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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern am Beispiel der Infektion mit Leishmania major Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Universität zu Lübeck – Aus der Medizinischen Fakultät – vorgelegt von Helmut Laufs aus Göttingen Lübeck 2001

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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene

der Medizinischen Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach

Die Interaktion von Granulozyten mit

intrazellulären Krankheitserregern am Beispiel

der Infektion mit Leishmania major

Inauguraldissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Universität zu Lübeck

– Aus der Medizinischen Fakultät –

vorgelegt von

Helmut Laufs aus Göttingen

Lübeck 2001

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1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. W. Solbach

2. Berichterstatter/in: ....................................................................................................................................................................

Tag der mündlichen Prüfung: ...................................................................................................................................................

Zum Druck genehmigt, Lübeck, den ..................................................................................................................................

gez. der Dekan der medizinischen Fakultät,....…………………………………………………………………….......

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Inhaltsverzeichnis 3

Inhaltsverzeichnis

0 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................. 4

1 EINLEITUNG ............................................................................................................................ 6 1.1 LEISHMANIA MAJOR ................................................................................................................................ 7

1.2 NEUTROPHILE GRANULOZYTEN.......................................................................................................... 10

1.3 GRANULOZYTEN UND LEISHMANIA MAJOR .......................................................................................... 19

1.4 FRAGESTELLUNG.................................................................................................................................. 21

2 MATERIAL.............................................................................................................................. 22 2.1 GERÄTE................................................................................................................................................. 22

2.2 LABORBEDARF...................................................................................................................................... 23

2.3 ZELLKULTURMEDIEN UND –ZUSÄTZE.................................................................................................. 24

2.4 IMMUNOLOGISCHE REAGENZIEN ........................................................................................................ 25

2.5 REAGENZIEN FÜR MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN................................................................. 25

2.6 TESTKITS .............................................................................................................................................. 25

2.7 CHEMIKALIEN UND SONSTIGE REAGENZIEN....................................................................................... 26

2.8 SOFTWARE............................................................................................................................................ 26

3 METHODEN............................................................................................................................ 28 3.1 PARASITEN............................................................................................................................................ 28

3.2 HUMANE ZELLEN ................................................................................................................................. 29

3.3 ZELLKULTURMEDIEN UND KULTURBEDINGUNGEN ............................................................................ 31

3.4 DURCHFLUßZYTOMETRIE: OBERFLÄCHENFÄRBUNG (CD66b, CD63, CD62-L) .............................. 33

3.5 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULÄREN SAUERSTOFFRADIKALPRODUKTION .................................... 34

3.6 BESTIMMUNG DER VITALITÄT INTRAZELLULÄRER LEISHMANIA MAJOR ........................................... 34

3.7 ELISA................................................................................................................................................... 36

3.8 RNASE PROTECTION ASSAY (RPA)..................................................................................................... 37

4 ERGEBNISSE .......................................................................................................................... 40 4.1 DIE INTERAKTION NEUTROPHILER GRANULOZYTEN MIT LEISHMANIA MAJOR IN VITRO ................ 40 4.2 DER EINFLUß DER LEISHMANIEN AUF DIE ZYTOKINSEKRETION DURCH GRANULOZYTEN............. 51

5 DISKUSSION........................................................................................................................... 57

6 ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................................... 69

7 LITERATURVERZEICHNIS................................................................................................ 71

8 EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN.................................................................................. 82

9 DANKSAGUNG....................................................................................................................... 83

10 STICHWORTVERZEICHNIS............................................................................................... 84

11 LEBENSLAUF......................................................................................................................... 86

12 DOKTORARBEIT ALS ONLINE-MATERIAL AUF CD.................................................. 87

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Abkürzungsverzeichnis 4

0 Abkürzungsverzeichnis

Folgende Abkürzungen wurden in dieser Arbeit verwendet: 32P Phosphor-32 Ak Antikörper APP Akute-Phase-Proteine Arg Arginin Asp Aspartat bp Basenpaare (base pairs) BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) CD Differenzierungsmarker (cluster of differentiation) cDNA komplementäre (complementary) Desoxyribonukleinsäure CGD chronische Granulomatose (chronic granulomatous disease) Ci Curie CL kutane Leishmaniose (cutaneous leishmaniasis) CR Komplementrezeptor (complement receptor) CSF koloniestimulierender Faktor (colony stimulating factor) ddH2O doppelt demineralisiertes Wasser DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxy-ribonuclein acid) DNS Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli ELISA heterogener Enzym-Immuntest (enzyme-linked immuno sorbent assay) eNOS endotheliale Stickoxidsynthase FACS Durchflußzytometrie (fluorescence activated cell sorting) FCS Fetales Kälberserum (fetal calf serum) FITC Fluoresceinisothiocyanat FL Fluoreszenz fMLP Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin ( f-Met-Leu-Phe) FSC forward scatter Gly Glyzin GlyCAM-1 glykosilierungsabhängiges Zelladhäsionsmolekül 1 gp63 Glykoprotein 63 GTP Guanosintriphosphat h Stunde(n) (hora) HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure HGE Humane Granulozytäre Ehrlichiose HLA Humanes Leukozytenantigen (human leukocyte antigen) HSA Humanes Serumalbumin i.v. intravenous (intra venam) IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin IL-1ra IL-1-Rezeptorantagonist iNOS induzierbare Stickoxid-Synthase L. Leishmania LD Verdünnungskulturverfahren (limiting dilution) LPG Lipophosphoglykan mAk Monoklonaler Antikörper (monoclonal antibody) MAC Membranattackierender Komplex (membrane attacking complex) MASP Mannanbindendes Lektin Assoziierte Serinproteasen (Mannan-Binding

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Abkürzungsverzeichnis 5

Lectin Associated Serine Proteases) MBL Mannanbindendes Lektin (mannan-binding lectin) MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) min Minute(n) (minuta) MIP inflammatorisches Makrophagenprotein (macrophage inflammatory

protein) MPO Myeloperoxidase mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger RNA) MUL Medizinische Universität zu Lübeck NADH Nikotinamidadenindinukleotid NADPH Nikotinamidadenindinukleotidphosphat NK-Zelle Natürliche Killerzelle NNN Novy-Nicolle-MacNeal NOS Stickoxid-Synthase (NO-Synthase) O.D. optische Dichte (optical density) PBMC mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear

cells) PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PE Phycoerythrin PMA Phorbol-12-myristyl-13-azetat Granulozyten Polymorphonukleäre Zelle PP Polypropylen RNA Ribonukleinsäure (ribonuclein acid) RNase Ribonuklease RNI Reaktive Stickstoffintermediate (reactive nitrogen intermediates) ROI Reaktive Sauerstoffintermediate (reactive oxygen intermediates) RPMI Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute Medium) s.c. subkutan (subcutaneus) Sgp 200 sulfatiertes Glykoprotein p200 SSC sideward scatter TBE Tris-Borat-Puffer TNF Tumornekrosefaktor Umin-1 Umdrehungen pro Minute UTP Uridintriphosphat VL viszerale Leishmaniose (visceral leishmaniasis)

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Einleitung 6

1 Einleitung

Leishmania major (L. major) ist ein obligat intrazellulärer Parasit, der nach Infektion des

Menschen phagozytiert wird und sich in Makrophagen vermehrt. Klinisch zeigen sich

unterschiedliche Verlaufsformen der Infektion. Auf der einen Seite kommt es zu einer

lokalisierten kutanen Infektion, die spontan abheilt („Orientbeule“); je nach Infektionsdosis

und –ort, infektiöser Leishmanienspezies und der Immunantwort kann der Erreger jedoch

auch eine unbehandelt tödliche systemische Infektion („Kala-Azar“) hervorrufen (Magill,

Grogl et al. 1993). Für die Analyse der zugrundeliegenden Mechanismen ist ein

Infektionsmodell in der Maus etabliert: Die Infektion von Inzuchtmäusen mit L. major

führt zu einer Erkrankung, die bei manchen Stämmen nach einigen Wochen ausheilt, bei

anderen dagegen letal verläuft. Ursache dafür ist die Ausprägung verschiedener

Immunantworten. Bei resistenten Tieren entwickelt sich eine zelluläre Immunreaktion vom

T-Helfer-1-Typ (TH1-Typ), während bei suszeptiblen Tieren eine TH2-Zellantwort

dominiert. Zur Erklärung soll an dieser Stelle angedeutet werden, daß anhand des

Leishmanieninfektionsmodells ein Konzept entwickelt wurde, gemäß dem sich naive T-

Helferlymphozyten nach Antigenerkennung entweder zu TH1- oder zu TH2-Zellen

differenzieren. Diese unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihre Fähigkeit,

unterschiedliche Zytokine zu produzieren. Th1-Zellen produzieren u.a. IL-2 und IFN-γ,

während TH2-Zellen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 sezernieren (Solbach und Laskay

2000).

Eine Reihe von Untersuchungen belegen, daß die Entwicklung einer TH1- bzw. TH2-

Antwort bereits einige Stunden bis Tage nach der Infektion beginnt (Solbach, Lohoff et al.

1987; Firestein, Roeder et al. 1989; Gajewski, Joyce et al. 1989; Scharton und Scott 1993;

Reiner und Locksley 1995). Ferner ist bekannt, daß die Begrenzung der Parasiten am

Infektionsort mit einer TH1-Antwort korreliert (Laskay, Diefenbach et al. 1995). Das

bedeutet, daß die Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem Krankheitserreger

erstens in den frühen Stunden und zweitens am Ort der Infektion die Ausbildung der

Immunantwort entscheidend beeinflußt. Analysen des Zellinfiltrats am Ort der Läsion

zeigen, daß 10 Stunden nach Infektion über 95% der Zellen Granulozyten sind und

Makrophagen dagegen erst 24 bis 48 Stunden später einwandern (Müller, van Zandbergen

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Einleitung 7

et al. 2001). Somit sind Granulozyten noch vor den Makrophagen diejenigen Zellen,

welche früh am Ort der Infektion mit L. major interagieren können.

Obwohl die Rolle von neutrophilen Granulozyten in der Abwehr extrazellulärer

Eitererreger gut untersucht ist, bleibt ihre Funktion in der frühen Abwehr intrazellulärer

Pathogene wie L. major unklar. Deshalb werden in dieser Arbeit die Wechselwirkungen

von L. major und Granulozyten untersucht.

1.1 Leishmania major

1.1.1 Taxonomie

Leishmanien gehören zur Familie der Trypanosomatiden (Abbildung 1). Innerhalb des

Genus sind über 13 humanpathogene Spezies bekannt. Die taxonomische Einordnung

geschieht mit Hilfe struktureller und biochemischer Merkmale. Die Nomenklatur ist

derzeit aufgrund von Genomanalyse im Fluß.

Abbildung 1: Taxonomie und Stammbaum der Leishmania spezies.

1.1.2 Lebenszyklus

L. major ist ein einzelliger Parasit, der sich durch binäre Teilung vermehrt. Als Wirt dient

dem Protozoon ein weites Spektrum von Vertebraten, darunter Nager, Haus- und Nutztiere

(Hunde, Rinder) sowie der Mensch. Die Erreger werden durch Sandmücken übertragen

(Phlebotomus spp., Lutzomyia spp., Psachodopygus spp.). Als Trypanosomatiden

Leishmania tropicaLeishmania major

Leishmania mexicana Leishmania braziliensis Leishmania donovani andere

GenusLeishmania

GenusTrypanosoma

Genusandere

FamilieTrypanosomatidae

OrdnungKinetoplastida

KlasseFlagellata

Subregnum:Protozoen

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Einleitung 8

unterliegen Leishmanien einem Dimorphismus: im Wirt und im Vektor durchlaufen sie

jeweils einen Entwicklungszyklus und liegen in der Sandmücke als Promastigote vor

(Abbildung 2, ). In dieser Form sind sie in vitro kultivierbar. Promastigote liegen

extrazellulär vor, sind 3 bis 6 µm breit, 10 bis 15 µm lang, tragen ein anteriores Flagellum

und sind somit aktiv beweglich. Im Wirbeltier befallen sie Zellen des retikuloendothelialen

Systems (Makrophagen) und wandeln sich intrazellulär zu Amastigoten um (Abbildung 2,

). Amastigote liegen primär intrazellulär vor, sind ovoid geformt mit einem Durchmesser

von 2 bis 5 µm, tragen kein Flagellum und sind unbeweglich (Turco und Descoteaux

1992).

Durch die Blutmahlzeit der Sandmücke bei einem infizierten Wirt gelangt L. major in

deren Darm (Abbildung 2, ). Die Amastigoten kommen aus den Zellen frei und

entwickeln sich zu Promastigoten (Metazyklogenese). An ihrer Oberfläche synthetisieren

sie eine dichte Glykokalix, deren Hauptbestandteil das Lipophosphoglykan (LPG) ist. LPG

Abbildung 2: Lebenszyklus der Leishmanien. Erläuterung im Text.

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Einleitung 9

ist ein Polymer aus Poly-Disaccharid-Phosphaten und vermittelt die Haftung des Parasiten

am Mitteldarm des Vektors (McConville und Ralton 1997; Beverley und Turco 1998).

Nach vier- bis siebentägiger Vermehrung kommt es durch Modifikation des LPG zum

Haftungsverlust. Die infektiösen, metazyklischen, Promastigoten wandern in den Pharynx

ihres Vektors aus und werden bei der nächsten Blutmahlzeit zusammen mit dem Speichel

des Insekts in den Endwirt übertragen (Abbildung 2, , S. 8). Die Infektiosität der

Promastigoten wird durch Speichelbestandteile gesteigert (Valenzuela, Belkaid et al.

2001). An der Einstichstelle sind die Promastigoten zunächst toxischen Serumbestandteilen

ausgesetzt, darunter Komplementfaktoren, die den Großteil (~ 90 %) der übertragenen

Parasiten vernichten (Sacks und Perkins 1984). Auf der anderen Seite vermitteln

Komplementfaktoren gleichzeitig die schnelle Aufnahme der Parasiten in die Zielzelle, wo

diese vor toxischen Serumbestandteilen geschützt sind (Brittingham, Morrison et al. 1995;

Mosser und Brittingham 1997). Unter physiologischen Bedingungen sind bei

Makrophagen die komplementvermittelten Aufnahmemechanismen die bedeutsamsten

(Sutterwala, Rosenthal et al. 1996). In der Literatur sind für Makrophagen darüber hinaus

Aufnahmewege von L. major beschrieben, die von LPG (Talamas-Rohana, Wright et al.

1990), dem Rezeptor für das C-reaktive Protein oder über den Mannose-Fucose-Rezeptor

(Bogdan und Röllinghoff 1998) vermittelt werden.

1.1.3 Epidemiologie, Krankheitsformen, Diagnostik und Therapie der Leishmaniosen

Die Art und Schwere der Erkrankung nach einer Leishmanieninfektion hängt sowohl von

der Erregerspezies als auch vom Immunstatus des Infizierten ab. Die Symptomatik reicht

von lokal begrenzten, spontan ausheilenden Hautulzerationen (kutane Leishmaniose, CL,

„Orientbeule“) bis hin zu einer schwersten, lebensbedrohlichen Systemerkrankung

(viszerale Leishmaniose, VL, „Kala-Azar“) (Pearson und Sousa 1996). Üblicherweise führt

zum Beispiel die Infektion mit L. donovani beim Menschen zu VL, die Infektion mit L.

major oder L. tropica zu CL. Andererseits kann L. infantum beide Leishmanioseformen

hervorrufen, und für L. tropica wurde bei infizierten Veteranen des Golfkriegs (Operation

Desert Storm) erstmals auch ein viszerotroper Verlauf beschrieben (Magill, Grogl et al.

1993).

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Einleitung 10

Gemäß den Daten der WHO von 1998 sind 12 Millionen, vor allem junge Menschen in 88

Ländern auf allen Kontinenten außer Australien von Leishmaniosen betroffen. 350

Millionen sind dem Erreger exponiert, und es kommt zu mindestens 2 Millionen

Neuerkrankungen jährlich. Dreiviertel der Länder mit endemischer Leishmaniose gehören

zur Gruppe der Entwicklungsländer, wo es zu tödlichen Epidemien kommen kann. In

unseren Breiten machen die Leishmaniosen eher selten von sich reden, obwohl sie in den

benachbarten Mittelmeerstaaten, u.a. in Italien und auf Mallorca, verbreitet sind und

zahlenmäßig zunehmen. Durch das Fortschreiten der AIDS-Pandemie sind in den letzten

Jahren Leishmaniosen vermehrt bei HIV-Infizierten aufgetreten, so daß in Südeuropa 25%

bis 70% der erwachsenen VL-Patienten HIV-positiv sind und 1,5% bis 9,5% der AIDS-

Erkrankten unter VL leiden (Solbach und Laskay 2000). In Deutschland werden 200

importierte Leishmaniosefälle pro Jahr geschätzt (Wichert 2001).

Leishmaniosen werden durch Direktnachweis des Erregers mittels Mikroskopie oder

Kultur sowie durch DNA-Nachweis diagnostiziert. Als Untersuchungsmaterial sind

Gewebeproben aus der Haut, der Milz oder dem Knochenmark geeignet (Cook und

Manson 1996). Immundiagnostik in Form von Antikörpernachweisen ist ebenfalls möglich

(Berman 1997). Um die zelluläre Immunantwort zu testen, kann ein dem Mendel-

Mantoux-Test ähnliches Verfahren mit Leishmanin, einer Suspension getöteter

Leishmanien aus der Kultur, durchgeführt werden. Intradermal applizierte und

autoklavierte L. major Promastigote induzieren eine Immunreaktion und werden als

Impfstoff in Studien getestet (Khalil, El Hassan et al. 2000). Während die Hautläsionen im

Rahmen der kutanen Leishmaniose meist spontan heilen und höchstens der topischen

Therapie mit Paromomycinsalbe oder in Form von Wärme- oder Kälteapplikation

bedürfen, muß dem Befall innerer Organe mit antimikrobiell wirksamen Substanzen

begegnet werden: Pentavalentes Antimon, Pentamidin, Liposomales Amphotericin B,

Paromomycin sowie IFN-γ sind die wirksamsten der eingesetzten Therapeutika (Berman

1997). Das erste effektive orale Therapeutikum ist Hexadechylphosphocholin (Miltefosine)

(Jha, Sundar et al. 1999).

1.2 Neutrophile Granulozyten

Der russische Naturforscher Elie Metchnikoff beobachtete, daß Mikroorganismen von

Zellen aufgenommen und verdaut werden und nannte diese Makro- bzw. Mikrophagen

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Einleitung 11

(Metchnikoff 1884). Die neutrophilen Granulozyten gehören zur Gruppe der

„Mikrophagen“. Diese Zellen sind in der Lage, unmittelbar nach Eindringen in den

Organismus die Erreger zu bekämpfen, sie bilden die erste Linie der Abwehr. Zusammen

mit den Faktoren des Komplementsystems sowie den Akute-Phase-Proteinen

„überbrücken“ sie die Zeit bis zum Einsetzen der spezifischen Immunantwort. Gelingt es

Mikroorganismen, diese erste Linie der Abwehr zu unterlaufen, können sie sich bis zum

Einsetzen der spezifischen Antwort weiter vermehren und ausbreiten.

Granulozyten gehören zu den Leukozyten und werden im Knochenmark gebildet, wo sie

als Myeloblasten gemeinsam mit den Vorläuferzellen der Makrophagen, den Monoblasten,

aus einer gemeinsamen Stammzelle hervorgehen. Neutrophile Granulozyten besitzen einen

vielgestaltigen, gelappten Kern; man spricht auch von polymorphkernigen Leukozyten

(Polymorphonukleäre Zellen, Granulozyten). Der Kern enthält keinen Nukleolus, ist

chromatinreich und läßt sich mit neutralen Farbstoffen anfärben. Das Zytoplasma ist

schwach azidophil und enthält zahlreiche Speichergranula. Es wurden mindestens vier

Typen identifiziert, die mit verschiedenen Rezeptoren, Enzymen und mikrobiziden

Proteinen ausgestattet sind (Smith 1994). Von den neutrophilen lassen sich eosinophile und

basophile Granulozyten abgrenzen, die zahlenmäßig die Minderheit der Granulozyten

bilden und sich funktionell von Neutrophilen unterscheiden.

Vom Knochenmark werden die Granulozyten an den eigentlichen Wirkort in den Geweben

über den Blutstrom transportiert. Damit befindet sich nur ein kleiner Teil der im Körper

vorhandenen Granulozyten in den Gefäßen (<1% des Blutvolumens). Die Neutrophilenzahl

ist physiologischen und pathologischen Einflüssen unterworfen und beträgt beim

Erwachsenen 2500 – 7500 Zellen pro Mikroliter. Granulozyten machen 40 % bis 75 % der

Leukozyten aus. Ihre Halbwertszeit im Gefäßsystem beträgt 6 - 7 Stunden, ihre

Lebensdauer am Zielort noch maximal 1 – 2 Tage. Pro Tag werden 1011 Granulozyten

nachgebildet (Lloyd und Oppenheim 1992; Smith 1994). Granulozyten sind also sehr

kurzlebige Zellen. Zum Vergleich: Makrophagen können Monate bis Jahre überleben.

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Einleitung 12

1.2.1 Die Funktion von Granulozyten als efferente Zellen des Immunsystems

Granulozyten wurden lange Zeit als im Knochenmark ausdifferenzierte Zellen betrachtet,

die daraus nach sieben bis zehn Tagen Reifungszeit mit allen präformierten

Effektormolekülen hervorgehen, an den Ort der Infektion einwandern, phagozytieren und

neben Chemotaxinen die gespeicherten Vorräte an Enzymen wie Kollagenase, Elastase

und Gelatinase sowie zytotoxische Komponenten wie Myeloperoxidase, Lysozym und

Laktoferrin freisetzen. Nach vollbrachter Leistung gehen die Granulozyten zugrunde.

Eine klassische Aufgabenstellung der Granulozyten ist die Abwehr extrazellulärer

Eitererreger (Bone 1991). Im Zusammenhang mit intrazellulären Erregern werden

Granulozyten kaum erwähnt. Ebenso selten wurde eine Interaktion mit dem spezifischen

Immunsystem untersucht. Dies wurde bislang für die Domäne der Makrophagen gehalten.

Zusammengefaßt dominiert ein Bild des Neutrophilen als efferente Effektorzelle des

angeborenen Immunsystems, die von diesem ausgeht, eine vorbestimmte Aufgabe zu

erfüllen. Ihre Rolle als wichtige Schnittstelle zu den Funktionen des spezifischen

Immunsystems ist bislang wenig untersucht.

1.2.1.1 Rekrutierung und Aktivierung

Im Blut strömende Granulozyten exprimieren L-Selektin (CD62-L), CD11a/CD18 und

andere Adhäsionsmoleküle. Die Ausbildung von Selektinliganden, Selektinen und

Adhäsinen auf den Endothelzellen ermöglicht die gesteuerte Margination und Diapedese

der Granulozyten aus dem Blut in das Gewebe (Abbildung 3, S. 13). Die gelappte Form

des Zellkerns begünstigt den Durchtritt durch das Endothel (Opdenakker, Fibbe et al.

1998). Die Granulozyten werden dann durch chemotaktische Faktoren wie C3a und C5a,

aber auch chemotaktische Zytokine (Chemokine), zum Ort der Infektion geleitet

(Abbildung 3). Diese werden von Phagozyten und anderen Zellen des Immunsystems

produziert, die bereits mit dem Erreger interagiert haben, aber auch direkt durch die

Infektionserreger selbst. Die Einwanderung der Entzündungszellen potenziert sich selbst

durch die weitere Freisetzung chemotaktischer Stoffe.

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Einleitung 13

Während der Transmigration durch das Endothel werden die Granulozyten aktiviert. Dies

führt zur Ausschüttung der in den verschiedenen Granula präformiert vorliegenden

mikrobiziden Substanzen (Degranulation, Abbildung 3). Der resultierende mikrobizide

Effekt wird durch eine Kombination von oxidativen und sauerstoffunabhängigen

enzymatischen Prozessen als weiteren Mechanismen unterstützt. Die Expression des

granulozytären Oberflächenmoleküls CD62-L nimmt nach der Aktivierung deutlich ab

(Abbildung 3). Hochreguliert werden die Komplementrezeptoren CR1 und CR3 sowie

FcγRI (Smith 1994). Ziel der Granulozyten ist die Eliminierung des Pathogens. Neben der

Ausschüttung toxischer Substanzen besteht ihre Effektorfunktion vor allem in der

Phagozytose des Erregers (Wright und Silverstein 1983).

1.2.1.2 Opsonisierung und Komplementsystem

Die Aufnahme der Erreger wird durch Opsonine wesentlich verbessert. Opsonine binden

an die Oberfläche der Mikroorganismen und gleichzeitig an spezifische Rezeptoren auf

Abbildung 3: Die akute Entzündungsreaktion. Erläuterung im Text; Abbildung modifiziert (Delves und Roitt 2000).

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Einleitung 14

Phagozyten und wirken dadurch wie ein universeller Adapter zwischen Pathogen und

Freßzelle. Zur Opsonisierung sind Komplementfaktoren, Immunglobuline und Akute-

Phase-Proteine befähigt. Die Gesamtheit der Komplementfaktoren bildet das

Komplementsystem, ein hitzelabiles System von über 30 (Glyko-)Proteinen (15% der

Globulinfraktion), die im Serum in einer Konzentration von 3 g/l inaktiv vorliegen

(Walport 2001). Das System kann auf drei Arten aktiviert werden, die alle zur Bildung der

C3-Konvertase führen, dem Schlüsselenzym der Komplementkaskade. Es spaltet den

Komplementfaktor C3 in C3a und C3b, wovon letzteres in großer Menge an die

Oberfläche der Pathogene bindet. Der klassische Weg der Komplementaktivierung trägt

seinen Namen, da er zuerst entdeckt wurde. Hier führen Antigen-Antikörperkomplexe aus

Pathogen und IgM bzw. IgG zur Aktivierung der Komplementkaskade.

Entwicklungsgeschichtlich wahrscheinlich älter ist der alternative Weg. Er führt

antikörperunabhängig zur Bildung von C3b (Ofek, Goldhar et al. 1995). Der Lektinweg ist

ebenfalls antikörperunabhängig und wird durch das Mannanbindende Lektin (MBL)

vermittelt. Dieses kalziumabhängige, zuckerbindende Protein gehört zur Gruppe der

Kollektine. Im Serum kommt es in kleinen Mengen vor, in der akuten Phase ist es erhöht

und bindet an Mannosereste auf der Oberfläche von Mikroorganismen, was die

Aktivierung der Komplementkaskade zur Folge hat (Turner 1998). Das Prinzip der

Komplementopsonisierung besteht darin, die Erregeroberfläche mit dem Opsonin C3b zu

beladen, das von Komplementrezeptoren erkannt wird. Es kann auch zur Bildung des

terminalen Lysekomplexes kommen, der durch Lochbildung in der Membran des

Pathogens dessen Desintegration bewirkt.

Auch Antikörper haben opsonisierende Eigenschaften. Ihr variabler Teil bindet spezifisch

an das Pathogen während der konstante Fc-Teil unmittelbar von Fc-Rezeptoren auf

Phagozyten gebunden wird. Neben erregerspezifischen Antikörpern gibt es sogenannte

natürliche Antikörper. Sie sind das Produkt von Immunglobulingenen, die noch keiner

somatischen Mutation unterlagen und Epitope mehrerer Antigene erkennen. Somit liegen

sie ‚natürlicherweise’ im Serum vor (Walport 2001).

Neben dem universellen Prinzip der komplementvermittelten Erregererkennung gibt es

opsoninunabhängige, z. T. sehr spezielle Mechanismen. Dazu gehört die

Lektinphagozytose. Sie basiert auf der Bindung zwischen Lektinen auf der

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Einleitung 15

Erregeroberfläche und Oberflächenkohlenhydraten der phagozytierenden Zelle (Ofek,

Goldhar et al. 1995).

1.2.1.3 Oxidative und nichtoxidative Mechanismen der Erregerabtötung

Die alleinige Phagozytose des Pathogens führt nicht unmittelbar zu dessen Eliminierung,

insbesondere intrazelluläre Parasiten sind auf das Überleben im Zellinneren spezialisiert.

Erst die Auslösung weiterer Effektormechanismen führt zur Erregerabtötung.

Granulozyten verfügen diesbezüglich über zwei z.T. redundante Prinzipien, nichtoxidative

und oxidative Mechanismen.

Hydrolytische Enzyme, antimikrobielle Polypeptide, Defensine und saure Hydrolasen

tragen zur nichtoxidativen Vernichtung der Erreger bei. Wie bereits erwähnt, können sie

unverzüglich aus den Granula freigesetzt werden. Der oxidative burst ist ein oxidativer

Mechanismus und bezeichnet einen stark erhöhten Sauerstoffumsatz der Granulozyten

durch Aktivierung einer von NADPH-Cytochrom-b-abhängigen Oxidase, die molekularen

Sauerstoff zu einem Superoxid reduziert. Toxischer als das Superoxid selbst sind weitere

reaktive Sauerstoffintermediate (reactive oxygen intermediates, ROI), die aus diesem

Vorläufer gebildet werden, wie Wasserstoffperoxid (H2O2) durch die Superoxiddismutase

oder spontane Dismutation. Myeloperoxidaseabhänig werden Oxyhalide wie

Hypochlorsäure (HOCl) gebildet, der eine 100- bis 1000fach höhere Aktivität als H2O2

zugeschrieben wird und die in der Protozoenabwehr eine besondere Rolle spielt, da Erreger

sie nicht detoxifizieren können (Eaton 1993). Die Kombination von ROI mit reaktiven

Stickstoffintermediaten führt zu Substanzen besonderer Toxizität wie Peroxynitrit

(OONOO-)3 oder Nitrylchlorid (NO2Cl) (Eiserich, Hristova et al. 1998). Oxidative und

nichtoxidative Prozesse in Kombination potenzieren sich, z.T. reagieren Erreger nur

sensibel auf deren gemeinsamen Angriff.

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Einleitung 16

1.2.1.4 Apoptose

Das natürliche Schicksal der Granulozyten ist ein früher Zelltod. Nach Erreichen des

Zielortes im Gewebe kehren Granulozyten in der Regel nicht in die Blutbahn zurück.

Somit ist eine schonende Beseitigung der Granulozyten notwendig, damit dem Gewebe

nicht zusätzlicher Schaden durch die aggressiven Substanzen in den Granulozyten zugefügt

wird. Nach zwölf bis 24 Stunden zeigen Granulozyten deshalb Zeichen der Apoptose.

Dabei kommt es zur Umorganisation der Zelle (Tabelle 1) derart, daß alle Organellen von

Zellmembran umgeben bleiben, keine toxischen Substanzen freigesetzt werden und

dadurch kein Entzündungsreiz entsteht. Die Membranpakete der apoptotischen

Granulozyten werden von Makrophagen erkannt und abgeräumt (Savill, Wyllie et al.

1989). Das Abräumen der apoptotischen Zellen geschieht innerhalb weniger Stunden. Im

Gegensatz zur Aufnahme zahlreicher anderer Partikel setzen Makrophagen ihrerseits dabei

keine gewebeschädigenden Substanzen frei (Haslett, Savill et al. 1989).

1.2.1.5 Primäre Störungen der Granulozytenfunktion

Klinisch sind primäre Störungen der Granulozytenfunktion wichtiger Bestandteil der

Differentialdiagnose rekurrenter Infektionen und Fieber bei Kindern und teils

Erwachsenen. In der Regel fallen die Patienten bereits in jungem Alter durch ihre

Empfindlichkeit gegenüber normalerweise nichtpathogenen Bakterien und Pilzen auf, die

zum Teil charakteristisch für den vorliegenden Phagozytendefekt sind. Von der absoluten

Morphologische Charakteristika (Savill, Wyllie et al. 1989)

Funktionelle Konsequenzen (Whyte, Meagher et al. 1993)

• Kernpyknose und –prominenz • Chromatinkondensation und –aggregation • Zytoplasmatische

Vakuolisierung • Trypanviolettausschluß

in den ersten Stunden • Zerfall in

membranumgebene Apoptosekörper

• Eingeschränkte Zytoskelettfunktionen • Chemotaxis • Verformung

• Stark eingeschränkte Phagozytose • Verminderte Degranulationsfähigkeit • Herabgesetzte MPO-Freisetzung • Produktion von Superoxidanionen

• Herabgesetzt bei Stimulation mit fMLP oder opsonisiertem Zymosan

• Erhalten bei Stimulation mit PMA Tabelle 1: Morphologische und funktionelle Charakteristika der Apoptose neutrophiler Granulozyten. Zusammengestellt nach (Savill, Wyllie et al. 1989) und (Whyte, Meagher et al. 1993).

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Einleitung 17

Verminderung der Neutrophilenzahl lassen sich die Funktionsstörungen unterscheiden. Zur

gestörten Abwehr intrazellulärer Erreger wie Mykobakterien, Salmonellen und Listerien

kommt es zum Beispiel bei unzureichender Produktion von ROI (Lekstrom-Himes und

Gallin 2000).

1.2.2 Die Funktion von Granulozyten als afferente Zellen des Immunsystems

Bisher wurden die Effektorfunktionen der Granulozyten dargestellt, die in der Literatur gut

beschrieben sind. Wesentlich jünger ist das Verständnis von Granulozyten als afferentes

Glied im Immunsystem. Sie sind aktive Mitglieder im Kommunikationsnetzwerk der

Abwehrzellen (Lloyd und Oppenheim 1992).

1.2.2.1 Zytokine

Zytokine sind zentrale Bindeglieder zwischen der unspezifischen und der spezifischen

Abwehr. Zytokine sind kleine lösliche Proteine und Peptide mit einer Halbwertzeit von

Stunden, die auto- oder parakrin auf Zielzellen wirken (Kirchner 1994). Dabei hängt die

Wirkung nicht nur vom Botenstoff ab, sondern auch von der Zielzelle, von deren Zustand

und eventuellen weiteren auf diese Zelle wirkenden Zytokinen. Daraus ergibt sich eine

große Komplexität. Dennoch lassen sich bestimmten Immunphänomenen charakteristische

Zytokinmuster zuordnen.

Reife Granulozyten behalten ihre Fähigkeit, ein begrenztes, aber signifikantes Spektrum

von messenger RNA (mRNA) und Proteinen zu synthetisieren. Bedeutsam für die afferente

Funktion ist jedoch ihre Fähigkeit, Zytokine zu produzieren (Lloyd und Oppenheim 1992).

Es gibt zahlreiche Belege, daß Granulozyten Chemokine, Wachstumsfaktoren und

Interferone sowohl in vitro als auch in vivo produzieren (Tabelle 2, Seite 18). Darüber

hinaus wurde gezeigt, daß die Interaktion Neutrophiler mit einem gegebenen Agonist nicht

nur zur Sekretion eines spezifischen Musters von Zytokinen führt, sondern daß diese

Antwort auch durch immunregulatorische Zytokine wie Interleukin-10 und Interferon-γ

moduliert werden kann. Wenngleich ihre Vielzahl vor allem in vitro demonstriert wurde,

weisen die Neutrophilenzytokine darauf hin, daß nicht nur die Immunantwort von

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Einleitung 18

Granulozyten beeinflußt werden kann, sondern gleichfalls Prozesse der Hämatopoese, der

Wundheilung, der Angiogenese und der Virusabwehr (Cassatella 1999).

Am Anfang einer Infektion stehen Zytokine, die eine Entzündungsreaktion stimulieren und

von Zellen gebildet werden, die früh am Ort der Infektion sind. Von Granulozyten werden

eine Reihe von Zytokinen produziert, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind.

Proinflammatorische Zytokine

Wachstumsfaktoren TNF1-α G-CSF12 IL2-1α M-CSF13 ?! IL2-1β GM-CSF14 ?! IL2-12 IL2-3 IFN3-α SCF15 ?! m IFN3-γ ?! IL2-6 ?! Angiogenese- und Fibrinogenesefaktoren

VEGF16 Antiinflammatorische Zytokine TGF4-α

IL2-1ra HGF17 TGF4-β LDGF18

CEMF19 Chemokine

IL2-8 Andere GRO5-α Fas-Ligand GRO5-β m CD30-Ligand CINC6-1 Oncostatin M CINC6-2α GDF20 IP7-10 NGF21 m MIG8 BDNF22 m I-TAC9 m NT23-4 m MIP10-1α MIP10-1β MCP11-1 ?!

Legende: ?! – bedarf weiterer Bestätigung; m – nur mRNA 1tumor necrosis factor, 2interleukin, 3interferon, 4transforming growth factor, 5growth-regulated-oncogene, 6cytokine-induced-neutrophil chemoattractant, 7interferon-inducible-protein, 8monokine induced by gamma interferon, 9interferon-inducible-T-cell-alpha-chemoattractant, 10macrophage-inflammatory protein, 11monocyte chemotactic protein, 12colony-stimulating-factor (CSF), 13macrophage-CSF, 14granulocyte-M-CSF, 15stem cell factor, 16vascular endothelial growth factor, 17hematopoietic growth factor, 18leukaemia-derived growth factor, 19corneal-endothelium modulation factor, 20granulocyte derived factor, 21nerve growth factor, 22brain-derived neurotrophic factor, 23neurotrophin

Tabelle 2: Zusammenstellung von Zytokinen oder Zytokin-mRNA, die durch neutrophile Granulozyten in vitro produziert werden. Nach (Cassatella 1999); Ausführung der Abkürzungen auf Englisch, soweit die Zytokine in dieser Arbeit näher erwähnt werden, findet sich eine deutsche Übersetzung im Text.

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Einleitung 19

1.3 Granulozyten und Leishmania major

Lange Zeit galten Makrophagen als die fast ausschließlichen Wirtszellen für L. major.

Einzelheiten der Makrophagen-Parasit-Interaktion sind gut beschrieben (Solbach und

Laskay 2000). Minuten nach der Phagozytose von L. major durch Makrophagen bildet sich

um die Leishmanien eine parasitophore Vakuole, die u.a. lysosomale Hydrolasen enthält

(Lang, Hellio et al. 1994; Antoine, Prina et al. 1998). Nach diversen Teilungen des

Parasiten wird die Wirtszelle schließlich lysiert, und die freigesetzten Leishmanien können

dann weitere Zellen befallen und sich ausbreiten (Russell und Talamas-Rohana 1989),

wenn sie nicht von den Makrophagen durch NO und Sauerstoffradikale (Murray und

Nathan 1999) vernichtet werden. Neben Makrophagen im engeren Sinne können aber alle

Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie mit L. major infiziert werden, inklusive

Langerhans- und dendritische Zellen (Locksley, Heinzel et al. 1988; Blank, Fuchs et al.

1993; Moll, Flohé et al. 1995). Demgegenüber haben nur wenige Studien Granulozyten als

mögliche parasitäre Zielzellen zum Inhalt. In vitro-Untersuchungen zeigten die Aufnahme

und Vernichtung von L. donovani durch Granulozyten (Chang 1981; Pearson und

Steigbigel 1981). Eine andere Arbeitsgruppe demonstrierte die L. major-Infektion muriner

Knochenmarkzellen, die einen Granulozytenmarker an ihrer Oberfläche exprimierten, und

erhielt Hinweise dafür, daß ein frühes Erscheinen von Granulozyten am Ort der Infektion

ursächlich für eine Ausweitung der Infektion war (Sunderkotter, Kunz et al. 1993).

Ebenfalls als dem Überleben des Parasiten dienlich wurde die Infektion von 25% aller

Leukozyten aus Humanblut mit Leishmanien gesehen (Dominguez und Torano 1999). Bei

Hunden wurde die Infektion von Granulozyten mit L. infantum und eine resultierende

Hemmung der ROI-Produktion beschrieben (Brandonisio, Panunzio et al. 1996).

Die existierenden Vorarbeiten, die Neutrophile in der Infektion mit Leishmanien

untersuchen, sind rar. Die Erkenntnisse entstammen vor allem Tiermodellen und

Untersuchungen in vitro, während wenig Erkenntnisse zur humanen Situation vorliegen:

Bei humanen Granulozyten sind die Aufnahmemechanismen und –bedingungen für L.

major, die folgenden intrazellulären Prozesse und das Schicksal der Parasiten noch

weitgehend unbekannt. Zur Frage der Zytokinproduktion durch mit Leishmanien infizierte

Granulozyten liegen bisher keine Daten vor. Die Interaktionen zwischen menschlichen

Granulozyten und L. major bedürfen somit weiterer Untersuchung. Dies ist besonders

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Einleitung 20

deshalb relevant, da Granulozyten ein entscheidendes Bindeglied zwischen angeborener

und adaptiver Immunantwort sind.

Ferner sind Granulozyten in den ersten Stunden nach der Infektion mit L. major die mit

Abstand vorherrschende Zellpopulation am Ort der Läsion (Müller, van Zandbergen et al.

2001). Experimente belegen, daß zu dieser Zeit und an diesem Ort entscheidende

immunologische Weichen im Infektionsverlauf gestellt werden. Über die Rolle der

Granulozyten während dieser Frühphase der Infektion ist nur wenig bekannt.

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Fragestellung 21

1.4 Fragestellung

In dieser Arbeit wird zum einen die Bedeutung von Granulozyten als efferente Zellen und

zum anderen als afferente Zellen des Immunsystems in der Infektion mit dem

intrazellulären Erreger L. major untersucht.

Im ersten Teil werden mittels zellbiologischer und immunologischer Methoden folgende

drei Fragen bearbeitet:

• Besteht eine Interaktion zwischen Granulozyten und L. major (Erregeraufnahme)?

• Welche Auswirkungen hat diese Interaktion auf die Granulozyten und deren

Funktion (Aktivierung, Sauerstoffradikalproduktion, Zelltod)?

• Welche Konsequenz haben diese Wechselwirkungen für den Erreger?

Im zweiten Teil werden mit molekularbiologischen Techniken folgende Fragen beleuchtet:

• Können Granulozyten als afferente Zellen des Immunsystems mit anderen Zellen

der Abwehr kommunizieren ?

• Wie wird diese Kommunikation durch L. major beeinflußt (Zytokinproduktion)?

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Material 22

2 Material

2.1 Geräte

Analysenwaage 1265 MP Sartorius, Göttingen

CO2-Inkubator IG 150 Jouan GmbH, Unterhaching

Durchflußzytometer FACSCalibur® Becton Dickinson & Co., Mountain

View, CA, U.S.A.

Eismaschine Scotsman, Vermon Hills, IL, U.S.A.

ELISA-Reader Precision Microplate Reader Molecular Devices, Ismaning

Gefriertruhen (-70°C, -20°C) Liebherr Comfort Liebherr Hausgeräte GmbH,

Ochsenhausen

Gelelektrophoresekammer (radioaktiv) S2

Sequencing Gel Electrophoresis Apparatus

Life Technologies, Karlsruhe

Gelelektrophoresekammer Agagel Biometra, Göttingen

Hitzeblock Unitek HB 130 Unitek, Deutschland

Mikroskop Axioplan Zeiss, Jena

Mikroskop Axiovert 25 Zeiss, Jena

Mikrowellenherd Bosch, Stuttgart

Netzgerät P25 Biometra, Göttingen

pH-Meter Beckman 3500 digital Beckman, München

Phosphoimager BAS 2000 Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan

Photoanlage digit Store duo Intas, Göttingen

Pipette Finnpette Labsystems, Helsinki, Finnland

Pipette Kombi Eppendorf, Hamburg

Pipette Multikanal Eppendorf, Hamburg

Pipette Transferpette Brand, Wertheim

Pipette Vario-Mikrotiterpipetten Eppendorf, Hamburg

Rüttler Vibrofix VF1 Electronic Janke & Kunkel IKA® Labortechnik,

Staufen

Scanner Power Look II Umax, Irland

Spektralphotometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg

Sterile Werkbank ANTARES Biohit, Köln

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Material 23

UV-Lichtquelle, UV-Tisch Intas, Göttingen

Vakuumkonzentrator UVS400A,

SpeedVac®Plus SC110A

Savant, NY, U.S.A.

Wasserbad Bioblock Scientific Illkirch, Cedex, Frankreich

Zählkammern Neubauer, Marienfeld

Zellsortiersystem FACS

Vantage SE cell sorter system

BD Biosciences, San Jose, CA,

U.S.A.

Zentrifuge Biofuge fresco Kendro Laboratory Products

(Heraeus), Hanau

Zentrifuge Megafuge 2.0R Kendro Laboratory Products

(Heraeus), Hanau

Zytozentrifuge Cytospin mit Einsätzen Shandon GmbH, Frankfurt am Main

2.2 Laborbedarf

Bakterienfilter, rund, 0,2 µm, steril Sarstedt, Nümbrecht

Blutentnahmeröhrchen Li-Heparin Sarstedt, Nümbrecht

Blutentnahmeröhrchen Serum Sarstedt, Nümbrecht

Cytoträger-Zentrifugeneinsätze Shandon, Pittsburgh, PA, U.S.A.

Einmalhandschuhe Peha-Soft® powder free Hartmann, Heidenheim

Einmalhandschuhe Vinyl 2000 PF Meditrade, Kiefersfelden

Fotofilm Fuji, Düsseldorf

Gewebekulturplatten 6 Loch, 24 Loch Greiner, Solingen

Glasobjektträger Menzel Superfrost Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk

GmbH & Co. KG, Braunschweig

Mikrotiterplatten 96 Loch

MicroWell™ELISA

Nunc, Wiesbaden

Mikrotiterplatten 96 Loch, MicroWell™

Flachboden (für L. major)

Nunc, Wiesbaden

Phosphoimaging Platte Raytest, Straubenhardt

Pipettenspitzen 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000

µl

Greiner, Solingen

Polycarbonatröhrchen 15 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht

Polypropylenröhrchen 15 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht

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Material 24

Reaktionsgefäße 0,5 ml, 1 ml, 2 ml Sarstedt, Nümbrecht

Röntgenfilm Kodak, Stuttgart

Stangenpipetten steril 5 ml, 10 ml, 25 ml Greiner, Nürtingen

Sterilfiltertips Art®, gestopft, nukleasefrei Molecular BioProducts, San Diego, CA,

U.S.A.

Sterilfiltertips Biosphere®, gestopft,

nukleasefrei

Sarstedt, Nümbrecht

2.3 Zellkulturmedien und –zusätze

2-Mercaptoethanol Gibco Laboratories, Eggenstein

Albumin, aus Rinderserum (BSA) Sigma Diagnostics, Deisenhofen

Albumin, human Sigma Diagnostics, Deisenhofen

brain heart infusion agar base Difco, Detroit, MI, U.S.A.

FCS (fetal calf serum) Sigma Diagnostics, Deisenhofen

Gentamicin Seromed Biochrom, Berlin

HEPES-Puffer Seromed Biochrom, Berlin

Kaninchenblut, frisch, defibriniert Froschek GmbH, Mühlhausen

Kulturmedium RPMI 1640 Gibco Laboratories, Eggenstein

L-Glutamin Seromed Biochrom, Berlin, BRD

LPS von E. coli, Sacharomyces cerevisiae Sigma Diagnostics, Deisenhofen

MBL (Mannanbindendes Lektin), aufgereinigt Statens Serum Institut, Copenhagen,

Denmark

Penicillin-G Seromed Biochrom, Berlin, BRD

Phosphate Buffered Saline 10x without Ca2+,

Mg2+

Gibco, Karlsruhe

Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) without

Ca2+, Mg2+

Apotheke der MUL, Lübeck

Streptomycinsulfat Seromed Biochrom, Berlin

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Material 25

2.4 Immunologische Reagenzien

Antikörper Konjugat/ Besonderheit Zellklon Verdünnung Bezugsquelle

anti-CD11b

(Integrin αM chain,

Mac-1 chain)

monoklonal, säurefrei,

endotoxinarm

M1/70 BD/Pharmingen,

Heidelberg

anti-CD62-L PE, monoklonal Dreg-56 1 µl/ml BD/Pharmingen,

Heidelberg

anti-CD66b FITC, monoklonal 80H3 1 µl/ml Immunotech,

Marseille,

Frankreich

anti-mouse IgG1 Isotypkontrollantikörper BD/Pharmingen,

Heidelberg

2.5 Reagenzien für molekularbiologisches Arbeiten

[α-32P]UTP 3000 Ci/mmol Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Ammoniumthiocyanat Sigma, Deisenhofen

Aqua ad injectabilia, 10 ml Braun, Heidelberg

Chloroform Roth, Karlsruhe

Ethanol Apotheke der MUL, Lübeck

Glycerol Sigma, Deisenhofen

Guanidinthiocyanat Roth, Karlsruhe

Isopropanol Apotheke der MUL, Lübeck

Natriumacetat Sigma, Deisenhofen

Phenol Sigma, Deisenhofen

Tris-Borat-Puffer (TBE) Fluka, Steinheim

2.6 Testkits

DuoSet® ELISA Development System human

IL-8

R&D Systems GmbH, Wiesbaden, BRD

Phagoburst® Medac, Hamburg

Quantikine® human IL-1ra Immunoassay R&D Systems GmbH, Wiesbaden

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Material 26

RiboQuant® Multi-Probe RNase Protection

Assay System

Pharmingen, Heidelberg

RiboQuant® Template sets: hck-2, hck-5 Pharmingen, Heidelberg

2.7 Chemikalien und sonstige Reagenzien

Agarose Sigma, Deisenhofen

ddH2O Mikrobiologie, MUL, Lübeck

Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen

Ficoll-Trennlösung 1,077 g/ml Seromed Biochrom, Berlin

Ficoll-Trennlösung 1,119 g/ml Seromed Biochrom, Berlin

Giemsa-Färbelösung Sigma, Deisenhofen

H2O2 R&D Systems GmbH, Wiesbaden

H2SO4 1N Abbot, Wiesbaden

Histopaque® 1119 Sigma, Deisenhofen

Kristallviolett-Färbelösung Sigma, Deisenhofen

Methanol Apotheke, MUL, Lübeck

NaN3 Sigma, Deisenhofen

Percoll-Trennlösung 1,130 +/- 0,005 g/ml Pharmacia, Uppsala, Schweden

Silikon Serva, Heidelberg

Streptavidin-HRP R&D Systems GmbH, Wiesbaden, BRD

Tetramethylbenzidine R&D Systems GmbH, Wiesbaden, BRD

Trypanblau-Färbelösung 0,4% Sigma, Deisenhofen

Tween 20 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

2.8 Software

Adobe®Acrobat® 5.0 Adobe Systems Inc., San Jose, CA, U.S.A.

Adobe®Photoshop® 6.0 Adobe Systems Inc., San Jose, CA, U.S.A.

Binuscan Cédex, Monaco

Cellquest Becton Dickinson, Mountain View, CA, U.S.A.

Microsoft® Excel Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.

Microsoft® Internet Explorer Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.

Microsoft® PowerPoint Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.

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Material 27

Microsoft® Word Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.

Phosphoimaging Software

TINA 2.0®

Raytest, Straubenhardt

Zeiss Mikroskop Software Zeiss, Jena

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Methoden 28

3 Methoden

3.1 Parasiten

3.1.1 Leishmania major:

Die in den beschriebenen Versuchen verwendeten Leishmanien gehören zum Leishmania-

major-Stamm MHOM/IL8/FEBNI, der 1981 aus der kutanen Läsion einer israelischen

Patientin isoliert wurde (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. F. Ebert,

Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg). Das Isolat wird durch regelmäßige

In-Vivo-Passagen (s. 3.1.3) durch s.c. Injektion von Promastigoten in die Fußsohle von

BALB/c-Mäusen und nachfolgende In-Vitro-Propagation (s. 3.1.2) der aus der Läsion

gewonnenen Parasiten in biphasischem Kulturmedium weiter gezüchtet (Solbach, Forberg

et al. 1986).

3.1.2 In-Vitro-Kultur

Für die Parasitenkultur wurde ein biphasisches Novy-Nicolle-MacNeal-Kulturmedium in

Flachbodenkulturplatten mit 96 Löchern verwendet, das aus 100 µl Novy-Nicolle-

MacNeal (NNN)-Schrägagar und 100 µl 10%-FCS-Medium (3.3.1.1) pro Vertiefung

bestand. NNN-Schrägagar wurde aus 50 ml defibriniertem, frischem Kaninchenblut, 50 ml

PBS, 30.000 IE Penicillin-G, 30 µg/ml Streptomycinsulfat und 200 ml „brain heart

infusion agar base“ hergestellt.

Die Parasitenkultur wurde im Inkubator in einer 5% CO2-Atmosphäre bei 27° C gehalten.

3.1.3 In-Vivo-Propagation

Zum Erhalt der Infektiosität der Parasiten wurden spätestens nach der 10. In-Vitro-Passage

2 x 106 Promastigote der stationären Wachstumsphase (ca. 7. Tag in Kultur) in 50 µl PBS

s.c. in die linke hintere Fußsohle einer BALB/c Maus injiziert. Es entwickelt sich dann

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Methoden 29

eine Infektion, deren Ausmaß in den ersten Wochen mit der lokalen Schwellung der

Fußsohle korreliert. Sobald die Schwellung nicht mehr wesentlich zunahm, wurde der

popliteale Lymphknoten der linken Seite entnommen und homogenisiert. Das Homogenat

wurde anschließend gewaschen und in 10%-FCS Medium (3.3.1.1) als Suspension wie

unter 3.1.2 beschrieben ausplattiert.

3.1.4 Aufbereitung für die Inkubation

Vor Zugabe von Leishmanien zu einem Versuchsansatz wurden die Parasiten zweimal in

Medium (3.3.1.1) gewaschen, und auf die gewünschte Konzentration eingestellt.

3.2 Humane Zellen

Venöses Blut wurde unmittelbar vor Aufreinigungsbeginn jungen, gesunden, weiblichen

oder männlichen Erwachsenen (in der Regel Laborpersonal) entnommen.

3.2.1 Granulozytenaufreinigung

Zur Gewinnung humaner Granulozyten wurde venöses Blut in Heparinröhrchen aus der

Vena mediana cubiti abgenommen und bei Raumtemperatur verarbeitet. Im folgenden ist

das typische Vorgehen bei der Präparation von Granulozyten aus 4,5 ml humanem Vollblut

geschildert.

In einem 15 ml Polypropylenröhrchen wurden 4,5 ml Ficoll-Trennlösung 1,119 g/ml

vorgelegt und die gleiche Menge Blut vorsichtig darüber geschichtet, anschließend für 20

min bei Raumtemperatur und 800g zentrifugiert. Es resultierten von unten nach oben vier

Fraktionen: I. Erythrozyten, II. Ficoll-Zell-Gemisch (v.a. Granulozyten, vereinzelt

Erythrozyten), III. Zellschicht (vor allem Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten), IV.

Plasma.

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Methoden 30

Schicht II wurde sorgfältig abgesaugt und zweimal in

Medium gewaschen (10 min, 350g), sodann in 1 ml

Medium (3.3.1.1) aufgenommen und auf einen Percoll-

Gradienten gegeben. Der Anteil der Stammlösung

(Percoll-Trennlösung 10:1 verdünnt mit 10x PBS) in den

Schichten von unten nach oben betrug 85% bis 65% in

5% Schritten entsprechend Dichten von 1,105 g/ml,

1,100 g/ml, 1,093 g/ml, 1,087 g/ml, 1,081 g/ml. Nach

20minütiger Zentrifugation bei Raumtemperatur und

800g wurde die Zellfraktion im Bereich der 80%-85%

Interphase vorsichtig separiert und zweimal wie oben

beschrieben gewaschen.

3.2.1.1 Bestimmung der Reinheit und Vitalität

Die verwendeten Granulozyten mußten hochrein sein, um zu gewährleisten, daß die

Beobachtungen auch wirklich die Neutrophilen betrafen und nicht durch Lymphozyten

oder Monozyten bedingt waren. Deshalb wurde nach der Isolierung die Reinheit aller

eingesetzten Präparationen kontrolliert. Dazu wurde ein Zytozentrifugenpräparat der

aufgereinigten Zellen mittels Giemsa gefärbt, und mindestens einhundert Zellen wurden

gezählt. Die Reinheit gemäß typischer zellmorphologischer Kriterien lag immer über 99%.

Mittels Trypanblaufärbung wurde die Lebendigkeit der isolierten Granulozyten getestet.

Für die Experimente wurden nur Zellen einer Vitalität von über 99% verwendet.

Die Zahl der gewonnenen Granulozyten lag zwischen 1,5 x 106 und 2 x 106 pro 1 ml

Vollblut.

III. Lymphozyten,Monozyten

II. granulozytenreicheFraktion

I. Erythrozyten

IV. Plasma

Abbildung 4: Resultierende Zellschichten nach Zentri-fugation des Vollbluts auf Ficoll-Trennlösung (s. Text)

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Methoden 31

3.3 Zellkulturmedien und Kulturbedingungen

3.3.1 Zellkultur

3.3.1.1 Medium, FCS-Medium, Plasma, Serum

Als Wachstumsmedium für die Zellkultur diente RPMI 1640, das mit 50 µM 2-

Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, 100 µg/ml Penicillin G

sowie 160 µg/ml Gentamicin supplementiert wurde, im folgenden als Medium bezeichnet.

Wenn angegeben, wurde das Medium mit 10% bzw. 20% FCS oder humanem Plasma oder

Serum versetzt. Je nach Experiment wurden die Supplemente für 30 Minuten bei 56°C im

Hitzeblock „hitzeinaktiviert“ (abgekürzt als ‚hi’). Dies diente vor allem zur Ausschaltung

der Wirkung von Komponenten des Komplementsystems.

Plasma wurde nach Blutabnahme im Heparinröhrchen und Zentrifugation auf Ficoll-

Trennlösung 1,119 g/ml als Schicht IV zellfrei separiert (siehe 3.2.1). Zur Gewinnung von

Serum fand die Blutentnahme mittels Serumröhrchen statt. Nach abgelaufener Gerinnung

und Zentrifugation konnte das Serum abpipettiert werden.

3.3.1.2 Mannanbindendes-Lektin (MBL)-defizientes Serum

Das unter 4.1.5 (S. 45) und in Abbildung 10 (S. 45) als MBL-defizientes Serum

bezeichnete Serum mit einem MBL-Gehalt von 16 ng/ml (Serum 3) bzw. 12 ng/ml (Serum

4) sowie aufgereinigtes MBL (MBL/MASP complex SSI, lot MO-04, stabilisiert mit 5

mg/ml HSA) wurde freundlicherweise von Dr. J. C. Jensenius (Institut für Medizinische

Mikrobiologie und Immunologie, Universität Aarhus) zur Verfügung gestellt. Die an

gleicher Stelle erwähnten Kontrollseren enthielten 2,3 µg/ml (Serum 1) bzw. 2,8 µg/ml

(Serum 2) MBL. Aufgereinigtes MBL wurde in einer Endkonzentration von 3,3 µg/ml

verwendet (Serum mit MBL).

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Methoden 32

3.3.2 Inkubation und Stimulation

3.3.2.1 Inkubation mit Leishmania major

Die Inkubation von Zellen mit oder ohne Leishmanien und ggf. den angegebenen Zusätzen

fand - soweit nicht anders beschrieben - in 24-Loch-Platten bei 37° C und 5% CO2 statt.

Die Zellkonzentration (ohne Parasiten) betrug 106 in 1 ml Medium. Es erfolgte ggf. Zugabe

von 20% FCS, 20% Serum oder 20% Plasma (jeweilige Endkonzentrationen). Bei

Inkubationszeiten unter 30 Minuten wurde die Inkubationstemperatur von 37°C

sichergestellt, indem die Proben in ein vorgewärmtes Wasserbad innerhalb des

Brutschrankes gestellt wurden.

3.3.2.2 Blockierung des Komplementrezeptors CR3/Mac-1

Zur Blockierung des Komplementrezeptors CR3 wurden 1 x 106 Granulozyten in 1 ml

Medium für 20 Minuten bei 37°C mit dem monoklonalen, gereinigten Ratte-anti-Maus-

CD11b-IgG1 (Integrin αM chain, Mac-1 chain, 1 µg/100 µl) inkubiert, der mit humanem

CD11b kreuzreagiert (Fearon und Collins 1983). Nicht gebundener Antikörper wurde

anschließend durch Waschen in Medium entfernt. Bei Kontrollansätzen wurde ein Ratten-

IgG1-Kontrollantikörper verwendet.

3.3.3 Giemsafärbung

Ca. 0,5 x 105 Zellen wurden in 100 µl PBS in der Zytozentrifuge bei 500 Umin-1 für 5 min

auf Glasobjektträger zentrifugiert und anschließend luftgetrocknet. Die Objektträger

wurden dann 5 min lang in Methanol fixiert, erneut luftgetrocknet und schließlich für 30

min mit Giemsa-Lösung (Giemsa : ddH2O = 1 : 10) gefärbt, mit H2O gewaschen und

luftgetrocknet.

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Methoden 33

3.3.4 Auswertung

3.3.4.1 Identifikation und Zählung intrazellulärer Leishmanien

Zur Untersuchung, ob und wie viele Granulozyten Leishmanien unter unterschiedlichen

Inkubationsbedingungen aufnehmen, wurden die Zellen nach Giemsafärbung von

Zytozentrifugenpräparaten lichtmikroskopisch analysiert. Zur Bestimmung der

Leishmanienaufnahmerate wurden mindestens 100 Zellen gezählt und der Anteil mit L.

major infizierter Zellen bestimmt. Eine Zelle galt als Leishmania-positiv, wenn mindestens

ein intrazellulärer Parasit identifiziert werden konnte (siehe Abbildung 7).

3.3.4.2 Identifikation und Zählung apoptotischer Granulozyten

Ebenfalls mittels Lichtmikroskopie nach Giemsa gefärbter Präparate wurden apoptotische

Granulozyten identifiziert. Als morphologische Apoptosekriterien galten kondensiertes

Kernchromatin, fehlende Kernbrücken und ein verminderter Zelldurchmesser im Vergleich

zu „frischen“ Granulozyten.

Zur Bestimmung der Apoptoserate wurden mindestens 100 Zellen gezählt und

mikroskopisch die Anzahl der Zellen bestimmt, die den Apoptosekriterien entsprachen.

3.4 Durchflußzytometrie: Oberflächenfärbung (CD66b, CD63, CD62-L)

Die Durchflußzytometrie ist als automatisiertes Verfahren zur genauen Einzelanalyse einer

großen Zellzahl etabliert. Neben Größe und Granularität können die Zellen in Kombination

mit einer Fluoreszenzmarkierung auf eine Vielfalt von Eigenschaften untersucht werden.

Diese Technik wurde zur Analyse der Expression der Aktivierungsmarker CD66b, CD63

und CD62-L auf der Zelloberfläche sowie der Bestimmung der intrazellulären

Sauerstoffradikalproduktion (s. 3.5) eingesetzt.

105 - 106 Zellen wurden in PBS aufgenommen und mit dem oder den jeweiligen

fluoreszenzmarkierten Antikörpern (s. 2.5) 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach

anschließendem zweimaligen Waschen in PBS und Aufsuspendieren der Zellen in PBS

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Methoden 34

wurden mit Hilfe des Durchflußzytometers Größe, Granularität und Fluoreszenzintensität

von 10.000 Zellen aufgezeichnet.

Es wurden jeweils parallel Kontrollproben gemessen, die entweder nicht markiert oder mit

entsprechenden Kontrollantikörpern behandelt worden waren. Die Auswertung erfolgte mit

der Software Cellquest®. Tote und aggregierte Zellen wurden mit Hilfe einer Größen- und

Granularitätsvoreinstellung ausgeblendet.

3.5 Bestimmung der intrazellulären Sauerstoffradikalproduktion

Eine typische Funktion von Granulozyten ist die Vernichtung phagozytierter

Mikroorganismen durch Freisetzung von Sauerstoffradikalen (oxidative burst). Diese

Funktion wurde untersucht, indem fluoreszierendes Rhodamin 123 (Fluoreszenz 1, FL-1)

intrazellulär durchflußzytometrisch gemessen wurde. Es entsteht aus dem fluorogenen

Substrat Dihydrorhodamin (DHR) 123 nach Oxidation durch Sauerstoffradikale.

Es wurden 100 µl von 106 Granulozyten/ml mit 20 µl DHR inkubiert. Im Anschluß wurde

1 ml FACS lysing solution (Kitbestandteil Phagoburst®) zur Fixierung der Zellen

hinzugegeben. Die Proben wurden nach Waschen in PBS aufgenommen und mittels

Durchflußzytometrie analysiert.

3.6 Bestimmung der Vitalität intrazellulärer Leishmania major

Um die Vitalität der intrazellulären Parasiten beurteilen zu können, wurden Granulozyten

von nichtphagozytierten freien Leishmanien durch Zellsortierung getrennt und

anschließend in 10% FCS Medium bei 37°C weiter inkubiert, um die intrazelluläre

Abtötung der Parasiten durch die Granulozyten zu ermöglichen. Die Vitalität wurde dann

mittels eines Titrationskulturverfahrens bestimmt.

3.6.1 Titrationskulturverfahren (Limiting dilution)

Zur Untersuchung der Lebendigkeit von L. major im Zellinneren von Granulozyten wurde

das Titrationskulturverfahren angewandt (Laskay, Röllinghoff et al. 1993). Das Prinzip

dieses Verdünnungskulturverfahrens (Limiting dilution, LD) ist, eine Verdünnungsreihe

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Methoden 35

einer Leishmanien enthaltenden Lösung anzufertigen, zu inkubieren und zu bestimmen, bis

zu welcher Verdünnung unter Kulturbedingungen noch Parasitenwachstum feststellbar ist.

Während der Inkubationszeit teilen sich lebendige Parasiten, und in Verdünnungsstufen,

die vor Inkubation mindestens einen (bzw. 10, siehe unten) teilungsfähigen Parasiten

enthielten, kann die Teilungsaktivität mikroskopisch nachgewiesen werden.

Die Zellen wurden in eine Zweierverdünnungsreihe (n-te Verdünnung = 2-n) in 96-Loch-

Flachbodenplatten im Dreifachansatz zu je 100 µl Medium gegeben zu Kulturbedingungen

für L. major wie unter 3.1.2 beschrieben. Die Platten wurden dann bei 27°C (s. 3.1.2) für

eine Woche inkubiert, um L. major die Teilung zu ermöglichen. Das Parasitenwachstum

wurde dann für jedes Loch (= jede Verdünnungsstufe) mikroskopisch erfaßt. Die Zahl

lebendiger Leishmanien im Inneren der sortierten Granulozyten wurde dann anhand der

letzten positiven Verdünnungsstufe bestimmt. Die Verdünnungsstufe galt als positiv, wenn

in mindestens zwei der drei Parallelansätze L. major Promastigote nachweisbar waren. Bei

der Berechnung der Ausgangszahl der lebendigen Leishmanien wurde davon ausgegangen,

daß erst ab 10 Promastigoten in einer Vertiefung Wachstum lichtmikroskopisch erfaßt wird

(Solbach, Forberg et al. 1986).

3.6.2 Sortierung nach Größe und Granularität

Granulozyten wurden mit L. major in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5

für 3 Stunden bei 37°C in 1 ml Medium mit Zusatz von 20% autologem Serum, 20% FCS

oder Medium allein inkubiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und in PBS

resuspendiert. Die freien Parasiten wurden nach der Inkubation mittels des

Abbildung 5: Selektion von Granulozyten anhand Größe und Granularität in der Durchflußzytometrie. Alle Zellen, die innerhalb des gestrichelt markierten Bereiches lagen, wurden positiv selektiert und aussortiert. Freie Promastigote bilden sich entsprechend ihrer geringen Größe und Granularität v.a. links unten im Dot Plot ab.

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Methoden 36

Zellsortierapparates (cell sorter) von den Granulozyten abgesondert. Die freien

Promastigoten wurden anhand ihrer geringen Größen- und Granularitätsintensität

identifiziert (Abbildung 5). Zellaggregate sowie Zellen, an deren Oberfläche Leishmanien

lediglich adhärierten, konnten nicht völlig ausgeschlossen werden. Im Anschluß an die

Sortierung wurden die Zellen für 24 Stunden in 10% FCS Medium bei 37°C weiter

inkubiert (s. 3.3.2.1) und anschließend dem Titrationskulturverfahren zugeführt.

3.7 ELISA

Zur Untersuchung von Granulozyten als mögliche Produzenten von Zytokinen wurden die

Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins IL-8 und des antiinflammatorischen

Botenstoffes IL-1ra im Zellüberstand mittels enzymgekoppelten Immunabsorptionstest

(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) gemessen. Der IL-1ra-ELISA wurde gemäß

dem Protokoll des Testkits durchgeführt. Gleiches gilt für den IL-8-ELISA, wobei das

Prinzip sowie die Beschichtung der Platten hier kurz skizziert werden.

Eine 96-Loch-Mikrotiterplatte für ELISA wurde mit 100 µl Fangantikörperlösung (4 µg/ml

Maus anti-human IL-8 Antikörper in PBS) befüllt, die Platte abgedeckt und über Nacht bei

Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer (0,05%

Tween 20 in PBS, pH 7,4) gewaschen. Zur Blockade wurden 300 µl Blockierungspuffer

(1% BSA und 0,05% NaN3 in PBS ) in jede Vertiefung gegeben. Nach einer Inkubation für

60 min bei Raumtemperatur folgte ein weiterer Waschschritt.

Zur Bestimmung des freigesetzten IL-8 wurden 100 µl der IL-8 Standardverdünnung (0;

31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 pg/ml rekombinantes humanes IL-8, in

Probenverdünnungspuffer) sowie eine 1:10 Verdünnung der jeweils zu untersuchenden

Zellüberstände in Probenverdünnungspuffer (0,1% BSA, 0,05% Tween 20 in PBS, pH 7,3)

pro Vertiefung im Doppel eingesetzt, die Platte abgedeckt und für 2 h bei Raumtemperatur

inkubiert. Danach wurden die Platten gewaschen (s. oben). Sodann wurden 100 µl

Detektionsantikörper (20 ng/ml biotinylierter Ziege-anti-human IL-8-Antikörper) pro Loch

beigefügt und wie zuvor 2 Stunden lang inkubiert sowie gewaschen. Nun wurden 100 µl

Streptavidin-HRP (1 : 20000 einer 1,25 mg/ml Lösung) in jede Vertiefung gefüllt und die

Platten im Dunkeln für 20 min inkubiert, gewaschen und anschließend 100 µl

Substratlösung (1 : 1 Mischung aus H2O2 und Tetramethylbenzidine) hinzupipettiert. Nach

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Methoden 37

mindestens 20 min Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 50

µl Stopplösung (2N H2SO4) beendet.

Die optische Dichte der Lösungen in den einzelnen Vertiefungen wurde mit einem ELISA-

Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 570 nm

zweimal gemessen. Aus den beiden Messungen und den Werten der Doppelansätze wurde

das arithmetische Mittel gebildet und schließlich die Konzentration entsprechend der

Eichkurve errechnet.

3.8 RNase Protection Assay (RPA)

Zur Bestimmung des mRNA-Expressionsgrads unterschiedlicher Zytokine wurde der

RNase Protection Assay (RPA) gewählt. Mit diesem Verfahren ist es möglich,

verschiedene mRNA Spezies gleichzeitig zu detektieren und zu quantifizieren.

3.8.1 Isolierung und Analyse von RNA

3.8.1.1 RNA-Extraktion

Aus 5 x 107 Granulozyten pro Ansatz wurde die RNA mittels Phenol-Chloroform

extrahiert (Chomczynski und Sacchi 1987). Dazu wurden die Zellen mittels Denaturing

Solution (Guanidin-, Ammoniumthiocyanat, Natriumacetat) denaturiert, mit gesättigtem

Phenol (Phenol, Glycerol, Natriumacetat) und Chloroform extrahiert und schließlich

mittels Isopropanol gefällt und mit Ethanol gewaschen. Das getrocknete RNA-pellet wurde

in ddH2O aufgenommen und bei 60°C gelöst. Schließlich wurde die RNA-Konzentration

spektralphotometrisch bei 260 nm Wellenlänge bestimmt, wobei eine Einheit optischer

Dichte (O.D.) 40 µg RNA/ml entspricht. Das RNA/Protein-Verhältnis wurde mittels des

folgenden Quotienten abgeschätzt:

RNA / Protein = O.D. bei 260 nm / O.D. bei 280 nm

Die RNA wurde nur dann in den Experimenten verwendet, wenn dieser Quotient >1,8 war.

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Methoden 38

3.8.1.2 Analyse der mRNA-Expression mittels RNase Protection Assay

Zum besseren Verständnis soll zunächst das Prinzip des RPA erklärt werden. Der Test

gliedert sich in vier Teile: 1. Synthese der Sonden entsprechend dem Template Set; 2.

RNA-Präparation und Hybridisierung; 3. RNase Behandlung; 4. Gelauftrennung der

Hybridisierungsprodukte.

Das Template Set enthält die aus Plasmiden isolierte c-Desoxyribonukleinsäure (cDNS

bzw. cDNA), entlang der mit Hilfe der T7 RNA Polymerase 32P markierte anti-sense RNA

synthetisiert wird. Ein anschließender DNase-Verdau stoppt die Reaktion ab. Es folgt dann

eine Phenol-Chloroform-Extraktion der gewonnenen Sonden. Nun kann die zu

untersuchende RNA präpariert (s. 3.8.1.1) und über Nacht mit der markierten anti-sense

RNA (im Überschuß) hybridisiert werden. Es schließt sich die RNase-Behandlung an,

welche die Spezifität der Hybridisierung sicherstellt: wo Fehlpaarungen zur Aufhebung

des Doppelstrangs führen, greift die RNase an, freie RNA wird eliminiert. Nach einem

folgenden Proteinase-K-Verdau werden mittels Phenol-Chloroform die Hybride extrahiert

und schließlich einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.

Die Länge der Sonden ist für jedes Zytokingen unterschiedlich und bekannt. Somit ergeben

sich entsprechende Banden. Je nach Menge der Hybride ist am Ort der Banden im Gel

Radioaktivität detektierbar, die mittels Phosphoimaging quantitativ erfaßt werden kann.

Ausgehend davon, daß es in jeder Zelle Gene gibt, die unabhängig von jeglicher

Aktivierung dieser Zelle konstant exprimiert werden, sog. Housekeeping Genes, kann die

RNA-Menge im Verhältnis zum Housekeeping Gene ausgedrückt werden. So lassen sich

dann verschiedene Gene und Proben vergleichen.

Der RNase Protection Assay wurde gemäß Instruction Manual, 5th Edition, April 1998

(RiboQuant® Multi-Probe RNase Protection Assay System) mit den Template Sets hck-2

und hck-5 durchgeführt. Hck-2 beinhaltet anti-sense RNA-Sonden, die mit humaner

mRNA hybridisieren können, welche die humanen Cytokine Ltn (Lymphotactin),

RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed, and presumably secreted),

IP-10, MIP-1β, MIP-1α, MCP-1, IL-8, I-309, L32, oder GAPDH codiert; für hck-5 gilt

Entsprechendes bezüglich IL-12p35,IL-12p40, IL-10, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-6, IFNγ,

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Methoden 39

L32 und GAPDH. Das Gel wurde vakuumgetrocknet und im Anschluß auf einem Kodak

Film exponiert. Zur quantitativen Erfassung wurde eine Phosphoimaging Platte ebenfalls

aktivitätsabhängig exponiert und eingelesen.

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Ergebnisse 40

4 Ergebnisse

In den folgenden funktionellen Experimenten wurde sowohl Kulturmedium mit autologem

Spenderplasma als auch -serum eingesetzt. Die Beobachtungen der Plasmaansätze

unterschieden sich nicht signifikant von denen der Serumansätze. Deshalb wird im

folgenden vereinheitlichend von Serum gesprochen.

4.1 Die Interaktion neutrophiler Granulozyten mit Leishmania major in vitro

Die Bedeutung von Granulozyten für die Abwehr extrazellulärer Erreger ist hinreichend

bekannt. So gut wie nicht untersucht ist ihre Funktion bei Infektion mit intrazellulär

wachsenden Mikroorganismen. Am Beispiel der Interaktion mit L. major sollen

wesentliche Merkmale dieser Interaktion beschrieben werden.

4.1.1 Die etablierte Isolierungsmethode liefert reine, nichtaktivierte Granulozyten

Abbildung 6: Aufgereinigte Granulozyten. Granulozyten wurden wie in 3.2.1 beschrieben aufgereinigt, und anschließend wurde ein Zytozentrifugenpräparat nach Giemsa gefärbt.

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Ergebnisse 41

Die lichtmikroskopisch kontrollierte Reinheit der isolierten Granulozyten betrug über 99%

(Abbildung 6, S. 40). Die durchflußzytometrische Analyse der Oberflächenmarker für

Aktivierung, CD62-L und CD63, belegte, daß die Zellen durch die Aufreinigung nicht

aktiviert wurden (s. Abschnitt 4.1.6 auf Seite 46, Abbildung 11). Die folgenden Ergebnisse

dieser Arbeit wurden somit weder durch verunreinigende Zellen noch durch eine

Aktivierung der Zellen bereits vor Versuchsbeginn verfälscht. Einen zusätzlichen Beweis

der Reinheit der isolierten Granulozyten stellt die fehlende Nachweisbarkeit der mRNA

von IL-6 dar (4.2.4, S. 56), einem typischen Zytokin monozytärer Phagozyten, welches

normalerweise in stimulierten Monozyten- aber nicht in Granulozytenpräparationen

nachgewiesen werden kann (Bazzoni und Beutler 1996).

4.1.2 Granulozyten phagozytieren L. major

Es ist bekannt, daß Makrophagen L. major phagozytieren (Solbach und Laskay 2000). In

den ersten Experimenten dieser Arbeit sollte gezeigt werden, daß auch Granulozyten L.

major aufnehmen. Dazu wurden Granulozyten mit L. major koinkubiert. Es wurde

gefunden, daß Granulozyten Leishmanien aufnehmen (Abbildung 7).

L. major

{

Vakuole

L. majorL. major

{

Vakuole

Abbildung 7: Granulozyten nach Inkubation mit L. major. Granulozyten in Medium mit 20% FCS-Zusatz wurden mit Leishmanien koinkubiert (Granulozyten : L. major = 1 : 5, T=37°C, t=90 min). Zur Verdeutlichung ist links ist eine Zelle dargestellt, die nicht als L. major-positiv gewertet wurde, da L. major als Promastigote lediglich mit der Zelle assoziiert erscheint, aber nicht sicher intrazellulär liegt. In der Mitte ist ein L. major-positiver Granulozyt abgebildet mit einem internalisierten Erreger (Amastigote) nach Aufnahme, rechts eine Zelle nach Aufnahme von mehr als drei Parasiten.

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Ergebnisse 42

4.1.3 Granulozyten besitzen Mechanismen für die serumabhängige sowie die serumunabhängige Phagozytose von L. major.

Die folgenden Experimente sollten das Aufnahmeverhalten in einer Kinetik darstellen und

weiter untersuchen, ob Opsonine für die Phagozytose von Bedeutung sind. Dazu wurden

Granulozyten mit L. major Promastigoten in Zellkulturmedium mit unterschiedlichen

Zusätzen inkubiert (Abbildung 8). Die Zusätze unterschieden sich u.a. in der An- oder

Abwesenheit von Faktoren des Komplementsystems, die wesentliche Opsonine darstellen.

In allen Ansätzen konnte eine Aufnahme von Leishmanien beobachtet werden. Allerdings

zeigten sich unter den unterschiedlichen Inkubationsbedingungen verschiedene

Aufnahmekinetiken.

In der Gegenwart frischen Serums mit intaktem Komplementsystem, nahm der Großteil

25

30 90 180

75

50

10Zeit [min]

% P

MN

mit

intr

a zel

lul ä

ren

Leis

h ma n

i en

20% Serum20% hi-Serum20% hi-FCSohne Serum

25

30 90 180

75

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10Zeit [min]

% P

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h ma n

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20% Serum20% hi-Serum20% hi-FCSohne Serum

20% Serum20% hi-Serum20% hi-FCSohne Serum

Abbildung 8: Kinetik der Phagozytose von L. major Promastigoten durch Granulozyten in vitro. Granulozyten wurden mit L. major Promastigoten bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem autologem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem („hi-“) Serum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Der Prozentsatz von Granulozyten, die mindestens einen intrazellulären Parasiten aufwiesen, wurde zu den angegebenen Zeitpunkten mikroskopisch an nach Giemsa gefärbten Zytozentrifugenpräparaten bestimmt. Die gezeigten Daten stammen aus einem Experiment, welches repräsentativ für fünf durchgeführte Experimente ist.

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Ergebnisse 43

der Granulozyten innerhalb weniger Minuten L. major auf (Abbildung 8). Dieser Anteil

der Granulozyten mit intrazellulären Parasiten stieg während der folgenden dreistündigen

Inkubation lediglich geringfügig weiter an.

Hitzeinaktivierung des Serums führte zu deutlich langsamerer Aufnahme von L. major

durch Granulozyten. Innerhalb der ersten 10 Minuten enthielten höchstens 10% der Zellen

Leishmanien. Jedoch nahmen über 50% der Zellen während der folgenden Inkubation über

3 Stunden Parasiten auf (Abbildung 8). Im Ansatz mit hitzeinaktiviertem FCS nahmen

knapp 30% der Granulozyten Leishmanien innerhalb von 3 Stunden auf.

Um zu untersuchen, ob Granulozyten auch Mechanismen für die opsoninunabhängige,

direkte Erkennung und Aufnahme von Leishmanien besitzen, wurden

Phagozytoseexperimente in Medium ohne Serumzusatz durchgeführt. Unter serumfreien

Bedingungen waren 10% der Granulozyten dazu in der Lage, innerhalb von 3 Stunden

Leishmanien zu phagozytieren (Abbildung 8).

Diese Versuche zeigen, daß Granulozyten in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des

sie umgebenden Mediums unterschiedliche Mechanismen zur Phagozytose von L. major

verwenden. In Anwesenheit hitzelabiler Serumfaktoren kam es sehr schnell zur Aufnahme,

aber auch in Abwesenheit von Serum nahmen Granulozyten Leishmanien auf.

Hitzeinaktivierung von Serumfaktoren führte zu verlangsamter Aufnahme. Dies weist

darauf hin, daß Granulozyten sowohl über Mechanismen zur opsoninabhängigen als auch

zur opsoninunabhängigen Phagozytose von L. major Promastigoten verfügen.

4.1.4 Der Komplementrezeptor CR3 (Mac-1) ist von Bedeutung bei der serumunabhängigen wie auch der serumabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten.

Wie gezeigt, reduzierte die Hitzeinaktivierung des Serums die Aufnahmerate von L. major

innerhalb der ersten Minuten auf ein Minimum (Abbildung 8, S. 42). Setzt man das Serum

einer Hitzebehandlung mit 56°C aus, führt dies zur Inaktivierung hitzelabiler

Serumfaktoren, darunter Komponenten des Komplementsystems. Dies könnte dazu führen,

daß nicht genügend C3 an den entsprechenden Rezeptor CR3 auf Granulozyten binden

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Ergebnisse 44

kann. Aus diesem Grunde untersuchten wir, ob CR3 an der schnellen serumvermittelten

Aufnahme von L. major durch Granulozyten beteiligt ist. Dazu wurde CR3 auf der

Oberfläche von Granulozyten in vitro mittels anti-CD11b mAk blockiert. Dies führte

annähernd zur Halbierung der Phagozytoserate von L. major durch Granulozyten im

Vergleich zu den mit Kontrollantikörper behandelten Granulozyten (Abbildung 9 A).

Neben der Vermittlung der Aufnahme mit Komplement opsonisierter Bakterien ist der

CR3 auch entscheidend an der opsoninunabhängigen Bindung von Mikroorganismen an

Phagozyten beteiligt (Wright, Weitz et al. 1988; Talamas-Rohana, Wright et al. 1990). Aus

diesem Grund wurde der Effekt von anti-CR3 mAk auch auf die komplementunabhängige

Aufnahme von L. major durch Granulozyten analysiert, d.h. in Abwesenheit von Serum. In

vitro-Blockade des CR3 führte in Medium ohne Serum zu einer Reduktion der Aufnahme

von L. major durch Granulozyten um 30% bis 70% (Abbildung 9 B).

Diese Befunde zeigen, daß der Komplementrezeptor Typ 3 an der Vermittlung der

Aufnahme von Leishmanien durch Granulozyten wesentlich beteiligt ist. Die Phagozytose

konnte durch anti-CR3 mAk jedoch nicht komplett blockiert werden. Dies spricht dafür,

daß weitere Moleküle des Serums an der Aufnahme beteiligt sind.

0

40

80

Experiment I Experiment II

Kontrollantikörperanti-CR3 mAb

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

20% Serum

A

0

10

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läre

n Le

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n Kontrollantikörperanti-CR3 mAb

ohne Serum

B

Experiment I Experiment II

0

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Experiment I Experiment II

Kontrollantikörperanti-CR3 mAb

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Experiment I Experiment II

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Experiment I Experiment II

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n Kontrollantikörperanti-CR3 mAbKontrollantikörperKontrollantikörperanti-CR3 mAbanti-CR3 mAb

ohne Serum

B

Experiment I Experiment II

Abbildung 9: Auswirkung der Rezeptorblockade durch anti-CR3 mAk auf die Aufnahme von L. major durch Granulozyten. Granulozyten wurden mit anti-CR3 mAk für 20 min bei 37°C präinkubiert, die Kontrollansätze wurden mit einem Kontrollantikörper inkubiert. Die Granulozyten wurden dann für 2 Stunden mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit 20% frischem Serum (A) bzw. ohne Zusatz von Serum (B) inkubiert. Die Aufnahme der Parasiten wurde mikroskopisch durch die Auswertung nach Giemsa gefärbter Zytozentrifugenpräparate erfaßt.

Page 45: Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären ... · Leishmania tropica Leishmania major Leishmania mexicana Leishmania braziliensis Leishmania donovani andere Genus Leishmania

Ergebnisse 45

4.1.5 Opsonisierung mittels Mannanbindendem Lektin (MBL) trägt nicht zur serumvermittelten Aufnahme von L. major durch Granulozyten bei.

Ein Kandidat für ein solches Molekül ist das hitzelabile Mannanbindende Lektin (MBL),

das den Lektinaktivierungsweg von Komplement vermittelt (Thiel, Vorup-Jensen et al.

1997; Walport 2001).

Die mögliche Beteiligung von MBL wurde in zwei Versuchsreihen untersucht. Zuerst

wurde die Aufnahme von L. major durch Granulozyten in der Gegenwart von Serum

gesunder Spender im Vergleich zu Serum MBL-defizienter Spender verglichen. Abbildung

10 zeigt keine wesentlichen Unterschiede zwischen Normalserum und Serum mit niedriger

MBL-Konzentration. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die evt. vorhandene geringe

Restmenge an MBL ausreichend ist, eine MBL-abhängige Aufnahme zu vermitteln, wurde

serumfreiem Medium aufgereinigtes MBL zugesetzt. Die Anwesenheit von MBL im

Kulturmedium führte nicht zu einer erhöhten Aufnahme von L. major durch Granulozyten

(Abbildung 10). Somit sind zusätzlich zu Komplementfaktoren, die an CR3 binden,

ohne Serum 20% hi-FCS

B

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

20

40

60

0

A

1 2 3 4

20

40

60

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

0

MBL defizientes Serum

Normalserum ohne MBL

mit MBL

ohne Serum 20% hi-FCS

B

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

20

40

60

0

A

1 2 3 4

20

40

60

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

0

MBL defizientes Serum

Normalserum

ohne Serum 20% hi-FCS

B

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

20

40

60

0ohne Serum 20% hi-FCSohne Serum 20% hi-FCS

B

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

20

40

60

20

40

60

00

A

1 2 3 4

20

40

60

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

0

MBL defizientes Serum

NormalserumA

1 2 3 4

20

40

60

20

40

60

% G

ranu

lozy

ten

mit

intra

zellu

läre

n Le

ishm

anie

n

00

MBL defizientes Serum

Normalserum

MBL defizientes SerumMBL defizientes Serum

NormalserumNormalserum ohne MBL

mit MBL

ohne MBLohne MBL

mit MBLmit MBL

Abbildung 10: Auswirkung von MBL auf die Aufnahme von L. major durch Granulozyten. Granulozyten wurden für 10 min mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C inkubiert. A) Koinkubation in Medium mit Zusatz von 20% Normalserum zweier gesunder Spender ( ) mit 2.3 µg/ml MBL (Serum 1) bzw. 2.8 µg/ml MBL (Serum 2), oder in Medium mit Zusatz von 20% Serum zweier Patienten mit MBL-Defizienz ( ) mit 16 ng/ml (Serum 3, Allotyp LYPB/HYPD) bzw. 12 ng/ml MBL (Serum 4, Allotyp LXPA/LYPB). B) Koinkubation ohne ( ) bzw. mit 3.3 µg/ml aufgereinigtem MBL ( ) in Medium ohne Serumzusatz oder mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS (hi-FCS). Die Daten stammen aus einem repräsentativen von zwei durchgeführten Experimenten.

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Ergebnisse 46

weitere und von MBL verschiedene hitzelabile Serumfaktoren an der serumvermittelten

Phagozytose von L. major durch Granulozyten beteiligt.

4.1.6 Nur die opsoninabhängige Aufnahme von Leishmanien aktiviert die Granulozyten.

Nachdem gezeigt war, daß Granulozyten prinzipiell zur Aufnahme von Leishmanien in der

Lage sind, untersuchten wir, ob mit Parasiten infizierte Granulozyten auch antimikrobielle

Effektormechanismen aktivieren können. Zunächst wurde die Oberflächenexpression von

A

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

92%

7%

91%92%

87%91%

3%

12%8%

96%8%7%

∅L. m

ajor+ L. m

ajor

ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum

BCD66b

CD

62-L

CD66b (mittlere Fluoreszenz) ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum

260 401 474 ∅ L. major 246 376 1306 + L. major

A

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

100 101 102 103 104

100

101

102

103

104

92%

7%

91%92%

87%91%

3%

12%8%

96%8%7%

∅L. m

ajor+ L. m

ajor∅

L. major

+ L. major

ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serumohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum

BCD66b

CD

62-L

CD66b (mittlere Fluoreszenz) ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum

260 401 474 ∅ L. major 246 376 1306 + L. major

Abbildung 11: Auswirkungen von L. major auf die Oberflächenexpression von CD62-L und CD66b auf Granulozyten. Granulozyten wurden für 90 min mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Die Granulozyten wurden anschließend mit FITC-konjugiertem mAk gegen CD66b und mit PE-konjugiertem mAk gegen CD62-L markiert und mittels Durchflußzytometrie analysiert. Gemäß der Quadranteneinteilung bezeichnen die Prozentwerte rechts oben die CD62-L-positiven Granulozyten, die Prozentzahlen rechts unten die CD62-L-negativen (A). Die Werte der mittleren Fluoreszenz der CD66b-Färbung sind unter B dargestellt.

Page 47: Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären ... · Leishmania tropica Leishmania major Leishmania mexicana Leishmania braziliensis Leishmania donovani andere Genus Leishmania

Ergebnisse 47

CD62-L und CD66b auf Granulozyten analysiert. CD62-L gilt als

Standardaktivierungsmarker für Granulozyten. Nichtaktivierte Zellen sind CD62-L positiv,

während aktivierte Zellen CD62-L negativ sind. Umgekehrt wird CD66b nach Aktivierung

auf höherem Niveau exprimiert. Die Daten in Abbildung 11 A (obere Reihe, „Ø L. major“,

S. 46) zeigen, daß in der Tat die in den Experimenten eingesetzten Granulozyten nicht

aktiviert waren, da sie zu rund 90% CD62-L positiv waren, bei gleichzeitig relativ

niedriger Expression von CD66b (Abbildung 11 A und B, S. 46).

Die Koinkubation der Granulozyten mit L. major führte in der Gegenwart von

Spenderserum zur Aktivierung der Granulozyten (Verlust von CD62-L-Expression,

verstärkte Ausprägung von CD66b, Abbildung 11, S. 46) zeigen konnten. Im Gegensatz

hierzu führte die Koinkubation von L. major mit Granulozyten in der Gegenwart

hitzeinaktivierten FCS oder in serumfreiem Medium nicht zur Zellaktivierung. Die

Granulozyten behielten die starke CD62-L-Expression bei (Abbildung 11 A), die von

CD66b (Abbildung 11 B) war nicht erhöht. Der ausgeprägte Aktivierungsgrad korrelierte

in den Serumansätzen mit der hohen Zahl phagozytierter Leishmanien, die niedrige

Aufnahmerate in Abwesenheit von Serumfaktoren mit der ausbleibenden Aktivierung der

Granulozyten. Die Daten in Abbildung 11 zeigen somit, daß die Aufnahme von L. major

nur dann zur Neutrophilenaktivierung führte, wenn Serumfaktoren als Opsonine zur

Verfügung standen.

4.1.7 Die opsoninabhängige Aufnahme von Leishmanien führt zur Sauerstoffradikalproduktion in Granulozyten.

Nach Aufnahme von Bakterien durch Granulozyten kommt es in der Regel zur Produktion

reaktiver Sauerstoffintermediate (oxidative burst), die zur Vernichtung der phagozytierten

Bakterien führt. Um zu überprüfen, ob dies auch in der Infektion mit eukaryonten Erregern

wie L. major der Fall ist, wurde nach Koinkubation von Granulozyten mit L. major die

Produktion intrazellulärer Sauerstoffradikale mittels Durchflußzytometrie gemessen. In der

Gegenwart frischen Serums reagierten gut 40% der Zellen mit einer oxidativen Antwort

auf die Stimulation mit Promastigoten (Abbildung 12, S. 48). Nur rund 15% der Zellen

dagegen zeigten eine erhöhte Sauerstoffradikalproduktion, wenn dem Medium

hitzeinaktiviertes Serum zugesetzt wurde. In Abwesenheit von Serum unterblieb die

oxidative Antwort nahezu gänzlich (Abbildung 12).

Page 48: Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären ... · Leishmania tropica Leishmania major Leishmania mexicana Leishmania braziliensis Leishmania donovani andere Genus Leishmania

Ergebnisse 48

4.1.8 Der oxidative burst tötet Leishmanien ab.

Es stellte sich anschließend die Frage, welche Konsequenz die Induktion der

Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten für die Parasiten hat. Zur Beantwortung

dieser Frage wurde die Lebendigkeit der intrazellulären Leishmanien untersucht. Nach

zweistündiger Koinkubation von Granulozyten mit L. major (im Verhältnis 1 : 5) wurden

die freien, nicht phagozytierten Parasiten von Granulozyten mittels FACS-Sortierung

getrennt. Anschließend wurde die Zahl der lebendigen Parasiten mittels des Limiting-

Dilution-Verfahrens (3.6.1, S. 34) bestimmt. In der Gegenwart von Serum war der Anteil

der lebendigen Leishmanien sehr gering. Diese wenigen Parasiten wurden nach Inkubation

20% hi-FCS 20% SerumOhne Serum0 % 0.1 %

14 %14 % 43 %43 %

0.2 %

2 %

(O2-

Rad

ikal

prod

uktio

n)

∅L. m

ajor+ L. m

ajor

SSC

FL-1

20% hi-FCS 20% SerumOhne Serum0 % 0.1 %

14 %14 % 43 %43 %

0.2 %

2 %

(O2-

Rad

ikal

prod

uktio

n)

∅L. m

ajor+ L. m

ajor

SSC

FL-1

Abbildung 12: Auswirkungen von L. major auf die Induktion der Sauerstoffradikalproduktion durch Granulozyten. Granulozyten wurden bei 37°C mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 für 10 min in Medium inkubiert mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz. Die Sauerstoffradikalproduktion durch Granulozyten wurde untersucht mittels des fluorogenen Substrats Dihydrorhodamin 123, welches nach Interaktion mit Sauerstoffradikalen zu einem fluoreszierendem Produkt oxidiert wird und durchflußzytometrisch (FL-1) quantifiziert werden kann. In der linken oberen Ecke ist der Prozentteil der sauerstoffradikalpositiven Zellen angegeben. Zur Bestimmung des Schwellenwertes in FL-1, ab dem Granulozyten als ‚burst-positiv’ galten, dienten mit Phorbol-12-myristyl-13-azetat (PMA) stimulierte Granulozyten (Phagoburst®-Protokoll), in denen zu 99% - 100% die Sauerstoffradikalproduktion induziert wird. Im dargestellten Experiment resultierte als Schwellenwert eine relative Fluoreszenz von 103.

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Ergebnisse 49

der infizierten Granulozyten bei 37°C für einen weiteren Tag nahezu vollständig eliminiert

(Abbildung 13). In der Gegenwart von hitzeinaktiviertem FCS war der Anteil der

lebendigen Leishmanien hoch, und 50% der intrazellulären Parasiten waren nach weiterer

Inkubation der infizierten Granulozyten für einen Tag noch lebendig (Abbildung 13).

Obwohl sich nur eine niedrige Aufnahme von L. major unter serumfreien Bedingungen

fand, war der Grad Lebendigkeit nach eintägiger Fortinkubation bei 37°C hoch (Abbildung

13).

Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Mehrheit der Parasiten, die in Anwesenheit von

Serum aufgenommen worden waren, sofort von den Granulozyten getötet wurde. Die

wenigen überlebenden Parasiten wurden dann innerhalb eines weiteren Tages nahezu

vollständig eliminiert. Dagegen überlebten die intrazellulären Leishmanien in Ansätzen mit

hitzeinaktiviertem Serum oder in Medium ohne Serumzusatz.

Abbildung 13: Die Lebendigkeit intrazellulärer Leishmanien in Granulozyten.

Anza

hl le

bend

iger

Lei

shm

anie

n in

104

Gra

nulo

zyte

n

1000

2000

ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum

Anza

hl le

bend

iger

Lei

shm

anie

n in

104

Gra

nulo

zyte

n

1000

2000

ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum

Granulozyten wurden für 2 Stunden mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Granulozyten wurden anschließend von nicht phagozytierten Promastigoten mittels FACS-Sortierung getrennt, anschließend in 10% FCS Medium bei 37°C für 24 h weiter inkubiert, um die intrazelluläre Abtötung der Parasiten durch die Granulozyten zu ermöglichen. Die Vitalität von L. major wurde dann mittels eines Titrationskulturverfahrens (LimitingDilution, LD) bestimmt (s. 3.6.1). Die Ordinate zeigt die aus dem LD-Verfahren berechnete Anzahl der lebendigen Parasiten pro 104

Granulozyten (Mittelwert aus 3 parallelen Ansätzen (± SD)).

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Ergebnisse 50

4.1.9 In Abwesenheit von Serumfaktoren zögert Leishmania major die Apoptose der Granulozyten hinaus.

Die Lebenszeit von Granulozyten im Körper beträgt maximal ein bis zwei Tage (Lloyd

und Oppenheim 1992). In vivo weisen die Zellen bereits nach 24 Stunden Zeichen der

Apoptose auf (Savill, Wyllie et al. 1989). In vitro zeigen Granulozyten schon nach

wenigen Stunden in Zellkulturmedium Merkmale der Apoptose (Abbildung 14, rechts).

Bei den mikroskopischen Auswertungen der bisherigen Experimente war wiederholt

aufgefallen, daß in Anwesenheit von Leishmanien nach wenigen Stunden dagegen kaum

morphologisch apoptotische Granulozyten zu finden waren (Abbildung 15). Um dies

23

123

123

1Abbildung 14: Unterschied zwischen nicht apoptotischen (links) und apoptotischen (rechts) Granulozyten. (1) Chromatin, bei Apoptose kondensiert; (2) Kernbrücken, bei Apoptose aufgehoben; (3) Zelldurchmesser, bei Apoptose vermindert

ohne L. major mit L. major

Abbildung 15: Das Apoptoseverhalten von Granulozyten in Medium mit und ohne L. major. Granulozyten wurden allein bzw. mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : Leishmanien Verhältnis von 1 : 5 für 12 Stunden bei 37°C in Medium inkubiert, anschließend die nach Giemsa gefärbten Präparate fotografiert.

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Ergebnisse 51

weiter zu untersuchen, wurden Granulozyten in unterschiedlichen Ansätzen mikroskopisch

auf morphologische Charakteristika der Apoptose untersucht.

Nach 24 Stunden Inkubation in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS

zeigten Granulozyten ohne L. major zu 86% (± 1%) morphologische Merkmale der

Apoptose. Dagegen reduzierte sich die Apoptoserate nach Koinkubation der Granulozyten

mit Leishmanien auf 11% bis 54% (Abbildung 16).

Die dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Leishmanien offenbar in das Apoptoseprogramm

der sonst kurzlebigen Granulozyten eingreifen und deren Eintreten in die Apoptose

hinauszögern.

4.2 Der Einfluß der Leishmanien auf die Zytokinsekretion durch Granulozyten

Die bisher gezeigten Ergebnisse haben belegt, daß Granulozyten Leishmanien aufnehmen

und dies Konsequenzen für die Zellfunktionen der Granulozyten hat, wie etwa für die

Produktion von Sauerstoffradikalen oder die Veränderung des Apoptoseverhaltens. In den

folgenden Experimenten ging es darum zu untersuchen, wie die Zytokinproduktion durch

die Infektion verändert wird.

20% hi-FCS

ohne L. majormit L. major

% a

popt

otis

che

Gra

nulo

zyte

n

0

20

40

60

80

100

Exp. I Exp. II Exp. III

20% hi-FCS

ohne L. majormit L. majorohne L. majorohne L. majormit L. majormit L. major

% a

popt

otis

che

Gra

nulo

zyte

n

0

20

40

60

80

100

Exp. I Exp. II Exp. III

Abbildung 16: Apoptoserate infizierter und nicht infizierter Granulozyten. Granulozyten wurden ohne (□) bzw. mit (■) L. major für 24 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS (hi-FCS) inkubiert. An nach Giemsa gefärbten Zytospinpräparaten wurde mikroskopisch der Prozentsatz von Granulozyten bestimmt, die morphologische Apoptosemerkmale aufwiesen. Dargestellt sind drei voneinander unabhängige Experimente (Exp. I-III), es wurden jeweils mindestens 100 Zellen gezählt.

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Ergebnisse 52

4.2.1 L. major induziert die Bildung proinflammatorischer Zytokine durch Granulozyten.

Es ist bekannt, daß die frühe entzündliche Reaktion des infizierten Gewebes für die

Ausbildung einer spezifischen Immunantwort auf L. major bestimmend ist (Solbach und

Laskay 2000). Granulozyten bilden den Großteil des frühen entzündlichen Infiltrats. Sie

sind zur Produktion verschiedener Zytokine fähig (Cassatella 1999) und spielen somit eine

mögliche Rolle bei der Entwicklung einer spezifischen Immunantwort. Um dies zu

untersuchen, wurde die durch L. major induzierte Erzeugung pro- bzw.

antiinflammatorischer Zytokine durch Granulozyten geprüft.

Zunächst wurden die Sekretion sowie die mRNA-Expression des proinflammatorischen

chemotaktischen Zytokins (Chemokin) IL-8 untersucht. Dazu wurden Granulozyten mit

und ohne L. major für 2 bzw. 24 Stunden inkubiert. In Medium ohne Zusatz oder mit

hitzeinaktiviertem FCS blieb die Sekretion von IL-8 nach 2 Stunden mit und ohne L. major

mit unter 80 pg/ml niedrig (Tabelle 3, obere Zeilen, links und Mitte), in der Gegenwart von

Serum lag sie mit bis zu 211 pg/ml höher (Tabelle 3, obere Zeilen, rechts). Nach 24

Stunden ließ sich im Kulturüberstand in Gegenwart von L. major innerhalb aller drei

Ansatzgruppen eine deutliche Steigerung des Gehalts an IL-8 nachweisen (Tabelle 3,

untere Zeilen). Am deutlichsten war diese Steigerung in der Gegenwart von Serum mit

einer Steigerung auf über 3400 pg/ml in den Ansätzen mit L. major gegenüber den 24-

Stunden-Kontrollen ohne L. major (maximal 85 pg/ml, Tabelle 3, untere Zeilen, rechts).

Im FCS-Ansatz war diese Steigerung ebenfalls deutlich (Tabelle 3, Mitte), in der Gruppe

IL-8 Gehalt in pg/ml im Kulturüberstand von Granulozyten in Medium

ohne Serum mit 20% hi-FCS mit 20% Serum Inkubations-zeit ∅ +L. major ∅ +L. major ∅ +L. major

Exp I

2

3

72

11

85

211

2 Stunden Exp II 2 17 2 52 2 97 Exp III 18 283 47 1892 25 3994 24 Stunden

Exp IV

41 349 65 2433 85 3438

Tabelle 3: L. major stimuliert die Sekretion von IL-8 durch Granulozyten. Granulozyten wurden mit L. major Promastigoten für 2 und 24 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium ohne Zusatz oder mit Zusatz von entweder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder 20% frischem Spenderserum inkubiert. Der IL-8 Gehalt des Kulturüberstands wurde mittels ELISA bestimmt.

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Ergebnisse 53

mit Medium ohne Zusatz blieb der gemessene Gehalt von IL-8 im Kulturüberstand auch in

Anwesenheit von Leishmanien mit unter 350 pg/ml vergleichsweise niedrig (Tabelle 3,

links).

Dieses beobachtete Sekretionsverhalten der Granulozyten zeigt, daß innerhalb von 24

Stunden die Freisetzung von IL-8 durch L. major induziert wird. Dies ist insbesondere in

der Gegenwart von Serum der Fall.

Es wäre möglich, daß die Dauer der Proteinbiosynthese von IL-8 ursächlich für diese

Latenzzeit ist. Deshalb wurde untersucht, ob L. major die IL-8-Produtkion auch auf

mRNA-Ebene stimuliert.

Dazu wurden Granulozyten für 3 Stunden mit bzw. ohne L. major inkubiert. Im Anschluß

daran wurde die RNA der Zellen isoliert, parallel auch RNA von frisch isolierten

Granulozyten ohne Inkubation. Die RNA wurde schließlich mittels RNase Protection

Assay (RPA) untersucht, einem semiquantitativem Verfahren, mit welchem mRNA-

Sequenzen wie z.B. von IL-8 mittels einer radioaktiv markierten Sonde spezifisch

nachgewiesen werden können (3.8, S. 37). Sowohl in frischen als auch in inkubierten

Granulozyten fand sich IL-8-mRNA (Abbildung 17, S. 54). Zur relativen Quantifizierung

wurden die detektierten Aktivitäten von IL-8 mit der jeweiligen Aktivität von L32

verglichen, einem Gen, dessen Expression konstant angenommen wird (housekeeping

gene). Es zeigte sich, daß sich die detektierten mRNA-Mengen von IL-8 für Granulozyten

nach Koinkubation mit und ohne Leishmanien kaum voneinander unterschieden und auch

ohne Inkubation die gleiche IL-8-mRNA-Menge nachzuweisen war (Abbildung 17). Somit

führt die Koinkubation von Granulozyten mit L. major zur Sekretion präformierten IL-8.

IL-1 ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das wie IL-8 u.a. chemotaktisch auf

Neutrophile wirkt. Im Gegensatz zum hauptsächlich membrangebundenen IL-1α wird IL-

1β sezerniert. Die Produktion von IL-1β-mRNA wurde parallel mit der von IL-8

untersucht.

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Ergebnisse 54

Im Gegensatz zu IL-8 war in der RNA nichtinkubierter Granulozyten keine mRNA von IL-

1β zu detektieren (Abbildung 17). Nach 3 stündiger Inkubation ohne L. major wurde IL-

1β-mRNA nachgewiesen, in Gegenwart von Leishmanien war die Aktivität zudem deutlich

erhöht (Abbildung 17).

Dies bedeutet, daß Leishmanien die Produktion von IL-8 mRNA durch Granulozyten nicht

induzieren, sondern daß IL-8-mRNA konstitutiv in Granulozyten vorliegt. Dagegen liegt

die IL-1β-mRNA nicht konstitutiv vor, sondern wird durch L. major induziert. Somit

wurde nachgewiesen, daß L. major auf zwei unterschiedlichen Wegen die Kommunikation

von Granulozyten mit dem Immunsystem beeinflußt: erstens können Leishmanien eine

Steigerung der Sekretion eines Proteins, wie im Falle von IL-8 gezeigt, bewirken, und

zweitens wird die Proteinbiosynthese auf mRNA-Ebene stimuliert, wie z. B. im Falle von

IL-1β.

StundenL. major

3+

L32

IL-1β

IL-1ra

IL-8

MIP-1β

MIP-1α

L32

3+

PMN PMN

StundenL. major

3+

L32

IL-1β

IL-1ra

IL-8

MIP-1β

MIP-1α

L32

3+

PMN PMN

Abbildung 17: Zytokingenexpression von Granulozyten nach Inkubation mit L. major. Granulozyten wurden mit bzw. ohne L. major Promastigoten für 0 und 3 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS inkubiert. Die Zytokingenexpression wurde mittels RNase-Protection-Assay (RPA) untersucht. Als Mengenbezug diente das Housekeeping Gen L32. Zu diesem sind die einzelnen Zytokinbanden in Bezug zu setzen: obwohl die IL-8-Bande nach dreistündiger Inkubation mit L. major (ganz rechts) absolut schwächer ist als die der Ansätze ohne Inkubation mit L. major (links daneben) so ist der Quotient aus den Grauwerten von IL-8 und L32 desselben Ansatzes größer als in den Ansätzen ohne L. major. Die absoluten Zahlen wurden mittels der Phosphoimaging Software TINA 2.0® ermittelt (nicht dargestellt).

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Ergebnisse 55

4.2.2 L. major induziert die Produktion von mRNA der Chemokine MIP-1α und MIP-1β, aber nicht von Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 und I-309.

Zur genaueren Beschreibung der Rolle von Granulozyten als Produzenten chemotaktischer

Zytokine wurde das Spektrum der untersuchten Chemokin-mRNA erweitert. Dazu wurde

analog zur mRNA-Untersuchung von IL-8 und IL-1β aus Granulozyten direkt nach

Aufreinigung bzw. nach 3 stündiger Koinkubation mit und ohne Leishmanien mRNA

isoliert und mittels RPA analysiert.

Die mRNA der Chemokine MIP-1α und MIP-1β wurde nicht konstitutiv exprimiert. Eine

leichte Expression der Zytokin-mRNA war jedoch nach dreistündiger Kultivierung der

Granulozyten in vitro ohne L. major nachweisbar (Abbildung 17, S. 54). Koinkubation von

Granulozyten mit L. major für drei Stunden führte zu hochgradiger Expression von MIP-

1α und MIP-1β (Abbildung 17). Dagegen konnte in keinem der Ansätze mRNA der

Chemokine Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 oder I-309 nachgewiesen werden (nicht

dargestellt).

Dies belegt, daß in Granulozyten die mRNA-Produktion weiterer Chemokine wie MIP-1α

und MIP-1β durch L. major induziert wird. Die fehlende Induktion von Ltn, RANTES, IP-

10, MCP-1 und I-309 zeigt, daß es sich nicht um eine generelle Aktivierung der

Zytokingentranskription handelt, sondern selektiv proinflammatorische Botenstoffe

gebildet werden.

4.2.3 Granulozyten exprimieren die mRNA des antiinflammatorischen Zytokins IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra) konstitutiv und unabhängig von L. major.

Analog zur Sekretion der proinflammatorischen Zytokine wurde auch der

antiinflammatorische Botenstoff IL-1ra untersucht. Die ELISA-Experimente ergaben, daß

Leishmanien die IL-1ra-Freisetzung durch Granulozyten nicht signifikant beeinflussen

(nicht dargestellt).

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Ergebnisse 56

Demgegenüber konnte die konstitutive Produktion von IL-1ra-mRNA mittels RPA

eindeutig nachgewiesen werden. Es kam aber nicht zur Induktion der mRNA durch

dreistündige Inkubation mit oder ohne L. major (Abbildung 17, S. 54).

Aus den dargestellten Ergebnissen läßt sich ableiten, daß Granulozyten grundsätzlich in

der Lage sind, den antiinflammatorischen Botenstoff IL-1ra zu produzieren und somit

entzündungsbegrenzende Kapazität haben. Infektion mit L. major fördert aber weder auf

RNA- noch auf Proteinebene die IL-1ra-Produktion, anders als bei den gegensätzlich

wirkenden proinflammatorischen Zytokinen IL-1β bzw. IL-8.

4.2.4 mRNA von IL-6, IL-10, IL-12 oder IFN-γ in Granulozyten lag weder konstitutiv noch durch L. major induziert vor.

Die L. major-Infektion ist Modell für die Etablierung einer TH1- bzw. TH2-

Immunantwort, die jeweils durch ein bestimmtes Zytokinprofil charakterisiert sind

(Solbach und Laskay 2000). Dazu gehören auf der TH1-Seite u.a. IFN-γ und IL-12 und auf

der TH2-Seite IL-6 und IL-10. NK-Zellen, Monozyten und Makrophagen sind als

Produzenten der jeweiligen immunologischen Botenstoffe gut charakterisiert. Ob

Granulozyten eventuell selbst direkt an der Ausbildung des einen oder anderen Typs der

Immunreaktion beteiligt sind, sollte durch die mRNA-Analyse spezifischer TH1- bzw.

TH2-Zytokine beleuchtet werden.

Mittels RPA wurde mRNA untersucht, die aus Granulozyten unmittelbar nach

Aufreinigung aus dem Blut oder nach Inkubation mit oder ohne L. major für 3 Stunden

isoliert worden war. Es fand sich kein Signal für IL-6, IL-10, IL-12 oder IFN-γ (nicht

dargestellt).

Somit stellen Granulozyten allein und auch nach Stimulation mit L. major keine Quelle der

genannten Zytokine dar, bilden also nicht unmittelbar die charakteristischen Zytokine, die

für die Ausbildung einer TH1- bzw. TH2-Immunantwort verantwortlich sind. Darüber

hinaus spricht der fehlende Nachweis von mRNA des monozytentypischen IL-6 gegen eine

Kontamination der Kulturen mit Monozyten und somit für einen granulozytenspezifischen

Nachweis aller vorhandenen mRNA.

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Diskussion 57

5 Diskussion

In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Granulozyten mit dem intrazellulären

Krankheitserreger L. major untersucht. Dies geschah vor dem Hintergrund, daß erstens die

Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern im Gegensatz zu

extrazellulären kaum untersucht ist, und zweitens Granulozyten als Regulatorzellen der

unspezifischen Abwehr wenig erforscht sind. Die Bedeutung der Interaktion zwischen

Granulozyten und L. major wird durch die Tatsache unterstrichen, daß innerhalb der ersten

Stunden Granulozyten sehr schnell an den Ort einer subkutanen Infektion der Maus

rekrutiert werden (Müller, van Zandbergen et al. 2001), aber erstaunlicherweise nur wenig

über ihre Bedeutung bei der menschlichen Infektion bekannt ist.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Granulozyten in der Interaktion mit dem intrazellulären

Krankheitserreger L. major eine vielfältige Rolle spielen. Die hier dargestellten Ergebnisse

zeigen, daß opsonisierte Leishmanien von Granulozyten phagozytiert werden und diese

aktivieren. Die Aktivierung wurde funktionell durch den Nachweis der Produktion von

Sauerstoffintermediaten (ROI) belegt. Aktivierte Granulozyten sind in der Lage, innerhalb

von 24 Stunden die Mehrzahl der Parasiten abzutöten. Nicht opsonisierte Leishmanien

werden ebenfalls aufgenommen, jedoch langsamer. Die Granulozyten werden dabei nicht

aktiviert, die ROI-Produktion bleibt aus, und der Großteil der intrazellulären Erreger

überlebt. Die Untersuchungen führten zu der neuen Erkenntnis, daß die Infektion mit L.

major die Apoptose der kurzlebigen Granulozyten um 24 bis 48 Stunden hinauszögert.

Weiter wurde erstmalig gezeigt, daß L. major die Sekretion von IL-8 durch Granulozyten

hervorruft und die mRNA-Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-1β sowie der

Chemokine MIP-1α und MIP-1β induziert.

Die Experimente erwiesen, daß Granulozyten über unterschiedliche

Phagozytosemechanismen verfügen. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Funktion

der Granulozyten und damit auch das Schicksal der Parasiten davon abhängt, wie L. major

in die Zelle aufgenommen wird. Welcher dieser Mechanismen sich die Granulozyten zur

Aufnahme von L. major hauptsächlich bedienen, liegt in der Zusammensetzung des

Milieus begründet, das sie umgibt. Während beispielsweise in Medium ohne Serum keine

Komplementfaktoren enthalten sind, stehen diese bei Zusatz frischen Serums zur

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Diskussion 58

Verfügung. Zusammen mit anderen hitzelabilen Faktoren können sie für die schnelle

Aufnahme von L. major durch Granulozyten verantwortlich gemacht werden.

Es ist bekannt, daß an der komplementvermittelten Phagozytose durch Neutrophile der

Komplementrezeptor CR3 beteiligt ist (Witko-Sarsat, Rieu et al. 2000). Durch Blockierung

dieses Rezeptors mittels Antikörper wurde die Aufnahme von Leishmanien durch

Granulozyten deutlich reduziert. Dies belegt, daß CR3-abhängige Mechanismen an der

Phagozytose von L. major durch Granulozyten wesentlich beteiligt sind. Die Aktivierung

des alternativen Wegs der Komplementkaskade mit resultierender Ablagerung von C3b auf

der Oberfläche von L. major Promastigoten wurde beschrieben (Mosser und Edelson 1987;

Puentes, Da Silva et al. 1990) ebenso wie deren CR3-vermittelte Aufnahme durch

Makrophagen (Mosser, Vlassara et al. 1987). Die hier dargestellten Resultate zeigen, daß

offenbar nicht nur Makrophagen, sondern auch Granulozyten über vergleichbare CR3-

bedingte Aufnahmemechanismen verfügen.

Die Blockierung von CR3 auf Granulozyten führte zu einer Reduktion der Phagozytoserate

um 30% bis 70%. Dies bedeutet, daß dieser Rezeptor nicht nur an der oben diskutierten

opsoninabhängigen, sondern auch an der opsoninunabhängigen Ingestion von L. major

durch Granulozyten beteiligt ist. Von Makrophagen ist eine serumunabhängige Bindung

des Oberflächenmoleküls LPG von Leishmania mexicana an eine CR3-Untereinheit

bekannt (Talamas-Rohana, Wright et al. 1990). Für Granulozyten wurde die Fähigkeit zur

opsoninunabhängigen, aber CR3-vermittelten Phagozytose bei Streptokokken der Gruppe

B gezeigt (Antal, Cunningham et al. 1992). Die CR3-Beteiligung an der

opsoninunabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten ist allerdings hier

erstmals direkt belegt.

Auf der anderen Seite zeigten die Blockierungsexperimente, daß zusätzlich zu CR3 weitere

Oberflächenmoleküle an der Aufnahme von L. major und deren Bindung an die

Granulozytenoberfläche beteiligt sein müssen, da die Zugabe von anti-CR3-Antikörper zu

Granulozyten nur zur teilweisen Blockierung der Phagozytose von L. major führte. Ein

weiterer, serumabhängiger Mechanismus, der zu einer CR3-unabhängigen Aufnahme von

L. major durch Granulozyten führt, könnte die Opsonisierung der Parasiten mit natürlichen

Antikörpern sein, die an Fcγ-Rezeptoren auf Granulozyten binden. Eine solche

Phagozytose mit Antikörpern opsonisierter Mikroorganismen durch Granulozyten wurde

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Diskussion 59

bereits beschrieben (Witko-Sarsat, Rieu et al. 2000), und natürliche Antikörper, die an

Leishmanien binden, konnten in frischen Seren nachgewiesen werden (Schmunis und

Herman 1970).

Die langsamere Phagozytoserate von L. major durch Granulozyten nach Hitzeinaktivierung

des Serums zeigte, daß hitzelabile Komponenten die schnelle Aufnahme vermitteln. Dazu

gehören Komplementfaktoren, aber auch das Mannanbindende Lektin (MBL), eine

hitzelabile Serumkomponente, deren wichtige Rolle bei der Komplementaktivierung und

der Phagozytose von Mirkoorganismen durch Phagozyten bereits gezeigt wurde (Vorup-

Jensen, Jensenius et al. 1998). MBL hat einen opsonisierenden Effekt und erhöht die

Aufnahmerate mannosereicher Pathogene durch Granulozyten (Kuhlman, Joiner et al.

1989). Es bindet an endständige Mannosereste des Lipophosphoglykans auf der Oberfläche

von Leishmanien und wirkt als Aktivator der Komplementkaskade. Die Anheftung des

MBL an die Oberfläche promastigoter Leishmanien stellt einen zusätzlichen Mechanismus

der C3b-Bildung dar, welche die Bindung an Makrophagen mitbewirkt (Green, Feizi et al.

1994). Experimente in dieser Arbeit mit MBL-defizienten Seren und aufgereinigtem MBL

unterstützten allerdings diese Bedeutung von MBL für die Opsonisierung bei der

serumabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten nicht. Also müssen neben

Komplementfaktoren, die an CR3 binden, weitere hitzelabile Serumfaktoren existieren, die

sich von MBL unterscheiden und an der serumvermittelten Aufnahme promastigoter

Leishmanien durch Granulozyten beteiligt sind.

In den Experimenten ohne frisches Serum war eine Aufnahme zu beobachten, die im Fall

von Granulozyten in Medium mit hitzeinaktiviertem FCS zwar langsam war, aber

letztendlich zu einer hohen Aufnahmerate führte. In verschiedenen Untersuchungen konnte

die Aufnahme von Bakterien durch Granulozyten in Abwesenheit von Antikörpern und

Komplement demonstriert werden (Ofek, Goldhar et al. 1995; Dong und Murphy 1997;

Estabrook, Zhou et al. 1998) ebenso die serumunabhängige Aufnahme von Leishmanien

durch deren direkte Bindung an den Mannoserezeptor auf Makrophagen (Wilson und

Pearson 1986; Wilson und Pearson 1988). Aber da Granulozyten den Mannoserezeptor

nicht exprimieren, ist ein davon verschiedener Mechanismus der Leishmanienbindung an

Granulozyten unter serumfreien Bedingungen noch zu erforschen.

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Diskussion 60

Granulozyten sind somit in der Lage, Leishmanien in den verschiedenen Milieus auf

unterschiedliche Art und Weise aufzunehmen. Dabei konnten zum Teil neue und zum Teil

im Zusammenhang mit anderen Erregern oder bei Makrophagen beschriebene

Mechanismen identifiziert werden. Es wurde gefunden, daß CR3 maßgeblich an der

Aufnahme von L. major durch Granulozyten beteiligt ist. Entscheidend für die

Interpretation dieser Ergebnisse ist allerdings die Frage, welche Konsequenzen sich aus

den unterschiedlichen Aufnahmewegen für die Abwehr der Parasiten ergeben.

Eine Granulozyten-Erreger-Interaktion hat in der Regel eine Aktivierung der Zelle zur

Folge. Eine artifizielle Aktivierung der Granulozyten durch die Aufreinigung mußte zur

weiteren funktionellen Untersuchung der Zellen zunächst ausgeschlossen werden, denn

Aktivierung und Degranulation durch unterschiedliche Isolierungsmethoden von

Granulozyten sind in der Literatur beschrieben (Haslett, Guthrie et al. 1985; Kuijpers, Tool

et al. 1991). Die in dieser Arbeit angewandte Methode zur Granulozytenaufreinigung

stellte den Einsatz nicht voraktivierter Granulozyten sicher, wie die hohe CD62-L-

Expression der isolierten Zellen bewies. Dies wurde durch die Vermeidung eines

hypotonen Lyseschritts zur Beseitigung der Erythrozyten erreicht, indem diese mittels

Dichtegradient separiert wurden. So konnte eine Stimulation der Granulozyten durch

Membranfragmente lysierter Erythrozyten verhindert werden, wie sie in der Literatur

beschrieben ist (Dominguez und Torano 1999).

Es wurde gezeigt, daß die Granulozyten bei Aufnahme von L. major in der Gegenwart von

Serum aktiviert werden, was zur Elimination der Erreger durch die Produktion toxischer

Sauerstoffintermediate führt. Dieser Befund entspricht früheren hinweisenden Berichten,

daß reaktive Sauerstoffintermediate Hauptmediatoren der Tötung von Leishmanien durch

Granulozyten sind (Chang 1981; Pearson und Steigbigel 1981; Murray und Nathan 1999).

Es wurde beschrieben, daß Granulozyten aus Kaninchenblut in der Gegenwart frischen

autologen Serums L. infantum aufnehmen und effizient töten, wofür ROI als Agens

vermutet wurden (Brandonisio, Panunzio et al. 1996). Ganz im Gegensatz dazu blieb in

den Experimenten dieser Arbeit eine Aktivierung der Granulozyten in Medium mit

hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Zusatz von Serum aus, obwohl es auch in diesen

Ansätzen zu einer Aufnahme von L. major kam. Die fehlende Aktivierung war auch mit

einer fehlenden Sauerstoffradikalproduktion der Granulozyten verbunden. Das bedeutet,

daß die an der serumunabhängigen Aufnahme beteiligten Mechanismen den oxidative

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Diskussion 61

burst nicht induzieren oder L. major in die Lage versetzen, die Sauerstoffradikalproduktion

zu verhindern. In der Konsequenz überlebt L. major die Phagozytose durch Granulozyten.

Dies ist ein interessanter Aspekt der Rolle von Granulozyten in der Abwehr eines

intrazellulären Erregers: statt zur Vernichtung führt die Interaktion von Granulozyten mit

L. major zu dessen Aufnahme ohne Abtötung. Bei der Humanen Granulozytären

Ehrlichiose (HGE) wurde kürzlich ebenfalls gezeigt, daß Ehrlichien die

Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten inhibieren (Mott und Rikihisa 2000). Zwar

ist die Fähigkeit der Leishmanien bekannt, der tödlichen Stickoxidproduktion durch

Makrophagen zu entgehen (Buchmüller-Rouiller und Mauël 1987; Passwell, Shor et al.

1994). Für L. donovani wurde auch beschrieben, daß eine membranständige saure

Phosphatase die ROI-Produktion von Neutrophilen inhibiert (Remaley, Glew et al. 1985).

Die Beobachtung aber, daß L. major seine Vernichtung durch die

Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten vermeiden kann, ist dagegen neu.

Die endgültige Wirtszelle der Leishmanien sind nicht Granulozyten, sondern Makrophagen

(Solbach und Laskay 2000). Somit könnten Granulozyten in der Frühphase der Infektion

einen „Übergangswirt“ bis zur Ankunft der Makrophagen an der Infektionsstelle darstellen

und eine pathologische Rolle in der Entzündung spielen. Diese Sichtweise erscheint um so

attraktiver vor dem Hintergrund des Befundes, daß L. major die Apoptose der

Granulozyten hinauszögert. Dies könnte L. major Zeit geben, sich wie in einer

parasitophoren Vakuole vor toxischen Agenzien zu schützen, wie es in Makrophagen der

Fall ist (Solbach und Laskay 2000).

Die Verzögerung der Apoptose von Granulozyten durch L. major ist in den Experimenten

mit Medium und hi-FCS sicher belegt worden. Daß L. major die Apoptose der aktivierten

Granulozyten in der Gegenwart von Serum hinauszögert, ist unwahrscheinlich. Denn

Studien haben gezeigt, daß Phagozytose mittels CR3 die Apoptose Neutrophiler induziert.

Als Kandidat für das Bindeglied zwischen Phagozytose und Apoptose in Granulozyten

werden ROI angeführt (Coxon, Rieu et al. 1996; Oishi und Machida 1997). In

Granulozyten von Spendern mit NADPH-Oxidase-Defizienz (CGD-Patienten) kommt es

nicht zur Apoptose, was auch auf den Zusammenhang zwischen ROI und Apoptose

hinweist (Coxon, Rieu et al. 1996). Dies stützt die dargestellten Beobachtungen, daß L.

major das Leben derjenigen Granulozyten verlängert, in denen die ROI-Produktion nicht

induziert wird und die Parasiten nicht abgetötet werden.

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Diskussion 62

Bereits in einem sehr frühen Apoptosestadium werden Granulozyten spezifisch von

Makrophagen erkannt und innerhalb von Minuten aufgenommen und abgebaut (Savill,

Wyllie et al. 1989). Der programmierte Zelltod von Granulozyten stellt eine das Gewebe

schonende Beseitigung der Granulozyten dar und kann als physiologisch vorgesehene

Begrenzung des Entzündungsprozesses verstanden werden. Granulozyten ohne L. major

werden natürlicherweise apoptotisch. Für diese spontane Apoptose ist eine

Proteinneusythese nicht erforderlich (Whyte, Savill et al. 1997). Dagegen ist die

Verhinderung der Apoptose von Granulozyten ein aktiver Prozeß bezüglich einer

notwendigen Neusynthese von ‚Überlebensproteinen‘ (Whyte, Savill et al. 1997).

Granulozyten zeigen darin ein gegensätzliches Verhalten zu anderen Zellarten. Somit

können die Befunde, daß L. major die Apoptoserate von Granulozyten senkt, dadurch

erklärt werden, daß die Granulozyten synthetisch aktiv werden. Die Produktion zweier

Kandidaten für ein solches ‚Überlebensprotein’ durch Granulozyten nach Koinkubation

mit L. major, wurde in dieser Arbeit demonstriert: Sowohl IL-8 als auch IL-1β haben eine

die Apoptose verzögernde Wirkung (Kettritz, Gaido et al. 1998). Colotta und Mitarbeiter

fanden unter In-Vitro-Bedingungen eine Steigerung der Überlebensrate von Granulozyten

nach Inkubation mit IL-1β um 89,5% (Colotta, Re et al. 1992).

Eine Möglichkeit der Apoptoseverzögerung durch Leishmanien wurde für Makrophagen

beschrieben. Intrazelluläre L. donovani verhindern den Eintritt von Makrophagen in die

Apoptose. Inkubation dieser Zellen mit LPG, welches auch auf L. major vorkommt,

resultierte ebenfalls in Hemmung der Apoptose (Moore und Matlashewski 1994). Auch

andere intrazelluläre Krankheitserreger, die Granulozyten infizierten, machten diese Zellen

gegen den programmierten Zelltod resistenter, wie zum Beispiel für den Erreger der HGE

gezeigt (Yoshiie, Kim et al. 2000). Somit hemmen verschiedene intrazelluläre

Mikroorganismen, die auf das Überleben ihrer Wirtszelle angewiesen sind, effektiv die

Mechanismen der Apoptose, darunter auch L. major.

Aus den Beobachtungen, daß L. major nach Aufnahme durch Granulozyten in Medium

nicht abgetötet wird, sondern im Gegenteil einen Übergangswirt in Granulozyten findet

und dessen Apoptose verzögert, erscheint ummittelbar vorteilhaft für den Parasit. Dagegen

werden die Leishmanien in aktivierten Granulozyten vernichtet. Diese unterschiedlichen

Auswirkungen auf den Krankheitserreger spiegeln die unterschiedlichen Funktionen der

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Diskussion 63

Granulozyten wider, die diese in der Auseinandersetzung mit L. major haben können. Dies

verdeutlicht, daß Granulozyten nicht unflexible Effektorzellen des Immunsystems sind, die

mittels präformierter Botenstoffe immer die gleiche Abwehrfunktion ausüben, um dann

nach kurzer Aktivität durch Makrophagen abgeräumt zu werden. Die Befunde dieser

Arbeit zeigen vielmehr eine flexible Rolle der Granulozyten in der frühen Immunabwehr

von L. major.

Diese Tatsache wird durch die Identifikation der Zytokine, die von Granulozyten nach

Interaktion mit L. major spezifisch produziert wurden, unterstützt. Die kurzlebigen

Granulozyten wurden lange Zeit für reine Freßzellen gehalten, unfähig Proteine zu

synthetisieren. Das lag u.a. daran, daß sie ihre Fähigkeit zur Phagozytose aufrechterhalten

auch wenn experimentell die ohnehin spärlich ausgebildeten Organellen blockiert werden,

die an der Proteinsynthese beteiligt sind (Lloyd und Oppenheim 1992). Inzwischen ist aber

klar, daß Neutrophile über eine Kapazität zur Synthese einer – wenn auch begrenzten –

Palette sowohl von Effektorproteinen als auch von Zytokinen verfügen (Lloyd und

Oppenheim 1992). Durch die in dieser Arbeit nachgewiesene Produktion von Zytokinen

können Granulozyten auf den weiteren Verlauf der Immunantwort Einfluß nehmen und

spielen dadurch im Immunsystem zusätzlich zu ihrer Rolle als efferente Zellen eine Rolle

als Regulatorzellen (afferente Zellen) der sich aufbauenden spezifischen Immunreaktion.

Im Vergleich zu Monozyten ist bei Granulozyten der Besatz mit Ribosomen und

Organellen des Endoplasmatischen Retikulums dürftig. Im Rahmen der Experimente dieser

Arbeit fiel der geringe Gehalt ribosomaler RNA dieser Zellen auf. Deshalb mußten etwa

fünfmal so viele Neutrophile eingesetzt werden, um eine ausreichende RNA-Menge

isolieren zu können, wie Monozyten hätten eingesetzt werden müssen. Das

Ungleichgewicht der Potenz Neutrophiler und Monozyten, Zytokine in einer biologisch

relevanten Menge zu produzieren ist nur ein scheinbares. Berücksichtigt man das im

Gewebe herrschende Verhältnis von Granulozyten zu Makrophagen von mindestens 20 : 1,

wie es zehn Stunden nach Infektion am Ort der Läsion vorliegt (Müller, van Zandbergen et

al. 2001), müßte ein einzelner Granulozyt nur ein Zwanzigstel der Zytokinmenge eines

Monozyten produzieren, damit die absolute Menge – und damit die Bioaktivität – identisch

ist.

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Diskussion 64

Granulozyten in ihrer großen Zahl sind relevante Produzenten von Zytokinen und können

den Verlauf der Immunantwort beeinflussen, wie anhand der IL-8-Sekretion durch

Granulozyten gezeigt werden konnte. Obwohl IL-8 von verschiedenen Zellen sezerniert

wird, darunter T-Lymphozyten, Epithelzellen, Keratinozyten, Fibroblasten und

Endothelzellen, stellen Neutrophile eine der wichtigsten Quellen dieses Zytokins dar

(Cassatella 1999). Gleichzeitig sind sie selbst auch die Hauptzielzellen von IL-8, so daß

die IL-8-Produktion zu einer sich selbst fördernden Rückkopplung führt (Gainet, Chollet-

Martin et al. 1998). Neben seiner chemotaktischen Bedeutung aktiviert IL-8 noch weitere

Zellfunktionen wie beispielsweise die Phagozytose (Baggiolini, Walz et al. 1989). Die

durch Leishmanien hervorgerufene IL-8-Sekretion durch Granulozyten führt daher

wahrscheinlich zur beschleunigten Rekrutierung von Granulozyten an den Ort der

Infektion und verstärkt die Ingestion der Parasiten. Zudem könnte die chemotaktische

Wirkung von IL-8 auf T-Lymphozyten eine Rolle in der Entwicklung einer T-Zell-

vermittelten Immunreaktion gegen L. major spielen. Ob die IL-8-vermittelte T-Zell-

Rekrutierung an der kürzlich bei Mäusen beschriebenen granulozytenabhängigen

Ausbildung einer TH2-dominierten Immunantwort beteiligt ist (Tacchini-Cottier, Zweifel

et al. 2000), bleibt zu erforschen.

Neben IL-8 zählt auch IL-1 zu den wichtigen proinflammatorischen Zytokinen. IL-1 wurde

initial als potentes Pyrogen identifiziert, das seine Wirkung bereits im femtomolaren

Bereich entfaltet. Neben seiner Funktion als die Apoptose von Granulozyten verzögernder

Mediator ist für IL-1 u.a. die Erhöhung des oxidative burst in Granulozyten und die

Induktion proinflammatorischer Zytokine, darunter IL-8, beschrieben. IL-1 führt außerdem

zur vermehrten Expression von Zelladhäsionsmolekülen (Curfs, Meis et al. 1997). Die

dargestellten Experimente zeigten, daß L. major innerhalb von 3 Stunden die IL-1β-

Produktion der Granulozyten auf Ebene der Transkription induziert. Dies steht im Einklang

mit Befunden, daß Granulozyten nach Stimulation mit LPS zwei bis sechs Stunden zur

Transkription der mRNA von IL-1β benötigen (Lloyd und Oppenheim 1992). Im

Gegensatz dazu induziert L. major die IL-8-Sekretion auf posttranslationaler Ebene. IL-1β

kann seine ergänzende proinflammatorische Wirkung demzufolge erst zeitlich versetzt zu

IL-8 entfalten, fördert dann aber bereits speziellere Abwehrmechanismen wie die

Auslösung des oxidative burst. Somit konnten in dieser Arbeit Granulozyten als

Produzenten der immunologischen Botenstoffe IL-8 und IL-1β identifiziert werden, die

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Diskussion 65

entscheidend an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer akuten Entzündung beteiligt

sind.

Darüber hinaus ergibt sich aus den Experimenten, daß Granulozyten eine maßgebliche

Bedeutung für den Aufbau der frühen unspezifischen Entzündungsreaktion und der

nachfolgenden spezifischeren Immunantwort haben. L. major induziert die mRNA-

Produktion des inflammatorischen Makrophagenproteins (MIP) durch Granulozyten. Für

MIP-1α und MIP-1β ist vor allem eine chemotaktische Wirkung auf Monozyten, T-Zellen

und im Falle von MIP-1α auf alle Arten der Granulozyten beschrieben (Ben-Baruch,

Michiel et al. 1995; Curfs, Meis et al. 1997). Neben diesem allgemeinen

proinflammatorischen Effekt bewirken MIP-1α und MIP1-β eine Veränderung der

Zusammensetzung des zellulären Infiltrats am Ort der Entzündung. Während in der frühen

Phase der Entzündung Granulozyten vorherrschen, werden sie im eher chronischen Verlauf

durch mononukleäre Phagozyten und Lymphozyten abgelöst (Beil, Meinardus-Hager et al.

1992). Stimulierte Granulozyten haben als Produzenten des Chemokins MIP-1α an dem

Wechsel des zellulären Infiltrats von Granulozyten zu mononukleären Zellen den

Hauptanteil (Kasama, Strieter et al. 1993). Antikörperblockade von MIP-1α führte zur

Reduktion der gesamten durch Neutrophile bewirkten chemotaktischen Wirkung auf

Monozyten um 60% (Kasama, Strieter et al. 1993). Im Fall der Leishmanieninfektion in

vivo zeigte die immunhistologische Analyse der Läsionen von Patienten mit kutaner oder

viszeraler Leishmaniose eine moderate bzw. deutliche Erhöhung von MIP-1α. Innerhalb

der untersuchten Gruppe chemotaktischer β-Zytokine war MIP-1α als einziges deutlich

exprimiert, und die Autoren sehen es verantwortlich für die Rekrutierung von

Makrophagen und T-Zellen in der kutanen Leishmaniose (Ritter, Moll et al. 1996). In der

vorliegenden Arbeit wurde demgemäß gezeigt, daß Granulozyten als Produzenten von

MIP-1α eine afferente Rolle in der Immunantwort bei Infektion mit dem intrazellulären

Erreger L. major zukommt.

Die fehlende Induktion der Chemokin-mRNA von Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 und I-309

bedeutet, daß Granulozyten diese nicht ohne weiteres produzieren und daß die Aufnahme

von L. major zur differentiellen Produktion nur bestimmter Zytokine führt. Außer für IP-10

und MCP-1 gibt es für die Produktion der genannten Chemokine durch Granulozyten bis

heute keinen Hinweis in der Literatur.

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Diskussion 66

Weder ohne noch mit Stimulation mit L. major konnte mRNA der Interleukine IL-6, IL-10,

IL-12 oder von IFN-γ nachgewiesen werden. Wie anhand eines Mausmodells in der

Infektion mit L. major erforscht, korreliert die Heilung der Infektion im Verlauf u.a. mit

einem erhöhten Spiegel von IL-12 und IFN-γ (TH1-dominierte Immunantwort), der fatale

Ausgang mit Erhöhung von IL-6 und IL-10 (TH2-dominierte Immunantwort) (Solbach und

Laskay 2000). Das in dieser Arbeit genutzte In-Vitro-System gibt keinen Hinweis auf

Granulozyten als direkte Quelle dieser Zytokine. Es ist aber möglich, daß andere durch

Granulozyten sezernierte Zytokine über die Stimulation unterschiedlicher Zellen des

Immunsystems die Weichenstellung der Immunantwort beeinflussen.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, daß die serumabhängige Aufnahme von L. major

zur schnellen Tötung der intrazellulären Leishmanien führt, wohingegen der Großteil der

intrazellulären Parasiten in Granulozyten überlebt, wenn L. major in Abwesenheit

hitzelabiler Serumfaktoren phagozytiert wird. Der Parasit ist dann in der Lage, die

Sauerstoffradikalproduktion der Granulozyten zu vermeiden. Diese Befunde legen eine

Doppelrolle der Granulozyten bezüglich ihrer Interaktion mit L. major nahe. Einerseits

üben Granulozyten eine Abwehrfunktion in der frühen Immunreaktion gegen diesen

Parasiten aus, indem sie L. major vernichten. Andererseits stellen Granulozyten

möglicherweise ein intrazelluläres Milieu für Leishmanien bereit, das den Parasiten ein

Überdauern der ersten Stunden bis Tage der Infektion ermöglicht. Das Überleben

intrazellulärer Pathogene wie L. major im Wirtsorganismus hängt von der Fähigkeit der

Phagozyten ab, diese Mikroorganismen zu erkennen und zu internalisieren. Letztere

können allen antimikrobiellen Substanzen des umgebenden Milieus entgehen, wenn es

ihnen gelingt, eine intrazelluläre Vakuole zu bilden. Myeloide Zellen wurden lange für

sichere Zielzellen (‚safe targets’) der Leishmanien gehalten (Mirkovich, Galelli et al.

1986). Es wurde nachgewiesen, daß Komplementaktivierung durch Membranbestandteile

promastigoter Leishmanien zum für die Infektion mit Leishmanien nötigen

Komplementverbrauch führt (Ilg, Stierhof et al. 1995; Peters, Kawakami et al. 1997).

Folglich könnte dieser lokale Komplementverbrauch nach Infektion mit Leishmanien ein

Milieu schaffen, in dem eine komplementunabhängige Aufnahme der Parasiten erfolgt, die

zu deren verlängerten Überleben führt. Da L. major in Granulozyten nach

opsoninunabhängiger Phagozytose in Granulozyten überleben kann, könnten diese Zellen

den Leishmanien als sichere Zielzellen (‚safe targets’) zum Überleben der Frühphase der

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Diskussion 67

Infektion dienen. Dies stünde in Einklang mit der Ansicht, daß die schnelle Aufnahme

promastigoter Leishmanien durch Leukozyten nach der Infektion die früheste

Überlebensstrategie der Parasiten ist (Dominguez und Torano 1999).

Zwei mögliche Bedeutungen ergeben sich aus dem Überleben der Leishmanien in

Granulozyten, das mit der Lebensverlängerung der Wirtszelle assoziiert ist. Einerseits mag

dies die Überbrückung der Zeit bis zur Ankunft der Makrophagen ermöglichen, den

eigentlichen Wirtszellen von L. major. Deren Rekrutierung bewirken neben IL-8 und IL-1β

v. a. MIP-1α und MIP-1β, deren Synthese von L. major induziert wurde. Andererseits

bedeutet die verlängerte Lebensspanne und Rekrutierung der Granulozyten durch IL-8 und

IL-1β eine protrahierte Entzündungsreaktion und ermöglicht die Produktion

immunologischer Botenstoffe, die zur Ausbildung einer spezifischen Immunantwort zu

Ungunsten der Parasiten führen kann.

Die Antworten auf die Fragestellung dieser Arbeit werden in der folgenden Grafik noch

einmal zusammenfassend dargestellt.

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Diskussion 68

Abbildung 18: Zusammenfassung. A: In Anwesenheit von Serumfaktoren führt die Interaktion von Granulozyten und L. major zur Phagozytose der Parasiten durch Neutrophile. Diese werden aktiviert, verlieren die Expression von CD62-L und verstärken jene von CD63 (A1). Gleichzeitig kommt es zur Sauerstoffradikalproduktion und konsekutiven Vernichtung der intrazellulären Erreger (A2). Durch die Sekretion von IL-8 und die Induktion der mRNA von MIP-1a, MIP-1ß und IL-1ß kommunizieren Granulozyten mit anderen Zellen der Immunabwehr (A3, B3). Ohne Serum werden Leishmanien langsamer aufgenommen, die Granulozyten werden nicht aktiviert und produzieren keine Sauerstoffradikale (B2), die IL-8-Sekretion ist niedrig. Bei Infektion mit L. major wird die natürliche Apoptose hinausgezögert (B2), und L. major könnte bis zur Ankunft von Makrophagen überleben und in diesen eine sichere Zielzelle (safe target) finden (B3).

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Zusammenfassung 69

6 Zusammenfassung

Granulozyten sind die Hauptabwehrzellen bei Infektionen durch extrazelluläre

Krankheitserreger. Bei einer Infektion mit dem intrazellulären Pathogen Leishmania major

(L. major) sind Granulozyten die ersten Abwehrzellen am Ort der Infektion, aber ihre

Bedeutung für die Immunantwort ist kaum erforscht. In dieser Arbeit wurde die Interaktion

von humanen Granulozyten mit L. major in vitro untersucht. Dazu wurden Granulozyten

mit einer Reinheit von über 99% aus peripherem venösen Humanblut isoliert. Die

Expression der Oberflächenmarker CD62-L und CD63 belegte, daß die aufgereinigten

Zellen nicht aktiviert waren.

Koinkubation von Granulozyten mit Leishmanien führte zur Phagozytose der Parasiten

durch die Granulozyten, woran der Komplementrezeptor CR3 beteiligt war.

Inkubationsexperimente mit und ohne Zusatz von Serum bzw. hitzeinaktiviertem Serum

zum Kulturmedium wiesen hitzelabilen Serumfaktoren eine entscheidende Bedeutung bei

der Interaktion zwischen Granulozyten und L. major zu: In Anwesenheit hitzelabiler

Serumfaktoren nahmen rund 50% der Granulozyten innerhalb von zehn Minuten L. major

auf. Dies führte zur Aktivierung der Granulozyten und zur konsekutiven intrazellulären

Produktion von Sauerstoffradikalen. Mikroskopische Analysen zeigten, daß infizierte

Granulozyten die Leishmanien innerhalb eines Tages nahezu vollständig eliminierten. In

Medium oder hitzeinaktiviertem (hi-) FCS dagegen, also in Abwesenheit hitzelabiler

Serumfaktoren, nahmen innerhalb von 10 Minuten weniger als 10% der Granulozyten

Leishmanien auf, nach drei Stunden rund 30% (hi-FCS). Die Zellen wurden nicht aktiviert,

die Sauerstoffradikalproduktion unterblieb, und die Parasiten wurden intrazellulär nicht

getötet.

Die natürlicherweise sehr kurzlebigen Granulozyten zeigten in Medium mit hi-FCS

innerhalb von 24 Stunden zu über 80% zellmorphologisch Zeichen der Apoptose, dagegen

nur etwa 10% bis 50% der Zellen nach Koinkubation mit Leishmanien.

Gegenüber nichtinfizierten Granulozyten steigerte die Infektion mit L. major die

granulozytäre Sekretion von IL-8 um rund 300 pg/ml ohne und rund 3000 pg/ml mit

hitzelabilen Serumfaktoren und induzierte die mRNA-Produktion der Zytokine MIP1α,

MIP-1β und IL-1β in Medium mit hi-FCS.

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Zusammenfassung 70

Die Experimente zeigen, daß Granulozyten eine Doppelrolle in der Bekämpfung von L.

major zukommt. In Anwesenheit von hitzelabilen Serumfaktoren tragen sie als

Effektorzellen zur Reduktion der Parasitenlast bei. Andererseits dienen sie L. major in

Abwesenheit hitzelabiler Serumfaktoren als Wirtszelle. Durch die Produktion von

Zytokinen modulieren Granulozyten als Regulatorzellen die Immunantwort. Die Fähigkeit

der Leishmanien, die Granulozytenapoptose zu verzögern und intrazellulär zu überleben,

stellen wichtige Evasionsfaktoren dieses Erregers dar.

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***

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Eigene Veröffentlichungen 82

8 Eigene Veröffentlichungen

ORIGINALARBEITEN Laufs H.; Müller, K.; Fleischer, J.; Reiling, N.; Jahnke, N.; Jensenius J.C.; Solbach, W.; Laskay, T. Intracellular survival of Leishmania major in neutrophil granulocytes after opsonin-independent uptake. Infect Immun. (in press)

Müller, K.; van Zandbergen, G.; Hansen, B.; Laufs, H.; Jahnke, N.; Solbach, W.; Laskay, T. Chemokines, NK cells and granulocytes in the early course of Leishmania major infection in mice. Med Microbiol Immunol (Berl). (in press)

Laufs, H.; Nigrovic, P.; Schneider, L.; Oettgen, H.; del Nido, P.; Moskowitz, I.; Perez-Atayde, A. Giant cell myocarditis in a 12 year-old girl with common variable immunodeficiency. Mayo Clin Proc. (in press)

VORTRÄGE In vitro Untersuchungen zur Interaktion von Granulozyten und Leishmania major (4. Minisymposium „Infektion und Immunabwehr“ auf Burg Rothenfels, 1998)

Interactions of Leishmania major with human granulocytes in vitro (15. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Stuttgart, 1999)

DISSERTATIONSARBEIT Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern am Beispiel der Infektion mit Leishmania major. Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen Universität zu Lübeck (http://www.hygiene.mu-luebeck.de)

http://www.laufs.com/helmut/dissertation.pdf

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Danksagung 83

9 Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. WERNER SOLBACH gilt mein besonderer Dank für die Vergabe des Themas der

Dissertation und seine jederzeit vorbildliche leitende Betreuung der Arbeit sowie seine ständige

Verfügbarkeit.

Herrn Prof. Dr. med. HOLGER KIRCHNER danke ich für die Beratung im Umfeld dieser Arbeit und im

gesamten Studium sowie für die großzügige Möglichkeit, zur Etablierung der Granulozytenaufreinigung auf

Buffy coats seines Instituts zurückgreifen zu dürfen. Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. LOTHAR RINK danke ich

für die unterstützende Beratung zu Fragen der immunologischen Untersuchung von Granulozyten und die

initiale Bereitstellung von Antikörpern.

Frau NICOLE JAHNKE danke ich für die Einführung in allgemeine Verhaltensweisen im Labor, speziell das

molekularbiologische und das Arbeiten mit Zellkulturen und das geistige Salz in der und um die Laborsuppe

zu jedem Zeitpunkt der Arbeit.

Frau Diplom Biologin KERSTIN MÜLLER danke ich für die Weitergabe der Erfahrung im RPA sowie

unermüdlichen Diskurs.

Frau MAREN GERKE danke ich für die professionelle und freundschaftliche Einführung in eine Technik der

Granulozytenisolierung.

Den Mitarbeitern des Instituts für Biochemie danke ich für die Erlaubnis der Mitbenutzung ihrer

Phosphoimaging-Einrichtungen, dem Institut für Molekularbiologie für die Möglichkeit, im Radioaktivlabor

zu arbeiten.

Herrn Dr. JENS FLEISCHER und Herrn Dr. NORBERT REILING danke ich für die Durchführung der

Zellsortierung im Forschungszentrum Borstel.

Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. TAMÁS LASKAY für seine

immer ausgezeichnete, engagierte und besonders freundschaftliche Betreuung in allen Phasen der Arbeit

bedanken. Ohne seine mitreißende Begeisterung für wissenschaftliches Arbeiten (und viele andere Dinge

darüber hinaus) und seine kompetente und konstruktive Kritik hätte die Arbeit nur halb so viel Spaß gemacht.

Die Versuche wurden mit finanzieller Unterstützung des Sonderforschungsbereichs 367/B10 der Deutschen

Forschungsgemeinschaft durchgeführt.

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Stichwortverzeichnis 84

10 Stichwortverzeichnis

A

Amastigote 8, 41

Apoptose 16, 33, 50, 51, 61, 62

C

CD62-L 12, 33, 41, 46, 47, 60

CD63 33, 41

CD66b 33, 46, 47

CR3 32, 43, 44, 58

E

ELISA 36, 52

F

FCS-Medium Siehe Medium

Fragestellung 21, 67

G

Giemsafärbung 32

Granulozytenaufreinigung 29, 40, 60

H

Hitzeinaktivierung 31, 43

I

I-309 55, 65

IFN-γ 18, 56, 66

IL-1 18, 53, 64

IL-10 56, 66

IL-12 18, 56, 66

IL-1ra 18, 55

IL-6 18, 56, 66

IL-8 18, 36, 52, 53, 64

IP-10 18, 55, 65

K

Komplementsystem 13, 42, 43

L

Leishmania major 6, 28

Aufnahme 41, 42, 43, 44, 45, 59

Granulozyten, und 19

Identifikation 33

Inkubation 32

Krankheitsformen 9

Lebendigkeit Siehe Vitalität

Lebenszyklus 7, 8

Lipophosphoglykan Siehe LPG

opsoninunabhängige Aufnahme 42,

43, 62

Stamm 28

Taxonomie 7

Vitalität 34, 49

Leishmaniose 9, 10

Limiting dilution Siehe

Titrationskulturverfahren

LPG 8, 58, 62

L-Selektin Siehe CD62-L

Ltn 55, 65

M

Mac-1 Siehe CR3

Mannanbindendes Lektin Siehe MBL

MBL 14, 31, 45, 59

MCP-1 18, 55, 65

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Stichwortverzeichnis 85

Medium 31, 42, 43, 45, 47, 50, 57

MIP 18, 55, 65

mRNA Siehe RNA

N

Neutrophile Granulozyten 10

Affektorfunktion 17, 63

Aktivierung 13, 41, 47, 60 Siehe

aufgereinigte 40

Effektorfunktion 12, 17, 60

Enzyme 12

Funktion 11, 17, 66

Funktionsstörungen 16

Isolierung Siehe

Granulozytenaufreinigung

Lebenszeit 50

Leishmania major, und 19, 40

Reinheit 30, 41

Sortierung 35

Zytokine 18, 51, 54, 55, 56

NNN Siehe Novy-Nicolle-MacNeal

Novy-Nicolle-MacNeal 28

O

Opsonine Siehe Komplementsystem

Opsonisierung 42, 45, 47

oxidative burst 15, 19, 34, 47, 48, 60

P

Parasit 28

Phagozytose 41, 42, 43, 59

Plasma Siehe Medium

polymorphkernige Leukozyten Siehe

Neutrophile Granulozyten

Promastigote 8, 41

Propagation 28

R

RANTES 55, 65

reactive oxygen intermediates Siehe

oxidative burst

RNA 37, 54, 55, 56, 63

RNase Protection Assay Siehe RPA

ROI Siehe oxidative burst

RPA 37, 38, 56

S

safe target 66, 68

Sauerstoffradikale Siehe oxidative burst

Serum Siehe Medium

Software 26

T

TH-Zellantwort 6, 56, 66

Titrationskulturverfahren 34, 48

Trypanosomatiden 7

Z

Zellen 29

Zellkultur 31, 32

Zusammenfassung 68, 69

Zytokine 17, 18, 51, 52, 54, 56, 63, 64

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Lebenslauf 86

11 Lebenslauf

Name: Helmut Laufs

Geburtstag und -ort: 9. Juni 1975 in Göttingen

SCHULEN:

1985 – 1994 Kath. Jesuitengymnasium Sankt-Ansgar-Schule, Hamburg

08/1991 – 01/1992 Huron High School, Ann Arbor, Michigan, U.S.A.

1994 Abitur

STUDIENSTIFTUNG:

1994 Aufnahme in die Studienstiftung des Deutschen Volkes

STUDIUM:

1994 – 2001 Humanmedizin an der Medizinischen Universität zu Lübeck

1996 Ärztliche Vorprüfung

1995 – 1996 Informatik an der Fernuniversität Hagen Kurs: Konzepte imperativer Programmierung

10/1996 – 02/1997 Humanmedizin an der Universität Wien

1997 I. Staatsexamen, Humanmedizin

10/1998 Famulatur an der Harvard Medical School, Cardiovascular Division, Department of Medicine (Dr. J. K. Liao), Brigham and Women’s Hospital, Boston, U.S.A.

2000 II. Staatsexamen, Humanmedizin

2001 III. Staatsexamen, Humanmedizin

PREISE UND STIPENDIEN:

1994 Paul-Overhage-Preis (Sankt-Ansgar-Schule, Abiturpreis)

2000 Stipendium der Studienstiftung des Deutschen Volkes für ein PJ-Tertial an der Harvard Medical School, Boston, U.S.A.

PROMOTION:

1/1998 – 8/1999 Experimentelle Durchführung am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Med. Universität zu Lübeck, Direktor: Prof. W. Solbach

BERUF:

seit 8/2001 Arzt im Praktikum an der Klinik für Neurologie der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, Direktor: Prof. H. Steinmetz

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Doktorarbeit als Online-Material auf CD 87

12 Doktorarbeit als Online-Material auf CD

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• WWW-Dokument

• Literaturdatenbank

Der Lebenslauf befindet sich auf Seite 86.