BIOMARCATORI Didattico/Igiene/2011/EPIDEMIOLOGIA... · strutturali, a carico del genoma e vengono distinti in: biomarcatori citogenetici, ... mutazioni somatiche); i geni reporter

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLAREPt. 2

- BIOMARCATORI -

Dr. Massimo Moretti

Università degli Studi di PerugiaFacoltà di Farmacia

PREMESSA

MalattiaEsposizione

PREMESSA

�

Xenobioticomutageno/cancerogeno

Detossificazionee escrezione

Attivazionemetabolica

Cellula normale

�

�

Cellulapre-iniziata

Celluladanneggiata

Cellulanormale

RiparazioneDel DNA

… … … oppure … !!!

PREMESSA

�

Xenobioticomutageno/cancerogeno

Detossificazionee escrezione

Attivazionemetabolica

Cellula normale

�

�

Cellulapre-iniziata

Celluladanneggiata

��

Cellulainiziata

Cellulapre-neoplastica

Cellulaneoplastica

PREMESSA: MUTAZIONI GENICHE



PREMESSA: MUTAZIONI CROMOSOMICHE

PREMESSA: MUTAZIONI CROMOSOMICHE

Traslocazione 9→22 (cromosoma “Philadelphia”):

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: BIOMARCATORI

MalattiaEsposizione

Suscettibilità genetica

MetabolismoRiparazione

del DNARisposta

immunitaria

Doseinterna

Dosebiologicaefficace

EffettiBiologiciprecoci

Alteratastrutturafunzione

Esposizione Effetto biologico

Metabolismo del DNA immunitaria

Metaboliti Danno ossidativoAddotti al DNA

Alterazionicitogenetiche

Attivazioneoncogeni

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: BIOMARCATORI

Un “biomarcatore” è rappresentato da una modificazione (ditipo molecolare, biochimico, genetico, immunologico ofisiologico) che consente di rilevare un evento in un sistemabiologico che possa influenzare o predire l’insorgenza ol’evoluzione di una malattia.

Pertanto, l’impostazione di uno studio di epidemiologiaPertanto, l’impostazione di uno studio di epidemiologiamolecolare è del tutto paragonabile a quella di uno studio diepidemiologia tradizionale, con la differenza che l’end-pointche viene valutato non è più la malattia conclamata (tassi diincidenza o prevalenza) o l’esito della malattia stessa (tassidi mortalità), ma uno o più biomarcatori.

BIOMARCATORI DI ESPOSIZIONE: DOSE INTERNA

Forniscono indicazioni riguardo la quantità di xenobioticoassorbita dall’organismo in un determinato tempo. Possonoessere costituiti dall’agente esogeno stesso, oppure da unprodotto del suo metabolismo o, ancora, dall’attivitàbiologica del composto in studio.

Esempi di biomarcatori di dose interna:Esempi di biomarcatori di dose interna:

� concentrazione eritrocitaria e/o linfocitaria di cromo;

� concentrazione urinaria di aflatossina-B1 (indicatore diesposizione alimentare);

� concentrazione urinaria di 1-idrossipirene in soggettiesposti ad idrocarburi policiclici aromatici;

� mutagenicità urinaria (Salmonella/microsomi test).


Salmonella/microsomi test (test di Ames):



� mutagenicità urinaria.

Controllonegativo

Fumo Fumo + S9-mix



� mutagenicità urinaria vs. determinazioni chimico/analitiche

BIOMARCATORI DI DOSE BIOLOGICA EFFICACE

Forniscono indicazioni riguardo l’entità della interazionedello xenobiotico assorbito (o dei suoi metaboliti) conmacromolecole coinvolte nel processo della cancerogenesi(es. DNA) o con molecole surrogate (es. albumina ol’emoglobina), causando alterazioni reversibili.

Tra i marcatori di dose biologica efficace maggiormenteTra i marcatori di dose biologica efficace maggiormenteutilizzati vi sono:

� addotti al DNA;

� addotti alle proteine;

� danno primario al DNA.


È stata osservata una stretta correlazione tra presenza diaddotti al DNA (il termine “addotto” deriva dall’inglese“adduct”, acronimo di addiction product = prodotto diaddizione covalente) e cancerogenesi.

Molti studi hanno confermato che la formazione di addotti alDNA è un evento necessario, anche se non sufficiente, perlo sviluppo di tumori da parte di cancerogeni chimici.


P32 post-labelling:

Controlli Esposti


Il danno primario al DNA, biomarcatore aspecifico maestremamente sensibile, viene valutato utilizzando il testdella cometa in condizioni alcaline (generalmente su linfocitidi sangue periferico).

Le principali lesioni evidenziabili con il test della cometasono:sono:

� single-strand breaks;

� double-strand breaks;

� siti alcali-labili;

� basi ossidate.


Test della cometa:

� inclusione delle cellule inmicrogel di agarosio;

� lisi delle membranecellulari e nucleari;

[A]

Vetrino da microscopiopretrattato con NMA 1%

Strato di gel LMA 0,7%con incluse le cellule

Strato protettivo digel LMA 0,7%

Cellula inclusa nel gel di agarosio

Membrana cellulare

Citoplasma

Nucleo

Membrana nucleare

� elettroforesi (condizionialcaline).

� colorazione dei vetrini;

� analisi al microscopio afluorescenza.

[B]

[C]

[D]

Lisi delle membrane cellularie nucleari

Idrolisi alcalina delle proteine edell’RNA;“denaturazione”del DNA

Migrazione elettroforetica deiframmenti di DNA nelle magliedel gel

_+


Test della cometa:

� campo al microscopio a fluorescenza.

(A)

(C)

(A)

(A)

(A)

(B)

(A) cellule con DNA non danneggiato;(B) cellule con DNA moderatamente danneggiato;(C) cellule con DNA fortemente danneggiato.


Test della cometa:

� valutazione del danno al DNA in una singola cellulacon sistema computerizzato di analisi di immagini:

Measure

Head Length 21.97Tail % intensity 18.53Tail Moment 3.16

Tail Length 47.60Total Area 639.36

Total Intensity 476477.11

Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98

1 cell scored Image is frozenx50 (Olio immersione)

Measure

Edit

Live

Frozen

Delete

BIOMARCATORI DI EFFETTO BIOLOGICO PRECOCE

I biomarcatori di effetto biologico precoce sonorappresentati da alterazioni irreversibili, funzionali ostrutturali, a carico del genoma e vengono distinti in:

� biomarcatori citogenetici,

� alterazioni in “reporter genes”.


I biomarcatori citogenetici possono essere rilevati mediante:

� analisi in metafase (aberrazioni cromosomiche numerichee strutturali, scambi tra cromatidi fratelli);

� analisi in interfase (micronuclei).


Aberrazioni cromosomiche (strutturali e/o numeriche) :

� risultano dalla rottura di interi cromosomi e dal lorosuccessivo riarrangiamento in forme abnormi:

DicentricoDelezione + “Gap”

Interscambio


Scambi tra cromatidi fratelli:

� si formano tipicamente in caso i danni al DNA simanifestino durante la metafase, in questo caso la cellulamette in atto dei meccanismi di riparazione durante iquali porzioni uguali dei due cromatidi opposti delcromosoma possono scambiare la loro posizione (scambicromosoma possono scambiare la loro posizione (scambisimmetrici):

Scambi tra cromatidi fratelli (SCE)


Micronuclei:

� corpuscoli di forma rotondeggiante, di dimensioni chepossono variare da 1/16 a 1/3 del nucleo principale,contenenti materiale genetico e che possono trovarsi nelcitosol al termine del ciclo cellulare.

Micronuclei


Micronuclei:

� si formano, durante l’anafase della mitosi, dallacondensazione di frammenti di cromosomi acentrici o dacromosomi interi che non vengono incorporati nei nucleiprincipali delle cellule figlie;

i micronuclei possono generarsi attraverso vari� i micronuclei possono generarsi attraverso varimeccanismi, riconducibili essenzialmente:

� all’azione di agenti clastogeni, che causano rotturecromosomiche dirette;

� a disfunzioni del fuso mitotico, che possono esseregenerate da agenti aneuploidizzanti;

� alla combinazione di entrambi i meccanismi.


Micronuclei:

� meccanismi di formazione.

(A)Effettoaneuploidizzante

Blocco della citocinesi �

Frammenti acentrici

Cromosoma intero

(B)Effettoclastogeno


Bonassi S. et al. (2000) Chromosomal aberrations inlymphocytes predict human cancer independently fromexposure to carcinogens. Cancer Research, 60(6):1619–1625.

� … … … Logistic regression models indicated a statisticallysignificant increase in risk for subjects with a high levelsignificant increase in risk for subjects with a high levelof chromosomal aberrations compared to those with alow level in the Nordic cohort (odds ratio, 2.35; 95%confidence interval, 1.31-4.23) and in the Italian cohort(odds ratio, 2.66; 95% confidence interval, 1.26-5.62). …… …


Bonassi S. et al. (2006) An increased micronucleusfrequency in peripheral blood lymphocytes predicts the riskof cancer in humans. Carcinogenesis, 28(3):625–631.

� … … … A significant increase of all cancers incidence wasfound for subjects in the groups with medium (RR=1.84;95% CI: 1.28-2.66) and high micronuclei frequency95% CI: 1.28-2.66) and high micronuclei frequency(RR=1.53; 1.04-2.25). … … …


“Reporter genes”:

� geni che non svolgono un ruolo diretto nel processo dellacancerogenesi, ma che se mutati danno origine a fenotipifacili da individuare (bioindicatori della frequenza dimutazioni somatiche);

i geni reporter di più ampio impiego in epidemiologia� i geni reporter di più ampio impiego in epidemiologiamolecolare sono:

� gene codificante per la ipoxantina-guaninafosforibosil-transferasi (HPRT);

� gene codificante per la glicoforina-A (GPA).

BIOMARCATORI DI SUSCETTIBILITÀ INDIVIDUALE


Mutazioni:

• interessano geni correlati all’insorgenza di tumori (es.geni deputati al controllo del differenziamento e del ciclocellulare), risultano poco diffuse nella popolazione(frequenza <1%), ma sono altamente correlateall’evento clinico (penetranza elevata).all’evento clinico (penetranza elevata).

Polimorfismi:

• sono rappresentati da mutazioni molto diffuse nellapopolazione (frequenza 1-50%), ma scarsamentecorrelate all’evento clinico (penetranza bassa).


Tra i geni tumore-correlati i proto-oncogeni codificano perproteine coinvolte nella regolazione e nell’induzione del ciclocellulare:

� fattori di crescita (FGF3, FGF4);

� fattori di trascrizione (JUN, FOS, MYC);

� proteine chinasi (ABL-1, FES, RET);

� recettori di membrana per fattori di crescita (ERBB2,CSF1R);

� proteine deputate alla trasduzione del segnale (BRAF);

I proto-oncogeni possono essere attivati ad oncogeni inseguito a mutazioni puntiformi, riarrangiamenti cromosomicied inserzione virale.


Gli oncosoppressori, invece, sono geni altamente conservati(APC, BRCA1, BRCA2, MEN1, NF1, RB1, TP53) checodificano per proteine di membrana, citoplasmatiche,nucleari che inibiscono la crescita e la divisione cellulare:

� ad esempio, il gene TP53 codifica per la proteina p53 chesvolge un ruolo centrale nella inibizione della crescita disvolge un ruolo centrale nella inibizione della crescita dicellule con danni al DNA, per cui la perdita di tale attivitàa seguito di mutazioni nel gene TP53 causa lapromozione della proliferazione di cellule con genomaalterato.


Molti geni che codificano per gli enzimi coinvolti nelmetabolismo degli xenobiotici o per gli enzimi deputati allariparazione del DNA sono polimorfici, ovvero esistono nellapopolazione in diverse forme alleliche dello stesso gene.

A varianti alleliche corrispondono attività enzimatichediverse.diverse.


Intermedioreattivo

(elettrofilo)

Pro-cancerogeno

Funzionalizzazione(Fase I)

Citocromo P450

Danno al DNA

Cancerogeno

Metabolitaidrofilo

Coniugazione(Fase II)

Glutatione S-transferasi

Escrezione


Metabolismo del benzo[a]pirene:

Metabolita attivo


Polimorfismi metabolici:

� combinazioni favorevoli / sfavorevoli:

Esempio:- Iperattivatore- Lento eliminatore


Polimorfismi metabolici - “CYP1A1”:

� al momento sono noti 4 principali polimorfismi nel geneCYP1A1,ai quali è stato assegnato un numero che siriferisce, cronologicamente, all’ordine di pubblicazione,preceduto dal simbolo “*” (CYP1A1*1 definisce, quindi, iltipo selvatico);tipo selvatico);

� una mutazione dell’esone 7, la transizione A4889G,conferisce un aumento di almeno 3 volte dell’attivitàcatalitica (polimorfismo CYP1A1*3 o Ile�Val).


Polimorfismi metabolici - “CYP1A1”:

St St

335 bp

129 bp

206 bp

PCR/RFLP (MspI)


Polimorfismi metabolici - “GSTM1”:

� i primi polimorfismi delle GST ad essere determinati sonoquelli di classe µ e sono stati caratterizzati sia misurandol’attività enzimatica in relazione ad un dato substrato(trans-stilbene ossido), sia isolando ed identificando gliisoenzimi;isoenzimi;

� il gene (GSTM1) che codifica per l’isoforma GSTM1 èpolimorfico e presenta 4 varianti alleliche, tra queste lavariante GSTM1*0 (allele nullo) determina nella formaomozigote la mancanza dell’attività enzimatica: circa il50% della popolazione caucasica manca dell’attività dellaGSTM1.


Polimorfismi metabolici - “GSTM1”:

300bp

200bp

268bp ( -globina)

215bp (GSTM1)

β

RISCHIO GENOTOSSICO E POLIMORFISMI GENETICI

Esposizione ambientale

Polimorfismo Effetto

Ammine aromatiche del fumo di sigaretta

Lenti acetilatori(NAT2)

Aumento di rischio per cancro alla vescica

Arilammine Veloci acetilatori Aumento di rischio Arilammine eterocicliche da pirolisi di carni cotte

Veloci acetilatori(NAT2)

Aumento di rischio per cancro colonrettale

Idrocarburi policiclici aromatici da fumo di sigaretta

Deficienza di GST(GSTM1*0)

Aumento di rischio per cancro al polmone

Esposizione a ossido di etilene, butadiene, stirene

Deficienza di GST(GSTT1*0)

Aumento dei livelli di danno cromosomico

SUSCETTIBILITA’ GENETICA INDIVIDUALE

La suscettibilità genetica all’azione dei cancerogeni siesprime soprattutto ai bassi livelli; da questo discendonoalmeno due conseguenze rilevanti da considerare nellescelte di politica ambientale:

1) le “soglie accettabili” di esposizione, comunque definite,dovrebbero tener conto dell’esistenza nella popolazionedi sottogruppi a più alto rischio di malattia e, didi sottogruppi a più alto rischio di malattia e, diconseguenza, essere adeguatamente abbassate;

2) nelle indagini epidemiologiche la suscettibilità geneticadovrebbe essere tenuta nella giusta considerazione, inmodo da aumentare la probabilità di evidenziarerelazioni causali con agenti ambientali.

SUSCETTIBILITA’ GENETICA INDIVIDUALE

Del tutto privo di fondamenti è invece un uso delleconoscenze sulla suscettibilità genetica per selezionare ilavoratori meno suscettibili all’azione dei cancerogeni:

1) un principio senza il quale tutta l’etica medicaperderebbe di significato è che “non fare del male”viene prima di “fare del bene”, in altre parole evitarel’esposizione a sostanze tossiche è un obbligo morale dil’esposizione a sostanze tossiche è un obbligo morale diordine superiore rispetto a prevenire i danni attraversoaltri strumenti come lo screening genetico;

2) la selezione genetica avrebbe una ricaduta inaccettabile,ovvero la discriminazione razziale, infatti i polimorfismimetabolici mostrano diversa distribuzione nei diversigruppi etnici.

NUOVI BIOMARCATORI ... ...

Nuove tecniche di biologia molecolare, nel campo sia dellagenomica che della proteomica, offrono la possibilità disviluppare una nuova serie di biomarcatori per valutare ilrischio genotossico.

Particolarmente attraenti sono tecniche come il cDNA-microarray (insieme di sequenze di DNA a elica singolaimmobilizzate su una superificie solida) per lo studio deiimmobilizzate su una superificie solida) per lo studio deiprofili di espressione genica:

NUOVI BIOMARCATORI ... ...

Documents

BIOMARCATORI Didattico/Igiene/2011/EPIDEMIOLOGIA... · strutturali, a carico del genoma e vengono distinti in: biomarcatori citogenetici, ... mutazioni somatiche); i geni reporter