DIEGO PULZATTO CURY

DIEGO PULZATTO CURY

Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de

ratos Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico

eletrônico de varredura e de transmissão

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento:

Cirurgia

Área de concentração:

Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres

Orientador:

Prof. Dr. Ii-sei Watanabe

São Paulo

2013

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2909 Cury, Diego Pulzatto FMVZ Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de ratos

Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico eletrônico de varredura e de transmissão / Diego Pulzatto Cury. -- 2013.

108 f. : il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, São Paulo, 2013.

Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.

Orientador: Prof. Dr. Ii-sei Watanabe. 1. Junção osteotendínea. 2. Ultraestrutura. 3. Fibras colágenas. 4. Envelhecimento.

5. Ratos. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Autor: CURY, Diego Pulzatto

Título: Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps

sural de ratos Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz,

microscópico eletrônico de varredura e de transmissão

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Anatomia dos Animais

Domésticos e Silvestres da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Mestre em Ciências

Data: ____/____/_____

Banca Examinadora

Prof. Dr.: ___________________________________________________________

Instituição: ______________________________ Julgamento: _________________

Prof. Dr.: ___________________________________________________________


Prof. Dr.: ___________________________________________________________


Ao meu avô Severino Pulzatto in memoriam.

Meus pais, minha avó e minha irmã.

Vocês são minha base, a força que me conduz na realização dos meus sonhos.

Amo vocês!

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me dado uma perfeita saúde para que mais uma etapa

de minha vida pudesse ser concluída.

Aos meus pais José Mariano Cury Junior e Ivanda Pulzatto Cury pela

compreensão, por todo o apoio, conselhos e incentivos, pelo imensurável amor e

carinho. A minha irmã Nathália Pulzatto Cury que sempre me apoiou, a minha amada

avó Conceição Alves Pulzatto pelo amor e carinho, que mesmo pedindo (sempre) para

eu voltar, soube entender a importância da minha ida para São Paulo, ao meu avô

Severino Pulzatto, onde quer que ele possa estar acredito que deve estar orgulhoso

neste momento.

A minha tia Roseli Aparecida Pulzatto de Oliveira que me incentivou, ajudou e

aconselhou, sou incapaz de demonstrar como sou grato.

Ao mestre e amigo Prof. Dr. Ii-sei Watanabe, agradeço pela oportunidade e

confiança em mim depositado, por ter me dado a honra de ser seu orientando, por

estar comigo na bancada ensinando as minúcias das trabalhosas técnicas de

microscopias eletrônicas, por todos os incentivos, pelo respeito, pelo exemplo de

conduta moral e pelo profissionalismo com o qual exerce a profissão.

Ao eterno mestre, amigo e maior incentivador para que eu embarcasse nessa

aventura de pós-graduação stricto sensu, Prof. Dr. Miguel Carlos Madeira, agradeço

por todos os incentivos, conselhos, pela oportunidade de trabalharmos juntos em

aulas teóricas e práticas, pelos feedbacks após as aulas, pelo exemplo de paixão a

profissão, por me ajudar e ainda continuar contribuindo para que eu me torne um

profissional de excelência.

Ao Prof. Dr. Jackson Cioni Bittencourt por me autorizar utilizar seu laboratório

para a obtenção das imagens de microscopia de luz.

Ao programa de pós-graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e

Silvestres, em nome de sua coordenadora Profa. Dra. Maria Angélica Miglino e a cada

um dos professores.

Ao Prof. Dr. Richard Halti Cabral e a Profa. Dra. Renata Frazão pela supervisão

e oportunidade de participar do Programa de Aperfeiçoamento de Ensino nos cursos

de medicina e odontologia da USP, respectivamente, contribuindo em minha formação

como docente.

A Profa. Dra. Maria Inês Nogueira por toda ajuda, atenção e pela amizade.

Ao amigo José Ari Gualberto Junqueira, por todos os ensinamentos teóricos e

práticos de anatomia, pelo incentivo, pela amizade, as imagens anatômicas que me

envia por e-mail e que deixa outros profissionais de boca aberta e me perguntando

onde as consigo, pelo exemplo de profissionalismo, respeito aos cadáveres e ética na

profissão.

Aos técnicos e amigos do Laboratório Multiusuário de Histologia e Microscopia

Eletrônica do Instituto de Ciências Biomédicas III da USP, Marta Maria da Silva

Righetti, Sônia Regina Yokomizo de Almeida, Kelly Patrícia Nery Borges e Sebastião

Aparecido Boleta, pela amizade, competência e disponibilidade demonstrados

durante o desenvolvimento deste trabalho.

Ao técnico de microscopia eletrônica de transmissão Edson Rocha de Oliveira

do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do ICB I/USP e o técnico

de microscopia eletrônica de varredura Alfredo Duarte da Central Analítica do Instituto

de Química da USP.

Ao meu primo Thiago Pulzatto de Oliveira que me deu um teto para morar assim

que cheguei em São Paulo, por toda a ajuda, por me apresentar os amigos Clayton

Pereira de Oliveira e Júlio César Feltrim Câmara com os quais divido apartamento,

por todos os momentos, por se tornarem minha família aqui em São Paulo.

Aos amigos do laboratório de Ultraestrutura das Células e Tecidos, Fernando

José Dias, Carlos Alexandre Haemmerle e Adriano Polican Ciena pela parceria, pelas

ajudas, pelos momentos de divertimento e por contribuírem com a execução deste

trabalho, sem vocês isso seria muito mais difícil.

Aos amigos do laboratório de neuroanatomia química, em especial a Joelcimar

Silva e a Daniella Batagello, conterrânea de Birigui, a primeira pessoa que encontrei

no departamento de anatomia do ICB III/USP, agradeço por toda ajuda, pela amizade

sincera, pelos conselhos.

Aos amigos do departamento de anatomia do ICB III/USP: Silvia Honda, Leila

Campos, Mike Hamasaki, Vitor Lee, Vanessa Lima, Miguel Lima, Ivson da Silva, e aos

amigos do departamento de cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia da USP: Cristiane Cagnoni, Eduardo Malavasi, Mariana Póvoa, Bárbara

Schäfer e Maria Brito que de uma forma ou de outra contribuíram para a conclusão

deste trabalho.

As instituições de fomento, CAPES e especialmente a FAPESP, por terem

concedido auxílio financeiro, o qual permitiu o desenvolvimento deste estudo.

Sabendo que a pratica de exercício é indispensável para benefícios tanto

físicos quanto mentais, agradeço aos amigos do time de futebol americano São Paulo

Saints, esporte que escolhi praticar em São Paulo e que tanto gosto, pela

compreensão por todas as vezes que precisei faltar aos treinos e jogos, pela amizade

e pela oportunidade de poder fazer parte deste time.

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho

original”.

Albert Einstein

“Estudo com paixão a anatomia, porque o homem é o modelo do mundo”.

Leonardo da Vinci

RESUMO

CURY, D. P. Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de ratos Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico eletrônico de varredura e de transmissão. [Structural characteristics of the bone-tendon junction of triceps surae muscle of the adult and old Wistar rats: light microscope, scanning electron microscope and transmission electron microscope study]. 2013. 108f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013.

Os tendões são tecidos de transição das forças contráteis geradas pelos músculos e

as transferindo para os ossos, podendo assim gerar movimento. A região em que o

tecido tendíneo se insere ao ósseo é chamada de junção osteotendínea ou entese.

Estas junções podem ser classificadas como fibrosas ou fibrocartilaginosas, as

fibrosas são aquelas em que os tendões e/ou ligamentos se inserem no eixo (diáfise)

dos ossos longos e as fibrocartilaginosas a inserção ocorre nas epífises dos ossos

longos ou nos ossos curtos. Este estudo tem como propósito analisar as fibras

colágenas e as células presentes na junção osteotendínea, utilizando microscopia de

luz com as colorações de Hematoxilina-eosina, Azocarmim, Picro-sírius e Tricromo de

Masson e os aspectos ultraestruturais empregando os métodos de microscopia

eletrônica de varredura e de transmissão. Foram utilizados 30 ratos Wistar machos,

sendo 15 adultos com idade de 4 meses (grupo A) e 15 idosos com idade de 18 meses

(grupo B), sendo utilizados 5 ratos de cada grupo para microscopia de luz, 5 para

microscopia eletrônica de varredura e 5 para microscopia eletrônica de transmissão.

Os membros posteriores dos ratos foram retirados, dissecados e desmineralizados

com EDTA a 7% para microscopia de luz e EDTA 0,15M pH 7,4 para microscopia

eletrônica de transmissão durante 4 semanas, não foi necessário desmineralizar as

amostras para microscopia eletrônica de varredura. Cortes de 6 µm foram realizados

e montados em lâminas histológicas para análise em microscópio de luz, a técnica de

criofratura em nitrogênio líquido foi realizada para análises em microscópio eletrônico

de varredura e cortes de 60 nm foram realizados, montados em telas de cobre de 200

“mesh” (EMS) para análises em microscópio eletrônico de transmissão. O processo

de envelhecimento mostrou alterações das fibrilas colágenas, em que o tipo I

predomina no grupo adulto e o tipo III no idoso, diminuição na quantidade de células

de fibrocartilagem, processos citoplasmáticos destas células curtos e em número

reduzido e uma diminuída capacidade de síntese devido a aparelhos de Golgi

menores, poucas cisternas de retículo endoplasmático granular e escassas

mitocôndrias.

Palavras-chave: Junção Osteotendínea. Ultraestrutura. Fibras Colágenas.

Envelhecimento. Ratos.

ABSTRACT

CURY, D. P. Structural characteristics of the bone-tendon junction of triceps

surae muscle of the adult and old Wistar rats: Light microscope, scanning

electron microscope and transmission electron microscope study.

[Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de ratos

Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico eletrônico de

varredura e de transmissão]. 2013. 108f. Dissertação (Mestrado em Ciências) –

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São

Paulo, 2013.

Tendons are transition tissues of contractile forces generated by muscles and

transferring to bone, generating this way move. The region where tendon attach to

bone is called bone-tendon junction or enthesis. These junctions can be classified as

fibrous or fibrocartilaginous, the fibrous are those in which tendons/ligaments are

attached in the shaft (diaphysis) of the long bones and fibrocartilaginous attachment

occur in the epiphyses of the long bones or short bones. This study aims to analyze

collagen fibers and the cells present in the bone-tendon junction, using light

microscope with Hematoxylin–eosin, Azocarmine, Picrosirius red and Masson's

trichrome staining and ultrastructural aspects using scanning electron microscope,

transmission electron microscope methods. Thirty male Wistar rats were using, 15

adults rats at 4 months-old (A group) and 15 old rats at 18 months-old (B group), were

used 5 rats of each group to light microscopy, 5 rats to scanning electron microscopy

and 5 rats to transmission electron microscopy. The hind limbs of the rats were

removed, dissected and demineralized using 7% EDTA solution to light microscopy

and 0,15M pH 7,4 EDTA solution to transmission electron microscopy for 4 weeks, was

not necessary demineralize the samples to scanning electron microscopy. Cut in slices

6 µm thickness were made and mounted on histological slides to analyze in light

microscope, freeze-fracture technique with liquid nitrogen was performed to analysis

in scanning electron microscope and cuts in slices 60 nm thickness were made,

mounted on copper grids (200-mesh - EMS) to analysis in transmission electron

microscope. The aging process showed changes of the collagen fibrils, in which type I

predominates on adult groups and the type III on the old group, decrease in the amount

of the fibrocartilage cells, few and short cytoplasmic processes of this cells and a

decreased synthesis capacity due a small Golgi apparatus, a few cisternae of rough

endoplasmatic reticulum and few mitochondria.

Keywords: Bone-tendon Junction. Ultrastructure. Collagen Fibers. Aging. Rats.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µm Micrômetro

FM Fibrocartilagem Mineralizada

FnM Fibrocartilagem não Mineralizada

GPa Gigapascal - Pascal é a unidade padrão de pressão e tensão no

Sistema Internacional de Unidades, equivale a força de 1 Newton

aplicada uniformemente sobre uma superfície de 1 m2, gigapascal

corresponde a 109

ME Microscopia Eletrônica / Microscópio Eletrônico

MEC Matriz Extracelular

MET Microscopia Eletrônica de Transmissão

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

min Minutos

ML Microscopia de Luz

ml Mililitros

mm Milímetros

MPa Megapascal (corresponde a 106)

nm Nanômetros

wt% Porcentagem por peso (weight %)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 18

2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 21

2.1 SISTEMA LOCOMOTOR: MÚSCULO ......................................................... 21

2.2 MÚSCULO TRÍCEPS SURAL ...................................................................... 21

2.3 TENDÃO CALCÂNEO .................................................................................. 22

2.4 JUNÇÃO OSTEOTENDÍNEA – ENTESE ..................................................... 24

2.5 TECIDO ÓSSEO .......................................................................................... 25

2.6 ENVELHECIMENTO .................................................................................... 27

3 PROPOSIÇÃO ................................................................................................... 30

4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32

4.1 MICROSCOPIA DE LUZ .............................................................................. 32

4.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA....................................... 33

4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO ................................... 34

4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ......................................................................... 35

5 RESULTADOS ................................................................................................... 40

5.1 MICROSCOPIA DE LUZ DOS GRUPOS ADULTO E IDOSO ..................... 40

5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO ADULTO ... 55

5.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO IDOSO ...... 64

5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO ADULTO

74

5.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO IDOSO .. 80

5.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ......................................................................... 87

6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 93

7 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 99

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 101

INTRODUÇÃO

18

1 INTRODUÇÃO

Tendões são tipicamente descritos como tecido conjuntivo fibroso denso que

inserem os músculos aos ossos. Eles possuem relativamente poucas células, mas

grande número de fibras colágenas que dão a eles forças tensíveis extremamente

altas (BENJAMIN; RALPHS, 2000).

Os tendões são revestidos externamente por tecido conjuntivo areolar frouxo

denominado paratendão, este tecido é forrado em sua superfície interior por células

sinoviais. Abaixo ao paratendão, todo o tendão é revestido por um delgado tecido

conjuntivo chamado de epitendão (KANNUS, 2000; MAZZONE; MCCUE, 2002).

Revestindo o fascículo de fibras colágenas encontra-se o endotendão, uma delgada

rede reticular com espessura variada e que atua como importante conduíte para vasos

sanguíneos e nervos e permite aos fascículos alguma independência de movimento

(BENJAMIN; RALPHS, 2000).

Sua principal função é servir como tecido de transição das forças contráteis

geradas pelos músculos e as transferir para os ossos podendo assim gerar

movimentos. A região de inserção do tendão ao tecido ósseo é chamada de junção

osteotendínea ou entese (BENJAMIN; RALPHS, 1998; THOMOPOULOS; GENIN;

GALATZ, 2010).

Enteses podem ser classificadas como fibrosas ou fibrocartilaginosas

(BENJAMIN et al., 2002), as fibrosas são aquelas em que os tendões e/ou ligamentos

se inserem no eixo (diáfise) dos ossos longos e as fibrocartilaginosas a inserção

ocorre nas epífises dos ossos longos ou nos ossos curtos (BENJAMIN; RALPHS,

2000).

Na maioria das vezes esta inserção não ocorre diretamente no tecido ósseo e

sim ao periósteo (RIZZOLO; MADEIRA, 2012), mas no caso da inserção do tendão

calcâneo em que ocorre através de uma região de fibrocartilagem, esta zona de

transição não apresenta periósteo e o tendão insere-se diretamente ao osso

(BENJAMIN et al., 2006).

O tecido ósseo se desenvolve por meio da substituição do tecido conjuntivo

preexistente e existem três processos de osteogênese: ossificação intramembranosa,

pericondral e endocondral (FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006).

19

Revestindo externamente o osso, encontra-se o periósteo, uma delgada

membrana conjuntiva que não se depara nas superfícies articulares

(SCHMAEDECKE, 2004) e internamente este revestimento é realizado por uma

membrana denominada endósteo, constituído por uma camada de células

osteogênicas achatadas revestindo as cavidades do osso esponjoso, o canal medular,

os canais centrais e os perfurantes (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2011).

A senilidade é o maior fator de risco para distúrbios do tendão, a idade

relacionada a mudanças das propriedades estruturais e mecânicas podem predispor

os tendões a lesões (ZHOU et al., 2010).

Em termos ósseos a idade é um preditor de osteoartrite, perda óssea,

desenvolvimento de osteoporose e fratura (WOOLF; PFLEGER, 2003).

Sabendo das complicações causadas pelo envelhecimento no tendão e no

tecido ósseo e pela falta de informações específicas deste processo natural da vida

na região de junção osteotendínea, o objetivo deste trabalho foi analisar

estruturalmente e ultraestruturalmente a inserção do tendão calcâneo ao osso e as

alterações decorrentes do processo de envelhecimento.

20

REVISÃO DE LITERATURA

21

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 SISTEMA LOCOMOTOR: MÚSCULO

O sistema locomotor é composto pelos músculos esqueléticos, tendões,

aponeuroses, ligamentos, fáscias e pelos ossos. O músculo é constituído basicamente

de ventre e tendão, o ventre muscular é a porção central formado por feixes de fibras

musculares contráteis, que em repouso apresentam certo grau de contração reflexa,

que corresponde ao tônus muscular. O tendão é a parte que se insere ao osso, não

contrátil e muito resistente (RIZZOLO; MADEIRA, 2012).

Além disso, histologicamente e ultraestruturamente a fibra muscular

esquelética possui uma estrutura alongada e multinucleada, com diâmetros que

variam de 10 a 100 µm em diferentes músculos e com o citoplasma contendo feixes

de miofibrilas dispostos longitudinalmente. As fibras musculares estão organizadas

em fascículos paralelos e são envoltos por feixes de fibras de colágeno. A disposição

dos feixes de colágeno permite certo grau de mudança do comprimento das fibras

durante a contração e relaxamento muscular (ISHIKAWA et al., 1982).

A organização muscular ocorre em disposições longitudinais, transversais ou

oblíquas. Cada fibra muscular apresenta a forma alongada contendo feixes de

miofilamentos e organelas. Histologicamente, uma fibra muscular está envolta por

uma camada de tecido conjuntivo, denominado endomísio, o conjunto de fibras se

agrupam em fascículos, que também são envoltos por tecido conjuntivo, denominado

perimísio. Além disso, estas fibras equivalentes encontram-se agrupadas como um

todo, envolvidas por uma camada espessa de tecido conjuntivo, denominada epímisio

(NISHIMURA; HATTORI; TAKASHI, 1994; OKITA et al., 2008).

2.2 MÚSCULO TRÍCEPS SURAL

Um conjunto de músculos posteriores da perna formado pelo músculo

gastrocnêmio e o músculo sóleo que juntos constituem o músculo tríceps sural.

22

Possuindo diversas características específicas na compreensão dos padrões

fundamentais da marcha, equilíbrio, entre outros. Estes músculos são os principais

agonistas do movimento de flexão plantar, mas possuem diferentes propriedades

arquitetônicas, como o comprimento do músculo e o comprimento do fascículo

(KAWAKAMI; ICHINOSE; FUKUNAGA, 1998; PEIXINHO, 2010).

O músculo gastrocnêmio é o mais superficial e forma a maior parte do tríceps

sural. Origina-se por duas porções inseridas aos côndilos do fêmur por tendões

achatados e resistentes. A porção medial e maior origina-se em uma depressão nas

partes proximal e posterior do côndilo medial e da parte adjacente do fêmur. A porção

lateral origina-se de uma impressão no lado do côndilo lateral e da superfície posterior

do fêmur, imediatamente proximal à parte lateral do côndilo. As fibras se unem

formando um ângulo na linha média do músculo em uma rafe tendínea que se

expande numa vasta aponeurose na superfície anterior do músculo, e nesta inserem-

se as fibras remanescentes. A aponeurose restringe-se gradualmente e une-se com

o tendão do sóleo, formando com este o tendão calcâneo (GOSS, 1988; BLITZ;

ELIOT, 2007; HÉBERT-LOSIER et al., 2011).

O sóleo é um vasto músculo plano fusiforme, localizado imediatamente abaixo

do gastrocnêmio. Origina-se por fibras tendíneas da superfície posterior da cabeça da

fíbula e do terço proximal da superfície posterior do corpo do osso; da linha poplítea e

do terço médio da borda medial da tíbia. Algumas fibras também se originam de um

arco tendíneo colocado entre as origens tibial e fibular do músculo, sob o qual

caminham os vasos poplíteos e o nervo tibial. As fibras terminam em uma aponeurose

que reveste a superfície posterior do músculo, e gradualmente tornam-se mais

espessas e mais estreitas, reúnem-se à inserção do gastrocnêmio, formando com este

o tendão calcâneo (GOSS, 1988; BLITZ; ELIOT, 2007; HÉBERT-LOSIER et al., 2011).

2.3 TENDÃO CALCÂNEO

O termo tendão deriva-se do Latim tendere e significa esticar (FERNANDES,

1999), este nome é controverso já que a função básica do tendão é transmitir as forças

contráteis geradas pelo ventre muscular para o tecido ósseo e assim gerar movimento

(BENJAMIN; RALPHS, 1998; BENJAMIN et al., 2002; VOLETI, BUCKLEY;

23

SOSLOWSKY, 2012) também são fundamentais para a estabilidade ligamentar

(NOURISSAT et al., 2010). O tendão calcâneo é constituído pela adjeção dos

músculos gastrocnêmio e sóleo, sendo o mais espesso e forte do corpo humano (DEL

SOL; JUNGE; VÁSQUEZ, 2011).

Os eventos morfológicos da formação dos tendões foram descritos inicialmente

por Wortham (1948), podemos explicar este processo resumindo-o em três etapas: 1)

fibroblastos sintetizam pequenas fibrilas colágenas intermediárias em distintos

componentes extracelulares. 2) estas fibrilas intermediárias agrupam-se

longitudinalmente ao longo de delgadas estruturas colágenas. 3) essas cadeias se

fundem lateralmente para constituir espessas fibrilas visto no tecido totalmente

desenvolvido (VOLETI, BUCKLEY e SOSLOWSKY, 2012).

O tendão consiste de 55-70% água, uma parte substancial está associada a

proteoglicanos na matriz extracelular (MEC), o peso do tendão seco corresponde a

60-85% de colágenos, destes aproximadamente 60% é do tipo I, organizados em

fibras resistentes a tração e compostos de duas cadeias α1 e uma α2 (KJAER, 2004).

Menos de 10% é colágeno tipo III (AMIEL et al., 1991; CHANG et al., 2012), sendo

que o tipo I está organizado em fibrilas agrupadas paralelamente formando

organizados feixes, enquanto o tipo III é quase completamente restrito ao endotendão

que rodeia os feixes (CHANG et al., 2012).

Os elementos da MEC são produzidos por tenoblastos e tenócitos, que são

fibroblastos e fibrócitos alongados que se encontram entre as fibras de colágeno,

estão organizados em um complexo esquema hierárquico para formar o tendão

(KANNUS, 2000). Os fibroblastos produzem grande quantidade da MEC, resultando

em uma estrutura densa e hipocelular (TOZER; DUPREZ, 2005).

A grande maioria dos trabalhos considera o tendão pouco vascularizado ou

relativamente avascular (CALVE et al., 2004), porém outros estudos demonstram que

o tendão calcâneo é vascularizado lateralmente pela artéria fibular e medialmente pela

artéria tibial posterior (CHEN et al., 2009), além destas duas os ramos terminais da

artéria poplítea também são responsáveis pela vascularização (WOLFF et al., 2012).

O paratendão mostra ser uma bainha tendinosa vascular que envolve o tendão

de tal maneira que sua remoção retiraria todo o suprimento vascular do tecido

tendíneo (CHEN et al., 2009).

24

2.4 JUNÇÃO OSTEOTENDÍNEA – ENTESE

A interface de contato do tendão com o tecido ósseo é chamada de “entese”,

este termo é derivado do Grego antigo énthesis, sendo que esta expressão também

é utilizada para ligamentos e cápsula articular que inserem-se ao tecido ósseo, são

classificadas como fibrosa (exemplo: ligamento colateral medial) ou fibrocartilaginosa

(exemplo: tendão supraespinal, tendão calcâneo) (DE PALMA et al., 2004;

CLAUDEPIERRE; VOISIN, 2005; SCHWARTZ et al., 2012). As enteses fibrosas

tipicamente ocorrem sob grandes áreas e as fibrocartilaginosas em pequenas áreas

(THOMOPOULOS et al., 2006).

Enteses fibrosas são formadas através de processos de ossificação

intramembranosa e possuem suas calcificações amparadas via fibras de colágeno

perfurante (fibras de Sharpey), estas fibras se estendem a partir do tecido profundo

do tendão/ligamento para o interior do osso (FAN et al., 2009). As enteses

fibrocartilaginosas originam-se através da ossificação endocondral e possuem uma

linha de cimento descontínua separando a fibrocartilagem mineralizada e o osso

lamelar (DOSCHAK; ZERNICKE, 2005).

A transição de tecido mole para tecido duro é de aproximadamente 1 mm e é

uma área complexa (O'BRIEN, 1997). Esta região tipicamente consiste de quatro

zonas: A primeira zona consiste do próprio tendão e é composta por fibras colágenas

tipo I bem alinhadas com pequenas quantidades de proteoglicano decorina. A

segunda zona consiste de fibrocartilagem não mineralizada e é composta por

colágeno tipo II e III, com pequenas quantidades de colágenos tipo I, IX e X e

pequenas quantidades de proteoglicanos, agrecanos e decorina. A terceira zona

consiste de fibrocartilagem mineralizada e é constituída predominantemente por

colágeno tipo II com significante quantidade de colágeno tipo X, bem como agrecanos.

E finalmente a quarta zona, constituída pelo tecido ósseo, composta principalmente

por colágeno tipo I com um elevado teor de minerais (THOMOPOULOS et al., 2006).

Enteses normais são avasculares em ambas regiões de fibrocartilagem (BENJAMIN;

MCGONAGLE, 2009).

A fibrocartilagem não mineralizada e a fibrocartilagem mineralizada, juntas

formam uma zona de transição. O arranjo da zona de transição entre tendão e osso

garante uma transição gradual da rigidez e outras propriedades do material entre o

25

tendão, um tecido mole e osso, um tecido duro (WONG et al., 2009). A fibrocartilagem

mineralizada encontra-se próxima ao tecido ósseo e a fibrocartilagem não

mineralizada propínqua ao tendão (WONG et al., 2004).

O tendão e o osso apresentam comportamentos mecânicos muito diferente, a

nível hierárquico de tecido, o tendão possui um módulo tênsil na ordem de 200 MPa

em direção a força muscular, por outro lado o tecido ósseo possui um módulo de 20

GPa em ambas as forças de tensão e compressão e é relativamente rígido e

quebradiço em relação ao tendão (THOMOPOULOS; GENIN; GALATZ, 2010).

Na maioria das vezes esta inserção não ocorre diretamente no tecido ósseo e

sim ao periósteo, sendo que a tração é feita neste último tecido que a transmite ao

osso, em alguns casos fibras tendíneas chegam a ultrapassar o periósteo para se

inserirem em pequenas fóveas ósseas. (RIZZOLO; MADEIRA, 2004), mas no caso da

inserção do tendão calcâneo em que ocorre através de uma região de fibrocartilagem,

esta zona de transição não apresenta periósteo e o tendão insere-se diretamente ao

osso (BENJAMIN et al., 2006).

Esta junção é uma estrutura forte protegida pela zona de transição, falhas

traumáticas perto da junção osteotendínea normalmente ocorrem com uma avulsão

do osso ou uma falha do tendão/ligamento, mas não na junção (NOYES; DE LUCAS;

TORVIK, 1974; CROWNINSHIELD; POPE, 1976; WOO et al., 1990).

2.5 TECIDO ÓSSEO

O tecido ósseo se desenvolve por meio da substituição do tecido conjuntivo

preexistente e existem três processos de osteogênese: ossificação intramembranosa,

pericondral e endocondral (FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006).

A ossificação intramembranosa é um tipo de formação óssea que ocorre no

mesênquima, que constitui uma bainha membranosa, o mesênquima condensa-se e

se torna altamente vascular, algumas células se diferenciam em osteoblastos

(MOORE; PERSAUD, 2008).

Osteoblastos são células de origem mesenquimal responsáveis pela criação e

manutenção da arquitetura esquelética, essas células produzem matriz extracelular,

proteínas e reguladores da mineralização da matriz durante a formação óssea inicial

26

e mais tarde são responsáveis pelo remodelamento ósseo (NEVE; CORRADO;

CANTATORE, 2011).

Os osteoblastos depositam uma matriz não-mineralizada chamada de tecido

osteóide, o fosfato de cálcio é depositado no tecido osteóide à medida que este é

organizado em osso, os osteoblastos ficam embebidos nesta matriz e tornam-se

osteócitos (MOORE; PERSAUD, 2008).

Os osteócitos são o tipo de célula mais abundante no osso e compõem cerca

de 90-95% da população de células no osso adulto (SCHAFFLER et al., 2013, no

prelo)1, o que corresponde entre 20,000 e 80,000 células por mm3 de tecido ósseo

(FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006).

No início o osso recém-formado não possui um padrão organizado, as

espículas ósseas logo se tornam organizadas e coalescem em lamelas que

desenvolvem-se ao redor de vasos sanguíneos formando os canais haversianos

(ósteons). Além disso, alguns osteoblastos permanecem na periferia do tecido ósseo

formando placas de osso compacto na superfície. Entre as placas ósseas da

superfície, o osso interposto permanece espiculado ou esponjoso, esse aspecto é

acentuado pela ação de células com uma origem diferente – os osteoclastos

(MOORE; PERSAUD, 2008), as principais células responsáveis pela reabsorção

óssea (LI; KONG; QI, 2006).

A ossificação pericondral é o modo mais comum de formação óssea se um

precursor cartilaginoso está presente. Este tipo de ossificação normalmente inicia-se

com a transformação de um pericôndrio em periósteo (FRANZ-ODENDAAL; HALL;

WITTEN, 2006).

Já a ossificação endocondral é o principal processo responsável pela formação

da maioria dos ossos de mamíferos, gerando osso via cartilagem intermediária

(LONG; ORNITZ, 2013).

Uma vez formado os modelos cartilaginosos estes são invadidos primeiramente

pelo centro por condrócitos hipertrofiados e por invasão vascular e mais tarde em cada

extremidade estabelecendo os centros de ossificação primário e secundário

(respectivamente). O centro secundário formado é separado do centro primário pela

placa de crescimento que é responsável pelo crescimento longitudinal (MACKIE et al.,

2008).

1 SCHAFFLER, M. B.; CHEUNG, W. Y.; MAJESKA, R.; KENNEDY, O. Osteocytes: Master Orchestrators of Bone. Calcified Tissue International, 2013.

27

A hipertrofia desses condrócitos está associada com apoptoses, calcificação

da matriz e invasão vascular. Os vasos sanguíneos trazem com eles células-tronco

de diferentes linhagens que dão origem a osteoblastos que depositam osso e os

osteoclastos que reabsorvem o tecido ósseo (WHITE; WALLIS, 2001).

Um terço da composição do osso do indivíduo adulto é formado por uma matriz

orgânica fibrosa com 90% de colágeno e uma substância fundamental amorfa

contendo proteínas. Tanto as fibras colágenas quanto as proteínas não-colagenosas

tem funções na mineralização e mostram grande tendência de agregação, em

particular ao íon cálcio. Os outros dois terços são inorgânicos: cristais de hidroxiapatita

de 10 nm de comprimento aproximadamente, que contêm principalmente cálcio,

fósforo e íons hidroxila. Os sais inorgânicos também são compostos por carbonato,

citrato de sódio, magnésio e flúor (RIZZOLO; MADEIRA, 2004).

Revestindo externamente o osso, encontra-se o periósteo, uma delgada

membrana conjuntiva que não se depara nas superfícies articulares

(SCHMAEDECKE, 2004).

A camada mais superficial do periósteo contém principalmente fibras colágenas

e fibroblastos. A lâmina interna apresenta células osteoprogenitoras,

morfologicamente parecidas com os fibroblastos. As células osteoprogenitoras se

multiplicam por mitose e se diferenciam em osteoblastos, desempenhando papel

importante no crescimento dos ossos. O endósteo é constituído por uma camada de

células osteogênicas achatadas revestindo as cavidades do osso esponjoso, o canal

medular, os canais centrais e os perfurantes, por onde apresentam estruturas

sensitivas, linfáticas e vasculares (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2011).

2.6 ENVELHECIMENTO

A senilidade é o maior fator de risco para distúrbios do tendão. A idade

relacionada a mudanças das propriedades estruturais e mecânicas podem predispor

os tendões a lesões (ZHOU et al., 2010). A habilidade de realizar seu papel funcional

é comprometida com o envelhecimento, contribuindo para a alta incidência de

fragilidade e deficiência na locomoção, observada na população idosa (WOOD et al.,

2011). Os tenoblastos e os tenócitos, os maiores elementos celulares do tendão

28

produzem e organizam a matriz extracelular que também sofrem com as mudanças

do envelhecimento em número e atividade (IPPOLITO et al., 1980; NAKAGAWA et al.,

1994).

A incidência de degeneração e ruptura do tendão no envelhecimento devido as

mudanças morfológicas, tal como, a diminuição da densidade celular, diminuição da

densidade das fibras colágenas e a perda da ondulação das fibras, predispõe a lesões

nos tendões (MAZZONE; MCCUE, 2002). Apesar de mudanças dramáticas nas

propriedades mecânicas no envelhecimento, a morfologia das fibras colágenas e a

fração de disposição permanecem relativamente constantes em todo o tendão

(WOOD et al., 2011).

A massa óssea aumenta durante a infância e adolescência e atinge um pico na

terceira ou quarta década de vida e então diminui com o avanço da idade (WASNICH,

1998). É amplamente reconhecido que a idade está associada com a diminuição da

massa e da densidade mineral óssea e ocasiona uma alta taxa de fraturas em pessoas

idosas (RUSSO et al., 2003; RITCHIE et al., 2006).

O envelhecimento ocasiona eventos agudos e de curta duração, podendo

evoluir para doenças ao longo da vida, incluindo osteoartrite, artrite reumatoide,

osteoporose e dor lombar (WOOLF; PFLEGER, 2003).

29

PROPOSIÇÃO

30

3 PROPOSIÇÃO

O presente estudo teve como objetivo analisar as alterações estruturais e

ultraestruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural em ratos Wistar

adultos e idosos.

Tendo como objetivos específicos:

- Descrever e quantificar as alterações do tecido conjuntivo, das células de

fibrocartilagem e a morfologia da região através de microscopia de luz com as

colorações de Hematoxilina-eosina, Azocarmim, Picro-sírius e Tricromo de Masson.

- Descrever as alterações estruturais através de microscopia eletrônica de

varredura e ultraestruturais, descrevendo as alterações celulares através da

microscopia eletrônica de transmissão.

31

MATERIAIS E MÉTODOS

32

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Foram utilizados 30 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, sendo 15 adultos

com idade de 4 meses (grupo A) e 15 idosos com idade de 18 meses (grupo B), 5

animais de cada grupo foram utilizados para ML, 5 para MEV e 5 para MET,

provenientes do Biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São

Paulo. Os animais foram alojados em gaiolas de contenção de polipropileno,

agrupados em números de cinco, com água e ração “ad libitum”, mantidos em

períodos claro/escuro de 12 horas, à temperatura média de 22 ± 2°C, e não foram

submetidos a qualquer regime especial de exercício. Foram anestesiados e

eutanásiados com overdose de Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg) (DIAS et

al., 2012). Todos os procedimentos adotados foram aprovados pelo Comitê de Ética

em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo, protocolado sob número 2536/2012 e do Instituto de

Ciências Biomédicas (ICB-USP), registrado sob número 120 nas folhas 133 do livro

02.

4.1 MICROSCOPIA DE LUZ

Foram utilizados 5 animais de cada grupo (n=5), eutanasiados com overdose

de Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg). Após a remoção de vinte amostras,

estas foram imediatamente imersas em solução fixadora de paraformoldeído 4%

durante 48 horas a temperatura ambiente no Laboratório Multiusuário de Histologia e

Microscopia Eletrônica do Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências

Biomédicas III da Universidade de São Paulo. Continuamente, as amostras foram

lavadas em água corrente e dissecadas, em seguida imersas em solução de EDTA –

ácido etilenodiamino tetra-acético, sal dissódico na concentração de 7% até completa

desmineralização.

Para verificar o processo de desmineralização, foram realizados testes a cada

72 horas com solução de oxalato de amônia 5% até que a solução descalcificadora

não se apresentou turva durante o teste.

33

A desidratação dos tecidos foi realizada utilizando série crescente de álcoois

do 70% ao absoluto, sendo 30 min em cada álcool até o absoluto II e uma hora no

absoluto III. Em seguida os tecidos foram diafanizadas com Xilol I, II e III por imersões

consecutivas de 30 min em cada solução.

A embebição das amostras em parafina foi efetuada na estufa a fim de se retirar

o Xilol e substituir gradativamente desde a parafina I, seguida por parafina II e III (30

min cada), desta forma, prontas para serem emblocadas com parafina pura.

As amostras foram incluídas em blocos de parafina de forma retangular de 4

cm (C) x 2,5 cm (L) x 3 cm (A) a fim de se obter cortes parassagitais da área de

inserção do tendão calcâneo para que se evidenciem as interfaces osteotendíneas.

Cortes de 6 µm foram montados em lâminas histológicas e corados pelos

métodos de Hematoxilina-eosina para examinar as características dos feixes de fibras

colágenas, tecido ósseo e núcleos, Azocarmim para evidenciar a distribuição do tecido

conjuntivo na área de inserção e o Tricromo de Masson para melhor evidenciar as

fibras colágenas na região mineralizada (BEHMER et al., 1976). Picro-sírius para a

disposição do tecido conjuntivo e sob luz polarizada para a identificação do tecido

conjuntivo tipo I e III segundo método descrito por Junqueira et al. (1979). As lâminas

foram analisadas em microscópio de luz Leica DMR equipado com câmera Nikon DS-

Ri1 do Laboratório de Neuroanatomia Química do Departamento de Anatomia do

Instituto de Ciências Biomédicas III da Universidade de São Paulo.

4.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Para a microscopia eletrônica de varredura, 5 animais de cada grupo, foram

anestesiados com Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg), sendo perfundidos com

a solução fixadora de Karnovsky modificada (glutaraldeído a 2,5% e paraformoldeído

2% em solução tampão fosfato de sódio a 0,1M e pH = 7,4) (WATANABE; YAMADA,

1983) injetando-se aproximadamente 60 ml de solução pelo ventrículo esquerdo do

coração.

A junção osteotendínea do tendão calcâneo foi dissecada e imersa na mesma

solução durante 24 horas à 4ºC. Para este tipo de microscopia as amostras não foram

desmineralizadas, em seguida foram lavadas em solução tampão fosfato de sódio a

34

0,1M e pH = 7,4. A fratura ocorreu de acordo com a técnica de congelamento em

nitrogênio líquido empregando o método descrito por Watanabe (1998).

As amostras foram lavadas em solução tampão fosfato de sódio e pós-fixadas

em solução de tetróxido de ósmio a 1%, durante 2 horas à 4ºC, em seguida lavadas

em água destilada e desidratadas em série crescente de alcoóis (70% ao absoluto,

durante 15 min em cada álcool e quatro vezes no absoluto pelo mesmo tempo), a

secagem das amostras foi realizada em aparelho ponto crítico Balzers CPD-030

(Processo FAPESP 86/2549-0) utilizando dióxido de carbono (CO2) líquido.

Estas amostras foram montadas em bases metálicas apropriadas (stubs) e

cobertas com íons de ouro em aparelho Balzers Union SCD-040 (Processo FAPESP

93/444-1) e analisados no microscópio eletrônico de varredura Field Emission Gun

Scanning Eletron Microscope (FEG-SEM) Jeol modelo JSM-7401F da Central

Analítica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo.

4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO

Para a microscopia eletrônica de transmissão, 5 animais de cada grupo, foram

anestesiados com Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg), sendo perfundidos com

a solução fixadora de Karnovsky modificada contendo glutaraldeído a 2,5% e

paraformoldeído 2% em solução tampão fosfato de sódio a 0,1M e pH = 7,4

(WATANABE; YAMADA, 1983) injetando-se aproximadamente 60 ml de solução pelo

ventrículo esquerdo.

A junção osteotendínea do tendão calcâneo foi dissecada e fixada em

glutaraldeído 2,5% durante 4 horas a temperatura ambiente. Em seguida as amostras

foram desmineralizadas com EDTA específico para este tipo de microscopia,

constituído de glutaraldeído 1,9%, cacodilato de sódio tampão 0,06 M e EDTA 0,15

M, pH 7,4 (EVERTS et al., 2012). Em seguida, foi realizada a lavagem com tampão

fosfato de sódio e pós-fixados com a solução de tetróxido de ósmio a 1% durante 2

horas à 4ºC.

Em temperatura ambiente foi realizada a desidratação em série crescente de

alcoóis a partir do 30 ao 100% com banhos de 30 minutos cada e 2 banhos de óxido

de propileno pelo mesmo tempo, para a infiltração da resina as amostras foram

35

colocadas em mistura de resina spurr 1:1 óxido de propileno durante 24 horas em

misturador rotatório, após esta etapa a resina foi substituída pela mistura de resina

spurr 3:1 durante 8 horas, finalmente as amostras foram colocadas em resina pura

durante 24 horas.

A inclusão do material a fim de se obter blocos foi realizada em molde de

silicone de 14 mm (C) x 5 mm (L) x 6 mm (A) que foram levados em estufa a 60ºC por

72 horas para completa secagem. Obtidos os blocos de resina, foi efetuada a

trimagem e os cortes semi-finos de 400 nm e corados com a solução de azul de

toluidina para verificação da área em microscópio de luz. Posteriormente foram

realizados os cortes ultrafinos de 60 nanômetros e coletados em telas de cobre de

200 “mesh” (EMS) e contrastados com a solução de acetato de uranila a 4% por 3 min

(WATSON, 1958; WATANABE; YAMADA, 1983) e com a solução aquosa de citrato

de chumbo a 0,4% por 3 min lavando em seguida com água destilada (REYNOLDS,

1963, WATANABE; YAMADA, 1983). As telas foram examinadas ao microscópio

eletrônico de transmissão Jeol 1010 regulado para 80 kV no Centro de Microscopia

do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências

Biomédicas I da Universidade de São Paulo.

4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Para a análise quantitativa diferencial das fibras colágenas dos tipos I e III na

área da junção osteotendínea do tendão calcâneo, utilizamos as imagens histológicas

coradas pelo método de Picro-sírius e analisadas ao microscópio sob luz polarizada.

Utilizando o software “Photoshop CS6” cada fotomicrografia obtida sob luz

polarizada foi composta em três imagens monocromáticas em amarelo, vermelho e

verde, levando em consideração o trabalho de Montes e Junqueira (1991), em que os

autores afirmam que o colágeno tipo I possui coloração amarela e/ou vermelha e o

tipo III tonalidades esverdeadas.

Separando estas cores o próximo passo foi convertê-las em imagens binárias

e quantificar a área de cada colágeno, para estes últimos procedimentos utilizamos o

software gratuito “ImageJ 1.47v” (DIAS et al., 2013).

36

Para avaliar a quantidade de células de fibrocartilagem presentes nas regiões

de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada, utilizamos as imagens

histológicas coradas com hematoxilina-eosina, obtidas com aumento de 50x.

Desenhamos sobre a área de inserção um retângulo de 0,15 mm2 dividido ao meio

em que ocupou toda entese, esta linha divisória foi colocada exatamente acima da

tidemark, dividindo assim as duas regiões de fibrocartilagem de acordo com as figuras

1 e 2. Apenas as células contidas no retângulo foram contadas.

Figura 1 - Aspectos de Microscopia de Luz, corado com Hematoxilina-Eosina

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Identifica-se a linha tidemark utilizada para posicionar o retângulo utilizado para quantificar

as células de fibrocartilagem. Aumento: 50x, barra: 100µm.

37


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Identifica-se o retângulo desenhado sobre a tidemark utilizado para quantificar as células

de fibrocartilagem. Aumento: 50x, barra: 100µm.

A medida do comprimento do tendão calcâneo na região de inserção com o

tecido ósseo foi realizada entre o ponto superior de contato do tendão com o osso e o

ponto inferior no final da fibrocartilagem não mineralizada, como mostra a figura 3.

Tanto para esta medida quanto para a contagem das células foi utilizado o software

ImageJ 1.47v.

38


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Identifica-se o local utilizado para medir a espessura do tendão. Aumento: 50x,

barra: 100µm.

As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software “Instat 3.0”

utilizando o “Teste-T de Student” não pareado, e aplicando ao teste de correção de

Welch, que melhor se aplica a este estudo por possuir dois grupos independentes, foi

adotado nível de “p” menor ou igual a 0,05 os dados foram representados pela média

± desvio padrão (MENDEŞ; AKKARTAL, 2010).

39

RESULTADOS

40

5 RESULTADOS

5.1 MICROSCOPIA DE LUZ DOS GRUPOS ADULTO E IDOSO

Análises realizadas ao microscópio de luz utilizando a coloração de

Hematoxilina-Eosina foi possível observar perante uma visão geral tanto no grupo

adulto quanto no idoso o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo, uma grande

quantidade de espaços trabeculares de diferentes formatos podem ser notados sendo

circundados pelas trabéculas ósseas, perifericamente ao osso calcâneo observa-se a

fibrocartilagem periosteal (Figuras 4A-B).

Em maior aumento da região em que o tendão calcâneo se anexa ao tecido

ósseo, observa-se com maiores detalhes as trabéculas ósseas e espaços

trabeculares de diferentes tamanhos tanto no grupo adulto quanto no idoso, assim

como a fibrocartilagem periosteal, necessária para proteger o osso da compressão

causada pelo tendão durante o movimento de dorsiflexão (Figuras 5A-B).

Ainda em maior aumento da região de inserção do tendão calcâneo ao tecido

ósseo no grupo adulto, nota-se uma pequena linha incompleta denominada tidemark

em que ocorre a transição do tecido conjuntivo não mineralizado do tendão para o

tecido conjuntivo mineralizado no osso calcâneo, trabéculas e espaço trabecular

ficaram evidentes (Figura 6A). A mesma região no grupo idoso analisada com o

mesmo aumento, demonstra uma diferença na tidemark, no grupo idoso ela é uma

linha completa que ocupa todo o local de inserção separando a fibrocartilagem não

mineralizada da mineralizada (Figura 6B).

41

Figura 4 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o aspecto geral do tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O),

fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas maiores) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 25x, barra: 500 µm. (B) Mostra o aspecto geral do tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas maiores) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 25x, barra: 500 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

A

B

*

FP

T

O

T

FP

* O

42


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto o tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O),

fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas maiores) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 50x, barra: 100 µm. (B) Mostra no grupo idoso o tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (seta maior) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

A

B

*

FP

T

O

T

FP

*

O

43


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto a região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM),

fibrocartilagem mineralizada (FM), uma pequena tidemark entre as fibrocartilagens (elipse tracejada), trabécula óssea (seta maior), espaço trabecular (*). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (B) Mostra no grupo idoso a região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), completa tidemark entre as fibrocartilagens (elipse tracejada). Aumento: 100x, barra: 50 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

A

FnM

FM

B

FM

FnM

*

44

Em maior aumento da junção osteotendínea do tendão calcâneo no grupo

adulto, é possível observar a fibrocartilagem não mineralizada separada da

fibrocartilagem mineralizada por duas incompletas e delgadas linhas denominadas

tidemark, o tecido ósseo aparece evidente entre a fibrocartilagem mineralizada (Figura

7A). No grupo idoso a tidemark é uma linha bem definida e completa, separando os

dois tipos de fibrocartilagem, de forma clara o tecido ósseo se destaca entre a

fibrocartilagem mineralizada (Figura 7B). Uma grande quantidade de condrócitos na

maior parte organizados em fileiras são notados, é possível atentar-se que estas

células na fibrocartilagem não mineralizada próximas a tidemark são maiores que as

localizadas na fibrocartilagem mineralizada em ambos os grupos (Figuras 7A-B).

Na região de inserção ambos os grupos nos demonstra os condrócitos alojados

em lacunas, nota-se que na região de fibrocartilagem não mineralizada eles

apresentam um tamanho maior em comparação aos presentes na região

mineralizada, separando estas duas regiões existe a tidemark, muito delgada e quase

imperceptível no grupo adulto, ao contrário no idoso que é bem definida (Figuras 8A-

B).

É possível observar o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo, ao redor

do osso calcâneo repara-se a fibrocartilagem periosteal que se distingue com nitidez

dos tecidos adjacentes, os espaços trabeculares de diversos tamanhos e formatos

rodeados pelas trabéculas ósseas são notados em ambos os grupos (Figuras 9A-B).

Em maior aumento da junção osteotendínea do tendão calcâneo corado com

Azocarmin evidencia-se tanto no grupo adulto quanto no idoso as fibrocartilagens

mineralizada e não mineralizada, entre elas é possível destacar a região de transição

destes tecidos, sendo possível notar os espaços trabeculares circundados por tecido

ósseo (Figuras 10A-B).

Análises em maior aumento da junção osteotendínea nos dois grupos nos

revela a região de transição da região de FnM para a FM, porém destaca-se a grande

quantidade de condrócitos, na maior parte deles organizados em fileiras. É possível

observar que estas células localizadas na FnM possuem um tamanho maior em

relação as presentes na FM, esta característica está presente em ambos os grupos

(Figuras 11A-B).

45


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto duas delgadas tidemark (setas maiores), fibrocartilagem não

mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), condrócitos (setas menores), tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra: 20 µm. (B) Mostra no grupo idoso uma completa e bem definida tidemark (seta maior), condrócitos (setas menores), fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

A

B

FnM

O

FnM

O

FM

FM

46


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto delgadas tidemark (setas maiores), tecido conjuntivo (setas

menores) entre os condrócitos (cabeças de seta) localizados na fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e mineralizada (FM). Aumento: 400x, barra: 10 µm. (B) Mostra no grupo idoso a tidemark (seta maior), tecido conjuntivo (setas menores), condrócitos (cabeças de seta), fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e mineralizada (FM). Aumento: 400x, barra: 10 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

A

B

FnM

FnM

FM

FM

47


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T) inserindo-se ao tecido ósseo (O), a fibrocartilagem periosteal (FP),

trabéculas ósseas (setas), espaço trabecular (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. (B) Mostra o tendão (T), tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabécula óssea (seta maior), espaço trabecular (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Azocarmim.

A

B

* FP

T O

T FP

* O

*

48


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra a fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM),

região de transição entre as fibrocartilagens (seta), espaço trabécular (*), tecido ósseo (O). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (B) Mostra a fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), região de transição entre as fibrocartilagens (*), tecido ósseo (O). Aumento: 100x, barra: 50 µm. Coloração: Azocarmim.

A

B

O

FnM

*

O

* FM

FM

FnM

49


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra fileiras de condrócitos (seta menor) na região de fibrocartilagem não

mineralizada (FnM), fileira de condrócitos (seta maior) na fibrocartilagem mineralizada (FM), região de transição entre as fibrocartilagens (elipse tracejada), tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra: 20 µm. (B) Mostra fileiras de condrócitos (setas menores) na região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fileira de condrócitos (setas maiores) na fibrocartilagem mineralizada (FM), região de transição entre as fibrocartilagens (elipse tracejada). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Azocarmim.

A

B

FnM

O

FnM

FM

FM

50

Utilizando o método de coloração de Trícromo de Masson em ambos os grupos,

foi possível demonstrar a fibrocartilagem periosteal, próxima a superfície profunda do

tendão, adjacente a junção osteotendínea as trabéculas ósseas ao redor dos espaços

trabeculares de diversos tamanhos e formatos também foram observados (Figuras

12A-B).

A coloração de Trícromo de Masson também nos demonstrou nitidamente os

feixes de fibras colágenas do tendão calcâneo da região de fibrocartilagem não

mineralizada em direção a região de fibrocartilagem mineralizada, estas fibras

apresentam-se organizadas paralelamente ao longo de todo o trajeto. Entre esses

feixes nota-se a presença de fileiras de condrócitos na região de fibrocartilagem

mineralizada tanto no grupo adulto quanto no idoso (Figuras 13A-B-C-D).

Análises realizadas sob uma vista geral do tendão e do osso calcâneo

utilizando a coloração de Pricro-sirius nos possibilita observar no grupo adulto e no

idoso o tecido tendíneo inserindo-se ao ósseo, adjacentemente encontra-se a

fibrocartilagem periosteal e ao centro as trabéculas preenchem o tecido parcialmente

formando cavidades, os espaços trabeculares (Figuras 14A-C). Estas mesmas

regiões analisadas sob luz polarizada nos permitiu observar o colágeno tipo I com tons

de amarelo e vermelho e o tipo III com coloração esverdeada, quanto a isto, destaca-

se a predominância do tipo I no grupo adulto e o tipo III no idoso, a fibrocartilagem

periosteal no adulto se distingue com clareza do tecido ósseo no adulto, enquanto no

idoso esta região não é tão bem observada (Figuras 14B-D).

Observações realizadas na região de inserção das fibras colágenas que

constituem o tecido tendíneo ao ósseo em maior aumento em ambos os grupos,

revelam a disposição geral destas fibras (Figuras 15A-C). Analisando a mesma área

sob luz polarizada é possível distinguir com clareza as fibras colágenas do tipo I e III

que constituem o tendão inserindo-se ao tecido ósseo, as fibras que compõem o

tendão demonstram uma disposição paralela entre si e bem organizada em direção

ao osso que apresenta colágeno distribuído de forma dissonante (Figuras 15B-D).

As fibras colágenas do tendão em ratos idosos demonstram uma inserção mais

profunda ao tecido ósseo e uma predominância de colágeno tipo III (Figura 15D),

enquanto que nos ratos adultos as fibras não se inserem tão profundamente e o

predomínio é de colágeno tipo I (Figura 15B).

51


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T) inserindo-se ao tecido ósseo (O), a fibrocartilagem periosteal (FP),

trabéculas ósseas (setas), espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. (B) Mostra o tendão (T), tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabécula óssea (seta), espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Tricromo de Masson.

* A

B

FP

T

*

*

*

FP

T

O

O

52

Figura 13 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A-B) e idosos (C-D). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior),

feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (seta menor). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (B) Mostra fileira de condrócitos (seta menor), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (cabeça de seta). Aumento: 200x, barra: 20 µm. (C) Mostra feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (seta menor). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (D) Mostra fileira de condrócitos (seta menor), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (cabeça de seta). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Tricromo de Masson.

A B

C D

53


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T), região de fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas) e

espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius. (B) Mostra o tendão (seta), fibrocartilagem periosteal (FP), tecido ósseo (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius, imagem sob luz polarizada. (C) Mostra o tendão (T), região de fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas) e espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius. (D) Mostra o tendão (seta), fibrocartilagem periosteal (FP), tecido ósseo (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius, imagem sob luz polarizada.

A B

C D

FP

T

*

FP *

FP

T

* FP

*

54


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A-C) Mostra as fibras tendíneas (*) inserindo-se ao tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra:

20 µm. Coloração: Picro-sirius. (B-D) Mostra as fibras tendíneas (*) inserindo-se ao tecido ósseo (O), separação entre as fibras colágenas do tecido tendíneo ao ósseo (linha tracejada). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Picro-sirius, imagem sob luz polarizada.

A

C D

*

O

B

*

O

* O

* O

55

5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO ADULTO

Análises realizadas em microscópio eletrônico de varredura, utilizando a

técnica de criofratura com nitrogênio líquido na região de inserção osteotendínea do

tendão calcâneo, em pequenas ampliações, 50x, 200x e 500x nas figuras 16A, 16B e

16C respectivamente nos revela o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo. As

trabéculas ósseas próximas a região de inserção foram demonstradas, assim como

espaços trabeculares ausentes de qualquer tipo de tecido em seu interior (Figura

16A).

Observa-se claramente as fibras colágenas que constituem o tendão calcâneo

inserindo-se ao tecido ósseo, é notável uma evidente transição entre estes dois

tecidos em maior aumento (Figura 16C).

Em maior aumento da região osteotendínea é possível observar com nitidez

entre as fibras colágenas que compõem o tendão calcâneo uma célula de

fibrocartilagem, assim como ficou evidente no tecido ósseo outra célula do mesmo

tipo. Lacunas, ou seja, pequenas cavidades em que estas células se alojam são

constatadas tanto na tecido tendíneo quanto ósseo (Figura 17A).

A mesma área analisada com um aumento ainda maior nos revela a disposição

das fibras colágenas pertencentes ao tendão inserindo-se ao tecido ósseo (Figura

17B).

Análise realizada em grande aumento nos revela a forma de como os feixes de

fibras colágenas que constituem o tendão calcâneo se inserem inicialmente na região

de fibrocartilagem não mineralizada, evidenciando nesta área lacunas de células de

fibrocartilagem presentes tanto entre os feixes de fibras colágenas quanto na

fibrocartilagem não mineralizada (Figura 18A).

É possível ainda demonstrar a transição entre as fibrocartilagens não

mineralizada e mineralizada, sendo que a não mineralizada apresenta fibras

colágenas não tão bem organizadas em comparação com a fibrocartilagem

mineralizada. Células de fibrocartilagem em ambas as regiões são notadas

organizadas em fileiras, sendo que entre estas células um grupo isogênico de

condrócitos foi observado (Figura 18B).

56

Figura 16 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O), espaço trabecular (*) e trabéculas

ósseas (setas). Barra: 100 µm. (B) Mostra o tendão calcâneo (T) e o tecido ósseo (O). Barra: 50 µm. (C) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O) e a zona de transição entre os dois tecidos (*). Barra: 10 µm.

A B

C

T T

O

O

T

O

* *

*

57


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T), tecido ósseo (O), célula de fibrocartilagem entre as fibras

colágenas tendíneas (seta maior preta), célula de fibrocartilagem no tecido ósseo (seta maior branca), lacuna de célula de fibrocartilagem no tendão (seta menor) e lacunas de células de fibrocartilagem no tecido ósseo (cabeças de seta). Barra: 10 µm. (B) Mostra o tendão calcâneo (T), fibras colágenas (setas) inserindo-se ao tecido ósseo (O). Barra: 2 µm.

O

T

T

O

A

B

58


Fonte: (CURY, D. P., 2013).

Legenda: (A) Mostra feixes de fibras colágenas do tendão (*) inserindo-se a região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e a presença de lacunas de células de fibrocartilagem (setas). Barra: 5 µm. (B) Mostra a transição entre a fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e a fibrocartilagem mineralizada (FM), fibras colágenas na FnM (cabeças de seta), células de fibrocartilagem em fileiras (setas menores) e um grupo isogênico de condrócitos (seta maior). Barra: 10 µm.

FnM

FM

B

A

* * *

FnM

59

Examinando a região de fibrocartilagem mineralizada mais detalhadamente,

em maior aumento é possível identificar a morfologia da lacuna de uma célula de

fibrocartilagem. Esta apresenta a mesma forma da célula que a ocupava, possuindo

um formato ovalado, sendo que ao seu redor as fibras colágenas apresentam-se bem

organizadas, dispostas paralelamente umas às outras (Figura 19A).

Um grupo isogênico de condrócitos também foi observado, ao redor da lacuna

de cada condrócito e separando uma célula da outra a matriz territorial é demonstrada

(Figura 19B).

No tecido ósseo foi possível analisar com riqueza de detalhes uma parte de um

osteócito ocupando sua devida lacuna, os processos celulares que comunicam-se

com outros osteócitos ficaram evidentes assim como os canalículos, local por onde

percorre tais processos celulares (Figura 20A).

Observa-se também em outra região mineralizada uma lacuna ausente de

osteócito, nesta situação podemos evidenciar a disposição da fibras colágenas que a

constituem, fica claro que estas não possuem um arranjo análogo. No interior

constata-se os orifícios dos canalículos e exteriormente parte do trajeto destes (Figura

20B).

Identifica-se em análises de MEV realizadas no tecido ósseo a presença de

aglomerados de células sanguíneas maduras entre as trabéculas ósseas (Figura

21A). Observando detalhadamente com grande aumento, nota-se a forma como estas

células se agrupam e a presença de tecido conjuntivo entre elas (Figura 21B).

Averiguações realizadas ao redor destes aglomerados, constata-se a presença

de seios venosos medulares e as células sanguíneas maduras em seu interior (Figura

21C).

Analises mais minuciosas do tendão nos revela hemácias presentes entre

diversos feixes de fibras colágenas, nota-se que estes não apresentam uma

disposição ordenada e possuem espessuras variadas (Figura 22A).

Em maior aumento destes feixes observa-se a presença de gotículas lipídicas

dispostas ao longo das fibrilas colágenas, em alguns momentos estas gotículas unem

duas ou mais fibrilas que também não demonstram possuir um arranjo ordenado entre

elas (Figura 22B).

60


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra a lacuna de uma célula de fibrocartilagem (**) na região de fibrocartilagem

mineralizada (*). Barra: 1 µm. (B) Mostra um grupo isogênico de condrócitos (**) envolto pela matriz territorial (*). Barra: 2 µm.

*

*

*

**

**

**

*

*

B

A

61


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra um osteócito (*) com seu processo celular (cabeça de seta) dentro de uma

lacuna, assim como os canalículos (setas). Barra: 1 µm. (B) Mostra uma lacuna vazia, internamente os orifícios dos canalículos (setas menores), fibras colágenas (seta maior) e externamente os canalículos (cabeças de setas). Barra: 1 µm.

A

B

*

62


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra conjuntos de células sanguíneas maduras (*) entre as trabéculas ósseas (setas).

Barra: 100 µm. (B) Mostras as células sanguíneas maduras (*). Barra: 10 µm. (C) Mostra seios venosos medulares (*) e as células sanguíneas maduras no interior dos seios venosos (setas). Barra: 10 µm.

A B

C

*

*

*

*

*

*

63


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra hemácias (setas maiores) entre o feixes de fibras colágenas do tendão (setas

menores). Barra: 5 µm. (B) Mostra gotículas lipídicas (cabeças de setas) presentes nas fibrilas colágenas (setas). Barra: 2 µm.

A

B

64

5.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO IDOSO

Ao analisar a região de junção osteotendínea do tendão calcâneo utilizando a

técnica de criofratura em nitrogênio líquido examinadas em microscópio eletrônico de

varredura, nota-se em pequenos aumentos o tendão se inserindo ao osso calcâneo

(Figuras 23A-B-C), espaços trabeculares presentes no tecido ósseo puderam ser

observados (Figura 23A), assim como a fibrocartilagem periosteal revestindo

externamente a superfície óssea que entra em contato com o tecido tendíneo (Figura

23B).

Em um aspecto geral da junção osteotendínea é possível observar as fibras

colágenas que compõem o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo, uma clara

zona de transição entre os dois tecidos fica evidente neste aspecto (Figura 24A).

A mesma região analisada em maior aumento nos revela que as fibras

colágenas não apresentam um homogêneo padrão de disposição ao inserirem-se no

tecido ósseo e que estas podem se anexar em feixes ou individualmente (Figura 24B).

Averiguações realizadas na região de fibrocartilagem não mineralizada nos

revelou células de fibrocartilagem dispostas em fileiras muito bem organizadas (Figura

25A). Um maior aumento desta área exibiu as células alojadas em suas lacunas

individuais, ao redor as fibras colágenas organizadas paralelamente em um mesmo

trajeto formam a matriz extracelular (Figura 25B).

Ao analisar a região de fibrocartilagem mineralizada, foi possível identificar

lacunas de células de fibrocartilagem e observar como o tecido conjuntivo forma uma

rede de fibras colágenas para compor a lacuna, externamente ao seu redor uma densa

matriz é demonstrada (Figura 26A).

Na mesma região um grupo isogênico de condrócitos foi exposto, rodeando

cada lacuna e até mesmo separando uma da outra pode ser constatada a matriz

territorial (Figura 26B).

65

Figura 23 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O), espaço trabecular (*). Barra: 100 µm.

(B) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (*). Barra: 100 µm. (C) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O). Barra: 50 µm.

B

C

T

T

T

*

O

O

O *

A

66


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra fibras colágenas (*) inserindo-se ao tecido ósseo (O), zona de transição (*).

Barra: 20 µm. (B) Mostra as fibras colágenas (setas) inserindo-se ao tecido ósseo (*). Barra: 1 µm.

B

A

**

*

*

* O

67


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra fileiras de células de fibrocartilagem (setas). Barra: 10 µm. (B) Mostra as células

de fibrocartilagem (setas menores), lacunas (setas maiores), fibrocartilagem não mineralizada (*). Barra: 5 µm.

B

A

*

*

68


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra a lacuna de uma célula de fibrocartilagem (**) na região de fibrocartilagem

mineralizada (*). Barra: 1 µm. (B) Mostra as lacunas de um grupo isogênico de condrócitos (**) envoltos pela matriz territorial (*). Barra: 2 µm.

B

A

**

*

*

**

**

*

*

*

69

Análises de MEV com grandes aumentos revelam os feixes de fibras colágenas

que constituem o tendão calcâneo e demonstram uma organização paralela

longitudinal, nestes feixes apresentam-se inseridas gotículas de gordura de formato

arredondado e tamanhos variados (Figuras 27A-B-C).

Ainda analisando o tendão calcâneo em grandes ampliações além dos feixes

de fibras colágenas que apresentam trajetos variados e até mesmo ramificações, as

gotículas de gordura de diversos tamanhos ficaram evidentes. É possível detectar

entre estes feixes de colágeno a presença de hemácias, com seu característico

formato arredondado achatado (Figuras 28A-B).

O tecido ósseo apresenta uma inúmera quantidade de trabéculas ósseas

circundando espaços trabeculares (Figura 29A), que podem ou não apresentar em

seu interior tecido medular. Em maior aumento as trabéculas apresentam abundante

quantidade de lacunas de osteócitos espalhadas por todo o tecido mineralizado

(Figura 29B).

Analisando outras regiões do tecido ósseo detectamos em alguns espaços

trabeculares a presença de tecido medular, nota-se que este possui uma consistência

viscosa pela quantidade de tecido gorduroso, desta forma não é possível identificar

as células sanguíneas maduras, ainda nas trabéculas ósseas destaca-se a presença

de lacunas de osteócitos (Figuras 30A-B).

70


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra feixe de fibras colágenas (*), gotículas de gordura (setas). Barra: 2 µm. (B)

Mostra feixe de fibras colágenas (*), gotículas de gordura. Barra: 0,5 µm. (C) Mostra feixe de fibras colágenas (**), fibras colágenas (setas), gotícula de gordura (*). Barra: 1 µm.

A B

C

*

* *

*

**

71


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra feixes de fibras colágenas (*), gotículas de gordura (setas menores), hemácia

(seta maior). Barra: 2 µm. (B) Mostra feixes de fibras colágenas (*), gotículas de gordura (setas menores), hemácia (seta maior). Barra: 1 µm.

B

A

*

*

*

*

*

72


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra as trabéculas ósseas (setas), espaços trabeculares (*). Barra: 100 µm. (B)

Mostra os espaços trabeculares (*), lacunas de osteócitos (setas). Barra: 50 µm.

B

A

*

*

*

*

*

*

73


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra tecido medular (*), trabéculas ósseas (**), lacunas de osteócitos (setas). Barra:

50 µm. (B) Mostra tecido medular (*), trabécula óssea (**). Barra: 10 µm.

B

A

* **

**

**

*

74

5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO ADULTO

Analises de microscopia eletrônica de transmissão da região de inserção do

tendão calcâneo ao tecido ósseo, nos revela conjuntos de fibras colágenas possuindo

uma organização uniforme e dispostas paralelamente umas às outras. Estas fibras

que constituem o tendão atravessam a região de fibrocartilagem não mineralizada e

por fim adentram a fibrocartilagem mineralizada (Figuras 31A-B).

Na região de fibrocartilagem não mineralizada analisada com MET, foi possível

identificar condrócitos organizados em fileiras e localizados entre as fibras colágenas

que se arranjam de modo paralelo ao redor destas células (Figura 32A).

Análises realizadas em um condrócito desta mesma região em maior aumento

nos revela seu núcleo com formato arredondado e um grande reticulo endoplasmático

granular ocupando uma ampla parte do citoplasma. Ao redor desta célula os

processos citoplasmáticos se destacam ocupando a matriz territorial e até mesmo se

desprendendo nesta matriz que rodeia o condrócito alojado sobre uma lacuna (Figura

32B).

Já ao analisar a região de fibrocartilagem mineralizada é possível observar os

núcleos dos condrócitos apresentando formas variadas e não definidas (Figuras 33A-

B-C). Porém, nota-se os mesmos alojados em lacunas, rodeados por uma matriz

territorial que é circundada por fibras colágenas, mais externamente constata-se a

matriz interterritorial (Figura 33A).

Ao redor dos condrócitos processos citoplasmáticos projetam-se e até mesmo

se desprendem sobre a matriz territorial (Figuras 33A-B). No interior da célula, o

retículo endoplasmático granular é bem desenvolvido e ocupa uma ampla parte do

citoplasma (Figura 33C).

75

Figura 31 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A-B) Mostra as fibras colágenas (setas) inserindo-se na fibrocartilagem mineralizada (*).

Barra: 200 nm.

B

A

*

*

*

*

76


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra na região de fibrocartilagem não mineralizada os condrócitos (setas), núcleo

dos condrócitos (*), fibras colágenas (**). Barra: 1 µm. (B) Mostra uma ampliação do condrócito direito da figura A, com o núcleo (N), retículo endoplasmático granular (setas menores), processos citoplasmáticos (cabeça de seta), lacuna (seta maior), matriz territorial (*). Barra: 0,4 µm.

A

*

*

**

**

N

B

*

77


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra na região de fibrocartilagem mineralizada condrócito e seu núcleo (N), processos

citoplasmáticos (seta), lacuna (cabeça de seta), matriz territorial (parêntese preto), fibras colágenas (*), matriz interterritorial (parêntese branco). Barra: 0,4 µm. (B) Mostra na mesma região um condrócito, núcleo (N), processos citoplasmáticos (setas), fibrocartilagem mineralizada (*). Barra: 0,4 µm. (C) Mostra o núcleo de um condrócito (N), vasto retículo endoplasmático granular (setas). Barra: 0,2 µm.

A

*

N

N N

C

*

* B

78


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Mostra um osteócito (cabeça de seta), núcleo (N), processo celular (seta menor),

canalículo (seta maior), lacuna (*). Barra: 0,5 µm.

Análise de MET demonstra um osteócito embebido em uma matriz óssea

mineralizada, seu núcleo possui o formato alongado e ocupa quase todo o interior

celular, os processos celulares estão situados no interior dos canalículos e através

destes se comunicam com outros osteócitos (Figura 34).

Ao analisar o tendão calcâneo seccionado longitudinalmente em MET, foi

possível demonstrar a organização das fibras colágenas agrupadas em feixes, sendo

que em cada feixe estas estão dispostas em sentidos variados, podendo em um

estarem distribuídas longitudinalmente, em outro transversalmente, obliquamente, ou

até mesmo arranjado da mesma forma em feixes vizinhos. Células tendíneas,

conhecidas como tenócitos são encontradas entre estes conjuntos de fibrilas e se

comunicam uns com os outros através de extensos prolongamentos citoplasmáticos

(Figura 35A). Em maior aumento nota-se um padrão de estriações de forma

homogênea ao longo de toda fibrila colágena (Figura 35B).

N

*

79


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra os feixes de fibras colágenas (*) do tendão calcâneo seccionado

longitudinalmente, tenócitos (cabeças de setas), prolongamentos citoplasmáticos (setas). Barra: 0,5 µm. (B) Mostra as estriações das fibrilas colágenas do tendão. Barra: 0,3 µm.

B

A

*

*

*

*

80

5.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO IDOSO

Análises realizadas na junção osteotendínea do tendão calcâneo sob MET nos

revela a maneira com que as fibras colágenas se inserem ao tecido mineralizado,

estas se organizam de forma símil em feixes de variados tamanhos, porém alguns

desses feixes inserem-se mais superficialmente enquanto outros mais profundamente

no tecido ósseo (Figuras 36A-B).

Sob um aspecto geral das fibrocartilagens no grupo idoso, podemos notar a

presença de condrócitos, que por sua vez não apresentam formato definido,

arranjados em fileiras. Ao redor de cada célula identifica-se a matriz territorial que

também separa células próximas, continua a esta matriz existe a interterritorial,

constituindo o maior espaço entre estas células. Os núcleos na maioria das vezes

apresentam formatos arredondados/ovalados, mas podem ser alongados e

preencherem quase todo o interior celular ou ainda não apresentarem formato definido

(Figuras 37A-B).

Na região mais externa da fibrocartilagem os condrócitos apresentam-se com

um formato alongado, o núcleo ocupa boa parte do citoplasma celular, externamente

a célula feixes de fibras colágenas estão dispostos tanto longitudinalmente quanto

transversalmente (Figura 38A).

Nas camadas mais profundas da fibrocartilagem os condrócitos apresentam

formatos arredondados/alongados, o núcleo possui formato similar ao da célula e

ocupa menos espaço na porção citoplasmática (Figuras 38B-C), nucléolo com formato

arredondado e próximo a membrana nuclear foi evidenciado (Figura 38C).

Reticulo endoplasmático granular e a presença de mitocôndrias podem ser

observados. Nesta região de fibrocartilagem as matrizes territorial e interterritorial são

visualizadas com facilidade (Figuras 38B-C).

81

Figura 36 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra as fibras colágenas (setas) inserindo-se na fibrocartilagem mineralizada (*).

Barra: 0,5 µm. (B) Mostra as fibras colágenas (**) e fibrocartilagem mineralizada (*). Barra: 0,5 µm.

B

A

* *

* *

*

**

**

82


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra condrócitos (setas), matriz territorial (parênteses preto), matriz interterritorial

(parêntese branco), lacuna (*), tecido conjuntivo (**). Barra: 1 µm. (B) Mostra núcleo dos condrócitos (*), processos citoplasmáticos (setas), tecido conjuntivo (**). Barra: 0,5 µm.

B

A

* **

**

*

*

**

**

83


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra núcleo de um condrócito (N), lacuna (seta), fibras colágenas horizontais (*) e

transversais (**). Barra: 0,5 µm. (B) Mostra núcleo (N), reticulo endoplasmático granular (seta) de um condrócito, matriz territorial (*) e interterritorial (**). Barra: 0,5 µm. (C) Mostra núcleo (N), nucléolo (seta maior), mitocôndrias (setas menores), matriz territorial (*) e interterritorial (**). Barra: 0,5 µm.

A B

C

*

**

N

N

*

**

N

* **

84

Análises realizadas no tecido mineralizado revelaram os osteócitos com

formatos alongados e núcleos sem formas definidas, estes por sua vez encontram-se

encapsulados em lacunas, seus processos celulares apresentam diversos tamanhos

como pode ser demonstrado (Figura 39A).

Através de um corte transversal foi possível observar os processos celulares

com formatos arredondados percorrendo o interior de canalículos para se

comunicarem com outras células (Figura 39B).

Secções realizadas no sentido longitudinal do tendão calcâneo nos revelou

conjunto de feixes de fibras colágenas que constitui o tecido tendíneo, estas fibras

apresentam uma ordenada disposição dentro de cada feixe, porém podem apresentar

disposições diferentes entre um feixe e outro (Figura 40A).

As análises dessas fibras em grandes aumentos, nos revelaram as fibrilas

colágenas e suas características estriações, estas possuem um padrão homogêneo e

um perfeito espaçamento entre cada estria ao longo de toda fibrila (Figuras 40B-C).

85


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no tecido mineralizado (TM) um osteócito (seta maior), núcleo (asterisco

branco), processos celulares (setas menores), lacuna (asterisco preto). Barra: 0,5 µm. (B) Mostra num corte transversal o canalículo (Can), processo celular (P). Barra: 50 nm.

B

A

* *

TM

Can P

86


Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra os feixes de fibras colágenas (*) seccionados longitudinalmente. Barra: 1 µm.

(B-C) Mostras as fibrilas colágenas. Barras: 50 nm, 25 nm, respectivamente.

A B

C

*

* *

87

5.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os valores obtidos revelam que a quantidade de colágeno tipo I no grupo adulto

foi de 29,154 ± 8,152% e do tipo III foi de 10,224 ± 3,623%, os resultados estatísticos

demonstram uma quantidade 65% maior de colágeno tipo I em comparação ao tipo

III, sendo que a diferença entre eles é extremamente significante (p < 0,0001), os

dados estão representados no gráfico 1A.

A quantidade média de colágeno tipo I no grupo idoso foi de 12,388 ± 6,853%

e do tipo III foi de 18,285 ± 3,232%, os resultados demonstram uma quantidade 32%

menor de colágeno tipo I em comparação ao tipo III, sendo que a diferença estatística

entre eles foi significante (p = 0,0166), os dados estão exibidos no gráfico 1B.

A quantidade média de colágeno tipo I no grupo adulto foi de 29,154 ± 8,152%

e no grupo idoso 12,388 ± 6,853%, os resultados estatísticos demonstram uma

quantidade 57% maior do tipo I no grupo adulto, a diferença entre os dois grupos é

extremamente significante (p = 0,0002), os dados estão expressos no gráfico 1C.

A quantidade média de colágeno tipo III no grupo adulto foi de 10,224 ± 3,623%

e no grupo idoso 18,285 ± 3,232%, os resultados demonstram uma quantidade 44%

menor de colágeno tipo III no grupo adulto em relação ao idoso, a diferença estatística

entre os grupos é extremamente significante (p < 0,0001), os dados estão

apresentados no gráfico 1D.

88

Gráfico 1 - Quantidade de colágeno nos grupos de animais adultos e idosos

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo I e III no grupo adulto, (***)

indica diferença estatística extremamente significante entre os dois tipos. (B) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo I e III no grupo idoso, (*) indica diferença estatística significante entre os dois tipos. (C) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo I entre o grupo adulto e idoso, (***) indica diferença estatística extremamente significante entre os dois grupos. (D) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo III entre o grupo adulto e idoso, (***) indica diferença estatística extremamente significante entre os dois grupos.

A B

C D

89

A quantidade de células de fibrocartilagem presentes na região de

fibrocartilagem não mineralizada no grupo adulto foi de 91,112 ± 10,857 e na região

de fibrocartilagem mineralizada de 65 ± 10,112 os dados estatísticos demonstram uma

quantidade 29% maior de células na região não mineralizada em comparação com a

região mineralizada, esta diferença é considerada extremamente significante (p <

0,0001), os dados estão expostos no gráfico 2A.

A quantidade de células de fibrocartilagem existentes na região de

fibrocartilagem não mineralizada no grupo idoso foi de 75 ± 17,407 e na região

mineralizada de 42,143 ± 5,984 os valores estatísticos demonstram uma quantidade

44% maior de células na região não mineralizada comparado com a região

mineralizada, esta diferença é considerada muito significante por apresentar p =

0,0022, os valores estão representados no gráfico 2B.

Na região de fibrocartilagem não mineralizada a quantidade de células de

fibrocartilagem no grupo adulto foi de 91,112 ± 10,857 e no grupo idoso de 75 ±

17,407, os dados demonstram uma quantidade 18% maior de células na região não

mineralizada no grupo adulto em relação ao idoso, porém, estatisticamente não existe

diferença, sendo que p = 0,0605, os dados são exibidos no gráfico 2C.

Na região de fibrocartilagem mineralizada a quantidade de células de

fibrocartilagem no grupo adulto foi de 65 ± 10,112 e no grupo idoso 42,143 ± 5,984,

os valores demonstram uma quantidade 35% maior de células nesta região no grupo

adulto comparado ao idoso, estatisticamente esta diferença é considerada

extremamente significante (p = 0,0003), os valores estão expressos no gráfico 2D.

90

Gráfico 2 - Quantidade de células de fibrocartilagem nas regiões de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada nos grupos de animais adultos e idosos

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na

área de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada no grupo adulto, (***) indica diferença estatística extremamente significante. (B) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na área de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada no grupo idoso, (**) indica diferença estatística muito significante. (C) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na área de fibrocartilagem não mineralizada nos grupos adulto e idoso. (D) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na área de fibrocartilagem mineralizada nos grupos adulto e idoso, (***) indica diferença estatística extremamente significante.

A B

C D

91

Gráfico 3 - Espessura do tendão calcâneo

Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Demonstra a espessura do tendão calcâneo ao se inserir no tecido ósseo em ambos os

grupos.

O tendão calcâneo ao se inserir no tecido ósseo no grupo adulto apresenta uma

espessura média de 490,014 ± 96,794 µm e no grupo idoso uma espessura de

465,374 ± 58,515 µm. Os dados analisados demonstram que no grupo adulto a

espessura do tendão é 5% maior em relação ao grupo idoso, estatisticamente não

existe diferença significante entre ambos, sendo que p = 0,4804. Os dados estão

representados no gráfico 3.

92

DISCUSSÃO

93

6 DISCUSSÃO

Os nossos resultados demonstraram as características morfológicas estruturais

e ultraestruturais da junção osteotendínea do tendão calcâneo, assim como as

alterações das fibras colágenas e das células de fibrocartilagem tanto nas regiões de

fibrocartilagem não mineralizada quanto mineralizada em ratos adultos e com

envelhecimento.

Pode-se afirmar ao observarmos em ML de ambos os grupos que estas

revelaram a constituição do tendão formado por células organizadas em fileiras

separadas por um tecido conjuntivo. Kannus (2000) explica que feixes deste tecido

compõem as fibras colágenas constituindo assim a unidade básica do tendão, e que

esta é a menor unidade visível ao microscópio de luz. Além disso, Benjamin e Ralphs

(1998) demonstraram que além das células enfileiradas presentes no tecido tendíneo,

existem grânulos e filamentos de proteoglicanos.

Por outro lado, a inserção do tendão no tecido ósseo constitui uma complexa

área a qual a transição entre estes dois tecidos ocorre por aproximadamente 1 mm

(O'BRIEN, 1997). Toda essa região é composta por 4 zonas e conseguimos identificá-

las com melhor clareza nas imagens de ML coradas com Picro-sirius e analisadas sob

luz polarizada, estas zonas são: 1) tendão, 2) fibrocartilagem não mineralizada, 3)

fibrocartilagem mineralizada e 4) tecido ósseo.

A primeira zona é a parte terminal do tendão, o qual o tecido lamelar é composto

de feixes de colágeno alinhados longitudinalmente, separados por tecido conjuntivo

frouxo que se funde com o peritendão e contem um variado número de fibras elásticas.

O tendão muda gradualmente ao longo da distância de poucos micrômetros para

dentro da segunda zona, a fibrocartilagem não mineralizada. As células assumem o

fenótipo de condrócitos. A terceira zona consiste de fibrocartilagem mineralizada,

sendo que a passagem da segunda para a terceira ocorre de forma abrupta na linha

de frente de mineralização visto como uma linha basofílica (tidemark) e finalmente a

quarta zona, composta de tecido ósseo trabecular (BENJAMIN; EVANS; COPP, 1986;

CLAUDEPIERRE; VOISIN, 2005; THOMOPOULOS et al., 2006).

Além disso, os nossos dados ao nível de ML, em cortes corados com

Hematoxilina-Eosina revelaram a linha de transição que separa a fibrocartilagem não

mineralizada da mineralizada, essa linha é denominada tidemark.

94

Thomopoulos et al. (2006) em um estudo sobre a orientação das fibras

colágenas na região osteotendínea podem esclarecer que esta é uma linha basófila e

representa uma frente de calcificação e ainda os autores Wopenka et al. (2008)

explicam que é o local em que a mineralização com apatita abruptamente se inicia e

Benjamin et al. (2002) enfatizam referindo que a tidemark indica a mudança repentina

no grau de mineralização, do zero no tendão para ~60wt% no tecido ósseo.

Em análises de dados em nosso estudo, no grupo de animais adultos

identificamos tidemark dupla, concordando com os de Oegema et al. (1997) que

explanam que esta ocorre como consequência da fase de ossificação “start-stop” e

que ela possui uma suave ondulação, essa última característica ficou evidente nos

dois grupos de animais adultos e envelhecidos examinados em nosso trabalho.

Quando a tidemark é examinada ao MET esta caracteriza-se por apresentar

uma camada elétron densa de material granular conforme é mostrado por Rufai,

Ralphs e Benjamin (1996).

Os nossos resultados ao ML revelaram diversas células de fibrocartilagem na

porção terminal do tendão, organizadas em fileiras ou em pares, tendo algumas

atravessando a linha tidemark e sendo encontradas na mesma disposição na região

de fibrocartilagem mineralizada, porém em tamanho menor. Benjamin e Ralphs (2000)

revelaram as células e referiram sobre o desenvolvimento de tendões e ligamentos

confirmando os nossos achados, dizendo que estas são organizadas em fileiras e

separadas por feixes de tecido conjuntivo.

Para Claudepierre e Voisin (2005) as células desta região assumem fenótipo

de condrócitos tornando-se arredondadas, arranjadas e distribuindo-se em pares ou

fileiras na matriz extracelular e são contínuas desde a primeira zona de

fibrocartilagem.

De acordo com as nossas observações os condrócitos apresentam formas

arredondadas/alongadas, revelando vários processos citoplasmáticos de diferentes

comprimentos e alojados em lacunas. Yanagisawa et al. (2012) também reportaram

sobre os processos citoplasmáticos das celulas e afirmam que eles se desprendem

na matriz territorial, as fibrilas colágenas que os rodeiam formam estruturas

tridimensionais interligadas cercando estas células para formar a lacuna.

Assim como os condrócitos os nossos resultados permitem observar

claramente os osteócitos em nível de ME, que também se alojam em lacunas

formadas por uma complexa rede de fibras colágenas dispostas de maneira a

95

constituir uma cavidade do mesmo formato da célula que a ocupa, os osteócitos

apresentam processos celulares no interior de canalículos intercomunicando-se com

as células vizinhas.

Apresentam uma morfologia dendrítica, embora seu corpo celular possua

formato fusiforme em ossos longos ou algumas vezes arredondado em ossos chatos,

conforme os resultados de Rochefort, Pallu e Benhamou (2010), em geral as lacunas

e os canalículos da rede lacuno-canalicular são rodeados por matriz óssea (BURGER;

KLEIN-NULEND, 1999). As lacunas contêm os corpos celulares com delgados

processos citoplasmáticos ricos em actina (cada célula possui de 50-60 processos

celulares) que se propagam através de canalículos (VAN HOVE et al., 2009).

Observando com o método de ME, Holmbeck et al. (2005) identificaram que os

osteócitos são separados fisicamente da matriz óssea, mas aparentemente para

compensar seu isolamento de outras células, eles mantêm uma elaborada rede de

processos citoplasmáticos através das quais interagem com outros osteócitos e

células de revestimento nas superfícies endosteal e periosteal da área correlata.

Durante o processo de envelhecimento o corpo sofre diversas alterações tanto

em níveis macroscópios quanto microscópios e essas alterações também foram

analisadas e quantificadas neste estudo.

Referindo-se especificamente na região de junção osteotendínea do tendão

calcâneo os nossos resultados não revelaram nenhuma alteração macroscópica,

entretanto, microscopicamente uma alteração evidente nas análises realizadas com

ML foi a quantidade de células de fibrocartilagem presentes nas regiões de FnM e FM.

Em ambas as regiões a quantidade de células foi maior no grupo de animais

adultos em comparação aos de envelhecimento, mesmo não sendo estatisticamente

significante, observa-se uma pequena diminuição na espessura do tendão ao se

inserir no tecido ósseo de animais envelhecidos.

A nível ultraestrutural as análises nos revelaram as células do grupo de animais

adultos contendo as organelas citoplasmáticas mais desenvolvidas, porém, em ambos

os grupos os núcleos apresentaram aparecer com formatos variados. Por outro lado,

Benjamin, Tyers e Ralphs (1991) afirmam que o núcleo celular normalmente é

arredondado, mas frequentemente pode caracterizar-se de forma denteada ou

multilobada.

Holmes (1971) analisando as alterações ocasionadas pelo envelhecimento nos

tendões da cauda, do calcâneo, do músculo flexor superficial dos dedos e no músculo

96

extensor dos dedos em cachorros, gatos, ratos e macacos, assim como em nosso

estudo, o autor declara que as células possuem grandes núcleos com variados

formatos.

As alterações ocorridas com o processo de envelhecimento, tanto

morfologicamente quanto bioquimicamente são muito bem embasadas por Floridi,

Ippolito e Postacchini (1981) afirmando o seguinte: 1) aumento no volume da matriz

extracelular com relativa diminuição no número de células; 2) diminuição das

organelas celulares; 3) aumento no diâmetro das fibras colágenas. Bioquimicamente

os autores supramencionados explicam que as mudanças são: 1) aumento no

conteúdo de colágeno; 2) diminuição no conteúdo de mucopolisacarídeo e água e 3)

diminuição no turnover de colágeno.

Em um estudo nas alterações advindas com o envelhecimento no tendão

calcâneo de humanos Strocchi et al. (1991) indentificaram mudanças histológicas e

ultraestruturais, assim como em nosso estudo os autores afirmam não aparentar

alterações na arquitetura do tendão quando analisados macroscopicamente, porém,

mudanças celulares e nos componentes fibrosos foram identificados por eles, assim

como, uma regular diminuição no número de células.

Análises ultraestruturais realizadas por Strocchi et al. (1991) demonstram as

células de fibrocartilagem com processos citoplasmáticos longos e delgados, no idoso

os autores demonstram um número reduzido de processos citoplasmáticos curtos,

além de uma diminuição na quantidade e tamanho das células.

No envelhecimento as mudanças funcionais induzem a uma redução na

capacidade de síntese celular, de valores de pico nos recém-nascidos e jovens e o

mínimo na fase de envelhecimento, conforme o relatado por Ippolito et al. (1980);

Floridi, Ippolito e Postacchini (1981) e Squier e Magnes (1983).

A diminuição da síntese provocada pelo envelhecimento ocorre pelas células

apresentarem aparelhos de Golgi diminuído, poucas cisternas de retículo

endoplasmático granular e escassas mitocôndrias (BENJAMIN; TYERS; RALPHS,

1991).

Quanto a presença de número de células também foi avaliado por Lavagnino,

Gardner e Arnoczky (2013), empregando os métodos de análises estatísticas

encontraram uma diminuição significativa no número de células por mm2 o que condiz

com nossos achados. Os autores ainda enfatizam afirmando que o núcleo das células

alongam-se com o referido processo de envelhecimento.

97

Quando as espécimes foram examinadas sob luz polarizada revelaram uma

alteração de tecido conjuntivo com o envelhecimento, sendo que no grupo de animais

adultos o tipo I prevalece e no animal idoso há um predomínio do tipo III.

As fibrilas de colágeno tipo I são estruturas resistentes que fornecem ao tecido

tendíneo força e durabilidade mecânica e o tipo III possui fibrilas mais delgadas em

comparação ao tipo I e possui um papel importante no processo de cicatrização,

porém não possuem a mesma força para resistirem a esforços mecânicos (MAFFULLI

et al., 2000; ERIKSEN et al., 2002; JÄRVINEN et al., 2004; BUCKLEY et al., 2013).

Por outro lado, Józsa et al. (1984) e Maffulli et al. (2000) esclarecem que a

presença do colágeno tipo III normalmente ocorre pela diminuição da resistência do

tendão à forças tensíveis e pode, no entanto, predispor o tendão a rupturas

espontâneas.

Smith et al. (1999) afirmam que a proporção de colágeno tipo III / tipo I aumenta

com o envelhecimento e os nossos resultados podem corroborar na interpretação do

mecanismo morfofuncional, Riley et al. (1994) e Gonçalves-Neto et al. (2002)

completam referindo que a alteração de colágeno aumenta os casos de lesões e

doenças.

Essas alterações de colágeno além de ocorrer no tendão, também acontecem

no tecido ósseo e foram demonstradas em nosso estudo. Ritchie et al. (2006) explica

que esse processo com o avanço da idade acarreta uma deterioração na rigidez da

matriz óssea além de alterações nas estruturas em dimensões em escalas micro e

nanométricas. Eventuais alterações na integridade e a baixa qualidade da rede de

colágeno com o avanço da idade pode resultar em pontes mais fracas e, por

conseguinte, uma menor resistência à fendilhação no osso idoso (WANG et al., 2002;

RITCHIE et al., 2006).

Por fim, é necessário enfatizar que o presente trabalho não apresenta todos os

aspectos inerentes a pesquisa em junção osteotendínea. O emprego de diferentes

métodos de investigação nesta área pode trazer interpretações dos mecanismos

morfofuncionais.

Portanto, outros projetos serão necessários para melhor elucidação destes

aspectos em trabalhos experimentais com associação de substâncias relacionadas

ao tratamento das alterações nas estruturas osteotendíneas.

98

CONCLUSÃO

99

7 CONCLUSÃO

De acordo com a metodologia utilizada e os resultados obtidos podemos

afirmar que:

I. Macroscopicamente não é possível identificar nenhuma alteração na

região analisada;

II. A região terminal do tendão, que entra em contato com o tecido ósseo

diminuiu 5% no grupo idoso, porém esse valor não é estatisticamente

significante;

III. Através de ML observa-se uma redução na quantidade de células de

fibrocartilagem presentes na FnM e na FM no grupo idoso comparado

ao animal adulto;

IV. ML sob luz polarizada nos demonstrou de forma clara a alteração no

colágeno, sendo predominante no grupo adulto o tipo I e no grupo idoso

o tipo III. Como as fibrilas de colágeno tipo III são mais finas que as tipo

I e não possuem a mesma resistência a esforços mecânicos as chances

de lesões aumentam com o envelhecimento;

V. A nível ultraestrutural as células de fibrocartilagem apresentam

processos citoplasmáticos curtos e em número reduzido e uma

diminuída capacidade de síntese devido a aparelhos de Golgi menores,

poucas cisternas de retículo endoplasmático granular e uma menor

quantidade de mitocôndrias no grupo idoso em relação ao adulto;

VI. Em ambos os grupos avaliados os núcleos celulares apresentam formas

e tamanhos variados.

100

REFERÊNCIAS

101

REFERÊNCIAS

AMIEL, D.; KUIPER, S. D.; WALLACE, C. D.; HARWOOD, F. L.; VANDEBERG, J. S. Age-related properties of medial collateral ligament and anterior cruciate ligament: a morphologic and collagen maturation study in the rabbit. Journal of Gerontology, v. 46, n. 4, p. B159-65, 1991. BENJAMIN, M.; EVANS, E. J.; COPP, L. The histology of tendon attachments to bone in man. Journal of Anatomy, v. 149, p. 89-100, 1986. BENJAMIN, M.; KUMAI, T.; MILZ, S.; BOSZCZYK, B. M.; BOSZCZYK, A. A.; RALPHS, J. R. The skeletal attachment of tendons--tendon "entheses". Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, v. 133, n. 4, p. 931-45, 2002. BENJAMIN, M.; MCGONAGLE, D. The enthesis organ concept and its relevance to the spondyloarthropathies. Advances in Experimental Medicine and Biology, v. 649, p. 57-70, 2009. BENJAMIN, M.; RALPHS, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments--an adaptation to compressive load. Journal of Anatomy, v. 193, Pt. 4, p. 481-94, 1998. BENJAMIN, M.; RALPHS, J. R. The cell and developmental biology of tendons and ligaments. International Review of Cytology, v. 196, p. 85-130, 2000. BENJAMIN, M.; TOUMI, H.; RALPHS, J. R.; BYDDER, G.; BEST, T. M.; MILZ, S. Where tendons and ligaments meet bone: Attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. Journal of Anatomy, v. 208, n. 4, p. 471-90, 2006. BENJAMIN, M.; TYERS, R. N.; RALPHS, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. Journal of Anatomy, v. 179, p. 127-36, 1991. BLITZ, N. M.; ELIOT, D. J. Anatomical aspects of the gastrocnemius aponeurosis and its insertion: A cadaveric study. The Journal of Foot & Ankle Surgery, v. 46, n. 2, p. 101-8, 2007. BUCKLEY, M. R.; EVANS, E.; MATUSZEWSKI, P. E.; CHEN, Y. L.; SATCHEL, L. N.; ELLIOTT, D. M.; SOSLOWSKY, L. J.; DODGE, G. R. Distributions of types I, II and III collagen by region in the human supraspinatus tendon. Connective Tissue Research, v. 54, n. 6, p. 374-9, 2013. BURGER, E. H.; KLEIN-NULEND, J. Mechanotransduction in bone--role of the lacuno-canalicular network. FASEB Journal, v. 13, p. S101-12, 1999. Supplement. CALVE, S.; DENNIS, R. G.; KOSNIK.; P. E.; BAAR, K.; GROSH, K.; ARRUDA, E. M. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering, v. 10, n. 5-6, p. 755-61, 2004.

102

CHANG, H. N.; PANG, J. H.; CHEN, C. P.; KO, P. C.; LIN, M. S.; TSAI, W. C.; YANG, Y. M. The effect of aging on migration, proliferation, and collagen expression of tenocytes in response to ciprofloxacin. Journal of Orthopaedic Research, v. 30, n. 5, p. 764-8, 2012. CHEN, T. M.; ROZEN, W. M.; PAN, W. R.; ASHTON, M. W.; RICHARDSON, M. D.; TAYLOR, G. I. The arterial anatomy of the Achilles tendon: anatomical study and clinical implications. Clinical Anatomy, v. 22, n. 3, p. 377-85, 2009. CLAUDEPIERRE, P.; VOISIN, M. C. The Entheses: Histology, Pathology, and Pathophysiology. Joint Bone Spine, v. 72, n. 1, p. 32-7, 2005. CROWNINSHIELD, R. D.; POPE, M. H. The strength and failure characteristics of rat medial collateral ligaments. The Journal of Trauma, v. 16, n. 2, p. 99-105, 1976. DE PALMA, L.; MARINELLI, M.; MEMÈ, L.; PAVAN, M. Immunohistochemistry of the enthesis organ of the human Achilles tendon. Foot & Ankle International, v. 25, n. 6, p. 414-8, 2004. DEL SOL, M.; JUNGE, C.; VÁSQUEZ, B. Inserción del Tendón Calcáneo. International Journal of Morphology, v. 29, n. 3, p. 918-21, 2011. DIAS, F. J.; ISSA, J. P.; BARBOSA, A. P.; DE VASCONCELOS, P. B.; WATANABE, I.; MIZUSAKIIYOMASA, M. Effects of low-level laser irradiation in ultrastructural morphology, and immunoexpression of VEGF and VEGFR-2 of rat masseter muscle. Micron, v. 43, n. 2-3, p. 237-44, 2012. DIAS, F. J.; ISSA, J. P.; IYOMASA, M. M.; COUTINHO-NETTO, J.; CALZZANI, R. A.; IYOMASA, D. M.; SOUSA, L. G.; DE ALMEIDA, S. R.; CURY, D. P.; WATANABE, I. Application of a low-level laser therapy and the purified protein from natural latex (Hevea brasiliensis) in the controlled crush injury of the sciatic nerve of rats: a morphological, quantitative, and ultrastructural study. BioMed Research International, v. 2013, p. 597863, 2013. DOSCHAK, M. R.; ZERNICKE, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions, v. 5, n. 1, p. 35-40, 2005. ERIKSEN, H. A.; PAJALA, A.; LEPPILAHTI, J.; RISTELI, J. Increased content of type III collagen at the rupture site of human Achilles tendon. Journal of Orthopaedic Research, v. 20, n. 6, p. 1352-7, 2002. EVERTS, V.; NIEHOF, A.; TIGCHELAAR-GUTTER, W.; BEERTSEN, W. Transmission electron microscopy of bone. Methods in Molecular Biology, v. 816, p. 351-63, 2012. FAN, H.; LIU, H.; TOH, S. L.; GOH, J. C. H. Anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold in large animal model. Biomaterials, v. 30, n. 28, p. 4967-77, 2009.

103

FERNANDES, G. J. M. Eponímia: Glossário de Termos Epônimos em Anatomia; Etimologia: Dicionário Etimológico da Nomenclatura Anatômica. São Paulo: Plêiade, 1999, 257 p. FLORIDI, A.; IPPOLITO, E.; POSTACCHINI, F. Age-related changes in the metabolism of tendon cells. Connective Tissue Research, v. 9, n. 2, p. 95-7, 1981. FRANZ-ODENDAAL, T. A.; HALL, B. K.; WITTEN, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics, v. 235, n. 1, p. 176-90, 2006. GONÇALVES-NETO, J.; WITZEL, S. S.; TEODORO, W. R.; CARVALHO-JÚNIOR, A. E.; FERNANDES, T. D.; YOSHINARI, H. H. Changes in collagen matrix composition in human posterior tibial tendon dysfunction. Joint Bone Spine, v. 69, n. 2, p. 189-94, 2002. GOSS, C. M. Gray anatomia. 29. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1988. 1147 p. HÉBERT-LOSIER, K.; SCHNEIDERS, A. G.; GARCÍA, J. A.; SULLIVAN, S. J.; SIMONEAU, G. G. Peak triceps surae muscle activity is not specific to knee flexion angles during MVIC. Journal of Electromyography and Kinesiology, v. 21, n. 5, p. 819-26, 2011. HOLMBECK, K.; BIANCO, P.; PIDOUX, I.; INOUE, S.; BILLINGHURST, R. C.; WU, W.; CHRYSOVERGIS, K.; YAMADA, S.; BIRKEDAL-HANSEN, H.; POOLE, A. R. The metalloproteinase MT1-MMP is required for normal development and maintenance of osteocyte processes in bone. Journal of Cell Science, v. 118, Pt 1, p. 147-56, 2005. HOLMES, I. Variations in tendon cell morphology with animal, site and age. Journal of Anatomy, v. 108, Pt 2, p. 305-9, 1971. IPPOLITO, E.; NATALI, P. G.; POSTACCHINI, F.; ACCINNI, L.; DE MARTINO, C. Morphological, immunochemical, and biochemical study of rabbit Achilles tendon at various ages. Journal of Bone and Joint Surgery, v. 62, n. 4, p. 583-98, 1980. ISHIKAWA, H.; SAWADA, H.; YAMADA, E.; Surface and internal morphology of skeletal muscle. Handbook of Physiology-Skeletal Muscle, p. 1-20, 1982. JÄRVINEN, T. A.; JÄRVINEN, T. L.; KANNUS, P.; JÓZSA, L.; JÄRVINEN, M. Collagen fibres of the spontaneously ruptured human tendons display decreased thickness and crimp angle. Journal of Orthopaedic Research, v. 22, n. 6, p. 1303-9, 2004. JÓZSA, L.; BÁLINT, B. J.; RÉFFY, A.; DEMEL Z. Fine structural alterations of collagen fibers in degenerative tendinopathy. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery, v. 103, n. 1, p. 47-51, 1984.

104

JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 11. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011. 524 p. KANNUS, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports, v. 10, n. 6, p. 312-20, 2000. KAWAKAMI, Y.; ICHINOSE, Y.; FUKUNAGA, T. Architectural and functional features of human triceps surae muscles during contraction. Journal of Applied Physiology, v. 85, n. 2, p. 398-404, 1998. KJAER, M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal muscle to mechanical loading. Physiological Reviews, v. 84, n. 2, p. 649-98, 2004. LAVAGNINO, M.; GARDNER, K.; ARNOCZKY, S. P. Age-related changes in the cellular, mechanical, and contractile properties of rat tail tendons. Connective Tissue Research, v. 54, n. 1, p. 70-5, 2013. LI, Z.; KONG, K.; QI, W. Osteoclast and its roles in calcium metabolism and bone development and remodeling. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 343, n. 2, p. 345-50, 2006. LONG, F.; ORNITZ, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, v. 5, n. 1, p. a008334, 2013. MACKIE, E. J.; AHMED, Y. A.; TATARCZUCH, L.; CHEN, K. S.; MIRAMS, M. Endochondral ossification: How cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 40, n. 1, p. 46-62, 2008. MAFFULLI, N.; EWEN, S. W.; WATERSTON, S. W.; REAPER, J.; BARRASS, V. Tenocytes from ruptured and tendinopathic Achilles tendons produce greater quantities of type III collagen than tenocytes from normal Achilles tendons. An in vitro model of human tendon healing. The American Journal of Sports Medicine, v. 28, n. 4, p. 499-505, 2000. MAZZONE, M. F.; MCCUE, T. Common Conditions of the Achilles Tendon. American Family Physician, v. 65, n. 9, p. 1805-10, 2002. MENDEŞ, M.; AKKARTAL, E. Comparison of ANOVA F and WELCH Tests with Their Respective Permutation Versions in Terms of Type I Error Rates and Test Power. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, v. 16, n. 5, p. 711-6, 2010. MONTES, G.; JUNQUEIRA, L. The use of the picrosirius-polarization method for the study of the biopathology of collagen. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 86, p. 1-11, 1991. Supplement, 3. MOORE, K. L.; PERSAUD, T. V. N. Embriologia clínica. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. 576 p.

105

NAKAGAWA, Y.; MAJIMA, T.; NAGASHIMA, K. Effect of ageing on ultrastructure of slow and fast skeletal muscle tendon in rabbit Achilles tendons. Acta Physicologica Scandinavica, v. 152, n. 3, p. 307-13, 1994. NEVE, A.; CORRADO, A.; CANTATORE, F. P. Osteoblast physiology in normal and pathological conditions. Cell and Tissue Research, v. 343, n. 2, p. 289-302, 2011. NISHIMURA, T.; HATTORI, A.; TAKASHI, K. Ultrastructure of the intramuscular connective tissue in bovine skeletal muscle. A demonstration using the cell-maceration/scanning electron microscope method. Acta Anatomica, v. 151, n. 4, p. 250-57, 1994. NOURISSAT, G.; DIOP, A.; MAUREL, N.; SALVAT, C.; DUMONT, S.; PIGENET, A.; GOSSET, M.; HOUARD, X.; BERENBAUM, F. Mesenchymal stem cell therapy regenerates the native bone-tendon junction after surgical repair in a degenerative rat model. Plos One, v. 5, n. 8, p. 1-11, 2010. NOYES, F. R.; DE LUCAS, J. L.; TORVIK, P. J. Biomechanics of anterior cruciate ligament failure: an analysis of strain-rate sensitivity and mechanisms of failure in primates. Journal of Bone and Joint Surgery, v. 56, n. 2, p. 236-253, 1974. O'BRIEN, M. Structure and metabolism of tendons. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports, v. 7, n. 2, p. 55-61, 1997. OEGEMA JR, T. R.; CARPENTER, R. J.; HOFMEISTER, F.; THOMPSON JR, R. C. The interaction of the zone of calcified cartilage and subchondral bone in osteoarthritis. Microscopy Research and Technique, v. 37, n. 4, p. 324-32, 1997. OKITA, M.; NAKANO, J.; KATAOKA, H.; SAKAMOTO, J.; ORIGUCHI, T.; YOSHIMURA, T. Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril arrangement in the endomysium of immobilized rat soleus muscle. Ultrasound in Medicine & Biology, v. 35, n. 2, p. 237-44, 2008. PEIXINHO, C. C. Biomicroscopia ultrassônica para caracterização biomecânica do tríceps sural saudável e lesionado de ratos. 2010. 74 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010. REYNOLDS, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. The Journal of Cell Biology, v.17, p. 208-12, 1963. RILEY, G. P.; HARRALL, R. L.; CONSTANT, C. R.; CHARD, M. D.; CAWSTON, T. E.; HAZLEMAN, B. L. Tendon degeneration and chronic shoulder pain: changes in the collagen composition of the human rotator cuff tendons in rotator cuff tendinitis. Annals of the Rheumatic Diseases, v. 53, n. 6, p. 359-66, 1994. RITCHIE, R. O.; NALLA, R. K.; KRUZIC, J. J.; AGER III, J. W.; BALOOCH, G.; KINNEY J. H. Fracture and Ageing in Bone: Toughness and Structural Characterization. Strain, v. 42, n. 4, p. 225-32, 2006.

106

RIZZOLO, R. J. C.; MADEIRA, M. C. Anatomia facial com fundamentos de anatomia geral. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2012. 349 p. RIZZOLO, R. J. C.; MADEIRA, M. C. Anatomia facial com fundamentos de anatomia sistêmica geral. São Paulo: Sarvier, 2004. 350 p. ROCHEFORT, G. Y.; PALLU, S.; BENHAMOU, C. L. Osteocyte: the unrecognized side of bone tissue. Osteoporosis International, v. 21, n. 9, p. 1457-69, 2010. RUFAI, A.; RALPHS, J. R.; BENJAMIN, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. Journal of Anatomy, v. 189, Pt 1, p. 185-91, 1996. RUSSO, C. R.; LAURETANI, F.; BANDINELLI, S.; BARTALI, B.; DI IORIO, A.; VOLPATO, S.; GURALNIK, J. M.; HARRIS, T.; FERRUCCI, L. Aging bone in men and women: beyond changes in bone mineral density. Osteoporosis International, v. 14, n. 7, p. 531-8, 2003. SCHMAEDECKE, A. Estudo quantitativo das fibras nervosas do periósteo acetabular em cães. 2004. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciência) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004. SCHWARTZ, A. G.; PASTERIS, J. D.; GENIN, G. M.; DAULTON, T. L.; THOMOPOULOS, S. Mineral distributions at the developing tendon enthesis. PLoS One, v. 7, n. 11, p. e48630, 2012. SMITH, R. K.; BIRCH, H.; PATTERSON-KANE, J.; FIRTH, E. C.; WILLIAMS, L.; CHERDCHUTHAM, W.; VAN WEEREN, W. R.; GOODSHIP, A. E. Should equine athletes commence training during skeletal development?: Changes in tendon matrix associated with development, ageing, function and exercise. Equine Veterinary Journal Supplement, n. 30, p. 201-9, 1999. SQUIER, C. A.; MAGNES, C. Spatial relationships between fibroblasts during the growth of rat-tail tendon. Cell and Tissue Research, v. 234, n. 1, p. 17-29, 1983. STROCCHI, R.; DE PASQUALE, V.; GUIZZARDI, S.; GOVONI, P.; FACCHINI, A.; RASPANTI, M.; GIROLAMI, M.; GIANNINI, S. Human Achilles tendon: morphological and morphometric variations as a function of age. Foot & Ankle, v. 12, n. 2, p. 100-4, 1991. THOMOPOULOS, S.; GENIN, G. M.; GALATZ, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - what development can teach us about healing. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions, v. 10, n. 1, p. 35-45, 2010. THOMOPOULOS, S.; MARQUEZ, J. P.; WEINBERGER, B.; BIRMAN, V.; GENIN, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. Journal of Biomechanics, v. 39, n. 10, p. 1842-51, 2006.

107

TOZER, S.; DUPREZ, D. Tendon and Ligament: Development, Repair and Disease. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews, v. 75, n. 3, p. 226-36, 2005. VAN HOVE, R. P.; NOLTE, P. A.; VATSA, A.; SEMEINS, C. M.; SALMON, P. L.; SMIT, T. H.; KLEIN-NULEND, J. Osteocyte morphology in human tibiae of different bone pathologies with different bone mineral density--is there a role for mechanosensing? Bone, v. 45, n. 2, p. 321-9, 2009. VOLETI, P. B.; BUCKLEY, M. R.; SOSLOWSKY, L. J. Tendon healing: repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering, v. 14, p. 47-71, 2012. WANG, X.; SHEN, X.; LI, X.; AGRAWAL, C. M. Age-related changes in the collagen network and toughness of bone. Bone, v. 31, n. 1, p. 1-7, 2002. WASNICH, R. D. Perspective on fracture risk and phalangeal bone mineral density. Journal of Clinical Densitometry, v. 1, n. 3, p. 259-68, 1998. WATANABE, I. Scanning electron microscopy atlas of cells and tissues of the oral cavity. São Paulo: ICB/SBIB, Publicação FAPESP e CNPQ, 1998. 196 p. WATANABE, I.; YAMADA, E. The fine structure of lamellated nerve endings found in the rat gingival. Archivum Histologicum Japonicum, v. 46, p. 173-82, 1983. WATSON, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. Journal Biophysical Biochemical Cytology, v.4, n. 4, p. 475-8, 1958. WHITE, A.; WALLIS, G. Endochondral ossification: A delicate balance between growth and mineralisation. Current Biology, v. 11, n. 15, p. R589-91, 2001. WOLFF, K. S.; WIBMER, A. G.; BINDER, H.; GRISSMANN, T.; HEINRICH, K.; SCHAUER, S.; NEPP, R.; ROIS, S.; RITSCHL, H.; TEUFELSBAUER, H.; PRETTERKLIEBER, M. L. The avascular plane of the Achilles tendon: a quantitative anatomic and angiographic approach and a base for a possible new treatment option after rupture. European Journal of Radiology, v. 81, n. 6, p. 1211-5, 2012. WONG, M. W.; QIN, L.; LEE, K. M.; LEUNG, K. S. Articular cartilage increases transition zone regeneration in bone-tendon junction healing. Clinical Orthopaedics and Related Research, v. 467, n. 4, p. 1092-1100, 2009. WONG, M. W.; QIN, L.; TAI, J. K. O.; LEE, K. M.; LEUNG, K. S.; CHAN, K.M. Engineered allogeneic chondrocyte pellet for reconstruction of fibrocartilage zone at bone–tendon junction - A preliminary histological observation. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, v. 70, n. 2, p. 362-7, 2004. WOO, S. L.; PETERSON, R. H.; OHLAND, K. J.; SITES, T. J.; DANTO, M. I. The effects of strain rate on the properties of the medial collateral ligament in skeletally immature and mature rabbits: A biomechanical and histological study. Journal of Orthopaedic Research, v. 8, n. 5, p. 712-21, 1990.

108

WOOD, L. K.; ARRUDA, E. M.; BROOKS, S. V. Regional stiffening with aging in tibialis anterior tendons of mice occurs independent of changes in collagen fibril morphology. Journal of Applied Physiology, v. 111, n. 1, p. 1-32, 2011. WOOLF, A. D.; PFLEGER, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bulletin of the World Health Organization, v. 81, n. 9, p. 646-56, 2003. WOPENKA, B.; KENT, A.; PASTERIS, J. D.; YOON, Y.; THOMOPOULOS, S. The tendon-to-bone transition of the rotator cuff: a preliminary Raman spectroscopic study documenting the gradual mineralization across the insertion in rat tissue samples. Applied Spectroscopy, v. 62, n. 12, p. 1285-94, 2008. WORTHAM, R. A. The development of the muscles and tendons in the lower leg and foot of chick embryos. Journal of Morphology, v. 83, n. 1, p. 105-48, 1948. YANAGISAWA, H.; HOSHI, K.; ASAWA, Y.; EJIRI, S.; SATO, K.; OZAWA H. Matrix remodeling and cytological changes during spontaneous cartilage repair. Journal of Electron Microscopy (Tokyo), v. 61, n. 4, p. 237-48, 2012. ZHOU, Z.; AKINBIYI, T.; XU, L.; RAMCHARAN, M.; LEONG, D. J.; ROS, S. J.; COLVIN, A. C.; SCHAFFLER, M. B.; MAJESKA, R. J.; FLATOW, E. L.; SUN, H. B. Tendon-derived stem/progenitor cell aging: defective self-renewal and altered fate. Aging Cell, v. 9, n. 5, p. 911-5, 2010.

Documents

DIEGO PULZATTO CURY