29. Maselli M.A., Mennuni L.: CCK1 receptor antagonist, de-xloxiglumide: effects on human isolated gallbladder. Mi-nerva Gastroenterol. Dietol. 2003, 49, 211-216.

30. Mollen R.M.H.G., Hopman W.P.M., Kuijpers H.H.C., Jansen J.B.M.J.: Plasma cholecystokinin. plasma peptide YY and gallbladder motility in patients with slow trans-it constipation: effect of intestinal stimulation. Digestion 2000, 62, 185-193.

31. Kania B.F.: Znaczenie kliniczne cholecystokininy i jej an-tagonistów. Medycyna Wet. 1994, 50, 541-544.

32. Al-Saffar A., Rosell S.: Effects of neurotensin and neu-rotensin analogues on the migrating myoelectrical com-plexes in the small intestine of rats. Acta Physiol. Scand. 1981, 112, 203-208.

33. Thor P.J., Konturek J.W., Sendur R., Konturek S.J.: Com-parison of neurotensin and fat on myoelectric activity pattern of the small bowel. W: C. Roman (edit.). Gastro-intestinal Motility. MTP Press Limited, Lancaster 1984, s.343-348.

34. Kamath P.S., Gaisano H.Y., Phillips S.F., Miller L.J., Char-boneau J.W., Brown M.L., Zinsmeister A.R.: Abnormal gal-lbladder motility in irritable bowel syndrome: evidence for target-organ defect. Am. J. Physiol. 1991, 260, G815--G819.

35. Chojnacki J., Klupińska G.: Dyspepsja (niestrawność) czynnościowa. W: J. Chojnacki (edit.). Czynnościowe za-burzenia motoryki przewodu pokarmowego. Janssen-Ci-lag, Łódź 1997, s. 68-75.

36. Torsoli A., Corazziari E., Habib F.I., Cicala M.: Pressure relationships within the human bile tract. Scand. J. Ga-stroenterol. 1990, 25, supl. 175, 52-57.

37. Feinle C., Meier O., Otto B., D’Amato M., Fried M.: Role of duodenal lipid and cholecystokinin A receptors in the pathophysiology of functional dyspepsia. Gut 2001, 48, 347-355.

38. Dufresne M., Seva C., Fourmy D.: Cholecystokinin and gastrin receptors. Physiol. Rev. 2006, 86, 805-847.

39. Lenz H.J., Messmer B., Zimmerman F.G.: Noradrenergic inhibition of canine gallbladder contraction and murine pancreatic secretion during stress by corticotropin-rele-asing factor. J. Clin. Invest. 1992, 89, 437-443.

40. Portincasa P., Di Ciaula A., van Berge-Henegouwen G.P.: Smooth muscle function and dysfunction in gallbladder disease. Curr. Gastroenterol Rep. 2004, 6, 151-162.

41. Gabryelewicz A., Wereszczyńska-Siemiątkowska U.: Ostre zapalenie trzustki. W: S. J. Konturek (red.). Gastroente-rologia i hepatologia kliniczna. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001, s. 506-524.

42. Jurkowska G.: Przewlekłe zapalenie trzustki. W: S. J. Kon-turek (red.). Gastroenterologia i hepatologia kliniczna. Wy-dawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001, s. 525-533.

43. Behar J., Corazziari E., Guelrud M., Hogan W., Sherman S., Toouli J.: Functional gallbladder and sphincter of oddi disorders. Gastroenterology 2006, 130, 1498-1509.

44. Forgacs I.C., Murphy G.M., Dowling R.H.: Gallbladder contraction and plasma immunoreactive CCK in gallblad-der and intestinal disease. W: G. Paumgartner, A. Stiehl, W. Gerok (edit.). Enterohepatic Circulation of Bile Acids and Sterol Metabolism. MTP Press Limited, Lancaster 1985, s. 147-153.

45. Glasbrenner B., Malfertheiner P., Pieramico O., Klatt S., Riepl R., Friess H., Ditschuneit H.: Gallbladder dynamics in chronic pancreatitis. Relationship to exocrine pancre-atic function, CCK, and PP release. Dig. Dis. Sci. 1993, 38, 482-489.

46. Ohashi S., Nishio A., Nakamura H., Kido M., Ueno S., Uza N., Inoue S., Kitamura H., Kiriya K., Asada M., Ta-maki H., Matsuura M., Kawasaki K., Fukui T., Watanabe N., Nakase H., Yodoi J., Okazaki K., Chiba T.: Protective

roles of redox-active protein thioredoxin-1 for severe acu-te pancreatitis. Am. J. Physiol. 2006, 290, G772-G781.

47. Szabolcs A., Biczó G., Rakonczay Z., Tiszlavicz L., Halm G., Wittmann T., Takács T.: Simultaneous proteosome in-hibition and heat shock protein induction by bortezomib is beneficial in experimental pancreatitis. Eur. J. Pharma-col. 2009, 616, 270-274.

48. Yuan J., Liu Y., Tan T., Guha S., Gukovsky I., Gukovskaja A., Pandol S.J.: Protein kinase D regulates cell death pa-thways in experimental pancreatitis. Front. Physiol. 2012, 3, 1-17.

49. Calam J.: CCK/gastrin antagonists – clinical perspecti-ves. Acta Gastroenterol. Belg. 1993, 56, 251-256.

50. Mössner J.: New advances in cell physiology and patho-physiology of the exocrine pancreas. Dig. Dis. 2010, 28, 722-728.

51. Otsuki M.: Pathophysiological role of cholecystokinin in humans. J. Gastroenterol. Hepatol. 2000, 15, supl, D71--D83.

52. Chopra A.: 99mTc-tricarbonyl-K-H-K-H-cholecystokinin 8. Mol. Imaging Contrast Agent Database 2008. PMID: 20641941 (PubMed).

53. Isik S., Ozcan H.N., Ozguz U., Berker D., Tutuncu Y., Ak-baba G., Guler S.: Impaired gallbladder motility and the ef-fect of metformin therapy in patients with polycystic ova-ry syndrome. Clin. Endocrinol. (Oxf.) 2012, 76, 373-378.

Prof. dr hab. Krzysztof Romański, Katedra Biostruktury i Fi-zjologii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy, ul. Norwida 31, 50-375 Wrocław, e-mail: krzysztof.romanski@up.wroc.pl

Babeszjoza psów jest przenoszo-ną przez kleszcze właściwe (Ixodi-

dae) pasożytniczą chorobą systemową o ostrym przebiegu. Choroba rozwija się w wyniku inwazji pierwotniaków z rodza-ju Babesia (1). W Europie u psów stwier-dzono występowanie gatunków B. canis, B. vogeli oraz B.  gibsoni, spośród któ-rych w  Polsce dotychczas wykryto je-dynie inwazje powodowane przez gatu-nek B. canis (1, 2, 3, 4). Babeszjoza psów w  Polsce występuje głównie w  środko-wej i wschodniej części kraju (5). Wyni-ka to z rozmieszczenia głównego wekto-ra, będącego równocześnie żywicielem ostatecznym kleszcza łąkowego Derma-centor reticulatus (6, 7, 8).

Do zarażenia psa będącego żywicielem pośrednim pierwotniaka dochodzi pod-czas żerowania na jego skórze zarażonego kleszcza. Wraz ze śliną kleszcza wprowa-dzane są do krwi psa sporozoity, które na-stępnie wnikają do krwinek czerwonych,

wewnątrz których przekształcają się w ko-lejne stadium rozwojowe, trofozoity. Tro-fozoity z kolei dzielą się na potomne sta-dium rozwojowe określane jako merozo-ity, które opuszczają krwinki czerwone, doprowadzając w  ostateczności do ich rozpadu, a  następnie zasiedlają kolejne krwinki czerwone, przekształcając się po-nownie w trofozoity. Cyklicznie powsta-jących na przemian pokoleń trofozoitów i  merozoitów może być wiele. W  przy-padku pasożytowania na psie następ-nych kleszczy dochodzi do ich zarażenia podczas ssania krwi zawierającej krwin-ki zasiedlone przez pasożyta. Dalsze eta-py cyklu rozwojowego przebiegają w or-ganizmie kleszcza. Nie mają one jednak znaczenia z  klinicznego punktu widze-nia, z  wyjątkiem faktu, iż zarażenie sa-mic kleszczy dużymi gatunkami z rodzaju Babesia (tj. B. canis, B. vogeli oraz wystę-pujący w  Afryce gatunek B. rossi) pro-wadzi do zarażenia zarodków kleszczy,

czego konsekwencją jest utrzymanie na-turalnych ognisk endemicznych dla ba-beszjozy (1, 9).

Diagnostyka babeszjozy psów w praktyce

Wojciech Zygner1, Karol Sobków2

z Zakładu Parazytologii i Inwazjologii Katedry Nauk Przedklinicznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie 1 oraz Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego – Lab-Wet w Warszawie2

Diagnostics of canine babesiosis in practice

Zygner W.1, Sobków K.2, Division of Parasitology and Parasitic Diseases, Department of Preclinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Warsaw University of Life Sciences-SGGW1, Veterinary Diagnostic Laboratory-Lab-Wet, Warsaw2

The aim of this paper was to present issues associat-ed with the practical aspects of canine babesiosis lab-oratory diagnosis. Canine babesiosis is a protozoan tick-borne disease caused by the parasite of the ge-nus Babesia. In Poland, the disease is caused by one species, i.e. B. canis, only. Although presenting non-specific clinical signs, the disease may be tentatively diagnosed basing on hematological changes in dogs from regions endemic for canine babesiosis. Howev-er, final diagnosis should be based on the detection of etiological agent. In practice, diagnosis is based on the result of microscopic examination of blood smears. This method, although not as sensitive as PCR, is cheaper and faster than PCR technique used for recognition of particular species from the genus Babesia. In this article, easy and reliable techniques used for increasing the  sensitivity of microscopic examination for canine babesiosis were presented.

Keywords: Babesia canis, canine babesiosis, laboratory diagnostic, test sensitivity.

Prace kliniczne i kazuistyczne

755Życie Weterynaryjne • 2012 • 87(9)

Objawy choroby są nieswoiste. W prze-biegu choroby obserwowano objawy, takie jak: apatia, gorączka, brak apetytu, bladość błon śluzowych, przyspieszenie tętna, bie-gunka, wymioty, kaszel, skąpomocz bądź bezmocz, ciemne zabarwienie moczu, od-wodnienie, objawy nerwowe oraz śpiącz-ka (10, 11, 12). Nie wszystkie wymienio-ne objawy choroby muszą wystąpić. Prze-bieg choroby natomiast zależy od gatunku pierwotniaka z rodzaju Babesia powodu-jącego inwazję. Choroba może mieć prze-bieg ostry lub nadostry z wysoką śmiertel-nością do łagodnego, a nawet podklinicz-nego, podczas którego nie obserwuje się żadnych objawów klinicznych. Najcięższy przebieg choroby występuje w Republice Południowej Afryki u psów zarażonych B. rossi. Z kolei najłagodniejszy przebieg inwazji obserwowano u psów zarażonych występującym na całym świecie (ale nie w Polsce) gatunkiem B. vogeli (12, 13). Je-dyny występujący w Polsce gatunek z ro-dzaju Babesia powodujący inwazję u psów (B. canis) wywołuje chorobę o przebie-gu umiarkowanym do ciężkiego (12, 13).

W rozpoznaniu babeszjozy psów nale-ży uwzględnić pobyt psa w rejonach en-demicznych oraz porę roku. W Polsce, jak wyżej wspomniano, babeszjoza psów wy-stępuje głównie we wschodniej i środkowej części kraju. Sezonowość występowania tej choroby związana jest z sezonową aktyw-nością kleszczy. W Polsce obserwuje się dwa sezony aktywności kleszcza łąkowego: na wiosnę oraz jesienią (14, 15). W związ-ku z tym występowanie wymienionych ob-jawów u psów przebywających w rejonach endemicznych dla kleszcza łąkowego w se-zonie jego aktywności może nasuwać po-dejrzenie babeszjozy. W wywiadzie można również uwzględnić stwierdzenie inwazji

kleszczy u psa oraz ewentualne jego za-bezpieczenie przed tą inwazją, jednakże, kleszcze często pozostają niezauważone przez właściciela zwierzęcia, natomiast preparaty stosowane do zwalczania inwa-zji kleszczy u psów na ogół nie zabezpie-czają zwierząt w 100% (16).

W badaniu morfologicznym krwi psów zarażonych pierwotniakami z rodzaju Ba-besia w Polsce najczęstszymi zmianami były: małopłytkowość dotycząca 96–100% zarażonych pierwotniakiem psów, leukope-nia spowodowana głównie neutropenią do-tycząca 36–68% zarażonych psów oraz nie-dokrwistość dotycząca około 30–57% do-tkniętych inwazją psów (10, 17, 18). Kirtz i wsp. (19) wykazali, że już na podstawie typowych zmian obserwowanych w bada-niu morfologicznym krwi psów, takich jak małopłytkowość, leukopenia oraz niedo-krwistość, w sezonie aktywności kleszczy przenoszących babeszjozę psów w rejo-nach endemicznych, można wstępnie po-stawić podejrzenie babeszjozy z bardzo wysokim prawdopodobieństwem trafnej diagnozy. Warto jednak zaznaczyć, iż brak tych typowych zmian w obrazie morfolo-gicznym krwi (w tym również brak mało-płytkowości) nie może być podstawą wy-kluczenia tej choroby (10, 17, 18, 19). W ba-daniach biochemicznych surowicy psów zarażonych pierwotniakami z rodzaju Ba-besia na terenie Polski najczęściej obser-wowano wzrost aktywności transaminaz asparaginianowej i alaninowej oraz fosfa-tazy zasadowej, enzymów wskazujących na uszkodzenie wątroby. Ponadto u sto-sunkowo wysokiego odsetka psów wystę-powało podwyższone stężenie bilirubiny, mocznika i kreatyniny (10, 20). W prze-biegu choroby stwierdzano również u czę-ści psów hipoglikemię i hipoalbuminemię

(20). W jonogramie natomiast najczęściej obserwowano obniżenie stężenia jonów sodowych i potasowych oraz wzrost stę-żenia jonów chlorkowych (21, 22). Stwier-dzenie wymienionych zmian biochemicz-nych w połączeniu ze zmianami w obrazie morfologicznym krwi, danymi z wywiadu, objawami choroby oraz porą roku i miej-scem przebywania psa, może w znacznym stopniu pomóc w rozpoznaniu choroby.

Ostatecznie rozpoznanie choroby po-winno opierać się na ustaleniu jej czyn-nika sprawczego. Jak wynika z przedsta-wionego wcześniej cyklu rozwojowego pasożyta, należy go poszukiwać we krwi żywiciela pośredniego. Stwierdzenie obec-ności piroplazm w mikroskopowym bada-niu krwi pozwala na rozpoznanie piropla-zmozy. Natomiast identyfikacja gatunku na podstawie badania metodą PCR pozwala dopiero na postawienie ostatecznego roz-poznania (23, 24). Jednakże w praktyce na terenie Polski prawidłowe rozpoznanie in-wazji z bardzo wysokim prawdopodobień-stwem może być postawione w oparciu o wynik badania mikroskopowego. Wyni-ka to z faktu, iż w Polsce babeszjozę psów powoduje jedynie gatunek B. canis (2, 3, 4, 7). Warto również podkreślić, iż now-sze metody diagnostyczne, tj. metoda PCR oraz jej odmiany opracowane do identy-fikacji pierwotniaków z rodzaju Babesia (25, 26, 27, 28), są droższe od tradycyj-nych technik mikroskopowych. Ponadto, należy dodać, iż czas oczekiwania na wy-nik badania mikroskopowego jest znacz-nie krótszy. W związku z  tym w prakty-ce klinicznej badania mikroskopowe wy-korzystywane do rozpoznawania inwazji pierwotniaków z rodzaju Babesia, pomi-mo niższej czułości, są nadal uważane za główne narzędzie diagnostyczne omawia-nej choroby u psów (19, 24, 29).

Pobierana do badania krew może być krwią żylną lub włośniczkową. W rutyno-wym badaniu morfologicznym krwi pod-czas badania rozmazu krwi żylnej w wie-lu przypadkach babeszjozy możliwe jest stwierdzenie obecności krwinek czerwo-nych zasiedlonych przez pasożyta. Jednak-że, w przypadku niskiego nasilenia para-zytemii, mikroskopowe badanie krwi wło-śniczkowej zwiększa szanse na wykrycie pasożyta (24, 29). Częstsze występowa-nie krwinek zawierających pierwotniaki z  rodzaju Babesia w naczyniach włoso-watych tłumaczone jest tendencją zasie-dlonych przez pasożyta krwinek do auto-aglutynacji lub też zjawiskiem cytoadhe-rencji krwinek z pierwotniakami w  ich wnętrzu, polegającym na przyleganiu krwi-nek czerwonych do komórek śródbłonko-wych naczyń włosowatych za pomocą grze-bieniastych struktur na powierzchni ery-trocytów zasiedlonych przez piroplazmy określanych w skrócie jako VESA1 (variant

Ryc. 1. Zabarwione rozmazy krwi. A – rozmaz wykonany techniką liniowego zagęszczenia. B – rozmaz wykonany techniką tradycyjną

Prace kliniczne i kazuistyczne

756 Życie Weterynaryjne • 2012 • 87(9)

erythrocyte surface antigen 1). Występowa-nie VESA1 opisano w przebiegu babeszjozy u bydła. Dzięki temu zjawisku pierwotnia-ki zatrzymane w naczyniach włosowatych chronione są przed ich pasażem przez śle-dzionę, w której zostałyby wyeliminowa-ne przez makrofagi (30, 31). Warto rów-nież zwrócić uwagę na fakt, iż zatrzymane w naczyniach włosowatych skóry piropla-zmy mają znacznie większą szansę na ich wyssanie wraz z krwią przez kleszcze, a co za tym idzie na kontynuację cyklu rozwo-jowego. Zatem zjawisko częstszego wystę-powania (lub też zatrzymywania) erytro-cytów zawierających pierwotniaki z rodza-ju Babesia w naczyniach włosowatych jest zjawiskiem korzystnym z punktu widzenia pasożyta (31). Zjawisko to może być jednak wykorzystane w diagnostyce babeszjozy.

Krew pobraną od zarażonego lub podej-rzewanego o zarażenie psa bada się przy użyciu mikroskopu świetlnego. Preparat do badania można wykonać kilkoma tech-nikami. Preparaty najczęściej barwione są metodą May-Grünwalda-Giemsy (MGG) lub jedynie barwnikiem Giemsy. W trady-cyjnym rozmazie krwi przypominającym ptasie pióro (ryc. 1B) poszukuje się pasoży-ta na brzegach preparatu oraz na jego koń-cu (24). Podczas badania takiego rozmazu

istnieje jednak ryzyko uzyskania wyniku fałszywie negatywnego, co może wynikać z niskiego poziomu parazytemii lub bra-ku bądź niewielkiego doświadczenia w dia-gnostyce laboratoryjnej osoby wykonują-cej badanie. Z tego również powodu nie-zmiernie ważne jest, by niedoświadczona osoba wykonująca badanie mikroskopowe (ucząca się) wykonywała je pod nadzorem doświadczonego diagnosty laboratoryjne-go. Doświadczony laborant nie ma wpły-wu na poziom parazytemii, może jednak zastosować kilka technik, dzięki którym pasożyty mogą zostać skoncentrowane na niewielkiej powierzchni preparatu mikro-skopowego. Jedną z tych metod jest oczy-wiście badanie krwi włośniczkowej. Jed-nakże w praktyce weterynaryjnej mate-riał do badania pobierany jest najczęściej w lecznicy i dostarczany do laboratorium. W związku z tym weterynaryjny diagnosta laboratoryjny nie ma kontaktu ze zwierzę-ciem, a więc nie ma możliwości pobrania krwi włośniczkowej, gdy do laboratorium dostarczono jedynie krew żylną.

Najprostszą, a zarazem wydajną meto-dą zagęszczenia krwinek czerwonych za-wierających pierwotniaki z rodzaju Babe-sia jest wykonanie rozmazu krwi metodą liniowego zagęszczenia (line concentration)

wykorzystywaną również w badaniu cyto-logicznym płynów ubogokomórkowych (19). W metodzie tej wykonywany jest roz-maz krwi według schematu przedstawio-nego na ryc. 2. Początkowo rozmaz krwi wykonywany jest w taki sam sposób, jak rozmaz tradycyjny, jednakże przed ukoń-czeniem wykonywania rozmazu należy szkiełko, którym ciągnie się rozmaz krwi unieść szybko do góry pod kątem prostym względem szkiełka podstawowego z prepa-ratem. W ten sposób uzyskuje się linię kon-centracji (ryc. 1A). W linii tej zostają zagęsz-czone komórki, wśród których znajduje się znacznie więcej krwinek zawierających pa-sożyta (ryc. 3), a zatem zwiększone zosta-je prawdopodobieństwo uzyskania praw-dziwego wyniku badania przez zwiększe-nie jego czułości.

Inną metodą skoncentrowania pierwot-niaków krwi na małej powierzchni bada-nego preparatu jest wykonanie badania krwi metodą grubej kropli (ryc. 4). W me-todzie tej na szkiełku podstawowym zo-staje umieszczona kropla krwi, do której dodawana jest kropla wody powodująca hemolizę na szkiełku. W ten sposób pier-wotniaki zostaną uwolnione z krwinek (ryc. 5; 32). Według Cencek i Ziomko (32) preparatu nie należy utrwalać, a  jedynie

Ryc. 2. Metoda wykonania rozmazu techniką liniowego zagęszczenia

Ryc. 4. Zabarwiony preparat wykonany metodą grubej kropli

Ryc. 3. Zgromadzenie czerwonych krwinek psa zawierających pierwotniaki z rodzaju Babesia w rozmazie wykonanym techniką liniowego zagęszczenia

Ryc. 5. Uwolnione z krwinek pierwotniaki z rodzaju Babesia w preparacie wykonanym metodą grubej kropli

Prace kliniczne i kazuistyczne

757Życie Weterynaryjne • 2012 • 87(9)

zabarwić. Autorzy ci jednak wykonywali to badanie z powodzeniem, utrwalając pre-parat przed barwieniem, gdyż spłukiwanie barwnika (np. Giemsy), bez wcześniejsze-go utrwalenia preparatu, często powodu-je spłukanie całego preparatu (tj. łącznie z badanym materiałem). W badaniu tym interpretacja uzyskanego obrazu jest jed-nak trudna, gdyż uwolnione z krwinek pa-sożyty mogą ulegać deformacji. W związ-ku z tym metoda ta jest rzadko wykorzy-stywana w praktyce, choć nie należy o niej zapominać.

Warto również wspomnieć, iż prepa-rat mikroskopowy można wykonać z ma-teriału uzyskanego po odwirowaniu krwi w kapilarze hematokrytowej. Otóż, we-dług Irwin (24) zajęte przez pierwotniaka krwinki czerwone mają niższy ciężar wła-ściwy od pozostałych krwinek czerwonych. Ta cecha zajętych przez pasożyta krwinek czerwonych powoduje, iż w rurce hemato-krytowej gromadzą się one w jednej war-stwie pomiędzy krwinkami czerwonymi a kożuszkiem leukocytarnym, tzw. buffy coat (13, 23, 24, 33). W ten sposób skon-centrowanie w  jednym miejscu krwinek zasiedlonych przez pierwotniaki z rodzaju Babesia powoduje, iż pobranie materiału do badania mikroskopowego z tego miej-sca również zwiększa szanse na wykrycie inwazji (13, 23, 24, 33).

Na koniec warto zaznaczyć, że bada-nie mikroskopowe tradycyjnego rozma-zu krwi, mające niższą czułość od metod, w których zajęte przez pasożyta krwinki są koncentrowane na małej powierzchni pre-paratu, ma również swoje zalety. W bada-niu tym w środkowej i końcowej części roz-mazu komórki krwi układają się w jednej

warstwie. Dzięki temu możliwe jest ocenie-nie zmian morfologicznych w komórkach krwi oraz wzajemne układanie się komó-rek względem siebie. Przykładem takich zjawisk mogą być opisywane w przebie-gu babeszjozy psów zjawisko aglutynacji wskazujące na obecność przeciwciał skie-rowanych przeciwko antygenom błon ko-mórkowych erytrocytów lub też obecność zmienionych krwinek czerwonych, takich jak ekscentrocyty czy sferocyty, wskazują-cych odpowiednio na tlenowe uszkodzenie komórek bądź immunologiczne podłoże niedokrwistości (ryc. 6; 34, 35, 36).

Podsumowując, w diagnostyce babe-szjozy psów warto wykonywać badania mikroskopowe stosując różne techniki. Techniki polegające na skoncentrowaniu zajętych przez pasożyta krwinek powin-ny być szczególnie polecane w przypad-ku stwierdzenia patologicznych i klinicz-nych zmian wskazujących na babeszjozę, przy równoczesnym negatywnym wyni-ku mikroskopowego badania tradycyjne-go rozmazu krwi.

Piśmiennictwo

1. Matijatko V., Torti M., Schetters T.P.: Canine babesiosis in Europe: how many diseases? Trends Parasitol. 2012, 28, 99-105.

2. Adaszek L., Winiarczyk S.: Molecular characterization of Babesia canis canis isolates from naturally infected dogs in Poland. Vet. Parasitol. 2008, 152, 235-241.

3. Zygner W., Górski P., Wędrychowicz H.: Detection of the DNA of Borrelia afzelii, Anaplasma phagocytophi-lum and Babesia canis in blood samples from dogs in Warsaw. Vet. Rec. 2009, 164, 465-467.

4. Welc-Falęciak R., Rodo A., Siński E., Bajer A.: Babesia canis and other tick-borne infections in dogs in Central Poland. Vet. Parasitol. 2009, 166, 191-198.

5. Adaszek Ł., Martinez A.C., Winiarczyk S.: The factors af-fecting the distribution of babesiosis in dogs in Poland. Vet. Parasitol. 2011, 181, 160-165.

Ryc. 6. Obraz mikroskopowy uzyskany w badaniu tradycyjnego rozmazu krwi psa z babeszjozą (widoczna krwinka zawierająca pasożytniczego pierwotniaka oraz zmienione krwinki z przemieszczoną hemoglobiną – ekscentrocyty)

6. Szymański S. Distribution of the tick Dermacentor reti-culatus (Fabricius, 1794) (Ixodidae) in Poland. Acta Pa-rasitol. Pol. 1986, 31, 143-154.

7. Zygner W., Jaros S., Wędrychowicz H.: Prevalence of Babesia canis, Borrelia afzelii, and Anaplasma phago-cytophilum infection in hard ticks removed from dogs in Warsaw (central Poland). Vet. Parasitol. 2008, 153, 139-142.

8. Zygner W., Górski P., Wędrychowicz H.: New localities of Dermacentor reticulatus tick (vector of Babesia canis canis) in central and eastern Poland. Pol. J. Vet. Sci. 2009, 12, 549-555.

9. Homer M.J., Aguilar-Delfin I., Telford S.R. 3rd, Krause P.J., Persing D.H.: Babesiosis. Clin. Microbiol. Rev. 2000, 13, 451-469.

10. Adaszek Ł., Winiarczyk S., Skrzypczak M.: The clinical course of babesiosis in 76 dogs infected with protozoan parasites Babesia canis canis. Pol. J. Vet. Sci. 2009, 12, 81-87.

11. Máthé A, Vörös K., Papp L., Reiczigel J.: Clinical manife-stations of canine babesiosis in Hungary (63 cases). Acta Vet. Hung. 2006, 54, 367-385.

12. Ayoob A.L., Hackner S.G., Prittie J.: Clinical management of canine babesiosis. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2010, 20, 77-89.

13. Irwin P.J.: Canine babesiosis: from molecular taxono-my to control. Parasit. Vectors 2009, 2 (Suppl 1), S4, do-i:10.1186/1756-3305-2-S1-S4

14. Szymański S.: Seasonal activity of Dermacentor reticu-latus (Fabricius, 1794) (Acarina, Ixodidae) in Poland. I. Adults. Acta Parasitol. Pol. 1987, 31, 247-255.

15. Zygner W., Wędrychowicz H.: Occurrence of hard ticks in dogs from Warsaw area. Ann. Agric. Environ. Med. 2006, 13, 355-359.

16. Zygner W., Waleriańska A.: Zwalczanie inwazji kleszczy u psów. Weterynaria w Praktyce 2005, 2, 52-57.

17. Fabisiak M., Sapierzyński R., Kluciński W.: Analysis of ha-ematological abnormalities Observed in dogs infected by a large Babesia. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2010, 54, 167-170.

18. Zygner W., Gójska O., Rapacka G., Jaros D., Wędrycho-wicz H.: Hematological changes during the course of ca-nine babesiosis caused by large Babesia in domestic dogs in Warsaw (Poland). Vet. Parasitol. 2007, 145, 146-151.

19. Kirtz G., Leschnik M., Hooijberg E., Tichy A., Leidinger E.: In-clinic laboratory diagnosis of canine babesiosis (Ba-besia canis canis) for veterinary practitioners in Central Europe. Tierarztl Prax Ausg K Kleintiere Heimtiere 2012, 40, 87-94.

20. Zygner W., Rapacka G., Gójska-Zygner O., Długosz E., Wędrychowicz H.: Biochemical abnormalities observed in serum of dogs infected with large Babesia in Warsaw (Poland). Pol. J. Vet. Sci. 2007, 10, 245-253.

21. Adaszek Ł., Górna M., Winiarczyk S.: Electrolyte level and blood pH in dogs infected by various 18S RNA stra-ins of Babaesia canis canis on the early stage of babesio-sis. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2012, 125, 45-51.

22. Zygner W., Gójska-Zygner O., Wędrychowicz H.: Strong monovalent electrolyte imbalances in serum of dogs in-fected with Babesia canis. Ticks Tick Borne Dis. 2012, 3, 107-113.

23. Taboada J., Lobetti R.: Babesiosis. W: Greene C.E.: Infec-tious Diseases of the Dog and Cat. 3rd ed. Saunders Else-vier, St. Louis 2006, 722-736.

24. Irwin P.: Babesiosis and cytauxzoonosis. W: Shaw S.E., Day M.J.: Arthropod-borne Infectious Diseases of the Dog and Cat. Manson Publishing, London 2005, 63-77.

25. Sobczyk A.S., Kotomski G., Górski P., Wędrychowicz H.: Usefulness of touch-down PCR assay for the diagnosis of atypical cases of Babesia canis canis infections in dogs. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2005, 49, 407-410.

26. Adaszek Ł., Winiarczyk S.: Application of the SYBR Gre-en real-time HRM PCR technique in the differentiation of the Babesia canis canis protozoa isolated in the areas of eastern Poland. Parasitol Res. 2010, 106, 1253-1256.

27. Adaszek Ł., Dzięgiel B., Górna M., Garbal M., Wernic-ka-Furmaga R, Winiarczyk S.: Application of real-time PCR in detecting of Babesia canis subclinical infestation in dogs – the effect of different DNA isolation methods on the sensitivity of PCR. Med. Weter. 2012, 68, 362-365.

28. Solano-Gallego L., Trotta M., Carli E., Carcy B., Caldin M., Furlanello T.: Babesia canis canis and Babesia canis vogeli clinicopathological findings and DNA detection by means of PCR-RFLP in blood from Italian dogs su-spected of tick-borne disease. Vet. Parasitol. 2008, 157, 211-221.

29. Lobetti R.: Canine babesiosis. W: Day M., Mackin A., Littlewood J.: Manual of Canine and Feline Haematolo-gy and Transfusion Medicine. BSAVA, Gloucester 2000, 83-91.

Prace kliniczne i kazuistyczne

758 Życie Weterynaryjne • 2012 • 87(9)

30. O’Connor R.M., Lane T.J., Stroup S.E., Allred D.R.: Cha-racterization of a variant erythrocyte surface antigen (VESA1) expressed by Babesia bovis during antigenic variation. Mol. Biochem. Parasitol. 1997, 89, 259-270.

31. Chauvin A., Moreau E., Bonnet S., Plantard O., Malan-drin L.: Babesia and its hosts: adaptation to long-lasting interactions as a way to achieve efficient transmission. Vet. Res. 2009, 40, 37, DOI: 10.1051/vetres/2009020

32. Ziomko I., Cencek T.: Inwazje pasożytnicze zwierząt go-spodarskich – wybrane metody diagnostyczne. Drukarnia Piotra Włodarskiego, Warszawa 1999.

33. Kraje A.C.: Canine haemobartonellosis and babesiosis. Compend. Contin. Educ. Vet. 2001, 23, 310-319.

34. Zygner W., Gójska-Zygner O., Szmidt K.: Zastosowanie winkrystyny i cyklofosfamidu w  leczeniu utrzymującej się niedokrwistości i małopłytkowości po inwazji Babe-sia canis u psa. Życie Wet. 2011, 86, 374-378.

35. Carli E., Tasca S., Trotta M., Furlanello T., Caldin M., So-lano-Gallego M.: Detection of erythrocyte binding IgM and IgG by flow cytometry in sick dogs with Babesia ca-nis canis or Babesia canis vogeli infection. Vet. Parasitol. 2009, 162, 51-57.

36. Furlanello T., Fiorio F., Caldin M., Lubas G., Solano-Gal-lego L.: Clinicopathological findings in naturally occur-ring cases of babesiosis caused by large form Babesia from dogs of northeastern Italy. Vet. Parasitol. 2005, 134, 77-85.

Dr Wojciech Zygner, Zakład Parazytologii i Inwazjologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Wete-rynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa

Nowotwory gruczołu sutkowego u suk pod względem częstości występowa-

nia zajmują drugie miejsce po nowotwo-rach skóry. W ocenie histopatologicznej ok. 40–50% guzów gruczołu sutkowego stanowią nowotwory złośliwe (1), z czego większość to nowotwory złośliwe pocho-dzenia nabłonkowego (2, 3). Nowotwo-ry te wywodzą się z nabłonka pęcherzy-ków lub przewodów i przybierają postać gruczolakoraków brodawkowatych, cew-kowych prostych lub złożonych oraz ra-ków litych (4). Występują tu też nowo-twory z komórek mioepitelialnych oraz tkanek mezenchymalnych. W badaniach własnych wśród 161 guzów gruczołu sut-kowego według wstępnej oceny histopato-logicznej stwierdzono również zdecydo-waną przewagę nowotworów złośliwych pochodzenia nabłonkowego. Złośliwe no-wotwory pochodzenia mezenchymalnego występowały mniej licznie, podobnie jak „guzy mieszane”.

Artykuł ten traktuje o nowotworach niezłośliwych pochodzenia nabłonkowe-go, które stanowią znacznie mniej liczną grupę w porównaniu z nowotworami zło-śliwymi, co znajduje potwierdzenie w ba-daniach własnych; wśród 138 nowotworów pochodzenia nabłonkowego, niezłośliwe stanowiły tylko 10,14%. Wyniki opraco-wań, dotyczące liczby i rodzaju nowotwo-rów w gruczole sutkowym psów, podawa-ne przez różnych autorów są odmienne. Na ogół oceniano, że około połowę stanowią nowotwory niezłośliwe (5, 6). Moulton (7) uważa, że nowotwory niezłośliwe stano-wią około 80% przypadków, a większość badanych guzów (65%) to „guzy miesza-ne”, a więc takie, w utkaniu których oprócz

tkanek pochodzenia nabłonkowego wystę-pują także tkanki chrzęstna i kostna. Ne-rurkar i wsp. (8) twierdzą, że zmiany nie-złośliwe to około 27% badanych guzów.

Zarówno wyniki własne, jak i wyniki in-nych autorów są bardzo rozbieżne, a róż-norodność tych danych wynika z braku jednolitych kryteriów oceny i w związku z tym jednolitej klasyfikacji nowotworów.

Najczęściej diagnozowaną grupą nowo-tworów niezłośliwych pochodzenia nabłon-kowego są gruczolaki (adenoma), w któ-rych zwykle widoczne są pęcherzyki i cewki gruczołowe, wysłane dobrze zróżnicowa-nym sześciennym nabłonkiem na błonie podstawnej i otoczone warstwą komórek mioepitelialnych. Niekiedy pęcherzyki wy-pełnione są wydzieliną.

Cel i założenia pracy

W świetle powyższych informacji intere-sujące wydawało się podjęcie pracy, któ-rej celem była ocena częstości występo-wania nowotworów niezłośliwych pocho-dzenia nabłonkowego gruczołu sutkowego u psów – gruczolaków oraz ocena histopa-tologiczna i immunohistochemiczna tych nowotworów. Dla osiągnięcia celu zapla-nowano określenie rodzaju nowotworu oraz immunohistochemiczną ocenę eks-presji antygenu jądrowego Ki-67, białka p53, cyklooksygenazy-2 oraz receptorów estrogenowych (ER).

Materiał i metody

Materiał badawczy stanowiły guzy gruczo-łu sutkowego suk pobrane w trakcie zabie-gów chirurgicznych przeprowadzonych

w warszawskich lecznicach weterynaryj-nych oraz w Klinice Małych Zwierząt Ka-tedry Nauk Klinicznych Wydziału Medy-cyny Weterynaryjnej SGGW. W przypad-ku każdego pacjenta odnotowywano dane dotyczące rasy i wieku psa.

Wycinki guzów utrwalano w 8% forma-linie buforowanej fosforanami. Po 24-go-dzinnym utrwalaniu materiał odwadniano w szeregu alkoholi o wzrastających stęże-niach kolejno: 50, 60, 70, 80, 90, 96% oraz alkoholu absolutnym i ksylenie, a następ-nie zatapiano w parafinie. Bloczki para-finowe krojono na skrawki o  grubości 4 µm. Uzyskane skrawki barwiono róż-nymi metodami w  celach diagnostycz-nych. W preparatach barwionych meto-dą hematoksylina-eozyna (H-E) określo-no: rodzaj nowotworu (według klasyfikacji WHO; 9); stopień histologicznej złośliwo-ści, uwzględniając formowanie tubul, in-tensywność dzielenia się i stopień zróż-nicowania komórek nowotworowych; in-deks mitotyczny obliczano jako średnią liczbę mitoz w 10 polach widzenia, przy powiększeniu obiektywu 40× (pole po-wierzchni 0,17 mm2); obecność i  inten-sywność nacieków komórkowych w no-wotworach według skali: (– brak nacieku, +/– naciek minimalny, + naciek niewielki, ++ naciek o średniej intensywności, +++ naciek intensywny. W badaniach immu-nohistochemicznych oceniono ekspresję antygenu jądrowego Ki-67, receptorów estrogenowych (ER), białka p53 oraz cy-klooksygenazy-2.

Wyniki

Wyniki badań histopatologicznych

W zebranym materiale operacyjnym zdia-gnozowano 150 (93%) nowotworów oraz 11 (7%) zmian nienowotworowych: 8 za-paleń, 2  rozrosty i 1 chrząstkę. Wśród 150 guzów stwierdzono 138 (92%) no-wotworów pochodzenia nabłonkowego i 12 (8%) nowotworów pochodzenia me-zenchymalnego. Wśród nowotworów po-chodzenia nabłonkowego zdiagnozowa-no tylko 14 nowotworów niezłośliwych – gruczolaków (adenoma), zaś pozostałe

Gruczolak – niezłośliwy nowotwór pochodzenia nabłonkowego gruczołu sutkowego u suk

Anna M. Badowska-Kozakiewicz

z Zakładu Biofizyki i Fizjologii Człowieka Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

Prace kliniczne i kazuistyczne

759Życie Weterynaryjne • 2012 • 87(9)