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Die Entwicklung und behördliche Akzeptanzvon Alternativ-Methoden zu Bioassays bei derQualitätskontrolle von ArzneimittelnEine Herausforderung für Industrie und Zulassungsbehörden

Gundel Miethe und Gisbert SponerStiftung zur Förderung der Erforschung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zur Einschränkung vonTierversuchen (SET), D-Mainz

ZusammenfassungBioassays werden zur Qualitätssicherung biologisch gewon-nener Arzneimittel gemäß den Monographien durchgeführt, dieim Deutschen oder Europäischen Arzneibuch festgelegt sind.Sie haben ihre Berechtigung, weil physiko-chemische oderandere analytische Methoden nicht in der Lage sind, die Wirk-samkeit (potency) der Chargen zu definieren oder beimHerstellungsprozess entstehende geringe Mengen an biologischwirksamen Verunreinigungen zu entdecken.Neuere Bestimmungen (zB. GMP) , mit denen eine intensiveKontrolle aller Produktionsschritte ermöglicht wird, sowietechnologische Fortschritte der letzten Jahre bei Herstellungs-verfahren und analytischen Methoden lassen die Frage aufkom-men, ob und gegebenenfalls welche Bioassays durch alter-native Methoden ersetzt werden können. Hierzu werden inder vorliegenden Untersuchung alle in den Monographien ent-haltenen Tests an biologischem Material einer kritischenDurchsicht unterzogen. Es werden Vorschläge für den Ersatzvon Bioassays gemacht, die allerdings nur realisiert werdenkönnen, wenn sich alle Beteiligten - pharmazeutische Industrie,Zulassungsbehörde und andere Institutionen wie die Arznei-buch-Kommissionen - gemeinsam dieser Aufgabe stellenund, wo immer möglich, weitere Bioassays durch alternativeMethoden ersetzen.

Summary: The development and approval of alternativemethods to bioassays used for quality assurance, achallenge forthe pharmaceutical industry and the authoritiesBioassays are performed to ensure a constant quality of medi-eines derivedfrom biological sourees. These tests are stipulatedfor so me drugs in the German and European Pharmacopoeias.They are justifted because physico-chemical 01' other analyticalmethods may not be appropriate to define exactly the potency ofthe drug in each individual batch and/or to detect any biolo-gically relevant impurities. However, the implementation ofgood manufacturing practice and the technological progress inmanufacturing and in analytical methods in the last few yearsraise the question whether some traditional bioassays can bereplaced by new alternative methods which do not requirebiological tissues 01' animals. With respect to this topic thepharmacopoeias were reviewed and so me proposals arepresented in this paper. However, these approaches can only berealised when all parties involved - pharmaceutical industry,regulatory authorities and others - co-operate in the challengeto replace - wherever possible - bioassays by appropriatealternative methods.

Keywords: 3R-methods, bioassays, biologieals. monographs, pharmacopoeia, safety tests

1 Einleitung undStandortbestimmung

Die maßgeblichen Standards für dieQualitätssicherung von Arzneimittelnsind im Deutschen Arzneibuch (2000)und in der Europäischen Pharmacopoeia(1997) festgelegt. Danach wird für eineReihe von Substanzen biologischenUrsprungs eine konstante Qualität desArzneimittels dadurch gewährleistet,dass Wertbestimmungen und Sicherheits-prüfungen mittels biologischer Metho-den (insbesondere Tierversuche, aber

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auch Zellkulturmethoden) erfolgen. Aufder anderen Seite kann der laufende Fort-schritt in Wissenschaft und Forschungneue Möglichkeiten eröffnen, Bioassaysdurch andere, z.B. chemisch-analytischeVerfahren zu ersetzen, insbesonderedann, wenn diese neuen Methoden einegleichwertige oder sogar höhere Präzisi-on und Richtigkeit erreichen als die ent-sprechenden Bioassays. Neue technischeMöglichkeiten sollten deshalb zu Überle-gungen und Neubewertungen der gelten-den Vorschriften führen, ob die für dieQualitätskontrolle vorgeschriebenen Tier-

versuche noch wissenschaftlich undethisch vertretbar sind. In den genanntenFällen sind alle Beteiligten, also diepharmazeutischen Firmen ebenso wie dieZulassungsbehörden und die Kommis-sionen, welche die Arzneibücher überar-beiten, aufgerufen, die neuen Erkenntnis-se in validierte Methoden umzusetzen,sie angemessen zu publizieren und siezu geltendem Recht zu machen. Damittrüge man dem 3R-Prinzip (reduction,replacement, refinement) Rechnung undkönnte die Anzahl der Tierversuche - woimmer möglich - reduzieren, wozu

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sich die politischen Parteien und viele In-stitutionen in Deutschland, in vielen an-deren Ländern und in der EuropäischenGemeinschaft bekannt haben (EU-Be-schluss 1999/575/EG).In der Tat sind in den letzten Jahren

durch die Europäische Arzneibuchbe-hörde (EDQM, European Directoratefor the Quality 0/ Medicines) eine be-trächtliche Anzahl von Monographiengeändert worden. Eine Reihe von Bio-assays sind durch physiko-chemischeMethoden ersetzt worden oder Tierver-suche sind als Routinetests bei Sicher-heitsuntersuchungen gestrichen worden.So wurde für Oxytocin und Calcitonindie Bestimmung des Hormongehaltsdurch Hochdruckftüssigkeits-Chromato-graphie (HPLC) in die Monographienaufgenommen. Bei einzelnen Substanzenwurde die Prüfung auf Histamin undblutdrucksenkende Substanzen sowie aufanomale Toxizität als Routineprüfungeliminiert und in den Abschnitt "Produk-tion" überführt, was bedeutet, dass derTest entfallen kann, wenn der Nachweiseines validierten Herstellungsverfahrenserbracht wird, der entsprechende Verun-reinigungen ausschließt (Spielmann etal. , 1998; Charton, 1999; Charton andCastle, 2001). Aufgrund einer kooperati-ven Studie des Paul-Ehrlich-Instituts (D-Langen) und der Medizinischen Hoch-schule Hannover konnte die Prüfung aufanomale Toxizität bei einer Vielzahl vonImpfstoffen bzw. Sera entfallen (Schwa-

nig et al. , 1997; BMBF Publikation,2001). Dies wurde im Jahr 2002 auchvon der EDQM beschlossen. Schließlichsei auch darauf hingewiesen, dass derKaninchen-Test auf pyrogene Substan-zen in Lösungen weitgehend durch denLimulus-Amöbozyten-Lysat-Test, ein invitro Verfahren, ersetzt worden ist, bzw.durch den noch potenteren Human- Voll-blut-Test ersetzt werden wird (Hartung etal. , 2001). Dennoch sind Bioassays invielen Monographien des Arzneibuchsfür die Qualitätskontrolle von Arzneienbiologischen Ursprungs verblieben.Die Stiftung zur Förderung und Erfor-

schung von Ersatz- und Ergänzungs-methoden zur Einschränkung von Tier-versuchen (SET) hat es sich zur Aufgabegemacht, Möglichkeiten zu eruieren, auf-grund neuerer Erkenntnisse weitere Tier-versuche im Rahmen der Qualitätskon-trolle von Arzneimitteln biologischenUrsprungs zu reduzieren oder zu ersetzenund damit dem 3R-Konzept weiter Rech-nung zu tragen. Dabei blieben Seraoder Vakzinen in unserer Untersuchungunberücksichtigt, weil für diesen Teil-bereich bereits umfangreiche Unter-suchungen vorliegen (Schwanig et al. ,1997).

2 Vorgehen

Eine intensive Durchsicht der Mono-graphien erlaubte eine Übersicht, bei

welchen Arzneimitteln noch Bioassaysvorgesehen sind. Die Hersteller solcherArzneimittel in Deutschland, derSchweiz, Österreich und den Niederlan-den wurden daraufhin angeschrieben undum Auskunft ersucht, ob die in denMonographien angegebenen Bioassaysweiterhin durchgeführt werden oder obalternative Methoden dazu erarbeitet undvalidiert oder gar schon in der Routineangewandt werden. Auch wurde denFirmen Diskussion und gegebenenfallsHilfe angeboten mit dem Ziel, Bioassaysdurch alternative Methoden zu ersetzen.Um dieses erreichen zu können, wurdeumfangreiche relevante Literatur, dieneuere immunologische und chemisch-analytische Methoden beschreibt, stu-diert sowie selbständige Ideen aufgrundeigener Erfahrung auf chemisch-analyti-schem Gebiet generiert.Im Hinblick auf die Anwendung von

sicherheitsrelevanten Tests, insbesondereder Test auf anomale Toxizität, interes-sierte die Frage, wie häufig Chargenallein aufgrund der Ergebnisse aus denBioassays verworfen werden mussten.Den Befragten war natürlich zuge-

sichert worden, ihre Angaben vertraulichzu behandeln.Schließlich hat die Europäische

Arzneibuchbehörde (EDQM) auf Anfra-ge von SET über die derzeit laufendenAktivitäten zum Ersatz von Tierver-suchen informiert. Die im Folgendendargestellten Ergebnisse geben den

Tab. 1: In den Monographien für folgende Substanzen ist zur Zeit noch eine Quantifizierung des Wirkstoffgehaltes mit einemBioassay (Tierversuch) vorgesehen:

Monographie Bioassay

HPLC (wird z.Zt. geprüft)mögliche Ersatzmethode

Tetracosactid* Kortikosteroid-Biosynthese in Nebennierenzellen von Ratten

Lypressin* Anstieg des Blutdrucks bei narkotisierten Ratten HPLC

Glukagon*

Erythropoietin**

Quantitative Bestimmung des hyperglykämischen Effekts inKaninchen (Glukosekonzentration im Blut)

HPLC

Einbau von Eisen in Erythrozyten polyzythämischer Mäuseoder Anstieg der Retikulozyten normozythämischer Mäuse

CZE Isoformen'" (wird z.Zt. geprüft)

Choriogonadotropin" Gewichtszunahme der Samenbläschen junger männl. Ratten CZE Isoformen***

Urofollitropin**

Test an embryonalen Herzmuskelzellen (Küken)

Gewichtszunahme der Ovarien jugendlicher weiblicher Ratten

Digitalisglykosid Infusion der Testpräparate in Meerschweinchen bis zumHerzstillstand

CZE Isoformen***

Bei allen Bioassays werden mehrere Dosen bzw Konzentrationen Prüfchargen gegen einen vorgegebenen Standard getestet, dessen Biopotenz bekannt ist., Peptide ohne Glykosilierung im Molekül., Peptide mit Glykosilierungen im Molekül

••, CZE Isoformen: Prädiktionsmodelle mittels potency der Isoformen in der capil/ary zone electrophoresis (siehe auch Miethe, 2002)

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Stand vom September 2001 wieder. DieRücklaufquote betrug nach mehreren Er-innerungsaktionen schließlich ca. 65%.

3 Bioassays im Rahmen derquantitativen Bestimmung derWirkung von Peptiden undherzwirksamen Glykosiden

In den Monographien sind für die inTabelle 1 aufgeführten Substanzen eineQuantifizierung des Wirkstoffgehaltes derChargen mittels Bioassays vorgesehen.Die Produktion von Peptiden kann

durch Vollsynthese oder durch gentech-nologische Verfahren erfolgen. Dabeikönnen Verunreinigungen und, besondersbei rekombinanter DNA- Technologie,Variationen entstehen, die den Wirkge-halt quantitativ beeinflussen können.Dies soll durch Bioassays erkannt wer-den. In vielen Fällen ist es bisher heutenicht möglich, den Wirkstoffgehalt derproduzierten Charge selbst mit moderns-ten physiko-chemischen Methoden exaktanzugeben.Ein Teil der Bioassays beinhaltet in

vitroMethoden, andere in vivo Methoden.Für Tetracosactid, den 24 Aminosäurenenthaltenden wirksamen Teil von Corti-cotropin, wird ein Bioassay angegeben,bei dem an Ratten-Nebennieren-Zellendie konzentrations abhängige Corticoid-Biosynthese durch die Testsubstanz imVergleich zu einem Standard quantitativgemessen wird. Offensichtlich wirdTetracosactid vollsynthetisch hergestellt,sodass der Bioassay durch die bei gen-technologischen Verfahren möglichenHeterogenität nicht begründet werdenkann. Unter Anwendung einer geeigne-ten HPLC-Technologie (Storring et al.,1984; Inouye et al., 1985) sollte es mög-lich sein, nicht nur die Identität, sondernauch den quantitativen Gehalt exakt zuerfassen, sodass nach unserer Ansicht aufden Bioassay verzichtet werden könnte.In der Tat laufen hierzu bereits Diskus-sionen bei einer EDQM-Expertengruppe.Lypressin ist ein Peptid, bestehend aus

neun Aminosäuren. Es ist mit Vasopres-sin und Oxytocin verwandt. Es wird syn-thetisch hergestellt. Die biologischeWertbestimmung erfolgt laut Mono-graphie über seine blutdrucksteigemdeWirkung an narkotisierten Ratten. Auch

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hier ist stattdessen eine chromatographi-sehe Bestimmung (HPLC) auf Identitätund Reinheit denkbar (Maxi und Siehr,1989; Krummen und Frei, 1977; Rao etal., 1991; Buck et al., 1991). Es gibtHinweise darauf, dass in den produzie-renden Firmen bereits solche Verfahrenpraktiziert werden. Inwieweit dieseanalytischen Methoden bereits lege artisgegen den Bioassay validiert wordensind, konnte nicht eruiert werden. DieEDQM ist offensichtlich noch nichtdamit befasst, diesen Bioassay durchandere Methoden zu ersetzen. Dies er-scheint aber sehr empfehlenswert, zumalin der US Pharmacopoeia bereits 2000der Bioassay durch eine HPLC-Methodeersetzt worden ist (USP, 2000).Glucagon ist ein Peptid aus 29

Aminosäuren, das durch Isolierung ausbiologischem Material oder durchVoll synthese und schließlich durchgentechnologische Verfahren gewonnenwerden kann. Die letztere Methodegewinnt offenbar zunehmend an Be-deutung. Der in den Monographienbeschriebene Bioassay sieht die Be-stimmung der hyperglykämischen Wir-kung an Kaninchen vor. Eine HPLC-Methode zur Prüfung auf Identität undReinheit ist nicht vorgeschrieben. Im-merhin ist aber eine HPLC-Methode zurBestimmung von Glucagon publiziert(O'Hare and Nice, 1979). Selbstver-ständlich wäre eine HPLC-Methodenicht nur im Sinne der 3R-Konzeptionvorzuziehen, sondern auch deshalb,weil sie eine zusätzliche Überprüfungauf Reinheit ermöglichen könnte. Aller-dings müssten gegebenenfalls bei derProduktion entstehende Nebenproduktemit biologischer Wirkung in die Kalku-lation einbezogen werden. Ergänzendsollten auch Aussagen über die Zusam-mensetzung/ Aminosäurensequenz unddamit über ihre Identität mit modernenMassenspektrometriemethoden gemachtwerden. Für den Fall der Neufassungder Monographie für gentechnologischhergestelltes Glucagon durch dieEDQM sollte jedenfalls auch die Fragedes Bioassays einer kritischen Neube-wertung unterzogen werden.Der Ersatz der Bioassays, die zur

Bestimmung der biologischen Wirkungvon Glykoproteinen benutzt werden,gestaltet sich weitaus schwieriger.

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Glykoproteine sind aus Isoformen mitunterschiedlichem Glykosilierungsgradund Sialinsäuregehalt zusammengesetzt.Die einzelnen Isoformen besitzen inAbhängigkeit von ihrer Struktur unter-schiedliche Biopotenz (Wirksamkeit undNebenwirkungen), im Wesentlichen auf-grund unterschiedlicher pharmakokineti-scher Kriterien. Die Heterogenität kannzu unterschiedlichen Wirkstärken derproduzierten Chargen in Abhängigkeitihrer Isoformenmuster führen. Zwareröffnen gentechnologische Verfahren imVergleich zur Gewinnung aus biologi-schem Material eine homogenere Pro-duktion, aber gewisse Variationen müs-sen weiterhin in Kauf genommenwerden. Als Beispiel sei hier Erythro-poietin vorgestellt. Es ist ein Glykopro-tein (MG ca. 30.000) mit schwankendemKohlehydratanteil (Hirth et al., 1988). Eswird gentechnologisch hergestellt, wo-durch ein sehr gut definiertes Produkterhalten wird. Im Arzneibuch sind zurBestimmung der Identität und Reinheitdie isoelektrische Fokussierung vorge-schrieben, allerdings ist deren Ersatzdurch Kapillarzonen-Elektrophorese(CZE) in Diskussion. Damit wird eine ef-fiziente Auftrennung und Quantifizierungder Isoformen möglich (Bristow andCharton, 1999; Watson and Yao, 1993;Takeuchi et al., 1989). Die Chargen-prüfung auf Biopotenz für die Rohwareund für die fertige Formulierung erfolgtmittels eines Bioassays, bei dem an poly-zythämischen oder normozythämischenMäusen der dosis abhängige Eiseneinbauin die Erythrozyten oder die Retikulo-zyten-Bildung im Vergleich zu einemStandard bestimmt wird. Die Möglich-keit, diesen Bioassay durch andereMethoden zu ersetzen, besteht darin, eineKorrelation zwischen den erhaltenenIsoformenmuster und der biologischenWirkung zu errechnen. Daraus ließe sichdann ein Prädiktionsmodell ableiten.Solche Möglichkeiten werden offenbarin industriellen und behördlichen Fach-kreisen ausgelotet, also experimentellbearbeitet und diskutiert. Eine behördli-che Akzeptanz und Aufnahme einerneuen Methode in die Monographie derArzneibücher steht allerdings aus, solangeUntersuchungen im Rahmen der Validie-rung noch nicht abgeschlossen sind. Im-merhin könnte das Vorgehen bei Erythro-

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poietin als Beispiel für andere Glyko-proteine herangezogen werden, bei de-nen die Probleme ähnlich gelagert sind.Das trifft zum Beispiel für Urofollitropinund die Gonadotropine zu, die zurzeitnoch - wenigstens überwiegend - ausbiologischem Material gewonnen wer-den und bei denen in Bioassays die Mas-senzunahme der Samenblase von juveni-len männlichen bzw. der Ovarien vonjuvenilen weiblichen Ratten bestimmtwird. Auch hier sollte es möglich wer-den, die Wirkstoffe durch gentechnologi-sche Verfahren zu produzieren. DurchEinsatz moderner analytischer Methodenkönnte dann ebenfalls eine Bestimmungeiner Korrelation zwischen den Isofor-men und der biologischen Wirksamkeitmöglich werden, woraus ebenfalls durcheinen Algorithmus ein Prädiktionsmodellentstehen könnte. Der endgültige Ersatzder Bioassays durch modeme analytischeMethoden kann selbstverständlich erstdann erfolgen, wenn eine behördlicheAkzeptanz erreicht wird, welche dieTauglichkeit der Methode und die inten-sive Validierung gegenüber dem bisheri-gen Verfahren beinhaltet.Monographien für herzwirksame Dro-

genextrakte aus verschiedenen Pflanzen(Adonis vernalis, Digitalis purpurea,Convallaria majalis und Urginea mariti-ma) finden sich nur im deutschen Arznei-buch, nicht jedoch in der EuropäischenPharmacopoiea. Im Gegensatz zu denReinglykosiden (z.B. Digoxin mitseinen Derivaten) wird die Wirkwert-bestimmung bei den Extrakten gemäßMonographie mittels Bioassay am Meer-schweinchen durchgeführt, wobei dieKardiotoxizität als Kriterium gilt. Ob einbeschriebener in vitro Assay (Lehmannet al., 1993) sich als Alternative eignetoder lediglich die Validierung noch nichtabgeschlossen ist, die eine Vorausset-zung für den Einsatz in der Qualitätskon-trolle darstellt, konnte nicht in Erfahrunggebracht werden. Wünschenswert wärees, den Tierversuch durch eine schonen-dere Methode abzulösen.

4 Bioassays als Sicherheitstests

Als Prüfung auf Verunreinigungen fürChargen von biologisch gewonnenenArzneimitteln werden in den Monogra-

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phien der Arzneibücher folgende Testsgenannt:

• Prüfung auf anomale Toxizität• Prüfung auf Histamin•Prüfung auf blutdrucksenkendeSubstanzen

Die Prüfungen haben ihren Ursprungvor ca. 50 Jahren und leiten ihre Sinn-fälligkeit aus Risiken her, als man dieProzesse der Gewinnung von Wirkstof-fen aus biologischem Material noch nichtso gut beherrschte wie heute und gen-technologische Verfahren noch nicht mitden technologischen Möglichkeiten wieheute existierten. Daraus ergaben sichfrüher immer wieder Verunreinigungenbei der Produktion von Wirkstoffen ausbiologischem Material, die für denPatienten Nebenwirkungen und Risikenmit sich brachten. Heutzutage kann dasVorkommen von Verunreinigungendurch den inzwischen eingetretenenFortschritt in der Technologie einschließ-lich verbesserter Verfahren zur Aufreini-gung der gewonnenen Materialien sowiedurch die Festlegung und Einhaltung vonGMP (Good Manufacturing Practice)-Standards weitgehend ausgeschlossenwerden (Ronneberger, 1993; Spielmannet al., 1998; Schwanig et al., 1997).Für viele Substanzen, insbesondere für

Sera und Vakzine ist die Prüfung aufanomale Toxizität in den letzten Jahrenaus den Monographien gestrichen wor-den (Stöcker, 1996; BMBF-Publikation,2001). Die Prüfung bleibt allerdings wei-terhin uneingeschränkt vorgeschriebenfür Griseofulvin, Streptokinase und fürAllergenzubereitungen aus Schimmel-pilzen. Für Aprotinin und deren Lösung,Kanamycinsulfat, Nystatin, Protamin(als Sulfat oder Hydrochlorid), Strep-tomycin und Dihydrostreptomycin wur-de der Test in den Abschnitt Produktionverlegt, sodass bei Nachweis eines ent-sprechend validierten Herstellungsver-fahrens, den der Hersteller gegenüber derBehörde zu erbringen hat, auf den Testverzichtet werden kann.Wie viele Tests auf anomale Toxizität

im Rahmen der Produktion dieser Wirk-stoffe tatsächlich noch durchgeführtwerden, konnte nicht exakt in Erfahrunggebracht werden. Auch konnte aufgrundunvollständigen Rücklaufes der Frage-

bogen von den Herstellern der betreffen-den Arzneimittel nicht eindeutig geklärtwerden, wie oft allein aufgrund der Prü-fung auf anomale Toxizität Produktions-chargen auffällig geworden sind oder garverworfen werden mussten. Die erhalte-nen Antworten deuten aber an, dass eineBeanstandung der Chargen nur aufgrundder Befunde dieses Testes - wenn über-haupt - wohl äußerst selten vorkommt.Darüber hinaus ist die Anzahl der positi-ven Testergebnisse äußerst selten unddiese werden fast nie im Wiederholungs-test bestätigt. Es gibt Hinweise darauf,dass der Test von den Produzenten derbetreffenden Arzneimitteln nicht mehrfür sinnvoll angesehen wird, er abertrotzdem weiterhin durchgeführt wird,um die Anforderungen an die Sicher-heitskriterien in allen Ländern erfüllenzu können.Die Prüfung auf Histamin ist bei den

Wirkstoffen in den Monographien vorge-sehen, die aus Histidin- oder Histamin-reichen Geweben gewonnen werden.Dies trifft für Aprotinin, Trypsin undChymotrypsin zu. Seit 2001 ist der Testin den Abschnitt "Produktion" überführtworden. Das bedeutet, wie zuvor bei der"anomalen Toxizität" beschrieben, dassauf den Test verzichtet werden kann,wenn ein validiertes, behördlich akzep-tiertes Herstellungsverfahren genutztwird. Dies muss die Verunreinigung mitHistamin ausschließen bzw. begrenzenoder ein Verfahren enthalten, bei dem dieVerunreinigung erkannt wird. Der Testselbst wird als ex vivo Untersuchung amisolierten Meerschweinchen-Darm durch-geführt. Dabei wird auf konzentrations-abhängige glatt-muskuläre Kontraktionder Prüfchargen im Vergleich zu einemHistamin-Standard geprüft. Anzumerkenist, dass dieser Test keineswegs Hista-min-spezifisch ist. Für den Fall, dass dieUntersuchung unklare Ergebnisse liefert(z.B. ungenügende Konzentrations-Wirkungs-Beziehung des Standards),muss der Test auf blutdrucksenkendeVerunreinigungen an der narkotisiertenKatze durchgefühlt werden, der auf dieEntdeckung von biogenen Aminen,einschließlich Histamin, als Verunreini-gungen ausgelegt ist. Diese Prüfung warin den Monographien generell für Hepa-rine, Kanamycin und Streptomycin vor-geschrieben und ist mittlerweile eben-

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falls in den Abschnitt "Produktion" über-führt worden mit den oben beschriebe-nen Auflagen.Die Antworten auf die Befragung der

Hersteller hat ergeben, dass beide Testsnoch durchgeführt werden. Andererseitssind Beanstandungen von Chargen, wennsie überhaupt vorkommen, extrem selten.Dies ist durch die Einführung von" GoodManufacturing Practice" (GMP) undderen zwingende Einhaltung durch dieHersteller pharmazeutischer Produkteauch nicht überraschend. Es fragt sichdaher, ob die Bioassays aus heutigerSicht noch befürwortet werden können,zumal sie keineswegs als spezifischangesehen werden können. Immerhinwird in der Lebensmittelchemie aufSpuren von Fremdstoffen analysiert,wobei Histamin mittels Kapillarzonen-Elektrophorese (CZE) oder HPLC inKombination mit Fluoreszenz- oder UV-Detektion in äußerst niedrigen Konzen-trationen nachgewiesen werden kann.Auch andere spezifische und sensitiveimmunologische Techniken könnten sichfür die Chargenprüfungen eignen(Stockemer, 1982; Busto et al., 1994;Liao et al. , 1999; Mahendradatta et al. ,1996; Serrar et al., 1995; Aygün et al. ,1999; Draisci et al., 1998; Thomas undWittmann, 2000). In eigenen Untersu-chungen ist gezeigt worden, dass mittelsCZE Histamin und Trypsin voneinanderabgetrennt und in Konzentrationendetektiert werden können, die den Anfor-derungen der Monographien entsprechen(Miethe und Surmann, 2001). Ähnlichesließe sich sicher auch für die anderenbiogenen Amine erarbeiten. Darausergibt sich, dass ein Ersatz der Tests aufHistamin und blutdrucksenkende Sub-stanzen wissenschaftlich und technischmöglich erscheint und durch die her-stellenden Firmen im Verbund mit dennationalen und internationalen Zulas-sungsbehörden und Arzneibuch-Kom-missionen angestrebt werden sollte.

5 Diskussion

In dem Problemkreis Tierversuche imRahmen der Qualitätssicherung von Arz-neimitteln biologischen Ursprungs sindsowohl die Sicherheit der Anwendungals auch tierschutzrelevante Überlegun-

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gen einzubeziehen. Es ist einleuchtend,dass aus ethischen und juristischenGründen dem erstgenannten Aspekthöhere Priorität einzuräumen ist. Dies istinsbesondere dann unabweislich, wennes keine Alternative gibt, welche diegleiche Sicherheit für den Patientengewährleistet. Andererseits ist zu beden-ken, dass die Einführung und diebehördlich überwachte Einhaltung vonRegeln des GMP die Qualität und dieKonsistenz der Produktion entscheidendverbessert haben, sodass sich allein dar-aus neue Überlegungen ergeben können.Neuere technologische Möglichkeitenbei der Produktion von biologischgewonnenen Arzneimitteln und in denphysikalisch-chemischen Analyseme-thoden können in jedem EinzelfallAnlass geben, die Sinnfälligkeit der Bio-assays zu überprüfen.Tatsächlich ist die Anzahl der biologi-

schen Tests, die für die Qualitätssiche-rung biologisch gewonnener Arzneimit-tel eingesetzt werden, in den letztenJahren zurückgegangen. Bioassays wer-den jedoch noch weiterhin durchgeführt,soweit sie in den Monographien derArzneibücher erwähnt sind. Dies habenauch unsere eigenen Recherchen erge-ben. Welche konkreten Auswirkungenaber zum Beispiel die Verlegung vonbestimmten Bioassays in den Abschnitt"Produktion" hatte, ließ sich nicht mitgenügender Genauigkeit aus Antwortenunserer Befragungen ermitteln. Über-haupt war der Rücklauf von den Herstel-lern zu unseren Anfragen nicht soerschöpfend, wie wir uns dies erhoffthatten. Dadurch mag manche Aussage -zum Beispiel hinsichtlich der Häufigkeitder noch durchgeführten Bioassays fürdie Sicherheitsuntersuchung - etwas ein-geschränkt sein. Andererseits konntendoch klare Tendenzen erkannt werden.Die Tatsache, dass unsere Anfragenmanchmal überhaupt nicht oder rechtzögerlich - zum Beispiel nach mehr-maligem Anschreiben oder Rückfragen- beantwortet wurden, kann mehrereGründe haben. Man muss sich darüberim Klaren sein, dass eine nicht-behördli-che Anfrage unsanktioniert ohneResonanz bleiben oder ausweichendbeantwortet werden kann. Obwohl Ver-traulichkeit zugesichert war, mögenmanche Hersteller Anfragen mit Miss-

trauen begegnet sein, weil die Firmenmöglicherweise unkalkulierbare Auswir-kungen befürchteten. Auffallend war je-denfalls, dass manche Firma, welche diebetreffenden Arzneimittel (produziertund) vertreibt, zunächst nicht korrekt er-klärte, dass in ihrem Unternehmen keineBioassays oder Tierversuche im Rahmender Qualitätssicherung durchgeführtwürden. Es mag sein, dass die Antwortennicht immer dem Stand der Dinge ent-sprachen, weil die Produktion und derenKontrollinstrumente an verschiedenenStandorten lokalisiert sein können oderdurch Auftragsvergabe an andere Dienst-leister die Gesamtsituation nicht über-sehen werden konnte. Diverse Gesprächehaben allerdings manches klarer werdenlassen. Man könnte erwarten, dass einebehördliche Anfrage mehr erschöpfendund repräsentative Antworten ergebenwürde, zum Beispiel in welchem Um-fang noch Bioassays auf anomale Toxi-zität, Histamin und/oder blutdrucksen-kende Substanzen durchgeführt werden,nachdem diese Tests weitgehend in dieAbteilung "Produktion" der Monogra-phie verlagert worden sind. Auch könnteerwartet werden, dass durch solcheoffiziellen Anfragen eindeutigere Ant-worten zu erlangen sind, ob allein durchden Bioassay Verunreinigungen in denProduktionschargen identifiziert werdenkonnten.Der Ersatz von Bioassays stellt ein

komplexes Thema dar, bei welchem eineReihe von Aspekten zu berücksichtigensind, unter anderem ethische und juristi-sche, die sich durchaus nicht immergleichsinnig auswirken. Zudem sindmehrere Parteien involviert, nämlich dieHersteller pharmazeutischer Produkte,Zulassungs behörden und diverse Kom-missionen, zum Beispiel diejenigen,welche für die Verfassung der Monogra-phien in den Arzneibüchern zuständigsind. Dabei stellt sich die Frage, welcheInstitution die Initiative ergreifen sollte.Möglicherweise wird eher auf Bioassaysverzichtet werden, wenn die Initiativehierzu von behördlichen Stellen oder vonden Kommissionen ausgeht, als von denHerstellern pharmazeutischer Produkte.Die entsprechenden Aktivitäten müssendann aber in eine konzertierte Aktionaller beteiligten Institutionen münden,um Konsens von allen Seiten zu erhalten.

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MIETHE UND SPONER

Ein Erfolg im Sinne einer Reduzierungvon Tierversuchen im Rahmen derQualitätskontrolle kann zudem nurerwartet werden, wenn für die betreffen-den Wirkstoffe neue, international akzep-tierte, Prüfmethoden gefunden werden.Durch Kontakte, die sich im Rahmen

unserer Recherchen ergeben haben, istuns bewusst geworden, dass zwar in eini-gen Fällen das Beharren auf geltendenRegelungen nicht zu unterschätzen ist,weil möglicherweise jede angestrebteVeränderung gerade in dem komplexenUmfeld schwierig zu erreichen ist undzumindest am Anfang einer solchenAktivität der Erfolg nicht sicher voraus-zusehen ist. Andererseits gibt es bei allenbeteiligten Institutionen Personen, dieVerständnis dafür haben, Bioassays ab-zulösen, und die sogar aktiv an diesemProblem arbeiten. Sicher wird ein Ver-zicht auf Bioassays nur zu erreichen sein,soweit dieser wissenschaftlich vertretbarist und die Bioassays dann aus denMonographien der Arzneibücher - undzwar international - gestrichen werden.Durch den Handel von Produkten übernationale Grenzen hinweg, würden natio-nale Alleingänge nur begrenzten Erfolghaben, deswegen müssen internationalakzeptierte Regelungen gefunden wer-den. Aus diesem Grund wäre der Pro-blemkreis durchaus ein Thema, welchesdie International Conference on Harmo-nization (ICH) aufgreifen könnte.

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DanksagungDie Autoren bedanken sich für mannig-faltige Hilfe und Unterstützung, die sieim Rahmen der beschriebenen Unter-suchungen erfahren haben bei Prof. H.Spielmann, Dr. B. Grune-Wolff, A.Dörendahl, S. Skolik (alle ZEBET);Dr. E. Charton, Dr. A. Artiges (alleEDQM); der Abteilung Biotechnologieder Roche Diagnostics GmbH, Penzberg,diversen pharmazeutischen Firmen sowieM. Hillenbrand (Verband der Chemi-schen Industrie) und Dr. A. Schlitt (SET).

KorrespondenzadresseProf. Dr. Gisbert Sponerc/o Stiftung SETKaiserstraße 60D-55116 MainzTel.: +49-6131-237789Fax: +41-6131-235698http://www.tierversuche-ersatz.de/ho-me.html