Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for

medisinsk mykologi

Lonny M. Kløvfjell Fagbioingeniør

Avdeling for mikrobiologi OUS-Rikshospitalet

lklovfje@ous-hf.no

Referanselaboratorium

Referansefunksjoner

• Bistå primærlaboratorier med identifikasjon og resistensbestemmelse av alle Candidaisolat fra blodkultur, og å forvalte nasjonal stammebank for invasive Candidaisolat.

• Nasjonal overvåkning av Candidaresistens

• Bistå primærlaboratorier med identifikasjon og resistensbestemmelse av andre kliniske soppisolat.

Hvilke analyser har vi? • Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter. - Maldi-TOF - Sekvensering - Mikroskopi - Selektive medier - Vitek2

• Påvisning av sopp-DNA (PCR). Utføres på molekylær-enheten

for oss. • Langtidsdyrkning mhp sopp • Resistensbestemmelse av gjær- og muggsopp. • Pneumocystis IF • Serologi • Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus).

LITT TALL……

• I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida.

• Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I

2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat. • 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i 2015.

• Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3- 4 %.

Sopp - analyser

Totalt antall analyser i 2015: 6989

SOPPTYPER

GJÆRSOPP

MUGGSOPP

DIMORFE SOPP

DERMATOFYTTER

Gjærsopp

• Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer.

• -Såes ut på Saboraud og kromskål

• Identifikasjon:

–Krom (grønn/ikke grønn)

–Maldi-TOF

–Evt. Vitek

–Sekvensering

•Resistensbestemmelse

• Fryses i vårt stammearkiv

Muggsopp

• Hvis sendt på skål:

– Rask vurdering av farge og øvrig morfologi

– Lupe

– Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk)

– Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ °C)

– Resistensbestemmelse dersom ønsket

• Maldi-TOF – ID kommer nå

• Sekvensering

• Fra flere ulike prøvematerialer

•Aspergillus

•Penicillum

•Mucorales

12

Aspergillus sp

• A.fumigatus

• A.flavus

• A.niger

• A.terrus

• 180 species • Vel 30 assosiert med

human sykdom

Aspergillus

A.fumigatus A.flavus A.niger A.flavus

Penicillum

Mucorales

Dermatofytter • Tinea pedis – fot • Tinea unguis (onychomycose) – negler (hånd/fot) • Tinea corporis – kropp (ringorm) • Tinea capitis – hode (hår/skjegg)

• Trichophyton rubrum

• Trichophyton mentagrophytes

(interdigitale)

• Microsporum canis

• Microsporum audouinii

• Trichophyton soudanense

• Trichophyton violaceum

Identifikasjon av dermatofytter

Dyrkning og tilsendte isolat:

• Mikroskopi • Kolonimorfologi • Veksttemperatur • Selektive medier • Sekvensering

Direkte på prøvematerialet: • Dermatofytt – PCR

Trichophyton sp T.soudanense Reflexive hyfer

Microsporum - makrokonidier

Dermatofytt-PCR

• Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR

• Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton

• Realtime PCR

• Smeltepunktsanalyse:

Dimorfe sopp

• Gjærsoppform ved 37C • Mugggsoppform 28C

• Histoplasma • Blastomyces • Coccidioides • Penicillum marneffeii

• Sjelden i Norge • Reiseanamnese! • Immunsupprimerte (HIV)

• P3-lab

Histoplasma capsulatum

Mikroskopi

Ulike metoder: • CFW – direkte på prøvemateriale • Bomullsblått - Blokkpreparat - Nålepreparat - Tapeteknikk • Lupe

Viktig oppgave • Rask og sikker • Krever øvelse • Oppslagsverk

• Struktur • Mikrokonidier • Makrokonidier • Sporangier («stilk») • Forgreninger • Vesikkel («hoder») • Apophyse («hals») • Phialider • Fruktlegemer – chleistotechia/pycnidia • Røtter • Størrelse

• Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper.

-veksthastighet -temperatur

Sekvensering + mikroskopi Maldi-TOF + mikroskopi

Aspergillus

Penicillum

Mucorales

BOMULLSBLÅTT - tapeteknikk

• Lactophenolblått

• Blank tape

• Objektglass

• Dekkglass

CALCOFLUORWHITE

• Flourescens – farging • Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp. • Direkte på prøvemateriale • Rask diagnostikk • Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra

hverandre.

Pneumocystis - Immunfluorescens

• Monoklonal, FITC merket antistoff • BAL og Indusert sputum

1. Forbehandler med di-thio-threitol og PBS 2. Sentrifugerer 3. Bunnfall på objektglass 4. Tørkes 5. Fikseres 6. Farges 7. Mikroskoperes

Resistensbestemmelse av sopp • Etest

• Flytmetode (ikke lenger anbefalt)

• RPMI-skåler

• Gjærsopp

• Muggsopp

• Vi bruker brytningspunkter anbefalt

av EUCAST • Ikke alle sopp har fått

brytningspunkter

• Vi har som mål å starte med buljongfortynning (gullstandard metode) på blodkulturisolater.

• Amphotericin • Fluconazole • Voriconazole • Caspofungin • Anidulafungin • Micafungin • Itraconazole

• Posaconazole • Flucytosin

• Isovuconazole

Serologi

• Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus)

- Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos

pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar.

- Elektroforese.

- Titrering ved positivt funn.

• Galaktomannan (utføres hos virus-avdelingen)

- Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter.

- Komponent i celleveggen hos Aspergillus.

- Enzym immuno assey; EIA-teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i

serum (spinalvæske og BAL).

Fritekst..... fritekst..... fritekst

• Dimorfe sopp (immundiffusjon):

–Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis)

Kryptokokk-antigen • Ø-hjelp • Utføres på spinalvæske, serum og BAL • Hurtigtest fra IMMY • Rimelig, rask og enkel

Påvisning av sopp-DNA

Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet • Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA - Utføres vanligvis parallelt - Sterilt materiale - BAL hos immunsupprimerte

• Mucorales DNA - Rhizomucor sp - Lichtheimia sp (Absidia) - Rhizopus sp • Pneumocystis jirovecii DNA - semikvantitativ - Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive

• Påvisning av sopp-DNA direkte på prøvematerialet - Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter - ITS2 og D1D2 - Der sopp-DNA påvises, utføres en sekvensering - Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i

internasjonale databaser for sopp. - Arbeidskrevende metode.

Takk for oppmerksomheten

Mykologi.no