puntos.

CÓDIGOS NO INFORMACódigo Fundamento10 Sin reactivo20 Sin profesional30 Otro (especificar)

CÓDIGOS DE RESULTADOSCódigo Tinción01 Negativo02 Positivo

CÓDIGOS DE TINCIÓNCódigo Tinción51 Azul de toluidina O52 Metenamina argéntica

53Inmunofluorescencia directa,especificar marca reactivo comercial

54 Otro especificar

Recomendaciones

• Recomendamos a los participantes que elmaterial de control se debe procesar comouna muestra de paciente.

• Conservar las láminas teñidas o muestrashasta recibir el informe de resultados decada evaluación, ya que este es el únicomedio de verificación frente a diferenciasentre el informe recibido y lo observadopor los participantes.

Informe de resultado

• Desde 1997 hasta 2010– Manual

• De 2010 a 2012– Formulario electrónico

• Desde 2013– Portal PEEC

Errores más frecuentes

• Confusión de elementos

• Confusión de códigos

• Falta informar los códigos de método

• No se respetan las instrucciones

Evaluación N°32 año 2013

Objetivo

• Evaluar la reproducibilidad de los métodosempleados mediante el envío de:– Una misma muestra repetida en 3

critoubos diferentes.– La identificación de Pneumocystis

jirovecii en muestras preteñidas conAzul de Toluidina O.

Características de las muestras enviadas

• Las muestras correspondían a Lavado bronqueoalveolar.

• Las muestras fueron analizadas por– Las técnicas de tinción:

• Metenamina Argéntica (MA)• Azul de Toluidina O (AT)• Reactivo comercial de Inmunofluorescencia

directa con anticuerpos monoclonalesespecíficos (IFD).

Tinción Resultado IFD Resultado144 Lámina sin

teñirNEGATIVO Criotubo con

muestraNEGATIVO

145 Lámina sin teñir

NEGATIVO Criotubo con muestra

NEGATIVO

146 Lámina sin teñir

NEGATIVO Criotubo con muestra

NEGATIVO

147 Láminateñida

POSITIVO Láminateñida

POSITIVO

148 Lámina teñida

NEGATIVO Lámina teñida

NEGATIVO

Resultados final de las muestras enviadas

Muestra N° Tipo Muestras Resultado MA ISP

Resultado AT ISP

Resultado IFD

Reactivo comercial 1

1 LA Negativo Negativo Negativo

2Lámina 

LA Positivo Positivo Positivo

3Lámina

LA Negativo Negativo Negativo

CRIOTUBO MUESTRA Nº RESULTADO

1441 NEGATIVO

1451 NEGATIVO

1461 NEGATIVO

147Lámina

2 POSITIVO

148Lámina

3 NEGATIVO

Análisis de la evaluación

Se incluyeron en este análisis las respuestas recepcionadas en el ISP

Número de envíos 19Número de Respuestas Recibidas 19 (100%)Número de Laboratorios Evaluados 19 (100%)

Número de Respuestas Satisfactorias 6 (31,57%)

Comentarios generales• La técnica de Azul de Toluidina O fue empleada

por el 63 % de los participantes, seiscontestaron con la técnica deInmunofluorescencia Directa 32% y unparticipante con Metenamina Argéntica 5%.

• El 32% de las respuestas técnicamente válidastuvieron un resultado final satisfactorio y de ellos

• El 50% obtuvieron 100 puntos con todas lasmuestras informadas correctamente.

Comentarios generales• Los resultados obtenidos se consideran bajos y se explican

principalmente por:– Todos los participantes recibieron la muestra 1 en los Criotubos

N° 144 -145 y 146 para evaluar reproducibilidad y presentaronproblemas, informando la misma muestra con diferentesresultados. Lo que se tradujo en una baja en los puntajesfinales.

• Los participantes recibieron 2 láminas preteñidas que se enviaronpara evaluar la identificación. Sin embargo, no todos informaron,aludiendo que no realizan de rutina la tinción.

• En estos casos solo se consideró para el cálculo del puntajelo informado.

Petición de revisión de resultados

• 2 participantes solicitaron de resultados– Uno acogida porque se comprobó un

error de numeración de las láminas• No conformidad para SGC

Parasitología– Otro no acogida por diferencias en la

morfología no correspondía a P. jirovecii

Consideración Final • Se evaluó eliminar la evaluación, lo que fue

descartado por:– 6 participantes alcanzaron puntaje

satisfactorio• 3 obtuvieron 100 puntos

• EL principal problema fue error en lareproducibilidad– 57 observaciones muestra 1 mezclando

• 26 Positivas• 31 Negativas

Desempeño en el tiempo

Envíos/ Respuestas/Satisfactorias 1997- 2013

0

5

10

15

20

25

1997 1998 1er2000

2º2000

1er2001

2º2001

1er2002

2º2002

1er2003

2º2003

1er2004

2º2004

1er2005

2do2005

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

Envíos

Respuestas

Satisfactorias

Problemas para el ISP

• Provisión de muestras – Paneles

• Control de homogeneidad

PNE POSITIVAS2008 115 132009 119 102010 96 62011 136 42012 101 32013 51 4

Muestras recibidas en el ISP2008-2013

Propuestas

• Envío láminas fijadas para IFD.– Colaboración para evaluar esta

propuesta.• Envío de evaluación extra para levantar la

No conformidad antes de abril 2014.– Colaboración con muestras.