Aus der Abteilung für

Pathologie

der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. Morgenroth

Die Bedeutung d es Plasminog en-Aktivatorsystems für die

Progno se des k leinzelli gen Bronchialkarzinoms

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Eva Barteck

aus Bochum

1999

Seite 1

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. med. H. Hildmann

Korreferent: Prof. Dr. med. K.M. Müller

Tag der mündlichen Prüfung: 6. Juni 2000

Seite 2

Inhaltsverzeichnis

1 INHALTSVERZEICHNIS................................................................................. 2

2 EINLEITUNG................................................................................................... 4

2.1 Das Bronchialkarzinom .......................................................................................................................4

2.2 Pr inzipien von Invasion und Metastasierung ..................................................................................13

2.3 Die Interaktionen der Proteine des Plasminogen-Aktivator -System .............................................14

2.3.1 Das Plasminogen Aktivator Systems unter physiologischen und pathologischen Bedingungen... 17

2.4 Histopathologische Untersuchungsmethoden ..................................................................................21

2.4.1 Die Immunhistochemische Untersuchung .................................................................................... 22

2.4.2 Die ABC-Methode........................................................................................................................ 22

2.5 Problemstellung.................................................................................................................................. 22

3 MATERIAL UND METHODEN...................................................................... 24

3.1 Untersuchungsmaterial ......................................................................................................................24

3.2 Geräte..................................................................................................................................................24

3.3 Chemiekalien ......................................................................................................................................25

3.4 Antikörper ..........................................................................................................................................25

3.5 Untersuchungsmethode......................................................................................................................28

3.6 Statistische Methoden ........................................................................................................................30

4 ERGEBNISSE............................................................................................... 31

5 DISKUSSION................................................................................................ 38

5.1 Diskussion der Ergebnisse.................................................................................................................38

5.2 Diskussion der Fehlermöglichkeiten ................................................................................................. 44

6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 46

Seite 3

7 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................... 47

Einleitung

Seite 4

1 Einleitung

Die malignen Tumoren des unteren Respirationstraktes haben in ihrer

Häufigkeit in den letzten Jahrzehnten erheblich zugenommen und die Tendenz

ist ansteigend. In den Krebsstatistiken ist das Bronchialkarzinom heute das

häufigste Karzinom beim Mann, Frauen erkranken bislang seltener. Der Tumor

manifestiert sich in der Regel in der 6. Lebensdekade. Die Entstehung des

Bronchialkarzinoms ist vor allem auf inhalative Noxen zurückzuführen.

Unter den vier Haupt-Subtypen der Bronchialkarzinome besitzt das kleinzellige

Bronchialkarzinom die ungünstigste Prognose. In der Häufigkeit des Auftretens

befindet es sich an zweiter Stelle. Es handelt sich um einen hochgradig

malignen epithelialen Tumor mit charakteristischen zytologischen

Eigenschaften. Der klinische Verlauf ist sehr aggressiv und häufig mit

weitverbreiteter lymphogener und hämatogener Metastasierung verbunden.

Invasives, destruierendes Wachstum und Metastasierung erfordern die

Fähigkeit der Tumorzellen mit den Komponenten der subepithelialen

Basalmembran zu interagieren und die Bestandteile der extrazellulären Matrix

zu degradieren (Colby T. et al.; 1994).

Zu den Basismechanismen dieser Vorgänge gehört die tumorassoziierte

Proteolyse. Das bösartige Verhalten der Tumorzellen und die schlechte

Prognose scheinen von der Synthese und Aktivität Matrix-abbauender

proteolytischer Enzyme abhängig zu sein. In diesem Zusammenhang hat die

Expression von Serinproteasen und deren Inhibitoren innerhalb des

Plasminogen-Aktivator-Systems Bedeutung erlangt (Heiss MM.; 1995).

1.1 Das Bronchialkarzinom

Bronchialkarzinome sind hochmaligne Lungentumoren, die sich überwiegend

vom Oberflächenepithel der Bronchien und Bronchiolen ableiten. Nach ihrer

Lokalisation werden zentrale hilusnahe (ca. 70%), intermediäre und periphere

Bronchialkarzinome (ca. 25%) unterschieden. Histologisch lassen sich vier

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Subtypen abgrenzen: Plattenepithelkarzinome, kleinzellige Karzinome,

Adenokarzinome und großzellige Karzinome. Diese Reihenfolge entspricht der

Häufigkeit ihres Auftretens.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem kleinzelligen Bronchialkarzinom.

Die Inzidenz des kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist in den letzten Jahren

angestiegen. Diese Form macht etwa 20% aller Lungenkrebse aus. In den

USA gibt es schätzungsweise 34 000 Neuerkrankungen pro Jahr. Das mittlere

Manifestationsalter wird mit 60 Jahren angegeben (Reichweite 32-79 Jahre).

Männer erkranken bevorzugt, der Prozentsatz der betroffenen Frauen stieg

jedoch kontinuierlich in den letzten Jahren an. Betrug die Fallzahl beim

männlichen Geschlecht anfangs das Zehnfache, so wird neuerdings von einem

Verhältnis von 2: 1 berichtet (Colby T. et al.; 1994). Einige Autoren berichten

auch von einem ausgeglichenen Verhältnis. In Bezug auf die Gesamtheit der

Bronchialkarzinome haben Männer ein fünffach erhöhtes Risiko zu erkranken

(Thurlbeck, WM.; 1988).

Die Hauptursache für Lungenkrebs sind inhalative Noxen, insbesondere der

Tabakrauch. Das kleinzellige Bronchialkarzinom und das

Plattenepithelkarzinom sind am stärksten mit dem Rauchen assoziiert. Des

weiteren begünstigen zu einem sehr geringen Prozentsatz die Exposition

gegenüber ionisierender Strahlung (Uran), Asbest, Arsen, Chromdämpfen,

Nickeldämpfen und Kokereirohgasen die Entstehung von Lungentumoren

(Colby T. et al.; 1994).

Das histologische Bild des kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist durch eine in

soliden Arealen angeordnete Wucherung kleiner Epithelzellen charakterisiert

(Morgenroth, K. und Nolte, D.; 1981). Die Zellen weisen durch die extrem

verschobene Kern-Plasma-Relation wenig Zytoplasma auf und die Zellgrenzen

sind undeutlich (Thurlbeck, WM.; 1988). In den Zellkernen findet sich eine

dichte feine Chromatingranula, so daß Nukleolen fehlen oder unauffällig sind

(Colby T. et al.; 1994).

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Abbildung 1 HE-Färbung, Originalvergrößerung 200 fach, rundliche bis spindelförmigeZellen mit spärlichem Zytoplasmasaum

Abbildung 2 HE-Färbung, Originalvergrößerung 20 fach, regressive Veränderungen in Formvon Nekrosezonen zwischen soliden kleinzelligen Tumorzellverbänden.

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Abbildung 3 HE-Färbung, Originalvergrößerung 50 fach, kleine zytoplasmaarmelymphozytenähnliche Tumorzellen als kennzeichnendes Merkmal kleinzelligerBronchialkarzinome.

Abbildung 4 HE-Färbung, Originalvergrößerung 200 fach, deutlich zu erkennen ist dieextrem verschobene Kern-Plasma-Relation der Tumorzellen

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Abbildung 5 EvG-Färbung, Originalvergrößerung 50 fach, Die Tumorzellenmasse grenzt aneine ausgeprägte Nekrosezone.

Die Zellen weisen Reste einer neuroendokrinen Differenzierung auf. Sie stehen

histogenetisch zum Kultschitzky-Typ des Apud-Systems in der

Bronchialschleimhaut und zu den Karzinoidtumoren des Bronchus in

Beziehung. Paraneoplastische Syndrome mit endokrinen und neurologischen

Symptomen können häufiger auftreten (Morgenroth, K. und Nolte, D.; 1981;

Colby et al.; 1994). In 75% der Fälle exprimieren die Zellen

neuronenspezifische Enolase sowie die embryonale Form des neuralen

Zelladhäsionsmoleküls. Dies erklärt die schlechte Zellkohäsivität und leichte

Quetschbarkeit des Gewebes bei der Entnahme (Thurlbeck, WM.; 1988).

Der Tumor zeigt häufig ausgedehnte Nekrosen (Abbildung 2). Makroskopisch

weist er eine weiße bis gelbliche Farbe und eine weiche krümelige Konsistenz

auf. In ungefähr 70% der Fälle zeigen sich perihiläre Tumormassen. Der Tumor

ist typischerweise peribronchial lokalisiert. Infiltrationen in die Submucosa und

die Peripherie können vorkommen. Frühe kleinzellige Bronchialkarzinome

können als submuköses Infiltrat mit normaler darüberliegender Mukosa oder

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als Plaque-ähnliche Läsionen auftreten. Mit fortschreitender Erkrankung kann

das Bronchiallumen durch Kompression von außen verschlossen werden.

Endobronchiale Läsionen sind ungewöhnlich, aber schon berichtet worden. Das

Kleinzellige Karzinom entwickelt sich nicht nach dem Muster eines Carcinoma

in situ (Colby T. et al.; 1994).

Aufgrund des schnellen Wachstums und der weitverbreiteten Metastasen sind

die meisten Patienten (über 80%) symptomatisch. Die Dauer der Symptome

beträgt weniger als drei Monate. Da die meisten Tumoren proximal lokalisiert

sind zählen Husten, Dyspnoe, Hämoptysen, thorakaler Schmerz und

postobstruktive Pneumonie zu den gemeinsamen Symptomen. Bei

Einbeziehung des Mediastinums treten das Vena-Cava-superior-Syndrom,

Paralyse des N. laryngeus recurrens und Dysphagie auf. Klinisch

kennzeichnend sind außerdem die überschießende ADH-Produktion, das

ektope Cushing Syndrom und das Eaton-Lambert-Syndrom. Ferner können

Symptome vom Befall des Zentralnervensystems, der Knochen und der Leber

resultieren (Colby T. et al.; 1994).

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Abbildung 6 Makroskopischer Aspekt eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms

Abbildung 7 Detailaufnahme aus Abbildung 6, zentrale hilusnahe Topographie

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Die histologische Klassifikation des kleinzelligen Brochialkarzinoms hat sich im

wesentlichen während der letzten drei Jahrzehnte entwickelt. Die Einteilung der

WHO von 1967 sah eine Unterscheidung von vier morphologischen Typen vor.

Diese wurden 1981 auf drei Typen reduziert:

1. Haferkorntyp

2. intermediärer Zelltyp

3. kombinierter Zelltyp.

Die Problematik dieser Einteilung besteht allerdings in der schweren

Reproduzierbarkeit der Begriffe für unterschiedliche Pathologen. Von einigen

wird der Haferkornzelltyp als nekrose-oder bearbeitungsbedingter Artefakt

angesehen.

Die IASLC (International Association for the Study of Lung Cancer) teilte das

kleinzellige Bronchialkarzinom in folgende Kategorien:

1. Kleinzelliges Bronchialkarzinom

2. gemischtes klein-und großzelliges Karzinom

3. kombinierter Typ (mit Bestandteilen des Plattenepithel- und des

Adenokarzinoms).

Bei Lichtmikroskopie zeigt das kleinzellige Karzinom häufig ausgedehnte

Nekrosen. Manche Tumoren haben ein prominentes desmoplastisches Stroma.

Sie wachsen nicht nach einem bestimmten Muster, können sich aber in

Nestern Bändern, tubulären und duktalen Strukturen und gelegentlich in

Pseudorosetten formieren. Die Mitoseraten sind charakteristischerweise hoch.

Sie erreichen bis zu 10 Mitosen pro Gesichtsfeld (Colby T. et al.; 1994).

Die Differentialdiagnose des Kleinzelligen Karzinoms nimmt eine wichtige Rolle

bei der Wahl der Therapie ein. Der Tumor reagiert äußerst sensibel auf

Chemotherapie. Diese Eigenschaft unterscheidet ihn von Nicht-kleinzelligen

Karzinomen. Weitere wichtige Differentialdiagnosen schließen das maligne

Lymphom, die chronische Entzündung und Fernmetastasen anderer

Primärtumoren ein. Im Einzelfall kann die Diagnosestellung kompliziert sein. Als

Anhaltspunkt für die Größe einer Tumorzelle kann der Vergleich mit dem

Durchmesser von 2-3 Lymphozyten hilfreich sein. Es wurde auch von einer

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Größe zwischen 35 und 45 µm berichtet (Colby T. et al.; 1994). Faktoren, die

zu einer schlechten pathologischen Beurteilbarkeit des Gewebes führen sind:

zu geringe Größe der Biopsieproben, Quetschungsartefakte, ischämische

Veränderungen, ungenügende Fixation und mangelhafte Qualität der

histologischen Schnitte.

Das kleinzellige Bronchialkarzinom wird als Systemerkrankung angesehen, da

fast alle Patienten zum Zeitpunkt der Entdeckung der Erkrankung regionale und

extrathorakal gelegene Lymphknotenmetastasen aufweisen. Die hämatogene

Aussaat des Tumors ist ebenfalls extrem häufig. Er metastasiert bevorzugt in

die Leber, das Gehirn, die Nebennieren und die Knochen (Colby T. et al.;

1994). Die chirurgische Resektion steht als einzige Heilungschance des

Bronchialkarzinoms zur Verfügung. Sie ist jedoch nur selten möglich. In etwa

5% der Fälle ist das kleinzellige Karzinom einer operativen Therapie zugänglich

und kann unter der primären Diagnose eines unklaren Rundherdes chirurgisch

reseziert werden. Dies gilt für 20% der Nicht-kleinzelligen Karzinome. Die

Frage, ob ein Patient ein Kandidat für die Resektion ist oder nicht, hängt vom

„Staging“ ab. Es ist der wichtigste prognostische Parameter. Es dient zur

Feststellung der anatomischen Ausbreitung der Krankheit und beruht auf

klinischen, radiologischen und pathologischen Beweisen.

Das übliche Staging-System für Lungentumoren wurde 1986 von Mountain

vorgeschlagen und basiert auf der TNM-Klassifikation. Darin bezieht sich „T“

auf die Größe und das Ausmaß des Tumors, „N“ auf die Anwesenheit und das

Ausmaß von Lymphknotenmetastasen und „M“ auf das Vorhandensein von

Fernmetastasen. Ein Tumorstadium bis IIIA kann reseziert werden, während

IIIB und IV als inoperabel gelten. Diese TNM-Einteilung läßt sich nicht gut auf

das kleinzellige Bronchialkarzinom anwenden. Daher entwickelte man ein

2-Stadien-System (Colby T. et al.; 1994).

Man unterscheidet das Stadium einer „limitierten Erkrankung“ (limited disease)

von einer „ausgedehnten Erkrankung“ (extensive disease). Um eine limitierte

Erkrankung handelt es sich bei Befall eines Hemithorax mit oder ohne Befall

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der ipsilateralen bzw. kontralateralen mediastinalen und supraklavikulären

Lymphknoten und Vorkommen eines Pleuraergusses. Das ausgedehnte

Stadium wird definiert als fortgeschrittener und schließt den Befall entfernter

Lymphknoten und anderer Organe ein. Zum Zeitpunkt der Vorstellung befinden

sich 30% der Patienten in einem limitierten Stadium der Erkrankung und 70% in

einem fortgeschrittenen Stadium. Die 5-Jahresüberlebensrate für ein limitiertes

Stadium beträgt etwa 10%, für das fortgeschrittene Stadium liegt sie zwischen

0 und 2%. Laut Statistik des „American National Cancer Institute“ liegt die

5-Jahresüberlebensrate für alle Stadien bei 13% für Weiße und bei 11% für

Schwarze. Die Ergebnisse einer Studie über Langzeitüberlebende von

Mountain 1988 machen die besondere biologische Aggressivität und schlechte

Prognose des kleinzelligen Bronchialkarzinoms deutlich. Bei einem Vergleich

der Daten von 50000 Patienten über den Zeitraum von 1978-1986 hat das

kleinzellige Karzinom die kürzeste relative Überlebensrate unter allen

histologischen Typen.

Patienten mit der Vorgeschichte eines resezierten Bronchialkarzinoms haben

ein merkliches Risiko eines sekundären Bronchialkarzinoms. Das Risiko der

Langzeitüberlebenden (> 5 Jahre) liegt bei 2% pro Jahr. Bei Patienten mit

kleinzelligem Karzinom liegt das Rezidivrisiko bei 5,6% pro Jahr (Colby T. et al.;

1994).

1.2 Prinzipien von Invas ion und Metastasierung

Die extrazelluläre Matrix, zu der die Basalmembranen und das interstitielle

Stroma zählen, fungiert im gesunden Organismus als Barriere zwischen den

Gewebskompartimenten. Sie ist aus Makromolekülen wie Kollagen,

Fibronektin, Laminin, Vitronektin, Proteoglykanen, Glykoproteinen u.a.

zusammengesetzt (Kath R. und Schmidt CG.; 1990), (Liotta LA. et al.; 1991).

Unkontrolliert wachsende Tumorzellen sind in der Lage, die epitheliale

Basalmembran zu penetrieren und in das darunterliegende interstitielle Stroma

und in Lymph- oder Blutgefäße zu gelangen. Dieser Intravasation folgt die

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Zirkulation der Tumorzellen im Blutstrom. In den Arteriolen des Zielorgans

binden die Tumorzellen an die endotheliale luminale Oberfläche, proliferieren

und durchbrechen die Gefäßwand. In Kapillaren und postkapillären Venolen

verursachen sie eine Retraktion des Endothels mit dem Ziel, der

Basalmembran anzuhaften. Durch deren lokale Zerstörung kommt es zur

Extravasation. Im Zielorgan durchwandern einzelne Tumorzellen das

perivaskuläre interstitielle Stroma (Liotta LA. et al. 1991). In vivo findet die

Invasion seltener in den Arterien und Arteriolen statt, da deren elastische

Fasern schwerer zu durchdringen sind (Kath R. und Schmidt CG.; 1990). Liotta

et al. beschreiben die Invasion als einen Prozeß, der in drei Schritten abläuft.

Erstens kommt es zur Anheftung der Tumorzellen an die Basalmembran,

zweitens zu lokaler Proteolyse durch Sekretion von Enzymen und drittens zur

Migration der Tumorzellen in die Region (Liotta LA. et al. 1991). Beispiele für

proteolytische Enzyme sind Metalloproteinasen, Serinproteasen und

Cysteinproteasen (Colby T. et al.; 1994). Diese Arbeit beschäftigt sich

ausschließlich mit den Serinproteasen und ihren Inhibitoren.

1.3 Die Interaktionen der Proteine des Plasminog en-Aktivator-System

Solide Tumoren benötigen für ein invasives Wachstum und die Fähigkeit zur

Metastasierung die Wirkung Tumor-assoziierter Proteasen, welche die

Auflösung der umgebenden Tumormatrix und Basalmembran vorantreiben

(Dano K. et al.; 1985), (Pollanen J. et al.; 1991). Der Rezeptorgebundene

Plasminogen Aktivator vom Urokinase-Typ (uPA) scheint bei diesen

Ereignissen eine Schlüsselrolle zu spielen (Chucholowski N. et al.; 1992), (Del

Vecchio S. et al.; 1993). Ein weiteres Plasminogen aktivierendes Enzym ist tPA

(tissue-type plasminogen activator). Dieses ist nicht an der Tumorausbreitung

beteiligt, denn es bindet nicht an die Tumorzelloberfläche und kann daher nicht

die perizelluläre Proteolyse vorantreiben (Schmitt M. et al.; 1995), (Constantini

V. et al.; 1996). tPA ist ein zentrales Enzym der Thrombolyse (Pyke C. et al.;

1991).

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uPA wird von Zellen als inaktives Proenzym, pro-uPA freigesetzt. Pro-uPA

besteht aus einer Einzel-Polypeptidkette und wird unter limitierter Proteolyse in

aktives uPA umgewandelt. Dieses besitzt zwei miteinander durch eine

Disulfitbrücke verbundene Polypeptidketten. Die Umwandlung in die aktive

Form wird von Plasmin katalysiert. Pro-uPA und uPA binden mit hoher Affinität

an den spezifischen Zelloberflächenrezeptor uPAR. Rezeptorgebundenes uPA

aktiviert Plasmin, indem es Plasminogen in die aktive Form, Plasmin

umwandelt. Die Ergebnisse immunhistochemischer und funktioneller Studien

stellen klar heraus, daß uPA primär für die Generation von Plasmin

verantwortlich ist. Plasmin ist eine Serinprotease, welche die Kaskade der

proteolytischen Schritte aktiviert, die zum Abbau von Fibronektin, Laminin und

Kollagen führen (Andreasen PA. et al; 1990), (Dano K. et al.; 1985), (Pollanen

J. et al.; 1991). Plasmin scheint außerdem bei der Aktivierung und Freisetzung

von Wachstumsfaktoren eine Rolle zu spielen (Dano K, et al,; 1994). Somit ist

es verantwortlich für Fibrinolyse und Thrombolyse und beteiligt an biologischen

Prozessen wie zum Beispiel des Matrixabbaus, der Zellmigration, der Invasion,

dem Wiederaufbau von Geweben und deren Zerstörung (Andreasen PA. et al;

1990).

Der Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ wurde ursprünglich aus Urin

gewonnen. Er befindet sich auch in geringer Konzentration im Plasma. Er wird

sowohl von Tumorzellen als auch von normalen Zellen exprimiert, wie z:B.

Nierentubuluszellen, phagozytierenden Zellen, Pneumozyten, Keratinozyten

und Fibroblasten (Schmitt M. et al.; 1995).

Seit den späten 70er Jahren sind die schnell wirksamen Plasminogen Aktivator

Inhibitoren identifiziert worden, welche zur Familie der Serpins (engl. Serine

Protease Inhibitors) gehören. Sie regulieren die Plasminogenaktivierung, indem

sie stabile äquimolare Komplexe mit tPA und uPA bilden. Es existieren zwei

Formen. PAI-1, wurde zuerst als Endothel-Typ bekannt, PAI-2 nannte man

Plazenta-Typ. Die heute verwendeten Namen wurden 1986 vom International

Committee on Thrombosis and Haemostasis übernommen (Krischnamurti C. et

al.; 1992), (Andreasen PA. et al; 1990), (Dano K. et al.; 1985). Beide Moleküle

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inhibieren freies und rezeptorgebundenes aktives uPA (Andreasen PA. et al.;

1986), indem sie mit uPA einen Komplex bilden und diesen gleichzeitig durch

intrazelluläre Aufnahme inaktivieren (Alitalo R. et al.; 1989), (Sier CFM. et al.;

1995). Diese erstmals von Cubellis et al. 1990 gemachte Beobachtung

bestätigten Chucholowski et al. (1992) in ihren Untersuchungen an

U397-Zellen.

PAI-1, wird von Plättchen, Endothelzellen, Granulosazellen und Tumorzellen

produziert. 90% der Gesamtmenge des im Blut vorhandenen Proteins befinden

sich in den α-Granula der Blutplättchen (Torr-Brown SR. und Sobel BE.; 1993).

Simpson et al. beobachten eine Färbung von PAI-1 in Kupfferzellen der Leber,

Makrophagen der Milz und Lungen und Neurogliazellen (Simpson AJ. et al.;

1991). In vitro Studien haben gezeigt, daß die PAI-1 Expression von

verschiedenen Hormonen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, wie

Glukokortikoiden, TNF-a, Interleukin 1, transforming growth factor ß und

epidermal growth factor reguliert wird (Andreasen PA. et al; 1990),

(Krischnamurti C. et al.; 1992). Obwohl PAI-1 die Aktivität von uPA hemmt und

daraus eine protektive Funktion resultiert, gibt es bislang keinen Bericht über

hohe PAI-1-Spiegel, die mit guter Prognose des Patienten assoziiert sind

(Pedersen H. et al.; 1994 (2)), (Dano K, et al,; 1994).

PAI-2 wird von Tumorzellen, phagozytierenden Zellen und Throphoblasten

produziert. Es ist daher in hoher Konzentration im Plasma schwangerer Frauen

und in humaner Plazenta vorhanden (Pyke C. et al.; 1991, Schmitt M. et al.;

1995).

Zwischen pro-uPA und dem jeweiligen Inhibitor gibt es keine Reaktion, obwohl

beide extrazellulär gleichzeitig vorhanden sind. Erst bei Umwandlung des

Proenzyms in aktives uPA kommt es zur sofortigen Hemmung. Ein PAI kann

außerdem tPA hemmen, jedoch nicht Plasmin (Andreasen PA. et al.; 1986).

Der Rezeptor uPAR ist ein cysteinreiches Glykoprotein und wurde zuerst 1985

von Vasalli et al. beschrieben. Seine Struktur besteht aus drei homologen

repetitiven Sequenzen (Domänen I-III). Für die kovalente Bindung von uPA an

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den Rezeptor ist das aminoterminale Ende des Moleküls, die Domäne I,

verantwortlich. uPAR beschränkt die uPA-Aktivität auf die Zelloberfläche (Dano

K, et al,; 1994). Auf diese Weise wird ein effektives proteolytisches

Enzymsystem geschaffen (Schmitt M. et al.; 1995). Bastholm et al. zeigen mit

Immunelektronenmikroskopie in einer Zellkultur des Mammakarzinoms, daß

uPAR an der Zelloberfläche hauptsächlich an Zell-Zell-verbindungen lokalisiert

ist. Zytoplasmatisches uPAR befindet sich in großen Vesikeln und in

Golgi-Apparaten. Das Vorkommen des Rezeptors im Golgi-Apparat weist

darauf hin, daß die tumorösen Zellen uPAR synthetisieren (Bastholm I. et al.;

1994).

1.3.1 Das Plasminogen Aktivator Systems unter physiologischen und

pathologischen Bedingungen

Unter normalen und pathologischen Bedingungen scheint uPA am Abbau

extrazellulärer Matrixproteine bei der Wiederherstellung von Geweben beteiligt

zu sein (Dano K. et al.; 1985; Pollanen J. et al.;1991).

Entlang des Gastrointestinaltraktes wird zum Beispiel uPAR in den luminalen

Epithelzellen gebildet, die nahe den uPA-produzierenden Zellen der Lamina

propria liegen. Hier dient die Lokalisation der Bestandteile des Plasminogen

Aktivator Systems dem physiologischen Prozeß des kontinuierlichen

Abschilferns der Epithelzellen (Dano K, et al,; 1994). In Kolonkarzinomen sind

diese Moleküle unter anderem im neoplastisch veränderten Epithel exprimiert

(Naitoh H. et al.; 1995), (Pyke C. et al.; 1991), (Pyke C. et al.; 1991(2) ).

Während der Wundheilung in der Haut wird uPAR von den Keratinozyten auf

der Oberfläche der Epithelschicht gebildet, die unter die Wunde wandert. Bei

pathologischen Veränderungen der Haut wie z.B. dem Plattenepithelkarzinom

der Haut exprimieren die tumorös veränderten Keratinozyten alle drei Moleküle

(Dano K, et al,; 1994). Die Ähnlichkeit der verschiedenen Expressionsmuster

weist darauf hin, daß es sich unter physiologischen und pathologischen

Bedingungen um dieselben Mechanismen handelt. Der Hauptunterschied

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scheint in der Regulation der Prozesse zu liegen. In verschieden Tumoren

werden uPA und uPAR, aber auch die Inhibitoren entweder von Tumorzellen

oder von umgebenden Stromazellen in unterschiedlicher Art und Stärke

exprimiert (Dano K, et al,; 1994).

Abbildung 8 Plasminogen-Aktivator Kaskade modifiziert nach Verspaget et al.; 1995

Weiter klinische Ereignisse, bei denen eine erhöhte PAI-1 Aktivität zu finden ist,

sind Sepsis, Schwangerschaft, Thrombose, akuter Myokardinfarkt, u.a.

(Krischnamurti C. et al.; 1992), (Andreasen PA. et al; 1990).

Bei einigen Tumorarten ähnelt die Expression von uPAR derjenigen unter

nicht-neoplastischen Bedingungen. So enthalten zirkulierende neutrophile

Granulozyten und Monozyten uPA-und uPAR-Protein. Diese Zellen benutzen

die beiden Moleküle für ihre aktive Wanderung ins Gewebe (Dano K, et al,;

1994).

Die Mitwirkung des Plasminogen Aktivator Systems an der Invasivität solider

Tumoren wurde sowohl in histologischen Untersuchungen verschiedener

Tumoren als auch an künstlichen Basalmembranen in Zellkulturen für das

kleinzellige Bronchialkarzinom nachgewiesen (Liu G. et al.;1995). Unter den

Karzinomen, an deren invasiven Foci uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 exprimiert

Hemmstoffe:

PAI-1 & PAI-2

UPA-R

u-PA

t-PA

Aktivatoren

Plasminogen

Plasmin

Prokollagenase Kollagenase

Spaltung von:

Fibrin

Fibronectin

Laminin

Kollagenen

Tumorzelle

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werden sind zum Beispiel Magenkarzinome, Mammakarzinome,

Kolonkarzinome, verschiedenen Typen von Brochialkarzinomen und

Nierenzellkarzinome (Heiss MM.; 1995), (Bianci E. et al.; 1995), (Naitoh H. et

al.; 1995), (Pedersen H. et al.; 1994), (Pedersen H. et al.; 1994 (2)), (Del

Vecchio S. et al.; 1993), (Hofmann R. et al.; 1996).

Einige Autoren schreiben dem Plasminogen Aktivator System klinische

Bedeutung zu, da seine Parameter vereinzelt oder in ihrer Gesamtheit in

einigen Karzinomen einen prognostischen Wert zu haben scheinen. Im Hinblick

auf die damit verbundene klinische Relevanz ihrer Resultate erhoffen sich die

Verfasser einiger Studien die Entwicklung neuer adjuvanter oder

intervenierender Therapiemöglichkeiten (Verspaget HW. et al.; 1995). Zur Zeit

sind Mammakarzinome die am intensivsten untersuchten soliden Tumoren in

Bezug auf die prognostische Bedeutung von uPA und PAI-1 (Schmitt M. et al.;

1995).

Bei der immunhistochemischen Anfärbung von Mammakarzinomen ist die

Färbung der Tumorzellen Membran-und Zytoplasma-assoziiert. Bei einigen

Schnitten kann eine schwache Reaktivität stromaler Zellen (Makrophagen oder

fibroblasten-ähnliche Zellen) festgestellt werden (Del Vecchio S. et al.;

1993),(Constantini V. et al.; 1996). Die Ermittlung der Antigenspiegel mittels

ELISA beim Mammakarzinom ergibt für hohe uPAR-Spiegel die Verbindung mit

einer schlechten Prognose, ein insgesamt noch stärkerer prognostischer Faktor

ist jedoch uPA (Duggan C. et al.; 1995).

Über die Signifikanz von uPAR-Spiegeln in Tumorgewebe in Bezug auf die

individuelle Prognose des Patienten wurde erstmals bei der Untersuchung von

Plattenepithelkarzinomen der Lungen mittels ELISA berichtet (Pedersen H. et

al.; 1994 (2)).

Heiss et al. beurteilen PAI-1, uPA und uPAR als neue funktionelle

Risikofaktoren in Magenkarzinomen. Besonders PAI-1 wird in ihren

immunhistochemischen Untersuchungen als ein neuer unabhängiger Marker

zur Erkennung von Hochrisikopatienten nach Tumorresektion verstanden. Es

fand sich allerdings keine signifikante Assoziation zwischen PAI-2 und einer

schlechten klinischen Prognose (Heiss MM.; 1995).

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Bei einem Vergleich zwischen der tPA-und der uPA-Expression in

Magenkarzinomen stellte sich ein niedriger tPA-Spiegel als unabhängiger

prognostischer Marker heraus, der mit einer kürzeren Überlebenszeit der

Patienten assoziiert ist. Bei der Erfassung von uPA weist dagegen ein erhöhter

Antigenspiegel auf eine schlechte Prognose des Patienten hin (Ganesh S. et

al.; 1996).

In Kolonkarzinomen wird uPA im Zytoplasma der Tumorzellen produziert

(Naitoh H. et al.; 1995). uPA mRNA wird auch in Fibroblastenähnlichen

Strukturen des Tumorstromas gefunden. In den invasiv wachsenden

Tumordrüsen ist uPAR-mRNA in einigen Epithelzellen nachweisbar (Pyke C. et

al.; 1991(2) ). UPAR ist in wenigen neutrophilen Granulozyten und

Makrophagen vorhanden (Pyke C. et al.; 1991(2) ). PAI-1 ist in den

umgebenden Fibroblasten und Gefäßendothelzellen lokalisiert und PAI-2

ebenfalls in den Tumorzellen (Naitoh H. et al.; 1995), (Pyke C. et al.; 1991).

In Kolorektalen Karzinomen sind hohe uPA und hohe PAI-2-Spiegel ein

Hinweis auf ein kurzes Überleben. Außerdem ist das Verhältnis von uPA zu tPA

erhöht (Verspaget HW. et al.; 1995). Das Vorkommen der Parameter des

Plasminogen Aktivator Systems in malignen Tumoren des unteren

Respirationstraktes fällt unterschiedlich aus.

In den normalen Zellen der Bronchialschleimhaut wiesen Gris et al. tPA, uPA,

PAI-1 und PAI-2 nach. Die Anwesenheit von Aktivator und Inhibitor unter

nicht-malignen Bedingungen deutet die Notwendigkeit eines molekularen

Äquilibriums der beiden Stoffe an für die Regulation des fibrinolytischen

Systems. Im Gegensatz zu den Ergebnissen in der normalen Schleimhaut sind

die bronchogenen Tumoren charakterisiert durch einen allmählichen Verlust

ihrer spezifischen Anfärbbarkeit für PAI-1 und -2. Während Adenokarzinome

und Plattenepithelkarzinome der Lunge anfärbbar sind, werden die beiden

Inhibitoren in Kleinzellern, den Tumoren mit der schlechtesten Prognose, nicht

entdeckt (Gris JC. et al.; 1993).

Nagayama et al. fanden uPA, PAI-1 und PAI-2-Spiegel signifikant höher im

Tumorgewebe von nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen als im gesunden

Einleitung

Seite 21

Gewebe. Immunhistochemische Untersuchungen am transplantierbaren

Lewis-Lungen Karzinom haben gezeigt, daß uPA in Gebieten invasiven

Wachstums exprimiert wird und die uPA-vermittelte Proteolyse von den

Tumorzellen selbst reguliert wird. Sie fanden in der Peripherie des Tumors, das

heißt an Stellen stark destruktiven Wachstums eine hohe uPA und eine

niedrige PAI-1-Immunreaktivität (Kristensen et al., 1990). Bei der Bestimmung

des uPA-Spiegel im pulmonalen Adenokarzinom mit ELISA fand sich dagegen

keine Assoziation zur Prognose. PAI-1 erweist sich als unabhängiger

prognostischer Faktor, denn hohe Antigenspiegel bedeuten für den Patienten

ein kurzes Überleben (Pedersen H. et al.; 1994). Die Bestimmung hoher

uPAR-Spiegel in Plattenepithelkarzinomen der Lunge mittels ELISA korreliert

jedoch signifikant mit kurzer Überlebenszeit der Patienten, während die

uPA-und PAI-1-Spiegel keinen prognostischen Wert in dieser Patientengruppe

hatt. Allerdings ist die Kombination von hohen uPAR-mit hohen PAI-1-Spiegeln

mit kurzem Überleben assoziiert (Pedersen H. et al.; 1994 (2)). Im

Nierenzellkarzinom wird PAI-1 in Tumorzellen und Endothelzellen angefärbt

und sowohl der mRNA-Gehalt als auch der Proteinspiegel im ELISA sind

signifikant höher als in normalem Gewebe (Wagner SN. et al.; 1996).

In fortgeschrittenen Ovarialkarzinomen färben sich bei der

immunhistochemischen Anfärbung mit den auch in dieser Arbeit verwendeten

Antikörpern gegen uPA, PAI-1 und PAI-2 die Tumorzellen stark an und ebenso

einige Stromazellen. In den benignen Tumoren des Ovars reagieren nur einige

Stromazellen (Schmalfeldt B. et al.; 1995).

1.4 Histopathologische Untersuchung smethod en

Die Mehrzahl der Proben aus Lungentumoren, die der Pathologischen

Bewertung unterzogen werden stammen aus Sputum, Aspiraten und Biopsien.

Die spezifische Diagnose wird in der Routine des Pathologen anhand

histologischer und zytologischer Präparate gestellt. Ergänzend können unter

anderen labortechnischen Möglichkeiten immunhistochemische

Untersuchungen sinnvoll sein.

Einleitung

Seite 22

1.4.1 Die Immunhistochemische Untersuchung

Immunhistochemische Techniken haben den Vorteil, daß sie die

mikroanatomische Verteilung der Proteine aufdecken, die sowohl von normalen

als auch von Tumorzellen exprimiert werden (Constantini V. et al.; 1996).

1.4.2 Die ABC-Methode

Diese Technik basiert auf der Fähigkeit des Eiweißglykoproteins Avidin, 4

Moleküle des Vitamins Biotin physikalisch zu binden. Als Reagenz wird erstens

ein spezifisch gegen das zu bestimmende Antigen gerichteter Primärantikörper

benötigt. Zweitens ist ein mit Biotin konjugierter Sekundärantikörper notwendig,

der als „Brücke“ zwischen dem enzymgekoppelten Avidin und dem

Primärantikörper fungiert. Dabei bindet das Avidin mit seinen freien Stellen an

das Biotin. Das Enzym Peroxidase reagiert mit dem Chromogen

(3-Amino-9-Ethylcarbazol), welches an der Stelle des gesuchten Antigens

präzipitiert. Um falsch positive Ergebnisse zu verhindern muß die endogene

Peroxidase des Schnittes vor Beginn der eigentlichen Färbung mit 0,3% H2O2

blockiert werden. Dabei bildet die Hämguppe als Aktivitätszentrum dieses

Enzyms einen Komplex mit Wasserstoffperoxid, der unter Abspaltung von

Wasser und atomarem Sauerstoff zerfällt. Das Prinzip der Unterdrückung der

Peroxidase besteht somit im Vorhandensein eines Substratüberschusses bei

gleichzeitigem Fehlen eines Elektronendonors (z.B. chromogene Substanz).

Zellen und Zellkomponenten, die kein Antigen enthalten, werden durch die

Gegenfärbung im Kontrast dargestellt (Bourne, JA.; 1990).

1.5 Problemstellung

Die Rolle des Plasminogen-Aktivator-System bei der tumorassoziierten

Proteolyse wurde in den letzten Jahren in einer Reihe von Studien mit Hilfe

verschiedener histologischer Methoden und Beobachtungen in Zellkulturen

untersucht. Dabei wurden die Parameter dieses Enzymsystems auf ihre

klinische Relevanz in Bezug auf die Prognose der Patienten getestet. In der

Literatur finden sich Publikationen zu Karzinomen der Mamma, des

Gastrointestinaltraktes, der Nieren, der Ovarien und der Lungen. In dieser

Arbeit wurde die immunhistochemische Bewertung der zellulären Verteilung

von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 in formalinfixierten und in Paraffin

Einleitung

Seite 23

eingebetteten Gewebeschnitten von kleinzelligen Bronchialkarzinomen

durchgeführt, um das Muster der Koexpression von Aktivatoren und Inhibitoren

aufzuklären. Das Ziel der Untersuchungen war, den Grad der Expression der

vier Moleküle mit dem biologischen Verhalten des Tumors zu korrelieren und

die Bedeutung des Plasminogen-Aktivator-System für diese histologischen

Gruppe von Lungentumoren festzustellen. Bislang gibt es nur eine Studie, die

einen Überblick über die immunhistochemischen Reaktionen aller vier Proteine

im kleinzelligen Bronchialkarzinom im Vergleich zu drei anderen Subtypen

liefert.

Material und Methoden

Seite 24

2 Material und Method en

2.1 Untersuchung smaterial

Die in dieser Arbeit untersuchten Lungentumoren stammten aus

Lungenresektaten aus den Jahren 1992 bis 1994 aus der Abteilung für

Thoraxchirurgie der Ruhrlandklinik Essen. Die Proben wurden zur

histologischen Diagnosestellung, Einteilung des Differenzierungsgrades und

Bewertung des Lymphknotenstatus sowie zur Durchführung spezieller

Untersuchungstechniken an die Abteilung für Pathologie der Ruhr-Universität

Bochum weitergeleitet.

Es wurden die Gewebeproben von 26 Patienten ausgewählt, die sich im

Zeitraum von Juli 1992 bis Februar 1994 der Resektion eines Lungenflügels

oder Lungenlappens unterzogen hatten. Der histopathologische Bericht ergab

für 26 Patienten die Diagnose eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms. Das Alter

der Patienten lag zwischen 46 und 76 Jahren, das Durchschnittsalter somit bei

60 Jahren. Die Geschlechterverteilung betrug 20 : 6 zugunsten der männlichen

Patienten. Dies entspricht einem Anteil von 77 % für das männliche

Patientengut und einem Anteil von 23 % für das weibliche. Nach der

modifizierten WHO-Klassifikation von 1981 wiesen 17 Patienten mit

kleinzelligem Bronchialkarzinom den intermediären Zelltyp auf, 6 Patienten den

Haferkorntyp und 3 konnten keinem Subtyp zugeordnet werden.

2.2 Geräte

• Mikrotom

• Feuchte Kammern

• Lichtmikroskop (Olympus, Japan)

• Objektiv (40x)

• Okular (10x) mit Zählraster

Material und Methoden

Seite 25

2.3 Chemiekalien

• Paraffin

• Formalin

• Xylol

• Alkohol (100%, 95%, 70%, 50%, 30%)

• Pufferbad aus gebrauchsfertigem PBS-Pulver (Sigma Diagnostics, St. Louis,

USA) gelöst in 1l Aqua dest.

• Aqua dest.

• 0,3% H2O2 (routinemäßig im Labor des Institutes hergestellt aus 970 ml PBS

und 60 ml H2O2)

• gebrauchsfertiges Normalserum/ Blocking Solution (10% Non-immune Goat

Serum), Flasche Nr. 1A des Histostain SP Kit/ Broad Spectrum von Zymed,

San Francisco, Kalifornien, USA

• Monoklonaler Antikörper gegen humane Urokinase/ uPA (Produkt #3689 von

American Diagnostica Inc.)

• Monoklonaler Antikörper gegen humanen u PA Rezeptor/ CD 87 (Produkt

#3936 von American Diagnostica Inc.)

• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor

Typ 1/ PAI-1 (Produkt #3785 von American Diagnostica Inc.)

• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor

Typ 2/ PAI-2 (Produkt #3750 von American Diagnostica Inc.)

• gebrauchsfertiger biotinylierter Sekundärantikörper/ IgG (Goat anti-mouse,

Rabbit, Guinea Pig & Rat), Flasche Nr. 1B des Histostain SP Kit

• gebrauchsfertiges Streptavidin-Peroxidase-Konjugat, Flasche Nr. 1C

• AEC-Substrate Kit von Zymed, San Francisco, USA (bestehend aus

Reagenz A: Substratpuffer, 20x; Reagenz B: AEC-Chromogen, 20x und

Reagenz C: 0,6% Wasserstoffperoxid, 20x)

• Hämalaun

2.4 Antikörper

• Monoklonaler Antikörper gegen humane Urokinase/ uPA (Produkt #3689 von

American Diagnostica Inc.): Es handelt sich um einen monoklonalen

Material und Methoden

Seite 26

Anti-Maus-Antikörper der Subklasse IgG1. Der Antikörper ist gegen ein

Epitop auf der ß-Kette von uPA in der Nähe des enzymatischen Zentrums

gerichtet. Er reagiert sowohl mit freiem als auch rezeptorgebundenem

pro-uPA und uPA (Kobayashi H. et al.; 1991). Das Produkt #3689 färbt

nachweisbar Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte von

tumorösem und normalem Mamma-bzw. Kolongewebe, in dem Urokinase

vorhanden ist (Sier CFM. et al.; 1991), (Jankun J. et al.; 1993). Gemäß

Anleitung des Herstellers wurde das in lyophilisierter (pulverisierter) Form

gelieferte Produkt mit Aqua dest. zu einer Lösung wiederaufbereitet. Diese

wurde dann mit 0.02% NaN3 versetzt, um eine längere Haltbarkeit zu

erzielen. Das Produkt wurde bei +2° bis +8° C gelagert. Für die

immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper mit PBS auf 1: 100

verdünnt. Zuvor war eine Testreihe mit den Verdünnungen 1: 100, 1: 500

und 1: 1000 durchgeführt worden.

• Monoklonaler Antikörper gegen humanen u PA Rezeptor/ CD 87 (Produkt

#3936 von American Diagnostica Inc.): Es handelt sich um einen

monoklonalen Anti-Maus-Antikörper der Subklasse IgG2a. Dieser erkennt

den humanen Urokinase-Rezeptor (uPAR) (Mohanam S, et al.; 1993). Die

uPA-Rezeptoren können sowohl an Oberflächen gebundene, als auch

intrazelluläre als auch lösliche Formen sein (Chucholowski N. et al.; 1992).

Das Produkt #3936 färbt nachweisbar formalinfixierte und in Paraffin

eingebettete Schnitte von Mammakarzinomen (Jankun J. et al.; 1993), (Del

Vecchio S. et al.; 1993). #3936 färbt uPAR auf der Plasmamembran und im

Zytoplasma (Chucholowski N. et al.; 1992). Bei der Aufbereitung und

Lagerung des Produktes wurde wie bei dem Antikörper gegen uPA

verfahren. Für die immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper

gegen uPAR mit PBS auf 1: 25 verdünnt, nachdem zuvor eine Testreihe mit

den Verdünnungen 1: 25, 1: 50 und 1: 100 durchgeführt worden war.

• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor

Typ 1/ PAI-1 (Produkt #3785 von American Diagnostica Inc.): Es handelt

sich um einen monoklonalen Anti-Maus- Antikörper der Subklasse IgG1.

Material und Methoden

Seite 27

Dieser entdeckt freies und komplexiertes PAI-1 (Heiss MM.; 1995) und wird

vom Hersteller ebenfalls zur Färbung von paraffineingebetteten Schnitten

empfohlen (Jankun J. et al.; 1993),(Nielsen LS. et al.; 1986). Das Produkt

wurde zu einer Lösung aufbereitet, mit NaN3 versetzt und in kleinen

Portionen zu jeweils 25 µl eingefroren. Zum Zeitpunkt der Färbung wurden

einzelne Portionen vorsichtig aufgetaut, um häufige Einfrier-Auftau-Zyklen

zu vermeiden. Für die immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper

mit PBS auf 1: 50 verdünnt. Ausgetestet worden waren zuvor die

Verdünnungen 1: 10, 1: 25 und 1: 50.

• Monoklonaler Antikörper gegen humanen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor

Typ 2/ PAI-2 (Produkt #3750 von American Diagnostica Inc.): Es handelt

sich um einen monoklonalen Anti-Maus-Antikörper der Subklasse IgG2a.

Dieser ist gegen humanes PAI-2 gerichtet (Heiss MM.; 1995), (Astedt B. et

al.; 1985). Die Wiederaufbereitung und Lagerung erfolgten wie bei PAI-1.

Für die immunhistochemische Färbung wurde der Antikörper gegen PAI-2

mit PBS auf 1: 20 verdünnt. Die Testreihe war mit den Verdünnungen 1: 10,

1: 25 und 1: 50 durchgeführt worden. Dabei hatte sich die Verdünnung 1: 10

als optimal erwiesen, war jedoch in Hinblick auf die für diese

Antikörperkonzentration benötigte Menge des Produktes nicht zu realisieren

gewesen.

Material und Methoden

Seite 28

2.5 Untersuchung smethod e

Einbettung des Gewebes und Herstellung der Schnitte

Es wurden Gewebestücke aus Resektaten in Formalin fixiert, dehydriert und in

Paraffin eingebettet. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden

die Paraffinblöcke, bei denen in der H.E.-Färbung Tumorgewebe nachgewiesen

worden war, mit einem Mikrotom in 4µm dicke Schichten geschnitten und im

40° C warmen Wasser auf beschichtete Objektträger aufgezogen. Die

präparierten Objektträger wurden mit dem entsprechenden Antikörper

beschriftet und über 24 h im Brutschrank bei 37° C getrocknet.

Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte

Zunächst erfolgte die Fixierung des Gewebes in einem Formalinbad für 10

Minuten. Hierauf wurden die Schnitte zur Entparaffinierung für 30 Minuten in

ein frisches Xylolbad eingelegt. Nach vollständiger Entfernung des

Einbettungsmediums wurden die Gewebeproben in einer absteigenden

Alkoholreihe, beginnend mit absolutem Alkohol, über 95%igen, 70%igen,

50%igen bis zu 30%igem Alkohol für jeweils 10 Minuten rehydriert. Schließlich

wurden die Objektträger für 5 Minuten in einem Pufferbad gespült.

Immunhistochemische Färbung der Schnitte

Die immunhistochemische Färbung wurde mit der im Labor des Institutes

routinemäßig angewandten Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC)

durchgeführt.

Die Präparate wurden mit 0,3%iger H2O2 für 15 Minuten vorbehandelt, um die

endogene peroxidatische Aktivität der Peroxidase zu blockieren. Der letzte

Schritt vor Beginn der eigentlichen Immunhistochemischen Färbung bestand in

einer weiteren Spülung in PBS für 5 Minuten. Die Objektträger wurden aus dem

Bad herausgenommen und um die Gewebeproben herum kreisförmig mit

Material und Methoden

Seite 29

einem Fettstift markiert. Nach Abtupfen überschüssiger Flüssigkeit mit

absorbierendem Zellstoff um die Präparate herum folgte die Ablage der

Objektträger in eine feuchte Kammer. Die Schnitte wurden sofort mit 1-2

Tropfen des gebrauchsfertigen Normalserums für 10 Minuten bei

Raumtemperatur vorinkubiert. Dies geschah zur Unterdrückung einer

unspezifischen Hintergrundfärbung, die sich aufgrund von Bindungen an stark

geladene Bindegewebskomponenten hätte ergeben können. Nach dieser

Einwirkzeit wurden die Schnitte nicht gespült, sondern die überschüssige

Flüssigkeit wurde nur abgegossen. Es wurde nun jedes Präparat mit ca. 200 µl

des jeweiligen Primärantikörpers bei Raumtemperatur inkubiert. Die

Inkubationszeit betrug für uPA 60 Minuten, für uPAR 90 Minuten und für PAI-1

und PAI-2 jeweils 110 Minuten. Danach kamen die Objektträger für 5 Minuten

in das Pufferbad, wurden wieder um die Proben herum abgetupft und für 10

Minuten mit dem gebrauchsfertigen biotinylierten Sekundärantikörper benetzt.

Nach einer 5 minütigen Spülung in PBS wurde das gebrauchsfertige

Streptavidin-Peroxidase-Konjugat aufgetropft, welches für 10 Minuten einwirken

mußte. Der Spülung in PBS folgte das Auftragen des AEC-Chromogens als

Substratlösung, welche zuvor angesetzt worden war. Hierzu benötigte man für

jeweils 10 Schnitte je 1 Tropfen der Reagenzien A, B und C gemischt mit 1 ml

Aqua dest. Die Einwirkzeit des Chromogens betrug ebenfalls 10 Minuten.

Anschließend wurden die Schnitte mehrmals in verschiedenen PBS-Behältern

gespült und zur Gegenfärbung für 3 Sekunden in Hämalaun eingetaucht.

Darauf wurden die Objektträger nacheinander in 4 kleine Küvetten mit

Leitungswasser gehalten und zum Bläuen schließlich für 10 Minuten in der

letzten Küvette belassen. Die Präparate wurden mit jeweils 2 Tropfen

erwärmter d.h. flüssiger Glycerin-Gelatine und Aqua dest. eingedeckelt.

Mikroskopie der gefärbten Schnitte

In der Übersicht wurde ein geeigneter Bereich für die Beurteilung der

angefärbten Tumorzellen aufgesucht. Dabei war zu beachten, daß die Dicke

der Zellagen möglichst gering war und die Anfärbung der Tumorzellen

gleichmäßig war. Im Falle einer fleckförmigen Anfärbung wurde sowohl in dem

Material und Methoden

Seite 30

Fleck als auch in der Peripherie gezählt. Es wurden 10 Gesichtsfelder bei

höchster Vergrößerung (400x) unter Zuhilfenahme eines Zählrasters

ausgezählt. Die Zählung wurde von einem erfahrenen Pathologen wiederholt

und das Ergebnis bestätigt.

Bei einigen Schnitten wurde zusätzlich zur prozentualen Verteilung der

Anfärbung die Intensität bewertet. Die Intensität wurde in vier Kategorien, von

nicht angefärbt bis stark angefärbt, eingeteilt.

2.6 Statistische Method en

Die bei den immunhistochemischen Methoden und deren Auswertung

gewonnenen Ergebnisse wurden mit Hilfe statistischer Methoden ausgewertet.

Von jedem ermittelten Wert wurde ein arithmetisches Mittel errechnet und wenn

es sich um eine Normalverteilung handelte auch die Standardabweichung. Dies

war nur bei der Auswertung der Altersverteilung möglich.

Die Auswertung der Abhängigkeiten der einzelnen Antikörper untereinander

und der Vergleich der Anfärbungen mit dem durchschnittlichem Überleben der

Patienten erfolgte mit dem Korrelationskoeffizienten nach Bravais-Pearson.

Auch der statistische Vergleich zwischen Anfärbehäufigkeit und Färbeintensität

wurde mit Hilfe dieses Korrelationskoeffizienten ermittelt. Werte die nicht in

einer Intervallskala vorlagen konnten mit dieser statistischen Methode

allerdings nicht ausgewertet werden.

Bei der Auswertung wurden die Ergebnisse auf Abhängigkeiten der Antikörper

untereinander und in Hinblick auf ihre Prognose untersucht. Kombinationen der

Antigenexpression und deren Abhängigkeit zur Prognose der Erkrankung

wurden nicht auf eine statistische Abhängigkeit hin untersucht, da für einen

solchen Vergleich die Anzahl der getesteten Personen zu gering war.

Ergebnisse

Seite 31

3 Ergebnisse

Bei den Untersuchungen wurden die histologischen Präparate von 26 Patienten

mit einem kleinzelligem Bronchialkarzinom immunhistochemisch untersucht.

20 der Patienten waren Männer und 6 waren weiblich. Das entspricht einer

Geschlechterverteilung von 77% zugunsten der Männer und 23 % Frauen.

Das Alter der Patienten reichte von 46 bis 76 Jahren. Das durchschnittliche

Alter der Untersuchungsgruppe betrug 60 Jahre. Die Alterswerte streuen mit

einer Standardabweichung von 9 Jahren um den Mittelwert. Zwischen den

erkrankten Männern und Frauen ist kein signifikanter Altersunterschied

erkennbar.

Von den 26 Patienten hatten 17 ein zentral oder zentral bis intermediär

lokalisiertes Bronchialkarzinom. Bei den übrigen 9 Patienten befand sich die

Tumormasse in peripheren Segmenten oder intermediär bis peripher lokalisiert.

Von den 26 Patienten waren 24 dokumentiert. Der Krankheitsverlauf von zwei

Patienten war nicht mehr zu eruieren. Von diesen 24 verbliebenen Patienten

waren zum Zeitpunkt der Erhebung 15 verstorben. Es gab 9

Langzeitüberlebende. Das entspricht einem Verhältnis von 62,5% Verstorbener

zu 37,5% Überlebender.

Bei den lichtmikroskopischen Auswertungen wurden von jedem Präparat der

prozentuale Anteil der angefärbten Zellen an der Gesamtzellzahl ermittelt.

Der Antikörper uPA zeigte im Durchschnitt eine 25,2 prozentige Anfärbung der

Zellen. Der maximale, diesem Antikörper zuzuordnende Wert betrug 96%. Eins

der Präparate zeigte keine Reaktion. Dieser Antikörper zeigte in insgesamt vier

der 26 Präparaten eine deutliche stärkere Anfärbung in fleckiger Anordnung.

Diese wurde besonders berücksichtigt und ausgewertet. Dabei fand sich in den

Ergebnisse

Seite 32

fleckförmigen Arealen eine zwischen 1,4 und 11,4 mal stärkere Anfärbung der

Zellen als in anderen Bezirken des Tumors. Eine signifikante Korrelation

zwischen einer fleckförmigen Anfärbung und anderen Parametern der

Untersuchung ist nicht zu erkennen.

Bei elf der mit Antikörper gegen uPA untersuchten Tumoren wurde nicht nur

der Anteil der angefärbten Zellen ermittelt, sondern auch deren Farbintensität.

Für den Antikörper gegen uPA läßt sich feststellen, daß eine schwache

Beziehung zwischen der Anfärbung und deren Intensität besteht. Dies ergibt

sich aus dem Koeffizienten nach Bravais-Pearson von 0,64.

Bei einem Vergleich von uPA-Spiegeln über 60% mit der Überlebenszeit der

Patienten ist zu erkennen, daß 3 von vier Patienten bereits verstorben waren.

Der Langzeitüberlebende zeigte keine Hinweise auf Rezidive oder Metastasen.

Abbildung 9 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxyilin, Originalvergrößerung 400 fach,

starke Anfärbung des Zytoplasmas der Tumorzellen mit Antikörper gegen uPA

Bei der Untersuchung auf die Reaktivität von uPAR war eine durchschnittliche

Anfärbung von 43,2 % festzustellen mit einem Maximum von 86 %. Auch in

dieser Gruppe war einer der 26 Patienten als negativ einzustufen. Ebenso

wurde in dieser Gruppe nicht nur die prozentuale Anfärbung, sondern in 16

Ergebnisse

Seite 33

Fällen deren Intensität ermittelt. Aus dem Vergleich der beiden Parameter

ergibt sich ein Bravis-Pearson Wert von 0,75. Dieser Wert bedeutet das

Vorhandensein einer starken Abhängigkeit zwischen den Parametern

prozentuale Anfärbung und Färbeintensität.

8 der Patienten dieser Gruppe hatten einen uPAR Spiegel über 60%. Von

denen waren zum Untersuchungszeitpunkt die Hälfte verstorben.

Abbildung 10 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxyilin, Originalvergrößerung 400 fach,

starke Zytoplasmaanfärbung mit Antikörper gegen uPAR/ CD 87

Präparate der Gruppe mit PAI-1-Reaktion zeigten eine durchschnittliche

Anfärbung von 41,5%. Der maximale Wert betrug 86% und der kleinste

gemessene Wert lag bei 11%. Alle Gewebeschnitte dieser Gruppe zeigten eine

positive Reaktion. Bei 24 der 26 Patienten wurde auch die Färbeintensität

ermittelt. Bei der Berechnung des Korrelationskoeffizienten nach Bravais-

Pearson ergab sich ein Wert von 0,6 was einer nur schwachen Abhängigkeit

entspricht. Ebenso wie in der Gruppe der mit dem Antikörper gegen uPAR

untersuchten Proben waren zum Untersuchungszeitpunkt bereits 50% der

Patienten verstorben, die eine erhöhten Meßwert mit über 60% Anfärbung

zeigten.

Ergebnisse

Seite 34

Abbildung 11 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 50 fach,

homogene Anfärbung der Tumorzellverbände mit Antikörpern gegen PAI-1

Abbildung 12 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 400 fach,

deutliche Anfärbung des Zytoplasmas einzelner Tumorzellen mit Antikörper gegen PAI-1

Ergebnisse

Seite 35

Abbildung 13 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 400 fach,

starke Reaktion einzelner Zellen mit Antikörper gegen PAI-2

Abbildung 14 ABC-Methode, Gegenfärbung Hämatoxylin, Originalvergrößerung 400 fach,

regelmäßige geringergradig ausgeprägte Reaktion des Tumors mit Antikörper gegen PAI-2

Ergebnisse

Seite 36

Die Untersuchungen mit dem Antikörper gegen PAI-2 zeigten eine maximale

Anfärbung von 77% der Zellen, aber auch in 2 Fällen eine negative Reaktion.

Die durchschnittliche Anfärbung lag bei 24 % der Gesamtzellzahl. Die

Aufzeichnung der Färbeintensität bei 16 Patienten dieser Gruppe ergab keine

Abhängigkeit für diesen Antikörper. Auffallend war, daß alle Patienten mit einer

hohen Anfärbung über 60% verstorben waren.

Insgesamt war die Spannbreite in der prozentualen Anfärbung bei allen

Kollektiven und Parametern außerordentlich hoch und schwankte zwischen 0

und 96%.

Bei keiner der negativen Proben zeigte sich gleichzeitig eine zweite negative

Reaktion mit einem anderen Antikörper.

Die Beobachtungen über einen Zeitraum von 3 Jahren ergaben 9

Langzeitüberlebende. Bei 2 Patienten ist der Verbleib nicht mehr zurück zu

verfolgen. Die längste Überlebenszeit zum Zeitpunkt der Untersuchungen

betrug 60 Monate bei den Langzeitüberlebenden und die kürzeste ermittelte

Überlebenszeit lag bei 41 Monaten. Die 15 bereits verstorbenen Patienten

hatten eine maximale Überlebenszeit von 42 Monaten und ein Minimum bei 2

Monaten.

Zwischen der Überlebenszeit und der Antikörperexpression ist kein signifikanter

Unterschied festzustellen. Dies gilt für jeden der verwendeten Antikörper. Die

Bravais-Pearson-Werte lagen dabei zwischen 0,07 und 0,19.

Ergebnisse

Seite 37

Vergleich der Antikörper untereinander:

uPA uPAR PAI-1 PAI-2

uPA - 0,36 0,63 0,06

uPAR 0,36 - 0,51 0,37

PAI-1 0,63 0,51 - 0,09

PAI-2 0,06 0,37 0,09 -

Tabelle 1 Die Tabelle zeigt die Korrelation d er einzelnen Antikörper untereinander.

Aufgeführt sind d ie Bravais-Pearson-Korrelationskoeff izienten:

Mit einem Bravais-Pearson-Korrelationskoeffizienten von 0,63 besteht

zwischen der Anfärbung mit PAI-1 und uPA eine schwache bis mäßige

Abhängigkeit. Der Wert von 0,51 zwischen uPAR und PAI-1 ist ebenfalls als

geringfügige Abhängigkeit der beiden Antikörper voneinander zu bewerten.

Zwischen allen anderen Kombinationen bestehen keine signifikanten

Abhängigkeiten (Tabelle 1).

Bei einem Vergleich zwischen der Tumorgröße und der Expression der

verschieden Antigene ist keine signifikante Abhängigkeit nachzuweisen.

Diskussion

Seite 38

4 Diskuss ion

4.1 Diskuss ion d er Ergebnisse

Von den 26 untersuchten Patienten waren 20 der Patienten Männer und

6 Frauen. Das entspricht einer Geschlechterverteilung von 77% zugunsten der

Männer und 23 % Frauen. Diese Geschlechterverteilung von 2,4: 1 entspricht

der Verteilung in der Klinik. Auch hier finden sich gehäuft männliche Patienten

mit einem kleinzelligen Bronchialkarzinom. Es ist allerdings zu berücksichtigen,

daß die älteste Gewebeprobe aus 1992 stammte und die jüngste aus 1994 und

daher das Geschlechterverhältnis der in diesem Zeitraum üblichen Quote

entspricht.

Das durchschnittliche Alter der untersuchten Personen betrug 60 Jahre. Auch

dieser Wert läßt sich mit dem Manifestationsalter des Patientengutes im

Krankenhaus gut in Übereinstimmung bringen (Colby T. et al.; 1994). Zwischen

den erkrankten Männern und Frauen ist sowohl in der Klinik als auch in dieser

Untersuchung kein signifikanter Altersunterschied erkennbar.

Bei 24 der 26 Patienten war es möglich, deren Krankheitsverlauf weiter zu

verfolgen. Von diesen 24 Patienten waren zum Zeitpunkt der Erhebung 15

verstorben. Das bedeutet, daß bereits innerhalb von 3,5 Jahren 67,5 % der an

einem kleinzelligen Bronchialkarzinom erkrankten Patienten verstorben sind.

Die 5-Jahres-Überlebensrate für Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom

beträgt 2-10% (Colby T. et al.; 1994). Die im Patientengut dieser Arbeit

ermittelte Zahl von 32,5% in 3,5 Jahren ist höher als normalerweise bei diesem

hochmalignen Tumor zu erwarten wäre. Der Grund für diese Diskrepanz liegt

möglicherweise in der zu geringen Zahl verfolgter Erkrankungsfälle.

Andererseits fehlen bis zum Erreichen eines Überlebens von 5 Jahren noch 1,5

Jahre, in denen die Prozentzahl stark sinken könnte.

Bei allen vier Antikörpern war eine Immunreaktivität der Tumorzellen zu

beobachten, deren Spannbreite jedoch stark variierte. Die verwendeten

Diskussion

Seite 39

monoklonalen Antikörper waren zwar in den meisten Fällen in der Lage, die

gesuchten Antigene sichtbar zu machen, es ließ sich allerdings keine

einheitliche Reaktivität erkennen und keine signifikante Abhängigkeit der

Expression von uPA, uPA-R, PAI-1 und PAI-2 von der Überlebensdauer

nachweisen. Folglich konnte in dieser Arbeit keinem der untersuchten

Parameter ein prognostischer Wert für den klinischen Verlauf des kleinzelligen

Bronchialkarzinoms zugeschrieben werden. Aufgrund vieler Experimente an

anderen Tumoren wäre ein Zusammenhang zwischen Antigenexpression und

Prognose zu erwarten gewesen. Dabei ist die Art des Tumors, das

Ausgangsorgan und die Lokalisation zu berücksichtigen.

In Mammakarzinomen lassen hohe uPAR-Spiegel auf einen negativen

Ausgang der Erkrankung schließen (Duggan C. et al.; 1995), insgesamt halten

die Autoren aber uPA für den stärkeren prognostischen Faktor. Del Vecchio et

al. unterstützen die Hypothese, daß uPAR in der Mamma eine zentrale Rolle

beim Erwerb eines malignen Phänotyps spielt, da die stärkste

Immunperoxidasefärbung an invasiven Foci zu erkennen ist. Sie stellen den

Rezeptor als geeigneten prognostischen Faktor für das Mammakarzinom dar.

Weiter Autoren bestätigen uPAR als pathologisches Merkmal und weisen auf

eine gleichzeitige Überexpression des Plasminogenaktivators vom

Urokinase-Typ und PAI-1 in destruktiv wachsenden Tumoren hin (Jankun J. et

al.; 1993), (Constantini V. et al.; 1996). Die tPA-Expression scheint nicht mit

Kennzeichen von Malignität assoziiert zu sein. Bianchi et al. erklären die

Produktion von PAI-1 durch das Tumorstroma in der Mamma als einen

Schutzmechanismus des Tumors selbst vor unkontrollierter Proteolyse.

Weiterhin ist PAI-1 ein unabhängiger neuer Marker in Magenkarzinomen zur

Erkennung von Hochrisikopatienten nach Tumorresektion. PAI-1 wird hier als

aussagekräftiger als uPA beurteilt. (Heiss MM.; 1995), (Ganesh S. et al.; 1996).

In Nierenzellkarzinomen scheint PAI-1 wie im Magen das zuverlässigste

Merkmal für die Vorhersage eines frühen Rezidivs zu sein, denn der

Antigenspiegel korreliert charakteristisch mit der Entwicklung von Metastasen

(Hofmann R. et al.; 1996). Den Zusammenhang zwischen Tumor-assoziierten

Diskussion

Seite 40

Enzymsystemen und Metastasierung bestätigen Schmalfeldt et al. mit ihren

immunhistochemischen Untersuchungen an Ovarialkarzinomen, in denen sie

einen simultanen Anstieg der Aktivator-und Inhibitor-Konzentrationen in

Tumorgewebe und in Metastasen im Omentum majus beobachteten

(Schmalfeldt B. et al.; 1995).

Beim Vergleich dieser Studien fällt die Gewichtung von PAI-1 als unabhängiger

prognostischer Faktor in vielen Karzinomen auf. Es gibt bislang keinen Bericht

über hohe PAI-1-Spiegel, die mit einer guten Prognose des Patienten assoziiert

sind. Die Rolle von PAI-2 in der Tomorprogression bleibt dagegen unklar. Heiss

et al. fanden keine signifikante Assoziation zwischen hohem PAI-2-Gehalt und

malignen Merkmalen. Nagayama et al. fanden dagegen hohe PAI-2-Spiegel

und eine starke Abhängigkeit zwischen PAI-2 und uPA in Fällen ohne

Lymphknotenmetastasen. Daraus schließen sie, daß die Freisetzung von PAI-2

als Antwort auf angestiegenes uPA in Lymphknoten-positiven Fällen gestört ist

und somit ein niedriger PAI-2 Gehalt mit einer Metastasierung in die

Lymphknoten assoziiert ist (Nagayama M.; 1994). Astedt et al. sehen eine

physiologische Signifikanz im Vorkommen des Proteins in der Plazenta zum

Schutz vor Blutungen (Astedt B. et al.; 1985). Diese Untersuchung konnte

ebenfalls keinen signifikanten Beitrag zur Bedeutung von PAI-2 in malignen

Lungentumoren leisten.

Die Lungentumoren verhalten sich hinsichtlich des Gehaltes an uPA, uPAR,

PAI-1 und PAI-2 sehr heterogen. Zu einem ähnlichen Ergebnis wie in dieser

Arbeit kommen Gris et al. aufgrund ihrer immunhistochemischen Anfärbung

von vier Subtypen des Bronchialkarzinoms. Sie untersuchten Schnitte von

Adenokarzinomen, Plattenepithelkarzinomen, großzelligen und kleinzelligen

Karzinomen mit den Antikörpern MUKI gegen uPA, MAI-11 gegen PAI-1 und

MAI-12 gegen PAI-2. Während der Plasminogenaktivator in allen

Karzinomtypen gleichmäßig angefärbt war, fanden sich bei den Inhibitoren

statistisch signifikante Differenzen. Die Reaktion von PAI-1 und PAI-2 in

Adenokarzinomen war am stärksten, verringerte sich in der oben genannten

Reihenfolge der histologischen Typen bis zum Verlust einer Anfärbung von

Diskussion

Seite 41

kleinzelligen Karzinomen. Diese negative Reaktion PAI-1 und PAI-2 in allen

Präparaten stimmt nicht mit den immunhistochemischen Ergebnissen dieser

Arbeit überein. Die Ursache könnte in der Anwendung unterschiedlicher

Antikörper und unterschiedlicher Färbemethoden liegen. Da der histologische

Typ eines Lungentumors mit dem Ausprägungsgrad der Malignität

zusammenhängt und das kleinzellige Bronchialkarzinom die kürzeste

Überlebenszeit aufweist, läßt sich folglich sein invasives Verhalten und seine

schlechte klinische Prognose mit der Expression der Plasminogenaktivatoren

allein nicht erklären. Gris et al. vermuten aus diesem Grund in den PAI-Genen

Tumorsuppressorgene. Auch bei den übrigen histologischen Typen wurde kein

charakteristischer Bezug zum Plasminogen Aktivator System entdeckt.

Auffallend in dieser Studie war überdies die gleich starke Immunreaktivität des

normalen Bronchialepithels im Vergleich zu den bronchogenen Neoplasien. Die

Autoren verstehen das Vorkommen von uPA und PAI-1 in der gesunden

Schleimhaut als molekulares Äquilibrium zwischen Aktivatoren und Inhibitoren,

welches die Aktivierung des fibrinolytischen Systems regulieren könnte (Gris

JC. et al.; 1993).

Andere Untersucher stellten bei der Beobachtung der Interaktionen kultivierter

Zellen eines nicht-kleinzelligen Lungentumors mit einer künstlichen

Basalmembran fest, daß uPA und PAI-1 im Verlauf des Matrixabbaus

miteinander kooperieren. Folglich ist eine kritische Balance zwischen den

beiden Proteasen für die optimale Invasivität eines Tumors zumindest in vitro

erforderlich (Liu G. et al.;1995). Diese Aussage könnte die Forderung eines

Äquilibriums unter physiologischen Bedingungen von Gris et al. widerlegen,

wenn man die Ergebnisse auf die Situation in vivo überträgt.

Eine weitere immunhistochemische Studie beschäftigte sich mit der Expression

von uPA, tPA, PAI-1 und PAI-2 in Adenokarzinomen und

Plattenepithelkarzinomen der Lungen und entdeckte signifikant höhere Spiegel

für alle Parameter im Vergleich zu normaler Schleimhaut. Die Ausnahme

bildete tPA, welches in den Karzinomen noch schwächer reagierte als in

normalen Proben. Da tPA in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht wurde, ist

Diskussion

Seite 42

ein Vergleich mit eigenen Ergebnissen nicht möglich. Trotzdem unterstützen

die Ergebnisse von Nagayama et al. die Feststellung, daß das

Plasminogenaktivator System eine wichtige Rolle in der Ausbreitung von

Tumoren allgemein und speziell von nicht-kleinzelligen Lungentumoren spielt.

Es konnte jedoch ebenfalls keine Korrelation zwischen den Antigenspiegeln

und der primären Tumorklassifikation oder dem klinischen Stadium hergestellt

werden (Nagayama M.; 1994).

In einer anderen Publikation über das pulmonale Adenokarzinom erweist sich

nur PAI-1 als unabhängiger prognostischer Faktor, der signifikant mit einer

kürzeren Dauer des Gesamtüberlebens assoziiert ist. PAI-1 soll das

Tumorgewebe vor dem proteolytischen Abbau schützen, der im umgebenden

Gewebe stattfindet (Pedersen H. et al.; 1994). Dies wurde bereits im

Zusammenhang mit Mammakarzinomen erwähnt und erklärt auch die

Expression von PAI-1 in Stromazellen in nicht-invasiven Arealen von

Lewis-Lungentumoren (Kristensen et al., 1990).

Die Gruppe von Pedersen berichtete als erste von der prognostischen

Bedeutung des uPA-Rezeptors in Plattenepithelkarzinomen der Lungen. Hier

korrelierten hohe Spiegel des Proteins im ELISA in Kombination mit hohen

PAI-1-Spiegeln mit einem kurzen Überleben der Patienten, während uPA und

PAI-1 als einzelne Moleküle nicht relevant waren. Für das großzellige

Bronchialkarzinom fand sich in derselben Studie kein Anhalt für eine

prognostische Aussagekraft für einen der Parameter (Pedersen H. et al.; 1994

(2)).

Die bisherigen Studien über Tumoren der Lunge stellen keinen

Zusammenhang zwischen Aktivatoren oder Inhibitoren und einer schlechten

Prognose fest. Eine Ausnahme bilden das pulmonale Adenokarzinom der

Lunge mit PAI-1 und das Plattenepithelkarzinom mit uPAR als prognostischen

Faktoren. Die vorliegende Arbeit kann ebenfalls keine Abhängigkeitn des

klinischen Verlaufes von Patienten mit einem kleinzelligen Bronchialkarzinom

und den Vorgängen der Tumor-assoziierten Proteolyse herstellen. Somit muß

Diskussion

Seite 43

angenommen werden, daß andere Faktoren für die besondere Malignität des

Tumors von Bedeutung sind. In dieser Arbeit wurde versucht, die Expression

von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 mit der Tumorgröße in Zusammenhang zu

setzen. Es fanden sich keine signifikanten Abhängigkeiten.

Im Vergleich mit immunhistochemischen Untersuchungen an nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinomen zeigten dort die uPA-Spiegel eine signifikante positive

Korrelation mit dem Tumordurchmesser. Daraus schließen die Autoren auf den

Einfluß der Aktivität von uPA auf das Tumorwachstum (Nagayama M.; 1994).

Im Mammakarzinom konnten Del Vecchio et al. keine Relation zwischen uPAR

oder uPA und der Tumorgröße nachweisen. Für das Kolonkarzinom ergab sich

ebenso keine Korrelation zwischen Farbintensität von uPA und Merkmalen wie

Tumordifferenzierung oder Stadium (Sier CFM. et al.; 1991). In neoplastischem

Kolongewebe von Patienten mit familiärer Adenomatosis Coli ändern sich

weder uPA noch PAI-1 parallel zur Adenomgröße. Die einzige Korrelation

besteht zwischen einem sinkenden tPA-Spiegel und zunehmenden

Adenomdurchmessern im Kolon. Die Ursache dafür liegt wahrscheinlich in

einer Änderung der Vaskularisierung (Sier CFM. et al.; 1995). Schließlich gibt

es in Nierenzellkarzinomen keine statistisch signifikante Beziehung zwischen

Urokinase und TNM-Status oder Differenzierungsgrad (Hofmann R. et al.;

1996).

Ein Vergleich der Expression der Antikörper untereinander ergab keine

Abhängigkeit außer einem schwachen Zusammenhang zwischen der

Expression von PAI-1 und uPA. In der Literatur fand sich im pulmonalen

Adenokarzinom keine Korrelation zwischen uPA und PAI-1 (Pedersen H. et al.;

1994). Dagegen wiesen Liu et al. in in vitro Versuchen nach, daß eine optimale

Invasivität ein ausgeglichenes Verhältnis zwischen uPA und PAI-1 erfordert.

Meine Beobachtungen könnten dieses Ergebnis bestätigen.

Die vorliegenden Untersuchungen ergaben schließlich eine geringfügige

Korrelation zwischen PAI-1 und uPAR. Dieses Merkmal findet sich in Berichten

über Plattenepithelkarzinome der Lungen, in denen eine Kombination von

Diskussion

Seite 44

hohen uPAR-mit hohen PAI-1-Spiegeln mit kurzem Überleben assoziiert ist

(Pedersen H. et al.; 1994 (2)). Aus den schwach ausgeprägten Abhängigkeiten

in dieser Arbeit läßt sich trotz einiger Literaturvergleiche keine Schlußfolgerung

für die Korrelation der Antigene ableiten, da das Plasminogen Aktivator System

keine Bedeutung in den immunhistochemischen Untersuchungen hat.

4.2 Diskuss ion d er Fehlermöglichkeiten

In diesen Untersuchungen wurde sehr genau darauf geachtet, alle

Arbeitsschritte, einschließlich des Zählverfahrens, mit einheitlichen Methoden

zu bearbeiten. Dennoch ergeben sich eine Reihe von Fehlermöglichkeiten.

Die verwertbare Patientenanzahl betrug 26. Diese Anzahl ist für

aussagekräftige statistische Auswertung zwar geeignet, aber es besteht die

Möglichkeit von statistischen Fehlern durch zufällige Ereignisse. Diese

Fehlermöglichkeit könnte durch eine größere Anzahl untersuchter Tumoren

verringert werden.

Bei der Auswertung der histologischen Schnitte wurde immer die gleiche

Methodik verwandt. Fehler in der Zählung wurden durch das Auszählen

mehrerer Gesichtsfelder minimiert. Eine nochmalige Erhöhung der

ausgezählten Felder wäre eine weitere Möglichkeit die ohnehin geringe

Fehlerrate nochmals zu verringern.

Die Färbungen der Präparate erfolgte zwar immer mit der gleichen Methode,

aber sie mußten aus technischen Gründen immer in mehreren Sitzungen

durchgeführt werden. Hieraus könnte sich eine mögliche Fehlerquelle ergeben,

da geringfügige Unterschiede in den Zeiten der Inkubationen oder Unterschiede

in den Konzentrationen sich summieren könnten.

Diskussion

Seite 45

Das kleinzellige Bronchialkarzinom zeigte oft viele Nekrosen. Diese wurden im

histologischen Bild als Quetschungsartefakte erkennbar. Diese Stellen waren

nur mit großen Schwierigkeiten auszählbar und somit auch eine potentiell

Fehlerquelle, die aber nicht zu vermeiden ist.

Die Zellen des untersuchten Tumors haben eine geringe Kern-Plasma-Relation.

Damit ähneln sie in ihrer histologischen Morphologie der von Lymphozyten.

Verwechslungen sind nicht immer auszuschließen. Der gemessene Prozentsatz

könnte als falsch zu niedrig ermittelt werden, da Lymphozyten für negativ

reagierende Tumorzellen gehalten werden könnten.

Zusammenfassung

Seite 46

5 Zusammenfassung

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Expression der Antigene für die

Serinproteasen uPA, uPA-R, PAI-1 und PAI-2 beim kleinzelligen

Bronchialkarzinom.

Nach der immunhistochemischen Anfärbung von insgesamt 26

Gewebeschnitten von Patienten mit dieser Erkrankung wurden diese durch

Auszählung und Beurteilung der Färbeintensität ausgewertet. Es wurde jeweils

für jeder einzelne Antikörper mit der Überlebenszeit und der Anzahl der

Langzeitüberlebenden in Beziehung zur Prognose gesetzt. Dabei ergab sich

aber keine signifikante Abhängigkeit zwischen diesen Parametern. Alle

Korrelationskoeffizienten lagen bei 0,1.

Lediglich beim Vergleich der Expression der Antikörper untereinander konnte

ein schwache Abhängigkeit zwischen der Expression von PAI-1 und uPA mit

einem Korrelationskoeffizienten nach Bravais-Pearson von 0,61 nachgewiesen

werden. Auch zwischen der Expression von PAI-1 und uPA-R war ein geringe

Abhängigkeit vorhanden (Bravais-Pearson: 0,51). Zwischen allen anderen

Antikörpern bestehen keine Zusammenhänge.

Auch bei einem Vergleich zwischen der Tumorgröße und der Expression der

verschieden Antigene ist keine signifikante Abhängigkeit nachzuweisen.

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