Die Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor FoxO1adarwin.bth.rwth-aachen.de/opus3/volltexte/2008/2136/pdf/von_Groote-B... · CAP Cbl associated protein Cat catalytic domain

Die Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor FoxO1aund der Proteinkinase DYRK1 und ihre Bedeutung bei der

Regulation des Glucose-6-Phosphatasegens

Von der Medizinischen Fakultätder Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Medizingenehmigte Dissertation

vorgelegt von

Florian Till von Groote-Bidlingmaier

aus

Neuss

Berichter: Herr UniversitätsprofessorDr. rer. nat. Dr. med. Hans Georg Joost

Herr UniversitätsprofessorDr. rer. nat. Peter C. Heinrich

Tag der mündlichen Prüfung: 19. Dezember 2007

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Wesentliche Teile der vorliegenden Arbeit wurden publiziert in:

Groote-Bidlingmaier, F., Schmoll, D., Orth, H.M., Joost, H.G., Becker, W., and

Barthel, A. (2003). DYRK1 is a co-activator of FKHR (FOXO1a)-dependent

glucose-6-phosphatase gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun.

300, 764-769.

Inhalt1 Einleitung..........................................................................................................1

1.1 Einführung in die Epidemiologie und Pathophysiologie des Typ 2-

Diabetes...................................................................................................1

1.2 Die Glucoseproduktion der Leber .....................................................2

1.3 Signaltransduktion des Insulinrezeptors............................................4

1.4 Der Transkriptionsfaktor FoxO1a und seine Rolle bei der Regulation

des Glucose-6-Phosphatasegens............................................................6

1.5 Die Familie der DYRK Kinasen und ihre Verbindung mit dem

Transkriptionsfaktor FoxO1a....................................................................9

1.7 Arbeitshypothese und Zielsetzung...................................................11

2 Materialien und Methoden............................................................................122.1 Konstrukte........................................................................................12

2.1.1 Der Promotor des Glucose-6-Phosphatasegens......................12

2.1.2 FoxO1a Wildtyp.........................................................................12

2.1.3 FoxO1a Ser329-Punktmutanten...............................................12

2.1.3.1 FoxO1a Ser329Ala-Mutante..................................................12

2.1.3.2 FoxO1a Ser329Asp-Mutante.................................................13

2.1.4 IRU-Mutante des Glucose-6-Phosphatasereportergens...........13

2.1.5 DYRK-Konstrukte......................................................................14

2.2 Zellbiologische Arbeitstechniken.....................................................15

2.2.1 Zelllinien....................................................................................15

2.2.1.1 Medien und allgemeine Kulturbedingungen..........................15

2.2.1.2 Subkultivierung.......................................................................15

2.2.2 Transfektion...............................................................................16

2.2.3 Retroviraler Gentransfer............................................................17

2.2.4 Selektionierung der infizierten Zellen........................................18

2.3 Proteinchemische Arbeitstechniken.................................................19

2.3.1 SDS-PAGE................................................................................19

2.3.1.1 Gelherstellung........................................................................19

2.3.1.2 Probenvorbereitung................................................................21

2.3.1.3 Proteinbestimmung (BCA-Methode)......................................21

2.3.1.4 Gelelektrophorese..................................................................22

2.3.2 Western-Blotting und ECL-System...........................................22

I

2.3.2.1 Transfer..................................................................................22

2.3.2.2 Inkubation mit Antikörpern.....................................................22

2.3.3 Ponceau-Färbung......................................................................23

2.4 Molekularbiologische Arbeitstechniken...........................................24

2.4.1 DNA-Präparation.......................................................................24

2.4.1.1 Minipräparation.......................................................................24

2.4.1.2 Präparation größerer DNA-Mengen ......................................24

2.4.2 Restriktionsverdau.....................................................................25

2.4.3 Herstellung kompetenter E. coli-Bakterien................................25

2.4.4 Transformation von E.coli-Bakterien.........................................26

2.4.4.1 Hitzeschocktransformation.....................................................26

2.4.4.2 Elektroporation.......................................................................27

2.4.5 DNA-Agarosegelelektrophorese...............................................27

2.4.6 Sequenzspezifische Mutagenese.............................................28

2.4.7 DNA-Sequenzierung.................................................................29

2.4.8 Northern Blotting ......................................................................31

2.4.8.1 RNA-Isolierung.......................................................................31

2.4.8.2 RNA-Agarosegelelektrophorese............................................31

2.4.8.3 Blotting....................................................................................32

2.4.8.4 Aufreinigen der DNA-Sonden nach Gelelektrophorese.........33

2.4.8.5 Markieren einer Sonde mit [32P]...........................................33

2.4.8.6 Hybridisierung der Northern Blots..........................................34

2.4.9 Reportergen-Assay (Luciferase)...............................................34

2.5 Statistische Analyse.........................................................................34

3 Ergebnisse......................................................................................................353.1 Effekte von überexprimiertem DYRK1A auf den Gehalt an

Glucose-6-Phosphatase-mRNA und die Aktivität des G6Pase-

Promotors in Hepatomzellen..................................................................35

3.1.1 Überexpression von DYRK1A in stabil transfizierten

Rattenhepatomzellen.........................................................................35

3.1.2 Der Einfluss von stabil transfiziertem DYRK1A auf die

endogene Glucose-6-Phosphatase-mRNA in Rattenhepatomzellen 36

3.1.3 Der Effekt von DYRK1A auf die Promotoraktivität des

Glucose-6-Phosphatasegens im Reportergen-Assay........................37

II

3.2 Der Effekt von DYRK1A auf die G6Pase-Promotoraktivität in

Abhängigkeit von der DYRK1A-Kinaseaktivität.....................................40

3.2.1 Der Einfluss von FoxO1a-Ser329-Punktmutanten auf die durch

DYRK1A vermittelte Expression des Glucose-6-Phosphatasegens..40

3.2.2 Der Effekt einer katalytisch inaktiven DYRK1A-Punktmutante

auf den Glucose-6-Phosphatase-Promotor.......................................43

3.3 Untersuchungen zu Effekten verschiedener DYRK-Isoformen auf

die Aktivität des Glucose-6-Phosphatase-Promotors............................44

3.4 Die Effekte unterschiedlicher DYRK-Isoformen auf die FoxO1a-

induzierte Aktivität des Glucose-6-Phosphatase-Promotors.................45

3.5 Der Effekt von DYRK1 auf den Glucose-6-Phosphatase-Promotor in

Abhängigkeit von FoxO1a-Bindungsstellen (IRUs)...............................47

4 Diskussion......................................................................................................495 Zusammenfassung........................................................................................556 Literaturverzeichnis.......................................................................................56

III

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Darstellung der pathophysiologischen Komponenten des Typ-2-Diabetes mellitus

Abb. 2: Schematische Darstellung der Glucoseproduktion der Leber

Abb. 3: Darstellung des Insulinrezeptors und der Signaltransduktion des Insulins

Abb. 4: Strukturausschnitt des Promotors des G6Pase-Gens

Abb. 5: Vergleich der drei in dieser Arbeit behandelten DYRK-Isoformen

Abb. 6: Das Prinzip des retroviralen Gentransfers

Abb. 7: Prinzip der Sequenzspezifischen Mutagenese

Abb. 8: Überexpression von DYRK1A in H4IIEC3-Zellen

Abb. 9: Der Effekt von überexprimiertem DYRK1A auf den Gehalt an spezifischer G6Pase-

mRNA in H4-Zellen

Abb. 10: Der Effekt von überexprimiertem DYRK1A auf die Promotoraktivität der G6Pase in

stabil transfizierten Hepatomzellen (H4IIEC3)

Abb. 11: Der Effekt von überexprimiertem DYRK1A auf die Promotoraktivität der G6Pase in

transient transfizierten Hepatomzellen (HepG2)

Abb. 12: Aktivität der G6Pase-Promotors in Abhängigkeit von der Menge des transfizierten

DRK1A-Expressionsvektors

Abb.13: Strukturausschnitt aus dem Promotor der FoxO1a-Punktmutante S329A

Abb. 14: Restriktionsanalyse der FoxO1a-Punktmutante S329A

Abb. 15: Der Effekt der DYRK1A-Phosphorylierung an der Position 329 auf die Aktivität des

G6Pase-Promotors

Abb. 16: Der Effekt einer katalytisch inaktiven DYRK1A-Punktmutante auf die Aktivität des

G6Pase-Promotors

Abb. 17: Der Effekt der verschiedenen DYRK-Isoformen auf die Aktivität des G6Pase-

Promotors

Abb. 18: Struktur der FoxO1a-bindenden Region des G6Pase-Promotors und Veränderungen

der Promotor-Punktmutante

Abb.19: Der Effekt von DYRK1 auf den G6Pase-Promotor (schwarz) und den mutierten

G6Pase-Promotor (weiß).

Tab. 1: Der Effekt von DYRK1 auf den Aktivität des G6Pase-Promotors in Synergismus mit

FoxO1a-WT und einer konstitutiv im Kern lokalisierten FoxO1a-Mutante

Abkürzungen

A Adenin

A, Ala Alanin

AICAR 5-Aminoimidazol-4-Carboxamid Ribosid

APS Ammoniumpersulfat

BamH1 Restriktionsenzym

BCA bicinchoninic acid

BSA bovine serum albumine

BspH1 Restriktionsenzym

C Cytosin

CaCl2 Calciumchlorid

CAP Cbl associated protein

Cat catalytic domain

CBP CREB binding protein

cDNA complementary DNA

cm centimeter

CO2 Kohlendioxid

CREBP cAMP responsive element binding protein

CrkII CT 10 regulator of kinase II

CSF-1 colony stimulating factor-1

D, Asp Asparaginsäure

DAF 16 Bezeichnung für FoxO in C. elegans

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytosintriphosphat

ddNTP 2'-Didesoxynucleotid-5'-triphosphat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DH5α Name eines Escherichia coli-Stammes

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid

DpnI Restriktionsenzym

DTT Dithiothreitol

dTTP Desoxythymidintriphosphat

DYRK dual tyrosine regulated kinase

ECL enhanced chemoluminescence

E. coli Escherichia coli

EcoRI Restriktionsenzym

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGFR epidermal growth factor receptor

ENV envelope, retrovirales Hüllprotein

ER estrogen receptor

ERK extracellular signal-regulated kinase

FAS fatty acid synthase

FCS fetal calf serum

FGFR fibroblast growth factor receptor

FKHR forkhead in rhabdomyosarcoma

FOXO Forkhead box protein

G Guanin

Gab-1 GRB2-associated binding protein 1

GAG group antigen, retrovirales Protein

GFP green fluorescent protein

GgPase Glycogenphosphatase

GLI1 glioma-associated oncoprotein

GLUT4 Glucosetransporter 4

G6Pase Glucose-6-Phosphatase

Grb2 growth factor receptor-bound protein 2

GRE Glucocorticoid-responsives Element

GSK-3 Glycogensynthase-Kinase-3

h Stunde

H2O Wasser

H4IIEC3 Hepatomzelllinie der Ratte

HBD Hormon-Bindungsdomäne

HBS HEPES buffered saline

HCl Salzsäure

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HepG2 Humane Hepatomzelllinie

HNF-4 hepatocyte nuclear factor 4

HNP Hexanucleotidprimer

IR Insulinrezeptor

IRS1 Insulinrezeptor Substrat 1

IRR insulin receptor-related Rezeptor

IRU insulin responsive unit

JAK Janus Kinase

JNK c-Jun-N-terminal kinase

K, Lys Lysin

kb kilo base

LB Nährmedium nach Luria Bertani

LiCl Lithiumchlorid

LSB Laemmli sample buffer

mA Milliampere

MAPK Mitogen-aktivierte Kinase

MgSO4 Magnesiumsulfat

MNB minibrain

MnCl2 Manganchlorid

MOPS 3-(4-Morpholino-)propansulfonsäure

mRNA messenger RNA

mTOR mammalian target of rapamycin

MUT Mutante

µM mikromolar

NaCl Natriumchlorid

NaF Natriumfluorid

NaN3 Natriumazid

Na4P2O7 Tetranatriumdiphosphat, Natriumpyrophosphat

Na3VO4 Trinatriumvanadattrihydrats

NFAT nuclear factor of activated T-cells

NLS nuclear localization sequence

OHT 4-OH Tamoxifen

OLB Oligo labelling buffer32P Radioaktives Phosphor-Isotop

pCDNA3.1 Expressionsvektor

PCR Polymerase Chain Reaction

PDGFR platelet derived growth factor receptor

PDK phosphatidylinositol-dependent kinase

pEGFP-C1 GFP-enthaltender Expresisonsvektor

PEPCK Phosphoenolpyruvatcarboxykinase

PEST Prolin, Glutamat, Serin, Threonin

PGC-1 PPARγ Coactivator -1

pGL2, pGL3 Expressionsvektoren

PH pleckstrin homology

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

POL Polymerase

PPAR peroxysome proliferator-activator receptor

PEPCK Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase

PIP2 Phosphatidyl-Inositol-3,4-Bisphosphat

PIP3 Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Trisphosphat

PI 3-K Phosphatidylinositol 3-Kinase

PKB/Akt Proteinkinase B

POL retrovirale reverse Transkriptase

pRLTK Renilla Luciferase Thymidin Kinase

pWZL Blasto Retroviraler Vektor

R, Arg Arginin

RbCl Rubiciumchlorid

RLU relative light units

RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

SDS-PAGE sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Ser Serin

Shc Src-homology-2-containing protein

SOCS supressor of cytokine signalling

Shp-2 Src homology 2-containing tyrosine phosphatase

SRC1 steroid hormone receptor coactivator-1

SSC Standard Saline Citrate

STAT3 signal transducer and activator of transcription 3

STET Sucrose, Triton, EDTA, Tris

T Thymin

Ta Annealing-Temperatur

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBE Tris-Borat-EDTA

TBS(-T) Tris buffered saline (-tween)

TE Tris-EDTA

TEMED Tetramethylethylendiamin

TfB I, TfB II Transformationbuffers I + II

Thr Threonin

UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study

U/min Umdrehungen pro Minute

UV ultraviolett

WT Wildtyp

Yak1p Yet another kinase; Serin-/Threoninkinase in Sacc. cerevisiae

XhoI Restriktionsenzym

1 Einleitung

1 Einleitung

1.1 Einführung in die Epidemiologie und Pathophysiologie des Typ 2-Diabetes

Der Diabetes mellitus ist eine chronische Stoffwechselerkrankung, die den Fett-

und den Kohlenhydratstoffwechsel betrifft und auf einem absoluten oder

relativen Insulinmangel beruht. Weltweit leiden zur Zeit etwa 170 Millionen

Menschen an einem Diabetes mellitus, im Jahr 2030 wird sich die Zahl der

Patienten voraussichtlich mehr als verdoppelt haben (Wild et al., 2004). Etwa 5

Millionen Diabetiker leben in Deutschland. Über 90% der Diabetes-Patienten

leiden am so genannten Typ-2-Diabetes. Man beobachtet zum einen eine

steigende Prävalenz des Typ-2-Diabetes in den Wohlstandsgesellschaften, zum

anderen haben etwa 40% der Patienten mindestens ein Elternteil mit der

gleichen Erkrankung (Klein et al., 1996). Diese Form des Diabetes mellitus

kommt gehäuft im Rahmen des Metabolischen Syndroms vor. Das

metabolische Syndrom beschreibt die Assoziation von stammbetonter

Adipositas, Dyslipoproteinämie, arterieller Hypertonie und

Glucosetoleranzstörung (Reaven, 1988). Das anabole Hormon Insulin steht im

Mittelpunkt der pathophysiologischen Vorgänge bei beiden Formen des

Diabetes mellitus. Insulin sorgt für eine Aufnahme von Glucose in Skelettmuskel

und Fettgewebe und inhibiert die hepatische Glucoseproduktion. Durch diese

Mechanismen wird die Blutglucosekonzentration gesenkt. Die Auswirkungen

und Langzeitfolgen sind bei beiden Typen des Diabetes mellitus ähnlich, sie

unterscheiden sich aber pathophysiologisch und hinsichtlich ihrer Therapie

erheblich voneinander. Während beim Typ-1-Diabetes durch

Autoimmunreaktionen ß-Zellen des Pankreas zugrunde gehen und somit ein

absoluter Insulinmangel vorliegt, steht beim Typ-2-Diabetes eine Resistenz der

Zielgewebe gegenüber Insulin im Vordergrund. Die Insulinresistenz führt zur

Hyperglykämie aufgrund einer verminderten Glucoseaufnahme in Fett und

Muskel und einer gesteigerten hepatischen Glucoseproduktion.

Kompensatorisch kommt es zur reaktiven Hyperinsulinämie. Die gestörte

Glucoseaufnahme kann durch erhöhte Insulinkonzentration für eine gewisse

1

1 Einleitung

Zeit kompensiert werden, dieser Mechanismus verstärkt allerdings die

Insulinresistenz (Kahn, 2003). Mit fortschreitender Erkrankungsdauer nimmt die

Insulinempfindlichkeit der peripheren Zielorgane ab, was zu einer progredienten

Störung der insulinabhängigen Glucoseverwertung führt. Die Folge ist eine

manifeste Hyperglykämie mit einer Nüchtern-Plasmaglucosekonzentration ≥

126 mg/dl oder einer Plasmaglucosekonzentration ≥ 200 mg/dl zu irgendeinem

Zeitpunkt während des Tages (Expert Committee on the Diagnosis and

Classification of Diabetes Mellitus, 1997). Die pathophysiologischen

Zusammenhänge des Typ-2-Diabetes mellitus sind in Abbildung 1 dargestellt.

Adipositas

GenetikAlter

Hyperinsulinämie

erhöhte Fettsäuren

gesteigerteGlukosefreisetzung

verminderteInsulinsekretion

muskul.Insulinresistenz

β-Zell Kompensation

β-ZellDekompensation

gesteigerteLipolyse

gesteigerteGlukoneogenese

Diabetes

verminderteGlukosetoleranz

Abb. 1 Darstellung der pathophysiologischen Komponenten des Typ-2-Diabetes mellitus. Durch Faktoren wie Genetik, Adipositas und Alter kommt es zur Insulinresistenz, die über eine verminderte Glucosetoleranz zum manifesten Diabetes mellitus führt (nach Saltiel, Cell 2001).

1.2 Die Glucoseproduktion der Leber

Neben der Glycogenolyse, der Bereitstellung von Glucose aus

Kohlenhydratspeichern, ist die Gluconeogenese der Hauptmechanismus der

hepatischen Glucoseproduktion. Unter Gluconeogenese versteht man die

2

1 Einleitung

Produktion von Glucose aus Vorstufen wie Laktat, gluconeogenen Aminosäuren

(z.B. Alanin) und Glycerol.

Leber und Niere sind die Organe, welche zur Gluconeogenese befähigt sind,

wobei die Niere als Glucosequelle des Gesamtorganismus eher eine

untergeordnete Rolle spielt. Die entscheidenden Regelgrößen für die

hepatische Glucoseproduktion sind die Konzentrationen der verfügbaren

Substrate und die Aktivität regulatorischer Enzyme. Die Glucose-6-

Phosphatase (G6Pase) ist eines der Schlüsselenzyme der Gluconeogenese.

Das Enzym wird hauptsächlich in Leber und Nieren exprimiert, zu einem

geringeren Grad auch in Darm und Pankreas. Es ist im endoplasmatischen

Retikulum lokalisiert und besteht aus mindestens vier Komponenten, der

katalytischen Untereinheit, einem bisher strukturell nicht bekannten

Glucosetransporter, einem G6Pase-Transporter und einem Transporter für

anorganisches Phosphat (Mithieux, 1997; Foster et al., 1997; van de Werve et

al., 2000; van Schaftingen and Gerin, 2002). Die G6Pase katalysiert den letzten

Schritt der Gluconeogenese, die Hydrolyse von Glucose-6-Phosphat in

Phosphat und freie Glucose, die dann ins Blut abgegeben wird. Im

Hungerzustand und bei Diabetes ist eine gesteigerte G6Pase-Aktivität in vivo

nachweisbar, die auf eine gesteigerte Expression des Enzyms zurückzuführen

ist (Segal and Washko, 1959; Arion and Nordlie, 1965; Argaud et al., 1996;

Minassian et al., 1996; Liu et al., 1994). Während die Gluconeogenese durch

Hormone wie Glucocorticoide (Garland, 1986) oder Glucagon (Chatelain et al.,

1998) gesteigert wird, vermindert Insulin den mRNA-Gehalt und die Aktivität der

G6Pase (Argaud et al., 1996; Liu et al., 1994; Massillon et al., 1996). Eine

Verminderung der Expression des G6Pase-Gens wird in vivo als auch in

Hepatomzellen beobachtet (Argaud et al., 1996; Hornbuckle et al., 2001). Auch

durch schnelle, posttranslationale Effekte wirkt Insulin auf die Aktivität von

Enzymen der Gluconeogenese und der Glycogensynthese.

Die Insulinresistenz beim Typ-2-Diabetes mellitus führt dazu, dass Insulin die

Aktivität der glucogenen Enzyme wie G6Pase oder Phosphoenolpyruvat-

Carboxykinase (PEPCK) nicht mehr ausreichend hemmen kann. Dies führt zu

gesteigerter hepatischer Glucoseproduktion und zu erhöhter

Blutglucosekonzentration. Abbildung 2 fasst die wesentlichen Schritte der

hepatischen Glucoseproduktion zusammen.

3

1 Einleitung

Pyruvat

Fructose-1,6-Bisphosphat

Glucose-6-Phosphat

Alanin

Fructose-6-Phosphat

Phosphoenolpyruvat

Oxalazetat

Glucose

Glucose-1-Phosphat

Glycerol

G6Pase

Glycogen

Laktat

F-1,6-BPase

PEPCK

GgPase GgS

Insulin

Insulin

GSK-3Insulin

Abb. 2 Schematische Darstellung der Glucoseproduktion der Leber. Im linken Bildabschnitt sind von unten nach oben die entscheidenden Schritte der Gluconeogenese dargestellt. Die Glucose-6-Phosphatase katalysiert die Hydrolyse von Glucose-6-Phosphat zu Glucose (grün dargestellt). Die Enzyme sind in Ellipsen abgebildet und gelb unterlegt. Glucose-6-Phosphatase, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und Glycogensynthase-Kinase-3 unterliegen dem hemmenden Einfluss des Insulins, wodurch der mRNA-Gehalt und die Enzymaktivität vermindert werden.

1.3 Signaltransduktion des Insulinrezeptors

Insulin beeinflusst die Expression von mindestens 150 Genen (O'Brien et al.,

2001). Auf zellulärer Ebene wirkt Insulin über den Insulinrezeptor. Der

Insulinrezeptor besitzt eine extrazelluläre Bindungsdomäne und eine

intrazelluläre Tyrosinkinasedomäne. Extrazelluläre Bindung von Insulin löst eine

intrazelluläre Autophosphorylierung und damit Aktivierung der

Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors aus.

Nach Ligandenbindung phosphoryliert der Insulinrezeptor verschiedene

intrazelluläre Substrate, z.B. die Insulinrezeptorsubstrate 1-4 (IRS) (Baumann et

al., 2000; Chiang et al., 2001; Lock et al., 2000; Noguchi et al., 1999).

4

1 Einleitung

Eine Rezeptorstimulierung führt zur Aktivierung von zwei wichtigen

Signalkaskaden, der MAP-Kinase (Mitogen activated protein-Kinase)-Kaskade

und der PI-3-Kinase (Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase)-Kaskade, wobei letztere

eine besondere Rolle bei der Vermittlung der Stoffwechseleffekte des Insulins

spielt. Phosphorylierung der IRS führt zu einer Aktivierung der PI-3-Kinase und

damit zur Bildung von Phosphatidyl-Inositol-3,4-Bisphosphat (PIP2) und

Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Trisphosphat (PIP3) in der Plasmamembran (Alessi

and Cohen, 1998). Dies hat eine gesteigerte Aktivität der Phosphatidyl-Inositol-

abhängigen Kinase 1 (PDK1) zur Folge (Lizcano and Alessi, 2002; Saltiel and

Pessin, 2002; Vanhaesebroeck and Alessi, 2000). Die Identität der PDK2 ist

nach wie vor unbekannt. PDK1 phosphoryliert wiederum die Proteinkinase B

(PKB, AKT). Es wurde gezeigt, dass PKB eine wichtige Rolle bei der

insulinabhängigen Hemmung der Expression des PEPCK- und G6Pase-Gens

spielt. So wurde beschrieben, dass Überexpression von PKB in Hepatomzellen

und primären Hepatozyten die Transkription von PEPCK und G6Pase

vermindert (Agati et al., 1998; Schmoll et al., 2000; Liao et al., 1998). Ein

direktes Substrat der PKB ist der insulinregulierte Transkriptionsfaktor FoxO1a,

der ein wichtiger Transaktivator des G6Pase-Gens ist (Schmoll et al., 2000;

Barthel et al., 2001). Abbildung 3 zeigt eine Darstellung der Signaltransduktion

des Insulinrezeptors.

5

1 Einleitung

IRS 1-4

Gluconeogenese

PKB 1-3

PI-3-K

FoxO1

CblCAP

Proteinsynthese

Glycogen-synthese

Zellwachstum und- differenzierung

STAT

ERK1,2

Shc

PDK1,2 Ras

mTOR

GSK-3

PPP

Glucose-aufnahme

JAK

SOCS1,3

JNK

TNFα IGF1 Insulin ZytokinePlasmamembran

Abb. 3 Darstellung des Insulinrezeptors und der Signaltransduktion des Insulins. Dargestellt sind die entscheidenden Stationen der Insulinrezeptorkaskade, der Insulinrezeptor selbst (blau/rot), die Insulinrezeptorsubstrate (IRS) 1-4 (türkis), die Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI-3-K) (grün) und die drei Isoformen der Proteinkinase B/AKT (PKB1-3) (pink). Die Kaskade wird auch durch den Insulin-like growth factor 1 (IGF1) aktiviert. Zytokine wie IL-6, Leptin, etc. beeinflussen die Signaltransduktion des Insulins. Weitere Interaktionspartner und Modulatoren sind Cbl-associated protein (CAP), extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1,2), forkhead box O1 (FoxO1), glycogen synthase kinase 3 (GSK-3), Janus kinase (JAK), c-Jun-N-terminal kinase (JNK), mammalian target of rapamycin (mTOR), phosphoinositide-dependent kinase 1 and 2 (PDK1,2), Ras, Src-homology-2-containing protein (Shc), supressor of cytokine signalling (SOCS), signal transducer and activator of transcription (STAT), (nach Taniguchi, et.al., Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 2006).

1.4 Der Transkriptionsfaktor FoxO1a und seine Rolle bei der Regulation des Glucose-6-Phosphatasegens

Der Transkriptionsfaktor FoxO1a (alte Nomenklatur FKHR) ist bei genetischen

Untersuchungen in Caenorhabditis elegans entdeckt worden (dort DAF 16

genannt) und gehört zur Familie der Forkhead Transkriptionfaktoren.

FoxO-Proteine besitzen ein konserviertes „winged helix“ Strukturmotiv, welches

die DNA-Bindungsdomäne, auch Forkhead box oder Fox box genannt, enthält

6

1 Einleitung

und zur Klassifizierung dient (Kaufmann and Knochel, 1996; Kaestner et al.,

2000). Im Gegensatz zu anderen Forkhead Proteinen besitzen FoxO-Proteine

eine besondere Aminosäuresequenz in der DNA-Bindungsdomäne. FoxO1a ist

an zahlreichen biologischen Prozessen wie Zellzykluskontrolle (Schmidt et al.,

2002), Apoptose (Gilley et al., 2003) sowie an der Regulation von

Stoffwechselprozessen in Leber, Muskel, Fett und Pankreas beteiligt. Ende der

Neunziger Jahre wurde in Studien mit Caenorhabditis elegans erstmals gezeigt,

dass FoxO-Proteine bei der Insulin-Signalkaskade eine Rolle spielen (Ogg et

al., 1997; Lin et al., 1997). In jüngeren Studien wurde eine Beteiligung von

FoxO-Proteinen an metabolischen Prozessen in Drosophila nachgewiesen

(Hwangbo et al., 2004).

Das humane FoxO1a enthält an den Aminosäureresten Threonin 24, Serin 256

und Serin 319 drei Konsensusmotive für die Phosphorylierung durch die

Serin/Threonin-Kinase PKB (RXRXXS/T) und ist ein direktes Substrat der PKB

(Rena et al., 1999; Nakae et al., 1999). Durch Phosphorylierung nimmt die

transkriptionelle Aktivität von FKHR ab und es erfolgt ein Transport aus dem

Zellkern ins Zytoplasma (Belham et al., 1999; Biggs, III et al., 1999; Brunet et

al., 1999; Lange et al., 1994; Liao et al., 1998; Lizcano and Alessi, 2002).

Weitere Phosphorylierungen an den Aminosäureresten Serin 322 und Serin 325

durch die Proteinkinase CK I (Rena et al., 2002) und am Aminosäurerest Serin

329 durch die Proteinkinase DYRK1A (Woods et al., 2001b) sind ebenfalls

bekannt.

In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, dass Forkhead

Transkriptionsfaktoren an so genannte Insulin-responsive Elemente (IRUs)

binden, die erstmals im Gen der PEPCK identifiziert wurden (Unterman et al.,

1994; O'Brien et al., 1990). Die katalytische Untereinheit des G6Pase-

Promotors enthält drei solcher IRUs mit dem Konsensusmotiv T(G/A)TTT.

7

1 Einleitung

CAGGCTGTTTTTGTGTGCCTGTTTTTCTATTTTACGTAA

GRE

IRU IRU IRU

-186 -172 -164-180

Abb. 4. Strukturausschnitt des Promotors des G6Pase-Gens. Die Insulin-responsiven Elemente IRUs (rot), die als FoxO1a-Bindungsstellen dienen, liegen in einem Abschnitt, der auch ein glucocorticoidresponsives Element (GRE, grau) enthält.

FoxO1a ist in der Lage, mit hoher Affinität an die IRUs im G6Pase-Promotor zu

binden (Ayala et al., 1999). Dies führt zu gesteigerter Transkription des Gens

der G6Pase (Schmoll et al., 2000; Barthel et al., 2001; Nakae et al., 2001).

Durch Mutationsanalysen in Reportergensystemen wurde die entscheidende

Rolle dieser Strukturen bei der Regulation des G6Pase-Gens durch Insulin

nachgewiesen. Die Phosphorylierung von FoxO1a durch Wachstumsfaktoren,

somit auch die insulinabhängige Phosphorylierung, führt zur transkriptionellen

Inaktivierung und nukleären Exklusion des Transkriptionsfaktors (Biggs, III et

al., 1999; Durham et al., 1999; Guo et al., 1999; Tang et al., 1999; Schmoll et

al., 2000).

Phosphorylierung durch andere Kinasen wie z.B. JNK (Jun-N-terminal kinase)

als Folge von oxidativem Stress führen hingegen zu einer Translokation in den

Zellkern. Die Angriffspunkte in den FoxO-Proteinen unterscheiden sich von den

oben beschriebenen (Essers et al., 2004; Matsumoto and Accili, 2005; Lehtinen

et al., 2006). Bemerkenswert ist, dass die Reaktion auf oxidativen Streß den

Effekt der Wachstumsfaktoren überwiegt (Wang et al., 2005).

Neben der Phosphorylierung ist die Acetylierung/Deacetylierung ein weiterer

Regulationsmechanismus der FoxO-Transkriptionsfaktoren. SIRT1 deacetyliert

FoxO-Proteine und vermindert somit deren Aktivität (Motta et al., 2004; Brunet

et al., 2004; van der Horst et al., 2004). Eine Phosphatase, die FoxO-Proteine

dephosphoryliert, ist noch nicht identifiziert.

Bei Glucagon- und Glucocorticoid-induzierter Expression des G6Pase-Gens

spielt FoxO1a ebenfalls eine essentielle Rolle (Nakae et al., 2001). Der

Glucocorticoidrezeptor bindet an „Glucocorticoid-responsive Elemente“ (GREs).

Ein solches GRE liegt im Promotor des G6Pase-Gens im selben

Sequenzabschnitt wie die IRUs (siehe Abbildung 4). Diese Erkenntnisse legen

8

1 Einleitung

die Vermutung nahe, dass FoxO-Proteine bei der Regulation der hepatischen

Glucoseproduktion eine wichtige Rolle spielen.

1.5 Die Familie der DYRK Kinasen und ihre Verbindung mit dem Transkriptionsfaktor FoxO1a

Die Proteinkinasen DYRK1A (DYRK = dual-specificity tyrosine-phosphorylated

and regulated kinase), DYRK1B und DYRK2, die in dieser Arbeit im

Wesentlichen untersucht wurden, gehören zu einer Familie bestehend aus

mindestens sieben Säuger-Isoformen (DYRK1A, DYRK1B, DYRK1C, DYRK2,

DYRK3, DYRK4A und DYRK4B), dem Hefehomolog Yak1p und der Drosophila-

Kinase minibrain (MNB). Dual Specificity beschreibt ihre Fähigkeit sowohl

Serin-/Threonin- als auch Tyrosinreste zu phosphorylieren (Himpel et al., 2001;

Kentrup et al., 1996; Becker et al., 1998; Becker and Joost, 1999).

Während DYRK1A ubiquitär exprimiert wird und DYRK1B in Muskel- und

Hodengewebe vorkommt (Leder et al., 1999), wurden die anderen Isoformen

bisher nur in Hodengewebe nachgewiesen.

DYRK1A und DYRK1B sind subzellulär im Kern lokalisiert, DYRK2 hingegen ist

nur im Zytoplasma vorhanden. Dies ist auf eine Kernlokalisationssequenz

(nuclear localisation sequence, NLS) zurückzuführen, die alle DYRK1-

Isoformen aufweisen.

629 AS 92% Kern Hoden, Muskel ja

Größe Lokalisation ExpressionGemeinsamkeit

mit DYRK1A(katal. Domäne)

528 AS 46% Zytoplasma Hoden nein

763 AS 100% Kern ubiquitär jaDYRK1A

DYRK1B

DYRK2

NLS

Abb. 5 Vergleich der drei in dieser Arbeit behandelten DYRK-Isoformen. DYRK1A und DYRK1B sind im Gegensatz zu DYRK2 im Kern lokalisiert. Die Isoformen unterscheiden sich zudem in ihrer Expression (NLS = nuclear localisation sequence (Kernlokalisationssequenz).

9

1 Einleitung

Die verschiedenen Isoformen unterscheiden sich außerdem durch ihre

Substratspezifität, was ihre Beteiligung an unterschiedlichen zellulären

Prozessen vermuten lässt. Bereits länger bekannte Substrate von DYRK1A

sind Transkriptionsfaktoren wie FoxO1a, STAT3, CREB und Gli1 (Matsuo et al.,

2001; Woods et al., 2001b; Mao et al., 2002; Yang et al., 2001). Neuere

Untersuchungen haben Mitglieder der NFAT (nuclear factor of activated T-

cells)-Transkriptionsfaktorenfamilie als Substrate von DYRK1A und DYRK2

identifiziert (Gwack et al., 2006). Neben den genannten Transkriptionsfaktoren

wurden auch zytoplasmatische Proteine als in vitro-Substrate von DYRK1A

nachgewiesen. Es handelt sich hierbei unter anderem um Proteine wie elF2Bε,

Tau und Dynamin (Chen-Hwang et al., 2002; Woods et al., 2001a), wobei

elF2Bε und Tau in vitro auch durch DYRK2 und DYRK3 phosphoryliert werden,

die im Zytoplasma lokalisiert sind (Woods et al., 2001a). Die Phosphorylierung

des Spleißfaktors SF3b1 lässt eine Beteiligung von DYRK1A an mRNA-

Spleißprozessen vermuten (De Graaf et al., 2006). Kürzlich wurde eine

Interaktion von DYRK1A mit 14-3-3-Proteinen nachgewiesen, wodurch die

katalytische Aktivität von DYRK1A gesteigert wird (Alvarez et al., 2007). Aus

der Familie der Cycline wird Cyclin L2 durch DYRK1A und Cyclin D3 durch

DYRK1B phosphoryliert (De Graaf et al., 2004; Takahashi-Yanaga et al., 2006).

DYRK1B phosphoryliert und aktiviert außerdem HNF1α (Lim et al., 2002).

In aktuellen Untersuchungen wurde eine Phosphorylierung des

Tumorsuppressorproteins p53 durch DYRK2 und somit eine Beteiligung an

Prozessen der Apoptose nachgewiesen (Taira et al., 2007).

Die DYRK-Isoformen haben große Ähnlichkeit in der katalytischen Domäne,

unterscheiden sich jedoch im N- und C-terminalen Bereich. Die wahrscheinlich

größte Gemeinsamkeit aller DYRK-Kinasen ist ihre Fähigkeit zur

Autophosphorylierung.

Das Gen für DYRK1 liegt auf Chromosom 21 in einer Region, die als „Down´s

syndrome critical region“ bezeichnet wird (Becker et al., 1998). DYRK1A scheint

eine Rolle bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems zu spielen.

Überexpression von DYRK1A in transgenen Mäusen hat zu Veränderungen der

Neuronenentwicklung, zu motorischen Störungen und Verhaltensänderungen

geführt (Altafaj et al., 2001). DYRK1A wird nicht nur in Verbindung mit der

10

1 Einleitung

Trisomie 21 (Down´s Syndrom) sondern auch mit der Alzheimer-

Demenzerkrankung gebracht (Kelly and Rahmani, 2005; Kimura et al., 2007).

Es wurde beschrieben, dass DYRK1A den Transkriptionsfaktor FoxO1a an der

Position Ser329 phosphoryliert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass FoxO1a

und DYRK1A in bestimmten Kernregionen co-lokalisiert sind („speckles“) und

aus Zellextrakten co-immunopräzipitiert werden können. Diese Daten lassen

vermuten, dass DYRK1 und FoxO1a auch funktionell miteinander interagieren

(Woods et al., 2001b).

1.7 Arbeitshypothese und Zielsetzung

Es war bekannt, dass FoxO1a an der Regulation des Glucose-6-

Phosphatasegens beteiligt ist. Außerdem wurde in vorausgehenden Arbeiten

eine Protein-Protein-Interaktion zwischen FoxO1a und DYRK1 beschrieben. Es

stellt sich somit die Frage nach der funktionellen Bedeutung dieser Interaktion.

Dieser Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass DYRK1 eine Rolle bei der

Vermittlung FoxO1a-abhängig regulierter biologischer Funktionen wie z.B. der

Regulation des G6Pase-Gens spielt.

Ziel dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen,

1.) welchen Effekt DYRK1 auf die FoxO1a-abhängige Aktivierung des

Promotors der Glucose-6-Phosphatase hat und

2.) über welche molekularen Mechanismen (z. B. Phosphorylierung von

FoxO1a durch DYRK1) dieser Effekt vermittelt wird.

11

2 Materialien und Methoden


2.1 Konstrukte

2.1.1 Der Promotor des Glucose-6-Phosphatasegens

Das in dieser Arbeit verwandte Promotorkonstrukt enthält den Glucose-6-

Phosphatase-Promotor der Ratte (-1227/+57), der in den promotorlosen

Luciferase-Reportergen-Vektor pGL3 basic kloniert wurde. Der G6Pase-

Promotor enthält drei sog. „Insulin responsive Elemente“ (T(G/A)TTT), die für

die Regulation des G6Pase-Gens durch Insulin entscheidend sind, da sie als

Bindungsstellen für FoxO1a dienen (Schmoll et al., 1996). Das Konstrukt wurde

freundlicherweise von PD Dr. Dieter Schmoll (Frankfurt) zur Verfügung gestellt

(siehe auch Abbildung 4).

2.1.2 FoxO1a Wildtyp

Dieses Plasmid wurde hauptsächlich zur Kontrolle und zum Vergleich mit

anderen FoxO1a-Konstrukten eingesetzt.

FoxO1a WT wurde in den Expressionsvektoren pCDNA3.1/His C (Fa.

Invitrogen, USA) und pEGFP-C1 (Fa. Clontech, USA) verwendet. Die cDNA

wurde freundlicherweise von Frank Rauscher (Pennsylvania, USA) zur

Verfügung gestellt.

2.1.3 FoxO1a Ser329-Punktmutanten

FoxO1a wird an der Position Serin 329 durch die Proteinkinase DYRK1A

phosphoryliert. Es wurden Experimente mit zwei FoxO1a-Mutanten

durchgeführt.

2.1.3.1 FoxO1a Ser329Ala-Mutante

Bei diesem Konstrukt wurde die Aminosäure Serin an der Position 329 durch

Alanin ersetzt. Durch diese Veränderung kann an dieser Position keine

Phosphorylierung mehr erfolgen.

12


2.1.3.2 FoxO1a Ser329Asp-Mutante

Durch den Austausch der Aminosäure Serin 329 gegen Asparaginsäure wurden

negative Ladungen eingefügt, die den Effekt einer permanenten

Phosphorylierung simulieren.

Diese Mutanten wurden nach dem Prinzip der „Sequenzspezifischen

Mutagenese“ hergestellt (siehe unten). Es wurden Pfu Turbo-DNA-Polymerase

(Fa. Promega) und die folgenden Primer (Fa. MWG Biotech) eingesetzt:

FoxO1 a Ser329Ala :

S G R L A P I M T E Q5´- AGT GGG AGA CTT GCT CCC ATA ATG ACA GAG CAG -3´3´- TCA CCC TCT GAA CGA GGG TAT TAC TGT CTC GTC -5´

FoxO1a Ser329Asp:

I S G R L D P I M T5´- ATC AGT GGG AGA CTG GA T CCC ATC ATG ACA -3´3´- TAG TCA CCC TCT GAC CTA GGG TAG TAC TGT -5´

Die fett gedruckten Buchstaben markieren die veränderten Nucleotide, die roten

die ausgetauschten Aminosäuren. Im Falle der Serin-Alanin-Mutante wurde

eine im Wildtyp enthaltene BspH1-Schnittstelle entfernt, bei der Serin-

Asparaginsäure-Mutante eine zusätzliche BamH1-Schnittstelle (unterstrichen)

eingefügt. Diese Schnittstellen dienen dazu, den Wildtyp von Mutanten und

Mutanten untereinander mittels einfacher Restriktionsverdaus zu unterscheiden.

Die Serin-Punktmutanten wurden in den Vektor pEGFP-C1 (Fa. Clontech, USA)

kloniert.

2.1.4 IRU-Mutante des Glucose-6-Phosphatasereportergens

Auch diese Mutante wurde, wie die anderen FoxO1a-Punktmutanten, nach dem

Prinzip der „Sequenzspezifischen Mutagenese“ hergestellt. Es wurden die drei

Phosphorylierungsstellen der PKB in FoxO1a Thr24, Ser256 und Ser319 durch

Alaninreste ersetzt. Dadurch ist diese Mutante resistent gegenüber einer

Stimulation mit Insulin und konstitutiv im Zellkern lokalisiert.

Für dieses Konstrukt wurden folgende Primer (Fa. MWG Biotech) verwendet:

13


Thr24Ala:

5´-CCC CGG CCG CGC TCG TGC GCA TGG CCG CTG CCC-3´

5´-GGG CAG CGG CCA TGC GCA CGA GCG CGG CCG GGG-3´

Ser256Ala:

5´-CCT AGG AGA AGA GCG GCC GCA ATG GAC AAC AAC-3´

5´-GTT GTT GTC CAT TGC GGC CGC TCT TCT CCT AGG-3´

Ser319Ala:

5´-CGC CCT CGA ACT AGT GCA AAT GCT AGT AC-3´

5´-GTA CTA GCA TTT GCA CTA GTT CGA GGG CG-3´

Die FoxO1a-Konstrukte wurden in die Vektoren pcDNA3.1/His C (Fa.

Invitrogen) und pEGFP-C1 (Fa. Clontech) kloniert. Sämtliche Konstrukte

wurden durch Sequenzierung des kompletten Leserahmens der FoxO1a-cDNA

überprüft.

2.1.5 DYRK-Konstrukte

Die verwendeten DYRK-Konstrukte DYRK1A, DYRK1B, DYRK2 und DYRK1A

K188R (alle in pEGFP-N1 (Fa. Clontech, USA)) wurden freundlicherweise von

Prof. Walter Becker (Aachen) zur Verfügung gestellt. Sie sind in

vorangegangenen Arbeiten beschrieben worden (Becker et al., 1998; Himpel et

al., 2001; Leder et al., 1999). Die Punktmutante DYRK1A K188R wurde, wie

auch die FoxO1a-Punktmutanten, nach dem Prinzip der „Sequenzspezifischen

Mutagenese“ hergestellt.

14


2.2 Zellbiologische Arbeitstechniken

2.2.1 Zelllinien

Bei den im Rahmen dieser Dissertation verwendeten Zellen handelt es sich um

die Hepatomzelllinien HepG2 (Mensch) und H4IIEC3 (Ratte) sowie um eine

retrovirale Verpackungszelllinie (Phoenix).

Mit HepG2-Zellen wurden ausschließlich transiente Transfektionen

durchgeführt.

Stabile Transfektionen wurden mit einer H4-Rattenhepatomzelllinie, die den

Promotor des G6Pasegens stabil exprimiert, durchgeführt. Diese Zelllinie wurde

freundlicherweise von PD Dr. Dieter Schmoll (Frankfurt) zur Verfügung gestellt.

Es wurde zusätzlich eine Zelllinie hergestellt, die DYRK1A stabil exprimiert.

Dafür wurde die in früheren Arbeiten beschriebene DYRK1A-cDNA (Kentrup et

al., 1996) in die EcoRI- und XhoI-Schnittstellen des retroviralen Vektors pWZL-

Blasto kloniert. Anschließend wurde das DYRK1A-Konstrukt mittels retroviralen

Gentransfers in H4-Hepatomzellen gebracht, die nun sowohl den Promotor des

G6Pase-Gens als auch DYRK1A stabil exprimieren. Als Kontrollzellen wurden

H4-Zellen mit dem leeren Vektor pWZL-Blasto infiziert.

2.2.1.1 Medien und allgemeine Kulturbedingungen

Die Zellen wurden in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit einem

Anteil von 5% CO2 bei 37°C kultiviert. Sie wurden in DMEM F-12 (HepG2) und

DMEM Medium (HAIIEC3) gehalten. Den Medien (Fa. PAA Laboratories GmbH,

A) wurden 10% FCS, 50 µg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin (Fa.

GIBCO) zugesetzt. Die Kulturgefäße stammen von der Firma Nalge Nunc

International. Sämtliche Kulturmedien wurden über Nitrocellulosemembranen

(Fa. Becton Dickinson) steril filtriert.

2.2.1.2 Subkultivierung

Jeweils nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen passagiert. Hierzu

wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 1 ml 0,05%-igem

15


Trypsin-EDTA (Fa. GIBCO) für ca. 10 min inkubiert. Der Prozess wurde durch

Zugabe von frischem Medium gestoppt und die Zellen auf neue Gefäße verteilt.

2.2.2 Transfektion

HepG2-Zellen wurden mit FuGENETM 6 Transfection Reagent (Fa. Roche) nach

den Beschreibungen des Herstellers transient transfiziert.

Am Tag vor Transfektion wurden die Zellen trypsiniert und auf neue

Kulturgefäße verteilt, so dass sie zum Zeitpunkt der Transfektion eine

Konfluenz von 50-80% besaßen.

Für die Transfektion wurde ein Reagenz-DNA-Gemisch im Verhältnis 3:1 (µl

Reagenz: µg DNA) hergestellt. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur ca.

15 min lang inkubiert. Anschließend wurde der Reagenz-DNA-Komplex

tröpfchenweise zum Kulturmedium der zu transfizierenden Zellen gegeben.

Bis zum weiteren Experiment wurden die Zellen bei 37 °C inkubiert.

24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geteilt und nach 36 Stunden

auf F12-Medium mit 0,01mg/ml BSA, 20mM Hepes, pH 7,4 und

Penicillin/Streptomycin gesetzt.

Phoenix-Zellen wurden transient mit der Calcium-Phosphat-Methode

transfiziert.

Materialien:

• Verpackungszelllinie (Phoenix-Zellen)

• Plasmid-DNA

• 2 M CaCl2

• 2x HBS

Durchführung:

30 µg der zu transfizierenden DNA wurden in einem sterilen 15 ml Kunststoff-

Röhrchen vorgelegt. Es wurden 1,5 ml Bidest und 183 µl der 2 M CaCl2-Lösung

hinzugefügt. Zur Transfektionskontrolle wurde außerdem 0,5 µg pEGFP-CF1-

Plasmid-DNA hinzu gegeben. Nach Durchmischen und kurzer Zentrifugation

16


wurde tropfen weise die 2x HBS-Lösung hinzu pipettiert. Mit einer

Pasteurpipette wurde für 20 s Luft in die Lösung geblasen, danach 15 min bei

Raumtemperatur inkubiert. An einer Trübung der Lösung kann man die Bildung

der Calciumphosphat-Kristalle erkennen. Das Gemisch wurde tropfen weise auf

die Zellkultur pipettiert und die Zellen über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Erfolg

der Transfektion konnte anhand der Expression von GFP unter dem UV-

Mikroskop anhand grün fluoreszierender Zellen beurteilt werden.

2.2.3 Retroviraler Gentransfer

Die Retroviren enthalten die Gene GAG (gruppenspezifisches Antigen), POL

(reverse Transkriptase) und ENV (Hüllprotein). Im Vektor pWZL-Blasto ist GAG

enthalten, die Phoenixzellen exprimieren POL und ENV. Bei Transfektion von

Phoenixzellen mit pWZL Blasto und der enthaltenen Plasmid-DNA ergibt sich

ein retrovirales Genom. Die produzierten Retroviren können nun weitere Zellen

infizieren, die dann die durch das Plasmid kodierten Gene stabil exprimieren

können.

Infektion der H4IIEC3-Zellen

Retrovirusproduktion

Retrovirales Plasmid

pWZLblasto

blastogag

LTR

LTR

amp

DYRK1AEcoRI XhoI

Ф-Zellen

Transfektion Infektion

Abb. 6 Das Prinzip des retroviralen Gentransfers. Die Verpackungszellen (Phoenix-Zellen, Ф) werden mit dem retroviralen Plasmid transfiziert. Die produzierten Retroviren infizieren die Hepatomzelllinie H4IIEC3, die das enthaltene Plasmid stabil exprimiert.

Die Verpackungszelllinie zur Herstellung der Retroviren (Phoenix-Zellen) wurde

mit dem retroviralen Vektor (pWZL) transient transfiziert (s.o.).

17


Nach der Transfektion wurden die Zellen über Nacht bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen nach einem Medienwechsel für weitere 48-72

h bei 32°C inkubiert, weil bei dieser Temperatur die von der transfizierten

Verpackungszelllinie produzierten Retroviren am stabilsten sind. Die

produzierten Viren akkumulierten so im Medium.

Der virushaltige Überstand wurde abgenommen, durch kurze Zentrifugation von

Zelldetritus gereinigt, steril filtriert (20µm Filter, Fa. Sartorius) und bis zur

weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.

Das Zellsystem, das das gewünschte Protein stabil exprimieren soll, wurde

dann mit den gewonnenen Retroviren infiziert. Dazu wurden die Zellen

(H4IIIEC3) auf Kulturschalen ausgesät, so dass sie zu Beginn der Infektion

einen Konfluenzgrad von 30-50 % hatten. Das alte Medium wurde durch 1 ml

frisches ersetzt. Dazu wurden 3 µl 10-3 M Insulin und 3 µl Polybrene (Fa. Sigma)

pipettiert. Auf das Medium wurden 2 ml des virushaltigen Mediums pipettiert.

Die Kulturschale wurde 90 min bei Raumtemperatur und 3400 U/min

zentrifugiert.

Anschließend wurden die Zellen für mind. 48 h bei 32°C inkubiert, bevor mit der

Selektion begonnen wurde.

2.2.4 Selektionierung der infizierten Zellen

Materialien:

• Retroviral infizierte Zellen

• Antibiotikum (Blasticidin, Fa. Calbiochem, USA)

Durchführung:

Um ausschließlich diejenigen Zellen zu erhalten, die die gewünschte cDNA ins

Genom integriert hatten, wurde das Prinzip der Antibiotikaresistenz zur

Selektionierung genutzt. Das Retrovirus enthält zusätzlich zur gewünschten

cDNA ein Antibiotika-Resistenz-Gen, welches es den erfolgreich infizierten

Zellen ermöglicht, in Gegenwart von Antibiotika, in diesem Fall Blasticidin, zu

überleben. Zur Kontrolle werden nicht-infizierte Zellen eingesetzt.

18


Die Selektionierung erfolgte mit einer Antibiotika-Konzentration von 500 µg/ml.

Das Medium mit dem Antibiotikum wurde alle zwei Tage gewechselt, bis alle

Kontrollzellen abgestorben waren.

2.3 Proteinchemische Arbeitstechniken

2.3.1 SDS-PAGE

Materialien:

• 30% Acrylamid/Bisacrylamid, 37,5:1 (Fa. Bio-Rad)

• 10% Ammoniumpersulfat

• TEMED (Fa. Bio-Rad)

• 10% SDS

• 1,5 M Tris-HCl pH 8,8

• 0,5 M Tris-HCl pH 6,8

• Elektrodenpuffer : 25 mM Tris

250 mM Glycin

0,1% SDS

• Probenpuffer (nach Laemmli, 2X LSB) :

20 Vol% Glycerin

8% SDS

10 mM EDTA

0,25 M Tris

5 Vol% Bromphenolblau-Lsg.

• Kaleidoskop-Proteingrößen-Standard (Fa. Bio-Rad)

2.3.1.1 Gelherstellung

In Abhängigkeit vom Molekulargewicht des zu bestimmenden Proteins wurde

ein Polyacrylamidgel entsprechender Zusammensetzung polymerisiert.

1) Polyacrylamid-Trenngel

19


Totales Volumen 30% Acrylamid (H2O)

Endkonzentration 12 ml 24 ml 36 ml 48 ml

5% 2 (6,8) 4 (13,5) 6 (20,3) 8 (27)

7,5% 3 (5,8) 6 (11,5) 9 (17,3) 12 (23)

10% 4 (4,8) 8 (9,5) 12 (14,3 16 (19)

12,5% 5 (3,8) 10 (7,5) 15 (11,3) 20 (15)

15% 6 (2,8) 12 (5,5) 18 (8,3) 24 (11)

weitere Komponenten:

1,5 M

Tris-HCl pH 8,83 ml 6 ml 9 ml 12 ml

10% SDS 0,12 0,24 0,36 0,48

10% APS 0,12 0,24 0,36 0,48

TEMED 0,012 0,024 0,036 0,048

2) 4% Polyacrylamid-Sammelgel (Gesamtvolumen 12 ml)

30% Acrylamid-Lösung 1,6 ml

H2O 8,6 ml

0,5 M Tris-HCl pH 6,8 1,5 ml

10% SDS 0,12 ml

10% APS 0,12 ml

TEMED 0,012 ml

Um die Polymerisation der Lösungen herbeizuführen, wurden pro Milliliter

jeweils 10 µl 10% APS und 1 µl TEMED hinzu gegeben.

Zuerst wurde das Trenngel (5 ml) zwischen zwei Glasplatten gegossen. Die

Lösung wurde mit 70% Ethanol überschichtet um eine exakte Grenzschicht zu

erhalten. Nach erfolgter Polymerisation wurde anschließend über das Trenngel

das Sammelgel gegossen, in das ein Kamm mit der gewünschten Anzahl an

Vertiefungen eingefügt wurde. Die Vertiefungen konnten nach beendeter

Polymerisation mit den Proben befüllt werden.

20


2.3.1.2 Probenvorbereitung

Die Zelllysate wurden in eiskaltem Lysepuffer gewonnen und 10 min bei 12000g

zentrifugiert.

Pufferzusammensetzung: 50 mM Hepes, pH 7,6

1% Triton X-100

150 mM NaCl

1 mM EDTA

10% Glycerol

1 mM DTT

1 mM Benzamidin

0,5 mM PMSF

10 mM NaF

1 mM Na3VO4

30 mM Na4P2O7

2.3.1.3 Proteinbestimmung (BCA-Methode)

Materialien:

• BCA Protein Assay Reagent A (Fa. Pierce)

• BCA Protein Assay Reagent B (1:50 mit Reagenz A)

• Lyse-Puffer

Durchführung:

Von dem zuvor bereiteten Zelllysat wurden 1-5 µl eingesetzt und mit dem Lyse-

Puffer auf 5 µl Endvolumen in einer Mikrotiterplatte vorgelegt. Zu den einzelnen

Proben wurden 100 µl fertiges BCA-Reagenz hinzugefügt.

Als Referenz wurde eine Eichkurve mit 0, 1, 2, 5, 10 bzw. 20 µg/µl BSA

(Bovines Serum Albumin) erstellt, wobei die BSA-Stocklösung mit dem Lyse-

Puffer verdünnt wurde. Diese Proben wurden ebenfalls in die Mikrotiterplatte

pipettiert. Der Reaktionsansatz wurde dann 30 min bei 37°C inkubiert. Das

Fortschreiten der Reaktion ließ sich anhand einer zunehmenden Violettfärbung

verfolgen.

21


Die Auswertung und damit die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte

mit dem Spektrometer LAMBDA E (Fa. MWG Biotech) bei 562 nm und der

Software KC4-Kineticalc for Windows (Fa. Bio-Tec Instruments Inc.).

2.3.1.4 Gelelektrophorese

Die Elektrophorese wurde in einer Elektrodenkammer durchgeführt, die

vollständig mit Elektrodenpuffer gefüllt wurde. Die Proteine wurden bei 30-40

mA über eine Laufstrecke von 5 cm elektrophoretisch aufgetrennt.

2.3.2 Western-Blotting und ECL-System

Materialien:

• PROTRAN® Nitrocellulose Transfer Membran (Fa. Schleicher & Schuell)

• Whatman-Papier

• Transfer-Puffer 2,5 mM Tris

192 mM Glycin

20 Vol% Methanol

• TBS-T TrisCl 20 mM, pH 7,5

NaCl 150 mM

Triton 0,1%

2.3.2.1 Transfer

Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf eine Nitrocellulosemembran gelegt

und zwischen 2 Lagen Whatman-Papier in einer Elektrophoresekammer fixiert.

Die Proteine wurden elektrophoretisch bei 400 mA auf die Membran transferiert.

Der Blot wurde anschließend in einer 3%-igen BSA-TBS-T-Lösung 15 min lang

geblockt, danach mit TBS-T gewaschen.

2.3.2.2 Inkubation mit Antikörpern

Die Inkubation mit dem entsprechenden Primärantikörper (Anti-DYRK1A-

Antikörper, Fa. BD Transduction Labs, USA) erfolgte über Nacht in einer 3%

BSA-Lösung in TBS-T mit 0,02% NaN3.

22


Am darauf folgenden Tag wurde der Blot gründlich mit TBST gewaschen.

Anschließend wurde der Blot für eine Stunde mit dem Peroxidase-konjugierten

Sekundärantikörper (Fa. Amersham Pharmacia, Schweden) (1:5000 einer 3%

(w/v) Milchpulver-TBS-T-Lösung) inkubiert. Danach wurde der Blot erneut

intensiv mit TBS-T gewaschen.

Die Antikörperreaktion mit dem Antigen wurde durch die Peroxidaseaktivität

mittels eines Lumineszenssubstrates detektiert.

Zusammensetzung der Substratlösung:

500 µl Tris-Cl 3M, pH 8,8

200 µl Luminol (Stocklsg. : 0,44 g/10 ml DMSO)

100 µl p-Coumarinsäure (Stocklsg.: 0,15 g/10 ml DMSO)

19,2 ml H2O

20 µl 30% H2O2

Der Blot wurde einige Sekunden lang in der Lösung inkubiert. Die emittierte

Lumineszenz wurde mit einem Film (Fa. Kodak) detektiert.

2.3.3 Ponceau-Färbung

Der Nachweis des erfolgreichen Proteintransfers vom Gel auf die

Nitrocellulosemembran erfolgte durch Färbung der Membran mit Ponceau S.

Durch reversible Bindung der Sulfonsäuregruppen an Proteine können die

Proteinbanden auf einem Western Blot sichtbar gemacht werden.

Materialien:

• Ponceau-Lösung 0,25 g Ponceau S (Fa. Sigma)

40 ml Methanol

15 ml Eisessig

45 ml H20

23


2.4 Molekularbiologische Arbeitstechniken

2.4.1 DNA-Präparation

2.4.1.1 Minipräparation

Materialien:

• Bakterienkolonien

• LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml)

• STET-Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8

50 mM EDTA

0,5% Triton X 100

8% Glucose

• Lysozym (10 mg/ml in H2O)

• TE-Puffer: TrisCl 10 mM

EDTA 0,5 mM

• Isopropanol

Durchführung:

Zur Isolierung kleinerer Mengen Plasmid-DNA diente die Methode nach

HOLMES und QUIGLEY (1981). Einzelkolonien wurden von Kolonieplatten

geerntet und über Nacht in 1,5 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) bei

37°C angezüchtet. Die Suspension wurde in Probengefäße (Fa. Eppendorf)

überführt und bei 12.000 g abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 250 µl STET-

Puffer und 10 µl Lysozym (10 mg/ml) resuspendiert. Anschließend wurden die

Bakterien durch Kochen (50 sec) lysiert. Es wurde 15 min bei 12.000 g

zentrifugiert und anschließend das Pellet verworfen. Der verbleibende

Überstand wurde mit 260 µl Isopropanol gefällt und das getrocknete Pellet in

TE-Puffer aufgenommen.

2.4.1.2 Präparation größerer DNA-Mengen

Größere Mengen Plasmid-DNA wurden mit Hilfe des Plasmid Maxi Kits (Fa.

QIAgen) nach den Angeben des Herstellers präpariert. 250 ml LB-Medium mit

24


Ampicillin (100 µg/ml) wurden mit einer Kolonie inokuliert und über Nacht bei

37°C inkubiert. Die so gezüchteten E. coli-Bakterien wurden abzentrifugiert (5

min, 8.000 g) und das Pellet zur Präparation von Plasmid DNA eingesetzt.

2.4.2 Restriktionsverdau

Restriktionsverdaus wurden nach den Angaben der Hersteller mit den

empfohlenen Puffern durchgeführt. Die Restriktionsenzyme wurden von den

Firmen NEB, Pharmacia und Gibco bezogen.

2.4.3 Herstellung kompetenter E. coli-Bakterien

Materialien:

• TfB I-Puffer (pH 5,8) 90 mM Kaliumacetat

10 mM CaCl2xH2O

0,5 mM LiCl

100 mM RbCl

50 mM MnCl2xH2O

15% (w/v) Glycerin

• TfB II-Puffer (pH 7,0) 10 mM MOPS

10 mM RbCl

75 mM CaCl2xH2O

• LB-Medium

Beide Puffer wurden steril filtriert.

Durchführung:

Aus einer Gefrierkultur wurden E. coli-Zellen des Stammes DH5α auf LB-

Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Eine einzelne Kolonie wurde am nächsten Tag in 2 ml LB-Medium

aufgenommen und über Nacht bei 37°C unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert.

25


Zu 150 ml LB-Medium wurden 800 µl dieser Kultur gegeben. Unter Kontrolle

der optischen Dichte (Eppendorf Photometer 1101M) wurde die Kultur bei 37°C

auf dem Schüttler (200 U/min) bis zu einer OD578 = 0,5 herangezogen .

Die Zellsuspension wurde in einem 250 ml-Zentrifugenbecher überführt und 20

min auf Eis gestellt. Anschließend erfolgte die Pelletierung der Zellen (5000 U/

min/4°C/10 min/Rotor JA-14 (Fa. Beckmann)) Das Pellet wurde vorsichtig in 45

ml TfB I-Puffer resuspendiert und für zwei Stunden auf Eis gekühlt. Die Zellen

wurden erneut pelletiert und in 6 ml TfB II-Puffer resuspendiert. Nach dem

Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff erfolgte die Lagerung der kompetenten

Zellen bei –80 °C.

2.4.4 Transformation von E.coli-Bakterien

2.4.4.1 Hitzeschocktransformation

Materialien:

• Plasmid-DNA

• Kompetente E. coli-Bakterien

• LB-Medium

Durchführung:

Zu 80-100 µl kompetenter E.coli-Bakterien wurden 1-2 µl der durch Mini-Preps

(s.o.) isolierten Plasmid-DNA in ein Probengefäß pipettiert. Dieses wurde 15

min auf Eis gestellt und anschließend 1-2 min bei 42°C erwärmt. Es wurden 900

µl LB-Medium hinzugefügt und das Reaktionsgefäß bei 37°C und 200 U/min für

eine Stunde in den Schüttler gestellt. Danach wurde 2 min bei 3000 U/min

zentrifugiert, 900 µl des Überstandes wurden verworfen und die sedimentierten

E. coli-Bakterien wurden durch Auf- und Abpipettieren in die verbleibenden 100

µl des LB-Mediums verteilt. Diese wurden dann auf eine mit Ampicillin versetzte

Agarplatte ausplattiert. Die Agarplatte wurde bei 37°C über Nacht inkubiert und

am nächsten Tag auf amplifizierte Klone überprüft.

26


2.4.4.2 Elektroporation

Materialien:

• Plasmid

• Elektroporationsküvetten (Fa. Eurogentec, Belgien)

• Elektrokompetente E. coli

• Antibiotikahaltige Agarplatten

Durchführung:

Das aufgereinigte Plasmid wurde mit 100 µl Bakteriensuspension in eine

Elektroporationsküvette gegeben. Die Bakterien wurden bei 2,5 kV, 25 µF und

200 Ω elektroporiert (Gene Pulser, Fa. Bio-Rad). Anschließend wurde die

Suspension mit LB-Medium ca. 1 h bei 37°C inkubiert und auf Agarplatten,

welche ein Antibiotikum enthielten, ausplattiert.

2.4.5 DNA-Agarosegelelektrophorese

Materialien:

• Agarose (Fa. Seakem)

• Ethidiumbromid, Stock-Lsg.: 10 µg/µl (Fa. ICN Biomedicals)

• DNA-Leiter (Fa. Gibco)

• TAE-Puffer: 40 mM Tris-Acetat, pH 8,0

1 mM EDTA

• Orange-G-Probenpuffer: 50% Glycerin

0,25% Orange-G Stock-Lsg. in TAE-Puffer

Durchführung:

DNA-Fragmente wurden in 0,7-1,5% Agarosegelen (Agarose in TAE mit 0,5 µg/

ml Ethidiumbromid) aufgetrennt. Zu den Proben wurde vor dem Auftragen 1/5

Volumen Orange-G-Probenpuffer zugegeben. Als Größenstandard diente die 1

27


kb DNA Leiter, als Laufpuffer TAE. Die Elektrophorese wurde bei 100 V

durchgeführt. Die Banden wurden im UV-Durchlicht sichtbar gemacht.

2.4.6 Sequenzspezifische Mutagenese

Die FoxO1a Ser329-Punktmutanten wurden mit Hilfe des QuickChange™ Site-

Directed Mutagenesis Kits (Fa. Stratagene) nach den Angeben des Herstellers

generiert.

Prinzip der Sequenzspezifischen Mutagenese (nach WEINER et.al.1994):

Man benötigt für jede Mutation zwei Primer, einen Strang- und einen

Gegenstrangprimer, die beide die gewünschte Mutation enthalten. Mit

PfuTurbo-DNA-Polymerase (Fa. Promega) (besitzt Proofreading-Affinität) führt

man 16 Zyklen PCR durch, um das gesamte Plasmid komplett zu amplifizieren.

Anschließend verdaut man das Gemisch aus PCR-Produkt und

Ausgangsplasmid (Template) mit DpnI. DpnI schneidet spezifisch methylierte

und hemimethylierte DNA, so dass nur die Templates abgebaut werden. Nun

transformiert man die verbleibenden PCR-Produkte in superkompetente XL1-

Blue-Zellen, um das Plasmid mit der Mutation zu vermehren.

28


PCR

Transformation

DpnI-Verdau

Abb. 7 Prinzip der Sequenzspezifischen Mutagenese. Im ersten Schritt werden Primer mit der entsprechenden Mutation zum Template gegeben. Durch die Pfu-Polymerase mit Proof reading-Funktion erfolgt die Vervielfältigung. Im anschließenden Verdau mit DpnI werden die Templates wieder entfernt. Es folgt die Transformation in kompetente E. coli-Bakterien.

Sämtliche Konstrukte wurden durch Sequenzierung überprüft.

2.4.7 DNA-Sequenzierung

Sequenzierungen wurden nach der Didesoxymethode durchgeführt (Sanger et

al., 1992).

Es wurden folgende Primer (IRD-markiert) eingesetzt (Fa. MWG Biotech):

pWZL 5´ : GCC TCA ATC CTC CCT TTA TCC

pWZL 3´ : CCT CAC ATT GCC AAA AGA CGG

FKHR 5´ : GAA TTC AAT TCG CCA CAA TCT

FKHR 3´ : GGA TCA ACC GGT GAC ATA ATG

29


Materialien:

• DNA/Primer Premix: 0,5 µg DNA

2 pmol Primer

1 µl DMSO

ad 26 µl H2O

• Terminations-Mischung

• Sequenzgel 18 g Harnstoff

3,74 ml 10x TBE

4,2 ml 40% Acrylamid (Fa. BIO-RAD)

12,4 ml H2O

186 µl APS (10% Stock-Lsg.)

20 µl TEMED

• Stop Lösung

• TBE-Puffer

Durchführung

Für jede der zu sequenzierenden DNAs wurden vier Ansätze vorbereitet, einer

für jedes Didesoxynucleotid. Zuerst wurden 2 µl der Terminations-Mischung

(enthält die ddNTPs) in PCR-Gefäße vorgelegt. Dazu wurden 6 µl des

jeweiligen DNA/Primer Mixes gegeben.

Die PCR-Reaktion wurde mit dem Hybaid Thermo Cycler (Fa. MWG Biotech)

nach folgendem Protokoll durchgeführt.

1. Schritt 94°C 2´ 1 Zyklus

2. Schritt 94°C 15´´

Ta (°C) 15´´ 30 Zyklen

70°C 30´´

3. Schritt 4°C

(Ta=Annealing-Temperatur)

30


Zu jedem Ansatz wurden dann 4 µl der Stop-Lösung gegeben, anschließend 1

µl des fertigen Ansatzes auf das Acrylamidgel geladen.

Die Sequenzanalyse wurde mit dem LiCor Sequenzierautomaten (Fa. MWG

Biotech) bei 50°C über Nacht durchgeführt und am darauf folgenden Tag

ausgewertet.

2.4.8 Northern Blotting

2.4.8.1 RNA-Isolierung

Die Präparation der RNA wurde mit dem RNeasy Kit (Fa. QIAgen) nach den

Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.4.8.2 RNA-Agarosegelelektrophorese

Materialien:

• RNA

• Puffer (200 µl): 96 µl Formamid

20 µl 10x MOPS

35 µl Formaldehyd

29 µl Glycerol (37%)

20 µl Bromphenol Blau (0,1%)

• Formaldehyd-Agarose-Gel (100 ml):

10 ml 10x MOPS

75 ml bidestilliertes Wasser

0,8 g Agarose (Fa. Seakem)

Durchführung:

40 µg RNA einer jeden Probe wurden mit RNase freiem Wasser auf 40 µl

Volumen aufgefüllt und mit 20 µl des oben beschriebenen Puffers versetzt.

Zusätzlich wurden zu jeder Probe 3 µg Ethidiumbromid in 5 µl des gleichen

Puffers pipettiert. Diese wurden dann 5 min bei 65°C erhitzt. Anschließend

wurden sie auf ein Formaldehyd-Agarose-Gel aufgetragen.

31


2.4.8.3 Blotting

Materialien:

• Glasschüssel

• 20x SSC (1l): 175,3 g NaCl

88,2 g Trinatriumcitrat

• Whatman-Pappe

• Nylonmembran

• Parafilm

Durchführung:

Eine rechtwinklige Glasschüssel wurde mit 20x SSC etwa zur Hälfte gefüllt.

Darin wurde ein Quader eingelegt und auf diesen wiederum eine Glasscheibe.

Drei ca. 60 cm lange Whatman-Pappstreifen in der Breite der Glasschüssel

wurden übereinander gelegt, mit dem Puffer getränkt, an ihren beiden Enden

jeweils eingerollt und so auf die Glasscheibe gelegt, dass ihre beiden Enden in

den Puffer eintauchen und somit durch Kapillarkräfte die gesamte Pappe

ständig von Puffer benetzt wurde. Auf diese Pappstreifen wurde nun das Gel so

aufgelegt, dass seine Oberseite nach unten zeigt. Auf des Gel wurde die

Nylonmembran und auf diese ein genau so großes Stück Whatman-Pappe

gelegt.

Diese Anordnung wurde bis auf das bedeckte Gel selbst komplett mit Parafilm

überzogen, damit die Kapillarkräfte den Puffer ausschließlich durch das Gel auf

die Membran übertragen.

Auf die jetzt oben liegende Whatman-Pappe wurden dicht nebeneinander zwei

Stapel Falthandtücher aus Papier gelegt, auf diese jeweils ein Ziegelstein (ca.

1-2 kg), damit der Flüssigkeitssog durch die Kapillarkräfte ausreichend stark ist.

Der Transfer der RNA auf die Membran erfolgte über Nacht. Die Membran

wurde getrocknet und die RNA mittels UV-Licht (Fa. Biometra) kovalent an die

Membran gebunden („Crosslinking“).

32


2.4.8.4 Aufreinigen der DNA-Sonden nach Gelelektrophorese

Nach elektrophoretischer Trennung von Plasmid und Insert (Sonde)

(Agarosegelelektrophorese, s.o.), wurde die Sonde mit einem Skalpell unter

UV-Bestrahlung aus dem Gel herausgeschnitten und in ein Eppendorf-Gefäß

gegeben.

Die weitere Aufreinigung der Sonde erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction

Kit (Fa. QIAgen) nach den Angaben des Herstellers.

2.4.8.5 Markieren einer Sonde mit [32P]

Materialien:

• 10x Oligo labelling buffer: 500 mM Tris-HCL, pH 6,9

100 mM MgSO4

1 mM DTT

0,6 mM dATP

0,6 mM dGTP

0,6 mM dTTP

• DNA-Sonde

• HNP (Hexanucleotidprimer) (Fa. Pharmacia)

• [γ-32P]-dCTP (30 µCi) (Fa. Hartmann)

• Klenow-Fragment (10 U/µl) (Fa. NEB)

• Micro Spin-Säule (Fa. Pharmacia)

Durchführung:

10-20 ng einer DNA-Sonde wurden in einem Eppendorfgefäß vorgelegt. Dazu

wurden 2 µl OLB, 1 µl HNP (0,2 µg) gegeben und mit Wasser auf 16 µl

aufgefüllt. Das Eppendorfgefäß wurde 7 min in kochendem Wasser erhitzt und

anschließend sofort auf Eis gelagert. Es wurden dann 3 µl [γ-32P]-dCTP (30 µCi)

und 1 µl Klenow-Fragment dazu gegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Das

nichtinkorporierte [γ -32P]-dCTP wurde anschließend durch Gelfiltration über

eine Micro Spin Säule von der markierten Sonde getrennt. Um die Einbaurate

33


der Reaktion zu bestimmen, wurde die Radioaktivität von einem Mikroliter des

Eluats mit dem Flüssigkeitsszintilations-Messgerät (Fa. Beckman) bestimmt.

2.4.8.6 Hybridisierung der Northern Blots

Materialien:

• Northern Blot

• radioaktiv markierte Sonde

• Prähybridisierungslösung (Fa. Clontech)

• 2x SSC-Puffer, pH 7,0

Durchführung

Der feuchte Blot wurde in einen Glaszylinder gelegt und bei 72°C mit 10 ml der

Prähybridisierungslösung 30 min lang unter Rotation inkubiert. Danach wurde

die zuvor bei 95°C für 5 min aufgekochte Sonde hinzu gegeben. Der Blot wurde

nun mit der Sonde über Nacht bei 42°C hybridisiert.

Am darauf folgenden Tag wurde der Blot zweimal mit 200 ml 2x SSC/0,1%SDS

bei 42°C gewaschen. Der Blot wurde dann 24 lang mit einem Screen inkubiert,

welcher dann mit dem Phospho-Imager (Fa. Packard) gelesen wurde.

2.4.9 Reportergen-Assay (Luciferase)

Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem Luciferase Assay System und dem Dual

Luciferase System (beide Fa. Promega) nach den Angaben des Herstellers

gemessen. Die Daten wurden auf die co-exprimierte Renilla (pRLTK)-Aktivität

(HepG2) oder die Proteinkonzentration (H4) bezogen.

2.5 Statistische Analyse

Die Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Experimente wurden

mittels eines zweiseitigen, ungepaarten (Student´s) t-Tests auf signifikante

Unterschiede hin überprüft. Als Signifikanzniveau wurde α= 0,05 festgelegt.

34

3 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Effekte von überexprimiertem DYRK1A auf den Gehalt an Glucose-6-Phosphatase-mRNA und die Aktivität des G6Pase-Promotors in Hepatomzellen

3.1.1 Überexpression von DYRK1A in stabil transfizierten Rattenhepatomzellen

Um zu untersuchen, ob DYRK1A die Expression von FoxO1a-abhängig

regulierten Genen beeinflusst, wurden Zellen einer Rattenhepatomlinie

(H4IIEC3) hergestellt, die DYRK1A stabil überexprimieren. H4IIEC3-Zellen

wurden zum einen ausgewählt, weil sie gut differenziert sind und

leberspezifische Funktionen wie Gluconeogenese erhalten sind. Zum anderen

sind sie in Bezug auf die Signaltransduktion des Insulins gut charakterisiert.

Die Zellen wurden mittels retroviralen Gentransfers mit einem Vektor infiziert,

der für DYRK1A codiert. Im SDS-PAGE-Verfahren wurden Proteine aus totalem

Zelllysat aufgetrennt. Mittels der Western Blot-Technik wurden die Proteine auf

eine Nitrocellulosemembran transferiert, auf der sie mit spezifischen

Antikörpern detektiert wurden. In diesem Experiment kam ein α-DYRK1A-

Antikörper (Fa. BD Transduction Labs, USA) zur Anwendung.

Im Vergleich zu H4-Zellen, die mit einem Kontrollvektor pWZL Blasto

transfiziert wurden, zeigten die mit DYRK1A infizierten Zellen eine deutliche

Überexpression von DYRK1A (Abbildung 8).

35

3 Ergebnisse

Kontro

lle

DYRK1A

Western Blotα-DYRK1A

Ponceau

Abb. 8 Überexpression von DYRK1A in H4IIEC3-Zellen. Jeweils 20µg Protein von Kontrollzellen (links) und von solchen, die DYRK1A überexprimieren (rechts) wurden elektrophoretisch getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Im ersten Schritt wurde die Membran mit einem α-DYRK1A-Antikörper (Fa. BD Transduction Labs, USA), im zweiten mit einem Peroxidase-gekoppelten Antikörper inkubiert. Das Signal wurde mit der Chemilumineszenzmethode sichtbar gemacht. Die Doppelbande im Western Blot ist möglicherweise auf unterschiedliche Phosphorylierungszustände von DYRK1A zurückzuführen.Im unteren Teil der Abbildung ist eine Ponceau-Färbung der Membran als Beladungskontrolle dargestellt.

3.1.2 Der Einfluss von stabil transfiziertem DYRK1A auf die endogene Glucose-6-Phosphatase-mRNA in Rattenhepatomzellen

In weiteren Experimenten wurde untersucht, ob Überexpression von DYRK1A

einen Einfluss auf den mRNA-Gehalt endogener G6Pase in H4-Zellen hat. Zu

diesem Zweck wurde aus H4-Zellen, die DYRK1A überexprimieren, und aus

Zellen, die mit einem leeren Kontrollvektor infiziert waren, RNA isoliert. Die

RNA-Proben wurden elektrophoretisch getrennt und im Northern Blot-Verfahren

auf eine Membran transferiert. Diese Membran wurde dann mit einer radioaktiv

markierten spezifischen Glucose-6-Phosphatase-Sonde inkubiert. Es wurde

gezeigt, dass die Zellen, die DYRK1A überexprimieren, einen ca. 3,5-fach

erhöhten mRNA-Gehalt an endogener G6Pase im Vergleich zu Kontrollzellen

haben (Abbildung 9). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass DYRK1A an der

Regulation der G6Pase beteiligt ist.

36

3 Ergebnisse

G6Pase

ß-Aktin

28S18S

Kontro

lle

DYRK1A

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Kontro

lle

DYRK1A

G6P

ase/

ß-Ak

tin m

RN

A(%

von

Kon

trolle

) A BAbb. 9 Der Effekt von überexprimiertem DYRK1A auf den Gehalt an spezifischer G6Pase-mRNA in H4-Zellen. Die Abbildung A zeigt H4-Kontrollzellen (linke Spur) und H4-Zellen, die DYRK1A überexprimieren (rechte Spur). In jeder Spur wurden 10 µg RNA aus totalem Zelllysat aufgetragen. Die Blots wurden mit spezifischen Sonden für G6Pase und β-Aktin hybridisiert. Abbildung B zeigt eine graphische Darstellung der densitometrischen Analyse von zwei unabhängigen Northern Blots, jeweils zweifach durchgeführt. Die Expression der Kontrollzellen wurde mit 100% festgesetzt. Die durchschnittliche Expression der DYRK1A-infizierten Zellen ergab 353% der Kontrollen (304% und 402%). Die Expression der G6Pase wurde durch Messung der β-Aktinexpression normalisiert.

3.1.3 Der Effekt von DYRK1A auf die Promotoraktivität des Glucose-6-Phosphatasegens im Reportergen-Assay

Um zu bestimmen, ob der Effekt von DYRK1A auf den G6Pase-Promotor auf

transkriptioneller Ebene abläuft, wurden Reportergen-Studien zur Regulation

des Promotors der G6Pase in H4-Zellen und HepG2-Zellen durchgeführt. Die

Zellen wurden transient mit der Calcium-Phosphat-Methode (H4IIEC3) oder mit

FuGENETM 6 Transfection Reagent (Fa. Roche Diagnostics, USA) (HepG2)

transfiziert. Im anschließenden Luciferase-Assay wurde wie im Methodenteil

beschrieben die Aktivität des G6Pase-Promotors in beiden Zelllinien gemessen.

Sowohl in H4-Zellen als auch in HepG2-Zellen wurde gezeigt, dass

Überexpression von DYRK1A eine signifikante Steigerung der Promotoraktivität

zur Folge hat (p<0,05). Somit ist ein Effekt auf transkriptioneller Ebene

anzunehmen (Abbildungen 10, 11).

37

3 Ergebnisse

Kontro

lle

DYRK1A

Insulin0

100

200

300

400

500

600

700

+_ +_R

LU (%

von

Kon

trolle

) *

Abb. 10 Der Effekt von überexprimiertem DYRK1A auf die Promotoraktivität der G6Pase in stabil transfizierten Hepatomzellen (H4IIEC3). H4 Zellen, die ein vom G6Pase-Promotor (-1227/+57) gesteuertes Luciferase-Konstrukt stabil exprimieren mit (rechts) und ohne (links) überexprimiertem DYRK1A. Die Zellen wurden nach Infektion für 18 Stunden in serumfreiem Medium mit (weiße Säulen) oder ohne (schwarze Säulen) Insulin (1 µM) kultiviert. Gemessen wurde die Luciferaseaktivität des Promotors im Reportergen-Assay bezogen auf die Proteinmenge (BCA-Assay, Fa. Pierce, USA). Die basale Promotoraktivität der G6Pase wurde als 100% gesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus einem Experiment, welches in Triplikaten durchgeführt wurde. Das Experiment wurde mit ähnlichen Ergebnissen mehrfach wiederholt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05).

0

50

100

150

200

Kontro

lle

DYRK1AInsulin+_+_

RLU

(% v

on K

ontro

lle) *

Abb. 11 Der Effekt von überexprimiertem DYRK1A auf die Promotoraktivität der G6Pase in transient transfizierten Hepatomzellen (HepG2). HepG2-Zellen wurden mit jeweils 0,5 µg des G6Pase-Promotorplasmids (-1227/+57) in pGL3, pRL-TK als Kontrollplasmid und 1 µg DYRK1A oder Kontrollvektor transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen für 18 Stunden in serumfreiem Medium mit (weiße Säulen) oder ohne (schwarze Säulen) Insulin (1 µM) inkubiert. Die Luciferase-Aktivität des G6Pase-Promotors wurde durch Messung der co-exprimierten Renilla-Luciferase normalisiert. Die basale Aktivität des G6Pase-Promotors wurde als 100% gesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt, die jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05).

38

3 Ergebnisse

In beiden Zelllinien ließen sich die Effekte durch Zugabe von Insulin (1μM)

signifikant hemmen (p<0,05). Es zeigte sich außerdem im Luciferase-Assay

eine von der Menge des transfizierten DYRK1A-Expressionsvektors abhängige

Induktion des G6Pase-Promotors (Abbildung 12).

0

50

100

150

200

250

300

RLU

(% v

on K

ontro

lle)

0 1 2 5 10

DYRK 1A [µg]

Insulin+_+_+_+_+_

Abb. 12 Aktivität der G6Pase-Promotors in Abhängigkeit von der Menge des transfizierten DYRK1A-Expressionsvektors. HepG2-Zellen wurden mit jeweils 0,5 µg des G6Pase-Promotorplasmids (-1227/+57) in pGL3, pRL-TK als Kontrollplasmid und verschiedenen Konzentrationen des DYRK1A-Expressionsvektors transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem Medium mit (weiße Säulen) und ohne (schwarze Säulen) Insulin (1µM) für 18 Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Renilla-Luciferase gemessen. Die basale Aktivität des G6Pase-Promotors wurde als 100% gesetzt. Gezeigt sind Mittelwerte aus einem Experiment, welches in Triplikaten durchgeführt wurde.

Aufgrund höherer Transfektionseffizienz sind alle in der Folge erwähnten

transienten Transfektionen in HepG2-Zellen durchgeführt worden.

39

3 Ergebnisse

3.2 Der Effekt von DYRK1A auf die G6Pase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von der DYRK1A-Kinaseaktivität

3.2.1 Der Einfluss von FoxO1a-Ser329-Punktmutanten auf die durch DYRK1A vermittelte Expression des Glucose-6-Phosphatasegens

Es galt nun herausfinden, ob die bekannte Phosphorylierung von FoxO1a durch

DYRK1A am Serinrest 329 funktionell wichtig für den Effekt von DYRK1A auf

die Aktivität des G6Pase-Promotors ist. Aus diesem Grunde wurden nach dem

Prinzip der Sequenzspezifischen Mutagenese wie im Methodenteil beschrieben

FoxO1a-Punktmutanten hergestellt, bei denen der Serinrest an Position 329

entweder durch einen Alanin- oder durch einen Asparaginsäurerest ersetzt

wurde (Abbildung 13). Durch den Austausch mit Alanin ist FoxO1a an diesem

Rest nicht mehr phosphorylierbar. Da Asparaginsäure unter physiologischen

pH-Bedingungen negativ geladen ist, wird durch diesen Aminosäureaustausch

eine Dauerphosphorylierung simuliert. Im Restriktionsverdau konnten Wildtyp

und Mutanten anhand des unterschiedlichen Verdaus unterschieden werden

(Abbildung 14).

FoxO1 S329ApWZL Blasto

1000

2000800

3700

I S G R L A P I M TATC AGT GGG AGA CTT GCT CCC ATA ATG ACAATC AGT GGG AGA CTT TCT CCC ATC ATG ACA

I S G R L S P I M T

BspH1-Schnittstelle (in Mutante entfernt)

Abb. 13 Strukturausschnitt aus dem Promotor der FoxO1a-Punktmutante S329A. Im großen Kasten sind die mutierten Basen und die daraus resultierenden Aminosäuren rot dargestellt. Das kleine Kästchen innerhalb des großen Kastens stellt die veränderte Restriktionsschnittstelle dar. Im Fall der Alaninmutante ist eine BspH1-Schnittstelle entfernt worden, bei der Asparaginsäuremutante (nicht abgebildet) wurde eine zusätzliche BamH1-Schnittstelle eingefügt. Die veränderten Schnittstellen dienen zur Unterscheidung der Mutanten vom Wildtyp.

40

3 Ergebnisse

FoxO1a

WT

FoxO1a

S329A

60004000

2000

3000

1500

1000750

Abb. 14 Restriktionsanalyse der FoxO1a-Punktmutante S329A. Durch Restriktionsverdau mit BspH1 erhält man beim Wildtyp vier Fragmente (linke Spalte), während aufgrund der Deletion einer BspH1-Schnittstelle in der Mutante drei Fragmente entstehen (rechte Spalte). Somit können nach Klonierung der Wildtyp und die Mutante unterschieden werden.

Im Reportergen-Assay wurden dann die verschiedenen FoxO1a-Konstrukte mit

und ohne Co-Expression von DYRK1A auf ihren Einfluss auf die Aktivität des

G6Pase-Promotors hin untersucht. In gleicher Weise wie zuvor beschrieben

wurden HepG2-Zellen transient mit den verschiedenen FoxO1a-Konstrukten

transfiziert, im einer zweiten Versuchsreihe wurde zusätzlich DYRK1A co-

transfiziert. Die Aktivität des G6Pase-Promotors wurde jeweils anhand der

relativen Luciferaseaktivität gemessen. Alle drei Konstrukte zeigten eine

gesteigerte Promotoraktivität im Vergleich zur Kontrolle (p≤0,05), es fanden sich

allerdings keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen

Konstrukten. In den Experimenten mit co-transfiziertem DYRK1A erhält man

ähnliche Ergebnisse (im Fall der S329D-Mutante + DYRK1A statistisch nicht

signifikant (p=0,0795)), so dass davon auszugehen ist, dass eine

Phosphorylierung an der Position 329 keine funktionelle Bedeutung bei der

Regulation der Glucose-6-Phosphatase hat (Abbildung 15).

41

3 Ergebnisse

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Kontro

lle

FoxO1 W

T

S329A

S329D

RLU

(% v

on K

ontro

lle)

+_+_+_+_ Insulin

** *

A

0

50

100

150

200

250

FoxO1 W

T

FoxO1 W

T + DYRK 1A

S329D

+ DYRK 1A

S329A

+ DYRK 1A

RLU

(% v

on F

oxO

1 W

T)

Insulin+_+_+_+_

**

BAbb. 15 Der Effekt der DYRK1A-Phosphorylierung an der Position 329 auf die Aktivität des G6Pase-Promotors. In gleicher Weise wie zuvor beschrieben wurden HepG2-Zellen mit jeweils 0,5 µg des G6Pase-Promotorplasmids (-1227/+57) in pGL3, pRL-TK und jeweils 1 µg der Expressionsvektoren, die FoxO1a-Wildtyp und die beiden Punktmutanten codieren, transfiziert. Die Abbildung B zeigt Ergebnisse der Experimente, in denen zusätzlich 1 µg des Expressionsvektors für DYRK1A transfiziert wurde. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen für 18 h in serumfreiem Medium mit (weiße Balken) und ohne (schwarze Balken) Insulin (1µM) inkubiert. Die Luciferaseaktivität wurde relativ zur Renilla-Luciferase gemessen. Die basale Aktivität des G6Pase-Promotors wurde als 100% gesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei verschiedenen Experimenten, welche jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05).

42

3 Ergebnisse

3.2.2 Der Effekt einer katalytisch inaktiven DYRK1A-Punktmutante auf den Glucose-6-Phosphatase-Promotor

In weiteren Experimenten wurde eine DYRK1A-Punktmutante (DYRK1A

Lys188Arg) (Kentrup et al., 1996; Himpel et al., 2001) untersucht, die keine

katalytische Aktivität besitzt. Ziel dieser Versuchsreihe war es, die

Unabhängigkeit der DYRK1A-Effekte auf den Promotor der G6Pase von der

Kinaseaktivität zu bestätigen. In der Mutante ist ein Lysinrest gegen einen

Argininrest ausgetauscht, was zu einer Inaktivität der katalytischen Einheit führt.

Diese Punktmutante wurde nach dem gleichen Prinzip wie die FoxO1a-

Punktmutanten hergestellt und uns freundlicherweise von Prof. Walter Becker

(Aachen) zur Verfügung gestellt.

Es wurden Reportergen-Assays durchgeführt, bei denen der Effekt dieser

Mutante mit dem Effekt von DYRK1A WT auf den Promotor des G6Pase-Gens

verglichen wurde. HepG2-Zellen wurden wie oben beschrieben transfiziert.

Auch bei diesen Versuchen zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der

Aktivität des G6Pase-Promotors zwischen der Punktmutante K188R und

DYRK1A WT (p=0,4414) (Abbildung 16). Es ist deshalb davon auszugehen,

dass weder die Phosphorylierung von FoxO1a durch DYRK1A an der Position

Ser329 noch die katalytische Aktivität von DYRK1A eine Rolle bei der

Aktivierung des Promotors der G6Pase spielt.

43

3 Ergebnisse

0

50

100

150

200

250

Kontro

lle

DYRK1A W

T

DYRK1A K18

8R

Insulin

RLU

(% v

on K

ontro

lle)

+ ++_ __

*

Abb. 16 Der Effekt einer katalytisch inaktiven DYRK1A-Punktmutante auf die Aktivität des G6Pase-Promotors. HepG2-Zellen wurden transient mit jeweils 0,5 µg des G6Pase-Promotorplasmid (-1227/+57) in pGL3, pRL-TK als Kontrollplasmid und jeweils 1 µg des entsprechenden Expressionsvektors transfiziert. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen für 18 h in serumfreiem Medium mit (weiße Balken) und ohne Insulin (schwarze Balken) inkubiert. Die Aktivität des G6Pase-Promotors wurde als relative Luciferaseaktivität, wie oben beschrieben, gemessen. Die basale Promotoraktivität wurde als 100% gesetzt. Die Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei unabhängig voneinander jeweils in Triplikaten durchgeführten Experimenten. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05).

3.3 Untersuchungen zu Effekten verschiedener DYRK-Isoformen auf die Aktivität des Glucose-6-Phosphatase-Promotors

Im weiteren Verlauf wurden Reportergen-Assays mit unterschiedlichen DYRK-

Isoformen (DYRK1A, DYRK1B und DYRK2) durchgeführt, um die Effekte der

einzelnen Isoformen auf die Aktivität des G6Pase-Promotors zu untersuchen.

Die strukturellen Unterschiede der einzelnen Isoformen sind im Kapitel

Einleitung beschrieben.

Es wurden Luciferase-Assays mit Zellen, die die verschiedenen DYRK-

Isoformen überexprimieren, durchgeführt .

44

3 Ergebnisse

DYRK1A und DYRK1B zeigten den schon vorher beschriebenen signifikanten

Effekt auf die Aktivität des G6Pase-Promotors (p<0,05). Die Promotoraktivität

ist bei Überexpression von DYRK2 im Gegensatz dazu jedoch nicht signifikant

erhöht (p=0,0921) (Abbildung 17). Diese Ergebnisse lassen schlussfolgern,

dass die Struktur der DYRK-Isoform entscheidend für die beschriebenen

Effekte ist. Da DYRK2 keine Kernlokalisationssequenz (NLS) besitzt und damit

extranukleär lokalisiert ist, liegt die Vermutung nah, dass FoxO1a und DYRK

gemeinsam im Kern lokalisiert sein müssen, um die G6Pase-Promotoraktivität

zu beeinflussen.

0

50

100

150

200

250

300

350

Insulin

DYRK 1A

Kontro

lle

DYRK 1B

RLU

(% v

on K

ontro

lle)

+

DYRK 2

_ _ _ _ ++ +

**

Abb. 17 Der Effekt der verschiedenen DYRK-Isoformen auf die Aktivität des G6Pase-Promotors. HepG2-Zellen wurden transient mit jeweils 0,5 µg des G6Pase-Promotorplasmid (-1227/+57) in pGL3, pRL-TK als Kontrollplasmid und jeweils 1 µg des entsprechenden Expressionsvektors oder Kontrollvektors transfiziert. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen für 18 h in serumfreiem Medium mit (weiße Balken) und ohne Insulin (1µM) (schwarze Balken) inkubiert. Die Luciferaseaktivität wurde relativ zur co-exprimierten Renilla-Luciferase gemessen. Die basale Promotoraktivität wurde als 100% gesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei unabhängigen jeweils in Triplikaten durchgeführten Experimenten. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05).

3.4 Die Effekte unterschiedlicher DYRK-Isoformen auf die FoxO1a-induzierte Aktivität des Glucose-6-Phosphatase-Promotors

Die Mitglieder der DYRK-Familie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer

Gewebeexpression und subzellulären Verteilung (Becker et al., 1998; Leder et

al., 1999). Das vorherige Experiment legt den Schluss nahe, dass die

45

3 Ergebnisse

Lokalisation von FoxO1a und DYRK1 entscheidend für den Effekt auf die

G6Pase-Promotoraktivität ist. Es wurden zu diesem Zweck Reportergen-

Assays mit verschiedenen FoxO1a- und DYRK1-Konstrukten durchgeführt. Wir

haben zum einen den Effekt von DYRK1A und DYRK1B allein, zum anderen

den Effekt mit co-exprimiertem Wildtyp-FoxO1a oder einer konstitutiv im Kern

lokalisierten FoxO1a-Mutante, hier FoxO1a MUT (Thr24Ala; Ser256Ala;

Ser319Ala) genannt, verglichen.

Der Effekt von DYRK1A ist sowohl basal als auch bei FoxO1a-induzierter

G6Pase-Promotoraktivität vergleichbar mit dem von DYRK1B, DYRK1 und

FoxO1a wirken dabei synergistisch. Wie erwartet, erhöht die Expression der im

Kern lokalisierten FoxO1a-Mutante (FoxO1a MUT) die Promotoraktivität des

G6Pase-Promotors. Dieser Effekt ist sowohl bei überexprimiertem DYRK1A und

DYRK1B als auch bei deren Abwesenheit zu sehen (Tabelle 1) Diese Resultate

geben weiteren Anhalt dafür, dass die Lokalisation von FoxO1a wichtig für

seine Funktion ist.

Expressionsvektor - Insulin + InsulinKontrolle 100 62 (+/-6)DYRK1A 187 (+/-13) 89 (+/-6)DYRK1B 210 (+/-16) 91 (+/-18)FoxO1a WT 9241 (+/-2589) 4182 (+/-1400)FoxO1a MUT 13108 (+/- 3097) 10351 (+/-3859)FoxO1a WT + DYRK1A 25919 (+/-6581) 9187 (+/-2601)FoxO1a MUT + DYRK1A 32229 (+/-10496) 30998 (+/-10632)FoxO1a WT + DYRK1B 29209 (+/-7391) 10277 (+/-2805)FoxO1a MUT + DYRK1B 60063 (+/-17983) 47805 (+/-13241)

Tab. 1 Der Effekt von DYRK1 auf den Aktivität des G6Pase-Promotors in Synergismus mit FoxO1a-WT und einer konstitutiv im Kern lokalisierten FoxO1a-Mutante. HepG2-Zellen wurden transient mit jeweils 0,5 µg des G6Pase-Promotorplasmid (-1227/+57) in pGL3, pRL-TK als Kontrollplasmid und jeweils 1 µg des entsprechenden DYRK1- bzw. FoxO1a-Expressionsvektors oder Kontrollvektors transfiziert. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen für 18 h in serumfreiem Medium mit (rechte Spalte) und ohne Insulin (1µM) (linke Spalte) inkubiert. Die Luciferaseaktivität wurde relativ zur co-exprimierten Renilla-Luciferase gemessen. Die basale Promotoraktivität wurde als 100% gesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.

46

3 Ergebnisse

3.5 Der Effekt von DYRK1 auf den Glucose-6-Phosphatase-Promotor in Abhängigkeit von FoxO1a-Bindungsstellen (IRUs)

Weder DYRK1A noch DYRK1B besitzen eine DNA-Bindungsdomäne. Deshalb

wurde untersucht, ob der Effekt von DYRK1 auf den G6Pase-Promotor direkt

abläuft oder durch den Transkriptionsfaktor FoxO1a vermittelt wird. Es wurden

Experimente durchgeführt, bei denen ein mutierter Promotor des G6Pase-Gens

verwendet wurde, in welchem die die drei Insulinresponsiven Elemente deletiert

waren. Dieser Promotor besitzt Punktmutationen in allen drei FoxO1a-

Bindungsstellen und ist somit durch FoxO1a nicht mehr regulierbar (Abbildung

18).

CAGGCTGTTTTTGTGTGCCTGTTTTTCTATTTTACGTAA

CGAG C C

Konsensus IRU: T(G/A)TTT

G6Pase WTG6Pase IRU MUT

Abb. 18 Struktur der FoxO1a-bindenden Region des G6Pase-Promotors und Veränderungen der Promotor-Punktmutante. Mittels Sequenzspezifischer Mutagenese (siehe Material und Methoden) wurden die drei FoxO1a-Bindungsstellen (Kästen obere Zeile) (Konsensusmotiv der Insulinresponsiven Elemente T(G/A)TTT) verändert (untere Zeile).

Im Luciferase-Assay zeigte sich, dass die Fähigkeit von DYRK1, den G6Pase-

Promotor zu aktivieren, um ca. 70% niedriger ist, wenn die FoxO1a-

Bindungsstellen im Promotor mutiert sind. Dieser deutliche Unterschied zeigte

sich auch bei co-exprimiertem FoxO1a (Abbildung 19). DYRK1B steigert die

Aktivität des G6Pase-Promotors signifikant (p<0,05), wobei die Aktivität der

G6Pase-Promotor-Mutante nicht signifikant induziert wird (p=0,1555). Diese

Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass der Effekt von DYRK1 auf den

Promotor des G6Pase-Gens ein FoxO1a-vermittelter Prozess ist.

47

3 Ergebnisse

0

100

200

300

400

500

600

700

800

RLU

(% v

on K

ontro

lle)

DYRK 1B_ +

*

Abb. 19 Der Effekt von DYRK1 auf den G6Pase-Promotor (schwarz) und den mutierten G6Pase-Promotor (weiß). HepG2-Zellen wurde wie zuvor beschrieben transient mit jeweils 0,5µg des G6Pase-Promotorplasmids (-1227/+57) in pGL2 oder des G6Pase-Promotormutantenplasmids (IRU mut) in pGL2, pRL-TK als Kontrollplasmid, jeweils 1µg des FoxO1a-Expressionsvektors und jeweils 1µg des DYRK1B-Expressionsvektors oder eines Kontrollvektors transfiziert. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen für 18 h in serumfreiem Medium inkubiert. Die basale Promotoraktivität wurde als 100% gesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei unabhängigen, jeweils in Triplikaten durchgeführten Experimenten. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05).

48

4 Diskussion

4 Diskussion

Die Erforschung der Signaltransduktion des Insulin ist in Bezug auf die dem

Diabetes mellitus Typ 2 zugrunde liegende Insulinresistenz und die hepatische

Glucoseproduktion von zentralem Interesse und eine Voraussetzung für die

Entwicklung neuer antidiabetisch wirksamer Substanzen. Zur Behandlung des

Diabetes mellitus Typ 2 stehen derzeit diverse Medikamente zur Verfügung,

deren Wirkmechanismen sich voneinander unterscheiden. So führen die

Sulfonylharnstoffe und die so genannten „Glinide“ zu einer verstärkten

Sekretion von Insulin. Eine weitere Substanzklasse, die Thiazolidindione wirken

als Aktivatoren des Transkriptionsfaktors PPARγ und verbessern somit auf

bislang noch ungeklärte Weise die Signaltransduktion des Insulins. Ein Co-

Aktivator dieses Transkriptionsfaktors ist das Protein PPARγ Coaktivator-1

(PGC-1). PGC-1 spielt sowohl bei der Regulation der GLUT4-Genexpression

als auch bei der Regulation der hepatischen Glucoseproduktion eine

entscheidende Rolle (Michael et al., 2001; Vidal-Puig and O'Rahilly, 2001).

Andere Medikamente wie die Glucosidasehemmer vermindern die enterale

Resorption von Glucose.

In der UKPD-Studie hat sich die Substanz Metformin, die zu den Biguaniden

zählt, als günstigstes orales Antidiabetikum gerade für übergewichtige

Diabetiker herausgestellt (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group,

1998). Die relativ alte Substanz verstärkt die Aufnahme von Glucose in die

Muskulatur, führt aber auch zu einer Hemmung der hepatischen

Gluconeogenese. Der molekulare Mechanismus ist hierbei noch nicht endgültig

geklärt.

Eine Verminderung der hepatischen Glucoseproduktion durch Insulin geschieht

hauptsächlich durch Verringerung der Expression der G6Pase- und PEPCK-

Gene über die Aktivierung von Insulinrezeptorsubstraten. Dabei spielen IRS 1

und 2 offenbar bei der Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels eine

bedeutende Rolle (White, 2002). Studien an knock-out-Modellen haben gezeigt,

dass Insulin die hepatische Glucoseproduktion hauptsächlich IRS-2-vermittelt

vermindert (Kubota et al., 2000; Withers et al., 1998). Es wird daher

49

4 Diskussion

angenommen, dass diese Isoform eine bedeutende Rolle bei der

Signaltransduktion zur Regulation der Gluconeogenese spielt. In der Folge wird

die PI3-Kinase/PKB-Signalkaskade aktiviert. Es wurde gezeigt, dass eine

Aktivierung der PI3-Kinase-Kaskade die Expression der Gene der PEPCK und

G6Pase entscheidend verringert. Studien mit einer dominant negativen Mutante

der regulatorischen Untereinheit der PI3-Kinase p85α hatten eine vermehrte

Expression der Gene und damit eine gesteigerte Glucoseproduktion zur Folge

(Miyake et al., 2002). Eine Hemmung der PI-3- Kinase durch Substanzen wie

z.B. Wortmannin verringert die insulinvermittelte Glucoseaufnahme (Cheatham

et al., 1994; Okada et al., 1994).

Eine Überexpression von PKB in Hepatomzellen und primären Hepatozyten hat

eine verminderte Transkription der PEPCK- und G6Pase-Gene zur Folge (Agati

et al., 1998; Liao et al., 1998; Schmoll et al., 2000). In Studien mit PKB-knock

out-Mäusen hat sich gezeigt, dass ein knock out der Isoform PKB β zu einer

Insulinresistenz und zu einem diabetischen Phänotyp führt, wobei ein knock out

der PKB α keine Stoffwechselveränderungen verursachte (Cho et al., 2001b;

Cho et al., 2001a). In einer Familie mit ausgeprägter Insulinresistenz ist eine

Mutation in der katalytischen Domäne der PKB β beschrieben worden, die eine

Phosphorylierung der PEPCK zur Folge hat und damit eine Hemmung der

hepatischen Glucoseproduktion unmöglich macht (Michael et al., 2001). Die

Aktivierung der PI3-Kinase/PKB-Kaskade ist von großer Bedeutung für die

Regulation der Glucose-6-Phosphatase. Als einer der Mediatoren dieses

Effektes wurde der Transkriptionsfaktor FoxO1a identifiziert.

Die Beteiligung von FoxO1a an Stoffwechselprozessen, insbesondere der

Regulation der hepatischen Glucoseproduktion, ist somit bereits bekannt. In

Studien mit einer heterozygoten FoxO1a-knock out-Maus wurde eine

Besserung der Insulinresistenz bei diabetischen Mäusen mit einer

Haploinsuffizienz des Insulinrezeptors beobachtet. Die Tiere hatten im

Vergleich zu den Kontrolltieren eine verbesserte Glucosetoleranz (Nakae et al.,

2002) Dies könnte mit einer verminderten Expression des G6Pase-Gens

zusammen hängen. In transgenen Mäusen mit einer konstitutiv aktiven FoxO1a

findet man eine gesteigerte Expression des G6Pase-Gens mit Insulinresistenz,

gesteigerter hepatischer Glucoseproduktion und konsekutiver Erhöhung der

50

4 Diskussion

Nüchternblutglucose (Nakae et al., 2002). In Studien mit einer dominant

negativen Form von FoxO1a zeigten die Tiere eine verminderte Expression der

G6Pase sowie eine verminderte hepatische Glucoseproduktion (Altomonte et

al., 2003). Diese Daten unterstützen die Bedeutung der FoxO Proteine bei der

Regulation des Glucosestoffwechsels.

Neben dem Transkriptionsfaktor STAT3 (Kortylewski et al., 2003) sowie dem

Östrogenrezeptor (Schuur et al., 2001; Zhao et al., 2001) konnte die

Proteinkinase DYRK1A als Interaktionspartner einer Protein-Protein-Interaktion

von FoxO1a identifiziert werden (Woods et al., 2001b). Darüber hinaus wurde

FoxO1a als direktes Substrat (Phosphorylierung an Serin 329) der DYRK-

Kinase beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der

Interaktion dieser beiden Proteine auf die Regulation der Glucose-6-

Phosphatase untersucht.

Ein Teil der Experimente wurde mit H4IIEC3-Zellen durchgeführt. Diese

Rattenhepatomzelle zeichnet sich durch eine sehr hohe Insulinempfindlichkeit

und eine erhaltene Regulation gluconeogener Gene durch Insulin aus. Deshalb

ist dieses Zellmodell sehr gut für die Untersuchung insulinabhängiger

Stoffwechselprozesse geeignet (Liao et al., 1998).

Es wurde gezeigt, dass DYRK1 einen stimulatorischen Effekt auf die FoxO1a-

abhängige Transaktivierung des G6Pase-Promotors hat. In Northern Blot-

Untersuchungen wurde gezeigt, dass nach stabiler Transfektion von DYRK1A

in Hepatomzellen der Gehalt an G6Pase-mRNA deutlich erhöht ist (Groote-

Bidlingmaier et al., 2003). In der vorliegenden Arbeit konnte mittels

Reportergenanalysen gezeigt werden, dass der Effekt von DYRK1A auf die

Menge des G6Pase-Transkriptes auf eine gesteigerte Aktivität des G6Pase-

Promotors zurückzuführen ist und damit auf transkriptioneller Ebene abläuft.

Studien haben gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor FoxO1a ein

entscheidender Transaktivator des G6Pase-Gens ist (Schmoll et al., 2000;

Barthel et al., 2001) und die G6Pase-Gentranskription durch Bindung an die

IRUs im Promotor auslöst (Schmoll et al., 2000; Ayala et al., 1999). Die drei

IRUs im G6Pase-Promotor sind funktionell verschieden und binden FoxO1a in

unterschiedlichem Maße (Vander Kooi et al., 2003). In der vorliegenden Arbeit

wurde gezeigt, dass die Transaktivierung des G6Pase-Promotorgens deutlich

51

4 Diskussion

herabgesetzt wird, wenn die IRUs im Promotor Mutationen enthalten, die eine

Bindung von FoxO1a verhindern (Groote-Bidlingmaier et al., 2003). Damit

wurde gezeigt, dass die Transaktivierung des Promotors des G6Pase-Gens von

intakten FoxO1a-Bindungsstellen in den IRUs des Promotors abhängig ist.

Diese Daten lassen den Schluss zu, dass der Effekt von DYRK1A auf die

Expression des G6Pase-Gens indirekt über den Transkriptionsfaktor FoxO1a

vermittelt wird. Offenbar erfüllt DYRK1A die Funktion eines Co-Aktivators für

den Transkriptionsfaktor FoxO1a.

In Experimenten mit FoxO1a-Mutanten wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass der

Effekt auf die Transaktivierung des G6Pase-Gens unabhängig von der

Phosphorylierung von FoxO1a durch DYRK1 ist. Experimente mit FoxO1a-

Punktmutanten, an denen der Serinrest 329 zu Alanin oder Asparaginsäure

mutiert ist, zeigen keine signifikante Änderung der G6Pase-Promotoraktivität. In

Versuchen mit einer DYRK-Mutante, die keine Kinaseaktivität mehr besitzt,

konnte ebenfalls kein signifikanter Unterschied bei der Transaktivierung des

G6Pase-Promotors festgestellt werden. Diese Ergebnisse legen den Schluss

nahe, dass der regulatorische Effekt von DYRK1A auf die transkriptionelle

Aktivität von FoxO1a unabhängig von der FoxO1a-Phosphorylierung durch

DYRK1A ist (Groote-Bidlingmaier et al., 2003). Der untersuchte Effekt ist somit

wahrscheinlich Ausdruck weiterer Mechanismen, bzw. Protein-Protein-

Interaktionen. Über Art und Weise kann hier jedoch nur spekuliert werden. In

Frage kommen Prozesse wie de novo-Proteinsynthese oder

Proteinstabilisierung. Für letzteres spricht die PEST-Domäne in DYRK1, eine

Struktur, die an Prozessen der Proteinstabilisierung beteiligt zu sein scheint

(Kentrup et al., 1996). PEST-Domänen sind beispielsweise an der Regulation

von IκBα über Phosphorylierung durch die Casein Kinase II beteiligt (Lin et al.,

1996). Die hier durchgeführten Experimente deuten jedoch darauf hin, dass die

gemeinsame Lokalisation von FoxO1a und DYRK1A im Zellkern für die

Interaktion von entscheidender Bedeutung ist. Es ist bekannt, dass das

Homolog von DYRK aus Hefe, Yak1, im Zustand des Glucosemangels in den

Zellkern transportiert wird (Moriya et al., 2001). Denkbar ist, dass DYRK1

ähnlich reguliert wird. Der Einfluss von FoxO1a auf die Aktivität der G6Pase

und damit auf die hepatische Glucoseproduktion wird ebenfalls unter anderem

durch den Lokalisationszustand zwischen Zellkern und Zytosol reguliert. Eine

52

4 Diskussion

Phosphorylierung von FoxO1a durch die Proteinkinase B und eine Interaktion

mit 14-3-3-Proteinen führen zu einer transkriptionellen Inaktivität und zur

nukleären Exklusion von FoxO1a (Brunet et al., 1999; Brunet et al., 2001;

Nakae et al., 1999; Kops et al., 1999; Guo et al., 1999; Rena et al., 2002; Biggs,

III et al., 1999). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass DYRK1, aber nicht die

Isoform DYRK2 die G6Pase-Promotoraktivität induzieren kann (Groote-

Bidlingmaier et al., 2003). Dies könnte auf die fehlende

Kernlokalisationssequenz in DYRK2 zurück zu führen sein, welche für die im

wesentlichen zytoplasmatische Lokalisation von DYRK2 verantwortlich ist

(Becker et al., 1998). Dies unterstützt die Vermutung, dass die Lokalisation von

DYRK1 im Zellkern entscheidend für die Transkription des G6Pase-Gens ist.

Diese These wird zusätzlich durch die Tatsache gefestigt, dass eine konstitutiv

im Kern lokalisierte FoxO1a-Mutante zu einer zusätzlichen Steigerung des

Effektes von DYRK1 auf die G6Pase-Promotor-Aktivität führt (Groote-

Bidlingmaier et al., 2003). Die fehlende Induzierbarkeit des G6Pase-

Promotorgens durch DYRK2 ist ein wichtiger Hinweis auf die Spezifität des

Effekts durch DYRK1.

FoxO-Transkriptionsfaktoren gehen mit diversen Mediatoren Protein-Protein-

Interaktionen ein, so werden z.B. die Effekte von CBP, p300, SRC1 und

PGC-1α über FoxO-Bindungsstellen vermittelt (Mahmud et al., 2002; Nasrin et

al., 2000; Puigserver et al., 2003). PGC-1α interagiert beispielsweise mit

Abschnitten der DNA-Bindungsdomäne und ist zusammen mit FoxO1a an der

Regulation der Glucose-6-Phosphatase beteiligt (Herzig et al., 2001). Durch

Phosphorylierung von FoxO1a wird diese Interaktion unterbrochen. FoxO-

Proteine können aber auch ohne FoxO-Bindungsstellen an der Regulation von

Promotoren teilnehmen, in dem sie an andere Transkriptionsfaktoren wie z.B.

STAT3 binden (Dowell et al., 2003; Schuur et al., 2001; Zhao et al., 2001; Li et

al., 2003; Kortylewski et al., 2003; Hirota et al., 2003; Seoane et al., 2004;

Nakae et al., 2003). In ähnlicher Form könnten DYRK1A und DYRK1B als

Zusatzfaktoren die FoxO1a-abhängige Transkription beeinflussen. Die

erhobenen Daten zeigen, dass DYRK1 neben der beschriebenen

Phosphorylierung auch weitere funktionelle Interaktionen mit FoxO-Proteinen

eingeht und somit als Coaktivator von FoxO1a einen Einfluss auf die Regulation

der hepatischen Glucoseproduktion hat.

53

4 Diskussion

Für ein genaueres Verständnis der Interaktion zwischen DYRK1 und FoxO1a

auf molekularer Ebene sind weitere Untersuchungen erforderlich. Aufgrund der

hier vorgestellten Ergebnisse ist es aber durchaus denkbar, dass durch eine

gezielte Hemmung der Interaktion zwischen DYRK1 und FoxO1a die

hepatische Glucoseproduktion über eine Hemmung der G6Pase-

Promotoraktivierung vermindert werden kann. Dies könnte zu einer

Verbesserung der diabetischen Stoffwechsellage bei Patienten mit Typ-2-

Diabetes führen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Daten sind somit von

potenziellem Interesse für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien in

der Behandlung des Typ-2-Diabetes.

54

5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

In der vorgelegten Arbeit wurde der funktionelle Zusammenhang zwischen der

Kinase DYRK1 und dem Transkriptionsfaktor FoxO1a detailliert charakterisiert.

Es wurde untersucht, welche Rolle DYRK1 bei der insulinabhängigen

Regulation der hepatischen Glucoseproduktion spielt. Dies geschah anhand der

Glucose-6-Phosphatase, eines insulinabhängig regulierten Enzyms der

Gluconeogenese.

Es wurde durch mehrere unabhängige experimentelle Ansätze gezeigt, dass

die Proteinkinase DYRK1A einen stimulatorischen Effekt auf die Aktivität des

Glucose-6-Phosphatase-Promotors im Leberzellmodell ausübt. In Northern-

Blot-Untersuchungen fand sich in stabil mit DYRK1A transfizierten

Hepatomzellen eine erhöhte Menge an endogener G6Pase-mRNA im Vergleich

zu Kontrollzellen. In Luciferase-Reportergen-Assays wurde ein synergistischer

Effekt von DYRK1A mit dem Transkriptionsfaktor FoxO1a gefunden. Darüber

hinaus wurde ausgeschlossen, dass eine zuvor beschriebene Phosphorylierung

von FoxO1a durch DYRK1 (Ser329) für den Effekt von DYRK1A auf den

G6Pase-Promotor verantwortlich ist. In weiteren Experimenten wurde eine

Abhängigkeit des Effekts von DYRK1 auf die Aktivität des G6Pase-Promotors

von intakten FoxO1a-Bindungsstellen im G6Pase-Promotor nachgewiesen.

Dies legt den Schluss nahe, dass der Effekt von DYRK1 auf den G6Pase-

Promotor nicht direkt, sondern über FoxO1a vermittelt wird. Weiterhin zeigten

verschiedene DYRK-Isoformen unterschiedliche Effekte auf die G6Pase-

Promotoraktivität. Dies ist wahrscheinlich auf die unterschiedliche subzelluläre

Lokalisation der einzelnen DYRK-Isoformen zurückzuführen.

Diese Arbeit liefert somit den ersten Bericht der funktionellen Bedeutung einer

Interaktion zwischen DYRK1A und DYRK1B mit einem Transkriptionsfaktor.

Außerdem wird der Einfluss auf die Expression eines bestimmten Gens, der

Glucose-6-Phosphatase, beschrieben.

55

6 Literaturverzeichnis


Agati,J.M., Yeagley,D., and Quinn,P.G. (1998). Assessment of the roles of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol 3-kinase, protein kinase B, and protein kinase C in insulin inhibition of cAMP-induced phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription. J. Biol. Chem. 273, 18751-18759.

Alessi,D.R. and Cohen,P. (1998). Mechanism of activation and function of protein kinase B. Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 55-62.

Altafaj,X., Dierssen,M., Baamonde,C., Marti,E., Visa,J., Guimera,J., Oset,M., Gonzalez,J.R., Florez,J., Fillat,C., and Estivill,X. (2001). Neurodevelopmental delay, motor abnormalities and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing Dyrk1A (minibrain), a murine model of Down's syndrome. Hum. Mol. Genet. 10, 1915-1923.

Altomonte,J., Richter,A., Harbaran,S., Suriawinata,J., Nakae,J., Thung,S.N., Meseck,M., Accili,D., and Dong,H. (2003). Inhibition of Foxo1 function is associated with improved fasting glycemia in diabetic mice. Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 285, E718-E728.

Alvarez,M., Altafaj,X., Aranda,S., and de la,L.S. (2007). DYRK1A autophosphorylation on serine residue 520 modulates its kinase activity via 14-3-3 binding. Mol. Biol. Cell 18, 1167-1178.

Argaud,D., Zhang,Q., Pan,W., Maitra,S., Pilkis,S.J., and Lange,A.J. (1996). Regulation of rat liver glucose-6-phosphatase gene expression in different nutritional and hormonal states: gene structure and 5'-flanking sequence. Diabetes 45, 1563-1571.

Arion,W.J. and Nordlie,R.C. (1965). Liver glucose-6-phosphatase and pyrophosphate-glucose phosphotransferase: effects of fasting. Biochem. Biophys. Res. Commun. 20, 606-610.

Ayala,J.E., Streeper,R.S., Desgrosellier,J.S., Durham,S.K., Suwanichkul,A., Svitek,C.A., Goldman,J.K., Barr,F.G., Powell,D.R., and O'Brien,R.M. (1999). Conservation of an insulin response unit between mouse and human glucose-6-phosphatase catalytic subunit gene promoters: transcription factor FKHR binds the insulin response sequence. Diabetes 48, 1885-1889.

Barthel,A., Schmoll,D., Kruger,K.D., Bahrenberg,G., Walther,R., Roth,R.A., and Joost,H.G. (2001). Differential regulation of endogenous glucose-6-phosphatase and phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression by the forkhead transcription factor FKHR in H4IIE-hepatoma cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285, 897-902.

Baumann,C.A., Ribon,V., Kanzaki,M., Thurmond,D.C., Mora,S., Shigematsu,S., Bickel,P.E., Pessin,J.E., and Saltiel,A.R. (2000). CAP defines a second

56


signalling pathway required for insulin-stimulated glucose transport. Nature 407, 202-207.

Becker,W. and Joost,H.G. (1999). Structural and functional characteristics of Dyrk, a novel subfamily of protein kinases with dual specificity. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 62, 1-17.

Becker,W., Weber,Y., Wetzel,K., Eirmbter,K., Tejedor,F.J., and Joost,H.G. (1998). Sequence characteristics, subcellular localization, and substrate specificity of DYRK-related kinases, a novel family of dual specificity protein kinases. J. Biol. Chem. 273, 25893-25902.

Belham,C., Wu,S., and Avruch,J. (1999). Intracellular signalling: PDK1--a kinase at the hub of things. Curr. Biol. 9, R93-R96.

Biggs,W.H., III, Meisenhelder,J., Hunter,T., Cavenee,W.K., and Arden,K.C. (1999). Protein kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged helix transcription factor FKHR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96, 7421-7426.

Brunet,A., Bonni,A., Zigmond,M.J., Lin,M.Z., Juo,P., Hu,L.S., Anderson,M.J., Arden,K.C., Blenis,J., and Greenberg,M.E. (1999). Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell 96, 857-868.

Brunet,A., Park,J., Tran,H., Hu,L.S., Hemmings,B.A., and Greenberg,M.E. (2001). Protein kinase SGK mediates survival signals by phosphorylating the forkhead transcription factor FKHRL1 (FOXO3a). Mol. Cell Biol. 21, 952-965.

Brunet,A., Sweeney,L.B., Sturgill,J.F., Chua,K.F., Greer,P.L., Lin,Y., Tran,H., Ross,S.E., Mostoslavsky,R., Cohen,H.Y., Hu,L.S., Cheng,H.L., Jedrychowski,M.P., Gygi,S.P., Sinclair,D.A., Alt,F.W., and Greenberg,M.E. (2004). Stress-dependent regulation of FOXO transcription factors by the SIRT1 deacetylase. Science 303, 2011-2015.

Chatelain,F., Pegorier,J.P., Minassian,C., Bruni,N., Tarpin,S., Girard,J., and Mithieux,G. (1998). Development and regulation of glucose-6-phosphatase gene expression in rat liver, intestine, and kidney: in vivo and in vitro studies in cultured fetal hepatocytes. Diabetes 47, 882-889.

Cheatham,B., Vlahos,C.J., Cheatham,L., Wang,L., Blenis,J., and Kahn,C.R. (1994). Phosphatidylinositol 3-kinase activation is required for insulin stimulation of pp70 S6 kinase, DNA synthesis, and glucose transporter translocation. Mol. Cell Biol. 14, 4902-4911.

Chen-Hwang,M.C., Chen,H.R., Elzinga,M., and Hwang,Y.W. (2002). Dynamin is a minibrain kinase/dual specificity Yak1-related kinase 1A substrate. J. Biol. Chem. 277, 17597-17604.

Chiang,S.H., Baumann,C.A., Kanzaki,M., Thurmond,D.C., Watson,R.T., Neudauer,C.L., Macara,I.G., Pessin,J.E., and Saltiel,A.R. (2001). Insulin-stimulated GLUT4 translocation requires the CAP-dependent activation of TC10. Nature 410, 944-948.

57


Cho,H., Mu,J., Kim,J.K., Thorvaldsen,J.L., Chu,Q., Crenshaw,E.B., III, Kaestner,K.H., Bartolomei,M.S., Shulman,G.I., and Birnbaum,M.J. (2001a). Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science 292, 1728-1731.

Cho,H., Thorvaldsen,J.L., Chu,Q., Feng,F., and Birnbaum,M.J. (2001b). Akt1/PKBalpha is required for normal growth but dispensable for maintenance of glucose homeostasis in mice. J. Biol. Chem. 276, 38349-38352.

De Graaf,K., Czajkowska,H., Rottmann,S., Packman,L.C., Lilischkis,R., Luscher,B., and Becker,W. (2006). The protein kinase DYRK1A phosphorylates the splicing factor SF3b1/SAP155 at Thr434, a novel in vivo phosphorylation site. BMC. Biochem. 7, 7.

De Graaf,K., Hekerman,P., Spelten,O., Herrmann,A., Packman,L.C., Bussow,K., Muller-Newen,G., and Becker,W. (2004). Characterization of cyclin L2, a novel cyclin with an arginine/serine-rich domain: phosphorylation by DYRK1A and colocalization with splicing factors. J. Biol. Chem. 279, 4612-4624.

Dowell,P., Otto,T.C., Adi,S., and Lane,M.D. (2003). Convergence of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and Foxo1 signaling pathways. J. Biol. Chem. 278, 45485-45491.

Durham,S.K., Suwanichkul,A., Scheimann,A.O., Yee,D., Jackson,J.G., Barr,F.G., and Powell,D.R. (1999). FKHR binds the insulin response element in the insulin-like growth factor binding protein-1 promoter. Endocrinology 140, 3140-3146.

Essers,M.A., Weijzen,S., Vries-Smits,A.M., Saarloos,I., de Ruiter,N.D., Bos,J.L., and Burgering,B.M. (2004). FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. EMBO J. 23, 4802-4812.

Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus (1997). Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 20, 1183-1197.

Foster,J.D., Pederson,B.A., and Nordlie,R.C. (1997). Glucose-6-phosphatase structure, regulation, and function: an update. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215, 314-332.

Garland,R.C. (1986). Induction of glucose 6-phosphatase in cultured hepatoma cells by dexamethasone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 1130-1134.

Gilley,J., Coffer,P.J., and Ham,J. (2003). FOXO transcription factors directly activate bim gene expression and promote apoptosis in sympathetic neurons. J. Cell Biol. 162, 613-622.

Groote-Bidlingmaier,F., Schmoll,D., Orth,H.M., Joost,H.G., Becker,W., and Barthel,A. (2003). DYRK1 is a co-activator of FKHR (FOXO1a)-dependent glucose-6- phosphatase gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300, 764-769.

58


Guo,S., Rena,G., Cichy,S., He,X., Cohen,P., and Unterman,T. (1999). Phosphorylation of serine 256 by protein kinase B disrupts transactivation by FKHR and mediates effects of insulin on insulin-like growth factor-binding protein-1 promoter activity through a conserved insulin response sequence. J. Biol. Chem. 274, 17184-17192.

Gwack,Y., Sharma,S., Nardone,J., Tanasa,B., Iuga,A., Srikanth,S., Okamura,H., Bolton,D., Feske,S., Hogan,P.G., and Rao,A. (2006). A genome-wide Drosophila RNAi screen identifies DYRK-family kinases as regulators of NFAT. Nature 441, 646-650.

Herzig,S., Long,F., Jhala,U.S., Hedrick,S., Quinn,R., Bauer,A., Rudolph,D., Schutz,G., Yoon,C., Puigserver,P., Spiegelman,B., and Montminy,M. (2001). CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature 413, 179-183.

Himpel,S., Panzer,P., Eirmbter,K., Czajkowska,H., Sayed,M., Packman,L.C., Blundell,T., Kentrup,H., Grotzinger,J., Joost,H.G., and Becker,W. (2001). Identification of the autophosphorylation sites and characterization of their effects in the protein kinase DYRK1A. Biochem. J. 359, 497-505.

Hirota,K., Daitoku,H., Matsuzaki,H., Araya,N., Yamagata,K., Asada,S., Sugaya,T., and Fukamizu,A. (2003). Hepatocyte nuclear factor-4 is a novel downstream target of insulin via FKHR as a signal-regulated transcriptional inhibitor. J. Biol. Chem. 278, 13056-13060.

Hornbuckle,L.A., Edgerton,D.S., Ayala,J.E., Svitek,C.A., Oeser,J.K., Neal,D.W., Cardin,S., Cherrington,A.D., and O'Brien,R.M. (2001). Selective tonic inhibition of G-6-Pase catalytic subunit, but not G-6-P transporter, gene expression by insulin in vivo. Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 281, E713-E725.

Hwangbo,D.S., Gersham,B., Tu,M.P., Palmer,M., and Tatar,M. (2004). Drosophila dFOXO controls lifespan and regulates insulin signalling in brain and fat body. Nature 429, 562-566.

Kaestner,K.H., Knochel,W., and Martinez,D.E. (2000). Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors. Genes Dev. 14, 142-146.

Kahn,S.E. (2003). The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia 46, 3-19.

Kaufmann,E. and Knochel,W. (1996). Five years on the wings of fork head. Mech. Dev. 57, 3-20.

Kelly,P.A. and Rahmani,Z. (2005). DYRK1A enhances the mitogen-activated protein kinase cascade in PC12 cells by forming a complex with Ras, B-Raf, and MEK1. Mol. Biol. Cell 16, 3562-3573.

Kentrup,H., Becker,W., Heukelbach,J., Wilmes,A., Schurmann,A., Huppertz,C., Kainulainen,H., and Joost,H.G. (1996). Dyrk, a dual specificity protein kinase with unique structural features whose activity is dependent on tyrosine residues between subdomains VII and VIII. J. Biol. Chem. 271, 3488-3495.

59


Kimura,R., Kamino,K., Yamamoto,M., Nuripa,A., Kida,T., Kazui,H., Hashimoto,R., Tanaka,T., Kudo,T., Yamagata,H., Tabara,Y., Miki,T., Akatsu,H., Kosaka,K., Funakoshi,E., Nishitomi,K., Sakaguchi,G., Kato,A., Hattori,H., Uema,T., and Takeda,M. (2007). The DYRK1A gene, encoded in chromosome 21 Down syndrome critical region, bridges between beta-amyloid production and tau phosphorylation in Alzheimer disease. Hum. Mol. Genet. 16, 15-23.

Klein,B.E., Klein,R., Moss,S.E., and Cruickshanks,K.J. (1996). Parental history of diabetes in a population-based study. Diabetes Care 19, 827-830.

Kops,G.J., de Ruiter,N.D., Vries-Smits,A.M., Powell,D.R., Bos,J.L., and Burgering,B.M. (1999). Direct control of the Forkhead transcription factor AFX by protein kinase B. Nature 398, 630-634.

Kortylewski,M., Feld,F., Kruger,K.D., Bahrenberg,G., Roth,R.A., Joost,H.G., Heinrich,P.C., Behrmann,I., and Barthel,A. (2003). Akt modulates STAT3-mediated gene expression through a FKHR (FOXO1a)-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 5242-5249.

Kubota,N., Tobe,K., Terauchi,Y., Eto,K., Yamauchi,T., Suzuki,R., Tsubamoto,Y., Komeda,K., Nakano,R., Miki,H., Satoh,S., Sekihara,H., Sciacchitano,S., Lesniak,M., Aizawa,S., Nagai,R., Kimura,S., Akanuma,Y., Taylor,S.I., and Kadowaki,T. (2000). Disruption of insulin receptor substrate 2 causes type 2 diabetes because of liver insulin resistance and lack of compensatory beta-cell hyperplasia. Diabetes 49, 1880-1889.

Lange,A.J., Argaud,D., el Maghrabi,M.R., Pan,W., Maitra,S.R., and Pilkis,S.J. (1994). Isolation of a cDNA for the catalytic subunit of rat liver glucose-6-phosphatase: regulation of gene expression in FAO hepatoma cells by insulin, dexamethasone and cAMP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 302-309.

Leder,S., Weber,Y., Altafaj,X., Estivill,X., Joost,H.G., and Becker,W. (1999). Cloning and characterization of DYRK1B, a novel member of the DYRK family of protein kinases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 474-479.

Lehtinen,M.K., Yuan,Z., Boag,P.R., Yang,Y., Villen,J., Becker,E.B., DiBacco,S., de,l., I, Gygi,S., Blackwell,T.K., and Bonni,A. (2006). A conserved MST-FOXO signaling pathway mediates oxidative-stress responses and extends life span. Cell 125, 987-1001.

Li,P., Lee,H., Guo,S., Unterman,T.G., Jenster,G., and Bai,W. (2003). AKT-independent protection of prostate cancer cells from apoptosis mediated through complex formation between the androgen receptor and FKHR. Mol. Cell Biol. 23, 104-118.

Liao,J., Barthel,A., Nakatani,K., and Roth,R.A. (1998). Activation of protein kinase B/Akt is sufficient to repress the glucocorticoid and cAMP induction of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene. J. Biol. Chem. 273, 27320-27324.

Lim,S., Jin,K., and Friedman,E. (2002). Mirk protein kinase is activated by MKK3 and functions as a transcriptional activator of HNF1alpha. J. Biol. Chem. 277, 25040-25046.

60


Lin,K., Dorman,J.B., Rodan,A., and Kenyon,C. (1997). daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science 278, 1319-1322.

Lin,R., Beauparlant,P., Makris,C., Meloche,S., and Hiscott,J. (1996). Phosphorylation of IkappaBalpha in the C-terminal PEST domain by casein kinase II affects intrinsic protein stability. Mol. Cell Biol. 16, 1401-1409.

Liu,Z., Barrett,E.J., Dalkin,A.C., Zwart,A.D., and Chou,J.Y. (1994). Effect of acute diabetes on rat hepatic glucose-6-phosphatase activity and its messenger RNA level. Biochem. Biophys. Res. Commun. 205, 680-686.

Lizcano,J.M. and Alessi,D.R. (2002). The insulin signalling pathway. Curr. Biol. 12, R236-R238.

Lock,L.S., Royal,I., Naujokas,M.A., and Park,M. (2000). Identification of an atypical Grb2 carboxyl-terminal SH3 domain binding site in Gab docking proteins reveals Grb2-dependent and -independent recruitment of Gab1 to receptor tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 275, 31536-31545.

Mahmud,D.L., Amlak,M., Deb,D.K., Platanias,L.C., Uddin,S., and Wickrema,A. (2002). Phosphorylation of forkhead transcription factors by erythropoietin and stem cell factor prevents acetylation and their interaction with coactivator p300 in erythroid progenitor cells. Oncogene 21, 1556-1562.

Mao,J., Maye,P., Kogerman,P., Tejedor,F.J., Toftgard,R., Xie,W., Wu,G., and Wu,D. (2002). Regulation of Gli1 transcriptional activity in the nucleus by Dyrk1. J. Biol. Chem. 277, 35156-35161.

Massillon,D., Barzilai,N., Chen,W., Hu,M., and Rossetti,L. (1996). Glucose regulates in vivo glucose-6-phosphatase gene expression in the liver of diabetic rats. J. Biol. Chem. 271, 9871-9874.

Matsumoto,M. and Accili,D. (2005). All roads lead to FoxO. Cell Metab 1, 215-216.

Matsuo,R., Ochiai,W., Nakashima,K., and Taga,T. (2001). A new expression cloning strategy for isolation of substrate-specific kinases by using phosphorylation site-specific antibody. J. Immunol. Methods 247, 141-151.

Michael,L.F., Wu,Z., Cheatham,R.B., Puigserver,P., Adelmant,G., Lehman,J.J., Kelly,D.P., and Spiegelman,B.M. (2001). Restoration of insulin-sensitive glucose transporter (GLUT4) gene expression in muscle cells by the transcriptional coactivator PGC-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 3820-3825.

Minassian,C., Zitoun,C., and Mithieux,G. (1996). Differential time course of liver and kidney glucose-6 phosphatase activity during long-term fasting in rat correlates with differential time course of messenger RNA level. Mol. Cell Biochem. 155, 37-41.

Mithieux,G. (1997). New knowledge regarding glucose-6 phosphatase gene and protein and their roles in the regulation of glucose metabolism. Eur. J. Endocrinol. 136, 137-145.

61


Miyake,K., Ogawa,W., Matsumoto,M., Nakamura,T., Sakaue,H., and Kasuga,M. (2002). Hyperinsulinemia, glucose intolerance, and dyslipidemia induced by acute inhibition of phosphoinositide 3-kinase signaling in the liver. J. Clin. Invest 110, 1483-1491.

Moriya,H., Shimizu-Yoshida,Y., Omori,A., Iwashita,S., Katoh,M., and Sakai,A. (2001). Yak1p, a DYRK family kinase, translocates to the nucleus and phosphorylates yeast Pop2p in response to a glucose signal. Genes Dev. 15, 1217-1228.

Motta,M.C., Divecha,N., Lemieux,M., Kamel,C., Chen,D., Gu,W., Bultsma,Y., McBurney,M., and Guarente,L. (2004). Mammalian SIRT1 represses forkhead transcription factors. Cell 116, 551-563.

Nakae,J., Biggs,W.H., III, Kitamura,T., Cavenee,W.K., Wright,C.V., Arden,K.C., and Accili,D. (2002). Regulation of insulin action and pancreatic beta-cell function by mutated alleles of the gene encoding forkhead transcription factor Foxo1. Nat. Genet. 32, 245-253.

Nakae,J., Kitamura,T., Kitamura,Y., Biggs,W.H., III, Arden,K.C., and Accili,D. (2003). The forkhead transcription factor Foxo1 regulates adipocyte differentiation. Dev. Cell 4, 119-129.

Nakae,J., Kitamura,T., Silver,D.L., and Accili,D. (2001). The forkhead transcription factor Foxo1 (Fkhr) confers insulin sensitivity onto glucose-6-phosphatase expression. J. Clin. Invest 108, 1359-1367.

Nakae,J., Park,B.C., and Accili,D. (1999). Insulin stimulates phosphorylation of the forkhead transcription factor FKHR on serine 253 through a Wortmannin-sensitive pathway. J. Biol. Chem. 274, 15982-15985.

Nasrin,N., Ogg,S., Cahill,C.M., Biggs,W., Nui,S., Dore,J., Calvo,D., Shi,Y., Ruvkun,G., and Alexander-Bridges,M.C. (2000). DAF-16 recruits the CREB-binding protein coactivator complex to the insulin-like growth factor binding protein 1 promoter in HepG2 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 10412-10417.

Noguchi,T., Matozaki,T., Inagaki,K., Tsuda,M., Fukunaga,K., Kitamura,Y., Kitamura,T., Shii,K., Yamanashi,Y., and Kasuga,M. (1999). Tyrosine phosphorylation of p62(Dok) induced by cell adhesion and insulin: possible role in cell migration. EMBO J. 18, 1748-1760.

O'Brien,R.M., Lucas,P.C., Forest,C.D., Magnuson,M.A., and Granner,D.K. (1990). Identification of a sequence in the PEPCK gene that mediates a negative effect of insulin on transcription. Science 249, 533-537.

O'Brien,R.M., Streeper,R.S., Ayala,J.E., Stadelmaier,B.T., and Hornbuckle,L.A. (2001). Insulin-regulated gene expression. Biochem. Soc. Trans. 29, 552-558.

Ogg,S., Paradis,S., Gottlieb,S., Patterson,G.I., Lee,L., Tissenbaum,H.A., and Ruvkun,G. (1997). The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature 389, 994-999.

62


Okada,T., Kawano,Y., Sakakibara,T., Hazeki,O., and Ui,M. (1994). Essential role of phosphatidylinositol 3-kinase in insulin-induced glucose transport and antilipolysis in rat adipocytes. Studies with a selective inhibitor wortmannin. J. Biol. Chem. 269, 3568-3573.

Puigserver,P., Rhee,J., Donovan,J., Walkey,C.J., Yoon,J.C., Oriente,F., Kitamura,Y., Altomonte,J., Dong,H., Accili,D., and Spiegelman,B.M. (2003). Insulin-regulated hepatic gluconeogenesis through FOXO1-PGC-1alpha interaction. Nature 423, 550-555.

Reaven,G.M. (1988). Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes 37, 1595-1607.

Rena,G., Guo,S., Cichy,S.C., Unterman,T.G., and Cohen,P. (1999). Phosphorylation of the transcription factor forkhead family member FKHR by protein kinase B. J. Biol. Chem. 274, 17179-17183.

Rena,G., Woods,Y.L., Prescott,A.R., Peggie,M., Unterman,T.G., Williams,M.R., and Cohen,P. (2002). Two novel phosphorylation sites on FKHR that are critical for its nuclear exclusion. EMBO J. 21, 2263-2271.

Saltiel,A.R. and Pessin,J.E. (2002). Insulin signaling pathways in time and space. Trends Cell Biol. 12, 65-71.

Sanger,F., Nicklen,S., and Coulson,A.R. (1992). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. 1977. Biotechnology 24, 104-108.

Schmidt,M., Fernandez,d.M., van der,H.A., Klompmaker,R., Kops,G.J., Lam,E.W., Burgering,B.M., and Medema,R.H. (2002). Cell cycle inhibition by FoxO forkhead transcription factors involves downregulation of cyclin D. Mol. Cell Biol. 22, 7842-7852.

Schmoll,D., Allan,B.B., and Burchell,A. (1996). Cloning and sequencing of the 5' region of the human glucose-6- phosphatase gene: transcriptional regulation by cAMP, insulin and glucocorticoids in H4IIE hepatoma cells. FEBS Lett. 383, 63-66.

Schmoll,D., Walker,K.S., Alessi,D.R., Grempler,R., Burchell,A., Guo,S., Walther,R., and Unterman,T.G. (2000). Regulation of glucose-6-phosphatase gene expression by protein kinase Balpha and the forkhead transcription factor FKHR. Evidence for insulin response unit-dependent and -independent effects of insulin on promoter activity. J. Biol. Chem. 275, 36324-36333.

Schuur,E.R., Loktev,A.V., Sharma,M., Sun,Z., Roth,R.A., and Weigel,R.J. (2001). Ligand-dependent interaction of estrogen receptor-alpha with members of the forkhead transcription factor family. J. Biol. Chem. 276, 33554-33560.

Segal,H.L. and Washko,M.E. (1959). Studies of liver glucose 6-phosphatase. III. Solubilization and properties of the enzyme from normal and diabetic rats. J. Biol. Chem. 234, 1937-1941.

63


Seoane,J., Le,H.V., Shen,L., Anderson,S.A., and Massague,J. (2004). Integration of Smad and forkhead pathways in the control of neuroepithelial and glioblastoma cell proliferation. Cell 117, 211-223.

Taira,N., Nihira,K., Yamaguchi,T., Miki,Y., and Yoshida,K. (2007). DYRK2 is targeted to the nucleus and controls p53 via Ser46 phosphorylation in the apoptotic response to DNA damage. Mol. Cell 25, 725-738.

Takahashi-Yanaga,F., Mori,J., Matsuzaki,E., Watanabe,Y., Hirata,M., Miwa,Y., Morimoto,S., and Sasaguri,T. (2006). Involvement of GSK-3beta and DYRK1B in differentiation-inducing factor-3-induced phosphorylation of cyclin D1 in HeLa cells. J. Biol. Chem. 281, 38489-38497.

Tang,E.D., Nunez,G., Barr,F.G., and Guan,K.L. (1999). Negative regulation of the forkhead transcription factor FKHR by Akt. J. Biol. Chem. 274, 16741-16746.

UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group (1998). Effect of intensive blood-glucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes (UKPDS 34). Lancet 352, 854-865.

Unterman,T.G., Fareeduddin,A., Harris,M.A., Goswami,R.G., Porcella,A., Costa,R.H., and Lacson,R.G. (1994). Hepatocyte nuclear factor-3 (HNF-3) binds to the insulin response sequence in the IGF binding protein-1 (IGFBP-1) promoter and enhances promoter function. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203, 1835-1841.

van de Werve,G., Lange,A., Newgard,C., Mechin,M.C., Li,Y., and Berteloot,A. (2000). New lessons in the regulation of glucose metabolism taught by the glucose 6-phosphatase system. Eur. J. Biochem. 267, 1533-1549.

van der Horst,A., Tertoolen,L.G., Vries-Smits,L.M., Frye,R.A., Medema,R.H., and Burgering,B.M. (2004). FOXO4 is acetylated upon peroxide stress and deacetylated by the longevity protein hSir2(SIRT1). J. Biol. Chem. 279, 28873-28879.

van Schaftingen,E. and Gerin,I. (2002). The glucose-6-phosphatase system. Biochem. J. 362, 513-532.

Vander Kooi,B.T., Streeper,R.S., Svitek,C.A., Oeser,J.K., Powell,D.R., and O'Brien,R.M. (2003). The three insulin response sequences in the glucose-6-phosphatase catalytic subunit gene promoter are functionally distinct. J. Biol. Chem. 278, 11782-11793.

Vanhaesebroeck,B. and Alessi,D.R. (2000). The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB. Biochem. J. 346, 561-576.

Vidal-Puig,A. and O'Rahilly,S. (2001). Metabolism. Controlling the glucose factory. Nature 413, 125-126.

Wang,M.C., Bohmann,D., and Jasper,H. (2005). JNK extends life span and limits growth by antagonizing cellular and organism-wide responses to insulin signaling. Cell 121, 115-125.

64


White,M.F. (2002). IRS proteins and the common path to diabetes. Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 283, E413-E422.

Wild,S., Roglic,G., Green,A., Sicree,R., and King,H. (2004). Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27, 1047-1053.

Withers,D.J., Gutierrez,J.S., Towery,H., Burks,D.J., Ren,J.M., Previs,S., Zhang,Y., Bernal,D., Pons,S., Shulman,G.I., Bonner-Weir,S., and White,M.F. (1998). Disruption of IRS-2 causes type 2 diabetes in mice. Nature 391, 900-904.

Woods,Y.L., Cohen,P., Becker,W., Jakes,R., Goedert,M., Wang,X., and Proud,C.G. (2001a). The kinase DYRK phosphorylates protein-synthesis initiation factor eIF2Bepsilon at Ser539 and the microtubule-associated protein tau at Thr212: potential role for DYRK as a glycogen synthase kinase 3-priming kinase. Biochem. J. 355, 609-615.

Woods,Y.L., Rena,G., Morrice,N., Barthel,A., Becker,W., Guo,S., Unterman,T.G., and Cohen,P. (2001b). The kinase DYRK1A phosphorylates the transcription factor FKHR at Ser329 in vitro, a novel in vivo phosphorylation site. Biochem. J. 355, 597-607.

Yang,E.J., Ahn,Y.S., and Chung,K.C. (2001). Protein kinase Dyrk1 activates cAMP response element-binding protein during neuronal differentiation in hippocampal progenitor cells. J. Biol. Chem. 276, 39819-39824.

Zhao,H.H., Herrera,R.E., Coronado-Heinsohn,E., Yang,M.C., Ludes-Meyers,J.H., Seybold-Tilson,K.J., Nawaz,Z., Yee,D., Barr,F.G., Diab,S.G., Brown,P.H., Fuqua,S.A., and Osborne,C.K. (2001). Forkhead homologue in rhabdomyosarcoma functions as a bifunctional nuclear receptor-interacting protein with both coactivator and corepressor functions. J. Biol. Chem. 276, 27907-27912.

65

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Dr. Hans Georg Joost danke ich für die Überlassung des

Dissertationsthemas und für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen im

Labor.

Herrn Prof. Dr. Peter C. Heinrich danke ich für die Übernahme des Koreferats.

Herrn PD Dr. Andreas Barthel danke ich für die intensive Betreuung und seine

ständige Bereitschaft, Fragen zu diskutieren und Hilfestellung zu geben. Ich

möchte ihm außerdem für die Durchsicht und Korrektur des Manuskripts und für

viele Anregungen danken.

Herrn Prof. Dr. Walter Becker danke ich für die Bereitstellung der DYRK-

Konstrukte und für interessante Diskussionen.

Allen Mitarbeitern des Institutes für Pharmakologie und Toxikologie danke ich

für die freundliche Arbeitsatmosphäre und die gute Zusammenarbeit. Herrn

Dipl.-Chemiker Klaus-Dieter Krüger und meinem Kommilitonen Herrn Hans-

Martin Orth gilt hierbei mein besonderer Dank.

Meiner Schwester Carolin danke ich für die Lösung technischer Probleme bei

der Textverarbeitung.

Nicht zuletzt gilt mein größter Dank meinen Eltern für Ihre bedingungslose

Unterstützung und Ihr Vertrauen.

Lebenslauf

Persönliche Daten Name Florian Till von Groote-Bidlingmaier

Geburtsdatum/-ort 08.10.1976, Neuss

Staatsangehörigkeit deutsch

Familienstand ledig

Schulbildung 08/1987 - 06/1993 Albert-Einstein-Gymnasium Kaarst

08/1993 - 06/1994 Pebblebrook High School Mableton, USA

08/1994 - 06/1996 Albert-Einstein-Gymnasium Kaarst

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Zivildienst 09/1996 - 08/1997 Malteser Hilfsdienst Neuss

Hochschulbildung 10/1997 - 11/2004 Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen

08/2000 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

08/2003 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

10/2003 - 10/2004 Praktisches Jahr, University of Pretoria, Universität

Zürich, RWTH Aachen

11/2004 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Berufsausbildung 04/2005 - heute Assistenzarzt, Medizinische Klinik, Evangelisches

Krankenhaus Düsseldorf

Documents

Die Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor FoxO1adarwin.bth.rwth-aachen.de/opus3/volltexte/2008/2136/pdf/von_Groote-B... · CAP Cbl associated protein Cat catalytic domain