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Die „Wnts“ -Wechselwirkungen zwischen - Embryonalentwicklung und Tumorentstehung -

Die Wnts -Wechselwirkungen zwischen - Embryonalentwicklung und Tumorentstehung -

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Die „Wnts“-Wechselwirkungen zwischen

- Embryonalentwicklung und Tumorentstehung -

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Die Wnt-Proteinfamilie: allgemein

- Gycoproteine mit 350- 400 As (MW 39-46 kDa)

- Name: entstanden aus dem Gen int-1 (durch Integration eines Tumorvirus

aktiviertes Gen) und seinem Drosophila Homolog Wingless (1982)

- insgesamt 16 wnt-Gene in Maus und Mensch (wnt1-wnt16)

- Expression von Wnt-Proteinen in Wirbeltieren und Nichtwirbeltieren,

jedoch nicht in Pflanzen und Bakterien

- Synthese durch eine Vielzahl verschiedener Zelltypen

- sezernierte Proteine

Wnt

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Die Wnt-Proteinfamilie: Struktur

- 23-24 konservierte Cysteinreste Proteinfaltung durch Ausbildung von

intramolekularen Disulfidbrücken

schlechte Löslichkeit, geringe biologische Aktivität in "in-vitro" assays

- C-terminale Domäne für die Signaltransduktion essentiell

C-terminal trunkierte Wnt-Proteine wirken als dom.neg. Mutanten

- Glycoproteine Funktion der Glycosylierung unbekannt

Wnt

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Die Wnt-Proteinfamilie: Gruppen

Wnt

- Einteilung der Wnts nicht nach Homologie sondern nach den nachgeschalteten Signalketten

"Canonical" WntsWnt 1

Wnt 3aWnt 8

Wnt 10b

"Non-canonical" WntsWnt 4

Wnt 5aWnt 11

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Die Wnt-Proteinfamilie: Funktionen in der Entwicklung

Wnt-Funktionen:

zentrale Bedeutung bei der Organ- und Zelldifferenzierung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Funktionen in der Entwicklung

Gen Phänotyp des Knock-outs

Wnt 1 Störungen der Gehirnentwicklung

Wnt 2 Plazenta Defekte

Wnt 3 Störungen der Körperachsenbildung, Defekt in der Haarbildung

Wnt 3a Verlust des Hippocampus

Wnt 4 Störungen der Nierenentwicklung, Defekte in der Entwicklung

weiblicher Geschlechtsorgane

Wnt 5a verkürzte Gliedmaßen

Wnt 7a Defekte in der Synapsenbildung, Infertilität weibl. Mäuse

Wnt 10b Defekt in der Adipozytenentwicklung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

Welche Signaltransduktionswege werden wie durch Wnt-Proteine aktiviert?

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalwege

1. Klassischer oder "canonischer" Wnt-Signalweg Wnt-stimulierte Akkumulation von ß-catenin und Aktivierung von Tcf/Lef

Transkriptionsfaktoren

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalwege

2. Wnt/Ca2+ -Signalweg Wnt-stimulierte Aktivierung von Gq/Go und Anstieg des intrazellulären [Ca2+]

Aktivierung von Ca2+-aktivierten Signalmolekülen:Ca2+/CaM-Kinase; Calcineurin (Phosphatase); NF-AT (Transkriptionsfaktor)

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalwege

3. Wnt/Zell-Polarität SignalwegWnt-stimulierte Aktivierung von Signalmolekülen, welche mit der

Organisation des Cytoskelets in Verbindung stehen z.B. Rho, Integrine, Actin/Myosin

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Die Wnt-Proteinfamilie: Wnt-Rezeptoren

LRP

1. Schritt der Aktivierung aller 3 Signalwege Bindung von Wnts an Rezeptoren auf der extrazellulären Seite

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Die Wnt-Proteinfamilie: Wnt-Rezeptoren

- 7 Transmembranrezeptoren

- geringe Homologie zu GPCRs

Frizzled-Rezeptoren

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Die Wnt-Proteinfamilie: Wnt-Rezeptoren

- 7 Transmembranrezeptoren

- geringe Homologie zu GPCRs

Frizzled-Rezeptoren

FrizzledMutante

Orientierung der Körperhaare bei

Drosophila

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Die Wnt-Proteinfamilie: Wnt-Rezeptoren

- 7 Transmembranrezeptoren

- N-terminale Cystein(C)-rich(R)-Domäne(D) Wnt-Bindung

- 10 unterschiedliche Flz-Rezeptoren im Menschen

- begrenzte Bindungsselektivität einzelner für unterschiedliche Wnts

- differentielle Expression unterschiedlicher Flz-Rezeptoren

in unterschiedlichen Geweben

Frizzled(Flz)-Rezeptoren

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Die Wnt-Proteinfamilie: Wnt-Rezeptoren

- 7 Transmembranrezeptoren

- N-terminale Cystein(C)-rich(R)-Domäne(D) Wnt-Bindung

- 2 Gruppen:

(A) Canonical Signalweg: keine Kopplung an G-Proteine

(B) Ca2+-Signalweg: Kopplung an Gq, Aktivierung von PLC und PKC

Frizzled-Rezeptoren

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Die Wnt-Proteinfamilie: Wnt-Rezeptoren

- LRP-5 und LRP-6 binden Wnts und bilden einen ternären Komplex mit

dem Frizzled Rezeptor Signaltransduktion

LDL-receptor-related protein (LRP) Rezeptoren

- LRP-5 und LRP-6 sind essentiell für die Aktivierung des

"canonical"-Wnt-Signalwegs

- Ko-Rezeptoren ternärer Wnt-Frizzled-LRP Komplex

- LRP5 und LRP6 (-/-) Mäuse zeigen ähnliche Defekte wie Wntx (-/-) Mäuse

LRP

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

Signaltransduktion des "canonischen" Wnt-Signalwegs

LRP LRP

Besonderheit der "canonischen" Wnt-Signalkette:

- nicht Stimulation eines ruhenden Systems

sondern

Inhibition einer konstitutiv aktiven Signalkette

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Unstimulierter Zustand

Proteolytischer Abbau von ß-Catenin

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

ß-Catenin

- Interaktion mit zahlreichen Proteinen durch "Arm-repeats"

- Bindungspartner von E-Cadherin

Verbindung von Zelladhäsionsmolekülen mit dem Zytoskelett

- cytoplasmatisches ß-Catenin wird schnell abgebaut Proteasomaler Abbau

42 As

Drosophila

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Unstimulierter Zustand

Proteolytischer Abbau von ß-Catenin

Ubiquitinylierung von ß-Catenin

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CyclinUbiquitin

E 1 = U biqu itin -ac tiva ting enzym eE 2 = U biqu itin -con juga ting enzym eE 3 = U biqu itin ligase

E 1

E 1

E 2

E 2

E 3

E 2E 3

E 2E 3

E 2E 3P ro teasom

Abbau

Kontrollierter Proteinabbau

Multiproteinkomplex

Proteasomaler Proteinabbau

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Unstimulierter Zustand

Proteolytischer Abbau von ß-Catenin

Ubiquitinylierung von ß-Catenin

Phosphorylierung von ß-Catenin

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

ß-Catenin

- cytoplasmatisches ß-Catenin wird schnell proteasomal abgebaut

- Phosphorylierung in der N-terminalen Domäne ist essentiell für die

Markierung mit Ubiquitin und den proteasomalen Abbau von ß-Catenin

42 As

Drosophila

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

ß-Catenin

- cytoplasmatisches ß-Catenin wird schnell proteasomal abgebaut

- Phosphorylierung in der N-terminalen Domäne ist essentiell für die

Markierung mit Ubiquitin und den proteasomalen Abbau von ß-Catenin

42 As

Drosophilahäufig Mutationenbei Dickdarmkrebs

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Destruction-Komplex:

- Caseinkinase I (CKI)

- Dishevelled

- Axin

- APC

- GSK-3

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Glycogen-Synthase Kinase 3 (GSK-3)

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Glycogen-Synthase Kinase 3 (GSK-3)

ß-Catenin Phosphorylierung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Glycogen-Synthase Kinase 3 (GSK-3)

- Ser/Thr Kinase, phosphoryliert ß-Catenin an den Positionen 33, 37 und 41

- für die Phosphorylierung von ß-Catenin an diesen Positionen ist eine vorherige

Phosphorylierung an Position 45 durch Casein-Kinase I (CKI) essentiel (priming)

- Phosphorylierung von ß-Catenin an diesen Positionen ist essentiell für

die Ubiquitinylierung von ß-Catenin durch die E3-Ligase ß-TrCP

- GSK-3ß phosphoryliert ß-Catenin nur im Komplex mit APC und Axin effektiv

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

Destruction-Komplex:

- CKI

- Dishevelled

- Axin

- APC

- GSK-3

"canonical"- Wnt-Signalweg

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Axin

- für normale Entwicklung der Maus essentiell

- wirkt als "scaffold"-Protein, in dem es die beteiligten Proteine ß-Catenin, APC,

Casein-Kinase I und GSK-3ß fixiert und damit in direkte räumliche Nähe bringt

- zentrale Domäne für ß-Cat und GSK-Bindung essentiell

- Phosphorylierung von ß-Catenin durch GSK-3ß wird durch Axin gesteigert

- Phosphorylierung von Axin durch GSK-3ß steigert dessen Affinität für APC

APC-Bindung Dimerisierung

ß-Catenin, GSK-3ß Bindung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Adenomatous polyposis Coli (APC)

- Tumorsupressorgen vor allem bei Dickdarmkrebs (Mutationen)

- Bindung von APC an ß-Catenin ist essentiell für die Phophorylierung durch

GSK-3ß

- GSK-3ß phosphoryliert neben ß-Catenin auch APC, wodurch die Bindung

von ß-Catenin und APC noch verstärkt wird

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Axin APC

GSK-3ß

ß-Catenin-P

ß-Catenin-P-Ubiquitin Abbau

Page 33: Die Wnts -Wechselwirkungen zwischen - Embryonalentwicklung und Tumorentstehung -

Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Axin APC

GSK-3ß

ß-Catenin-P

ß-Catenin-P-Ubiquitin Abbau

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

Wie beeinflusst die Bindung von Wntdie Aktivität von GSK-3ß und damit die

ß-Catenin Konzentration ?

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP"canonical"- Wnt-Signalweg

Stimulierter Zustand

Destruction-Komplex:

- Dishevelled (Dvl)

Wnt-induzierte Phosphorylierung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Dishevelled (zerzaust)

- positiver Mediator des klassischen Wnt-Signalwegs

- ubiquitär, cytosolisch lokalisiert

- Wnt-Bindung führt zu einer Phosphorylierung von Dishevelled (wahrscheinlich

durch Casein-Kinase I (CKI))

Axin-Bindung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signaltransduktion

LRP LRP

"canonical"- Wnt-Signalweg

Stimulierter Zustand

Translokation in den Kern

Destruction-Komplex:

- Dishevelled

Wnt-induzierte Phosphorylierung

Bindung von Dvl an Axin

Rekrutierung von GBP an GSK-3ß

(GSK-binding protein)

Inhibition der GSK-3ß/Axin Bindung

und ß-Catenin Phosphorylierung

Translokation von ß-Catenin in den Kern

Aktivierung von Tcf/Lef

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

- Gruppe von Transkriptionsfaktoren (Tcf 1-4)

- Tcf: T-cell factor; Lef: lymphoid enhancer factor

TCF/Lef -Transkriptionsfaktoren

DNA-Bindung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

- Gruppe von Transkriptionsfaktoren (Tcf 1-4)

- Tcf: T-cell factor; Lef: lymphoid enhancer factor

- konstitututive DNA-Bindung, aber keine transkriptionelle Aktivität

ohne Ko-Aktivator

TCF/Lef -Transkriptionsfaktoren

DNA-Bindung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

- Gruppe von Transkriptionsfaktoren (Tcf 1-4)

- Tcf: T-cell factor; Lef: lymphoid enhancer factor

- konstitututive DNA-Bindung, aber keine transkriptionelle Aktivität

ohne Ko-Aktivator

- Bindung von ß-Catenin an TCF/Lef führt zu einer Transaktivierung und

damit Transkription von Zielgenen durch Tcf/Lef

TCF/Lef -Transkriptionsfaktoren

DNA-Bindung

Page 41: Die Wnts -Wechselwirkungen zwischen - Embryonalentwicklung und Tumorentstehung -

Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Tcf/Lef kontrolierte Gene:

C-myc (Protoonkogen)

Cyclin D (CDK-Aktivator)

p21 (CDK Inhibitor)

VEGF (Wachstumsfaktor)

PPARNucleärer Rezeptor/Transkriptionsfaktor)

MMP7 (Metalloproteinase)

TCF/Lef -Transkriptionsfaktoren

DNA-Bindung

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Die Wnt-Proteinfamilie: Signalmoleküle

Tcf/Lef kontrolierte Gene:

C-myc (Protoonkogen)

Cyclin D (CDK-Aktivator)

p21 (CDK Inhibitor)

VEGF (Wachstumsfaktor)

PPARNucleärer Rezeptor)

MMP7 (Metalloproteinase)

TCF/Lef -Transkriptionsfaktoren

DNA-Bindung

Proliferation