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Max-Planck-Institut fiir Ziichtungsforschung (Erwin-Baur-Institut), Abteilung Straub, Koln-Vogelsang, Deutschland

Dielektrischer Durchbruch des Plasmalemmas von Valerianella locusta-Protoplasten

The Dielectric Breakdown in the Plasmalemma of Valerianella locusta Protoplasts

HANS-HENNING STEINBISS

Mit 6 Abbildungen

Eingegangen am 16. Dezember 1977· Angenommen am 14. Januar 1978

Summary Dielectric breakdown of the plasmalemma of Valerianella protoplasts (mean volume

4300 ,um3) was observed in high external fields (approx. 1000-1600 V/cm) using an elec­trolytical discharge chamber which was part of a high voltage circuit. This phenomenon occurred when membrane potential reached a critical value of 1.3 V and was not associated with overall damage to the protoplasts. It was demonstrated that dielectric breakdown is followed by an uptake of 14C-mannitol. The protoplasts resealed completely at 25°C as shown by incorporation of mannitol. Dielectric breakdown of protoplast membranes provi­des a successful technique for the injection of foreign genetic materials in isolated proto­plasts.

Key words: dielectric breakdown, permeation, protoplasts, Valerianella locusta.

Einleitung

Au~ere elektrische Felder, die kurzzeitig, d. h. in f-lsec, dem inneren elektrisc'hen Feld von Zellmembranen iiberlagert werden, konnen in ihnen reversible Permeabili­tatsanderungen induzieren. Dieses Phanomen wurde erstmalig von NEUMANN and ROSENHECK (1972) und ZIMMERMANN et al. (1973) experimentell nachgewiesen und beinhaltet die Moglichkeit, nieder- und hohermolekulare Substanzen in isolierte Pflanzenzellen oder zellwandlose Protoplasten einschleusen zu konnen. Angeregt wurde die vorliegende Arbeit durch die grundlegenden Untersuchungen an hamoly­sierten Erythrozyten von RIEMANN et al. (1975) und ZIMMERMANN et al. (1975,

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1976 a-c), insbesondere aber durch den erfolgreichen EinschluB von aktiver Urease in Erythrozyten-ghosts durch ZIMMERMANN et al. (1976 b).

Praktische Anwendung konnte diese Technik bei der Aufnahme von fremden Nukleinsauren in Pflanzenzellen finden, wenn der Nachweis gelange, daB isolierte Protoplasten eine lokale Membraninstabilitat - induziert im elektrischen Feld einer Entladungskammer - unbeschadigt liberstehen und nach einer gewissen Erho­lungszeit auch ausheilen konnen. Bisher bediente man sich bei DNA-Aufnahme­studien der permeationssteigernden Polykationen (u. a. OHYAMA et aI., 1972; Su­ZUCKI and TAKEBE, 1976; HESS, 1976; UCHIMIYA and MURAHIGE, 1977; COCKING, 1977). Durch den dielektrischen Durchbruch im Plasmalemma bestlinde nun die Moglichkeit, Makromolekiile in Sekundenschnelle unkontrolliert in Protoplasten permeieren zu lassen. Dieser Bericht behandelt das Verhalten von isolierten Proto­plasten im elektrisc'hen Hochspannungsfeld und die Permeationssteigerung flir ra­dioaktives Mannitol.

Material und Methoden Blattmaterial Freilandpflanzen von Valerianella locusta (1.) LATERRADE em. BETCKE.

Sterilisation 1 min in 700f0igem Kthanol.

Vorplasmolyse Abaxiale Blattepidermis entfernt, 30 min in 2,5 Ofo KCL und 1 Ofo MgCl2 . 6 H 20.

Enzymbehandlung 16 h ohne Schiitteln bei 20 DC in 10f0 Meicellase, 0.25 Ofo Macerozym, 0,10f0 KH2P04,

2,5 Ofo KCl, 1 Ofo MgCl2 . 6 H 20, 770 mosmol und pH 5,6.

Reinigung Grobreinigung mit Nylonnetz (Maschenweite 40 ,urn), dann zweimal zentrifugieren (3

min, 200 g) in 2,5 Ofo KCl, 1 Ofo MgCL2· 6 H 20, 0.27 Ofo Na2HP04· 12 H 20, 0,033 Ofo NaH2P04 · 1 H 20, 0,2 Ofo Glukose, 770 mosmol und pH 6,7.

Ausbeute 3-4 X 106 Protoplasten pro Gramm Frischgewicht.

Pulsanlage Hochspannungsanlage und Entladungskammer nach NEUMANN and ROSENHECK (1972)

und RIEMANN et al. (1975), Knderung der Pulslange durch Variation der Speicherkondensa­torkapazitat, Kontrolle der Feldstarke und Pulslange mit Speicheroszillograph Phillips PM 3234, Temperaturkonstanz in der Entladungskammer durch Kiihlwassermantel und Wasser­bad Lauda K4R.

Pulsmedium Wie Reinigungsmedium, aber zusatzlich 1 ,uCi HC-Mannitol (spez. Aktivitat 10-30

,uCilmmol).

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Protoplastendichte 8 X 106 Protoplasten pro ml.

Erholungsdauer 15 min bei 1200 Lx und 20°C.

Waschen 4mal zentrifugieren mit 850f0igem Seewasser (3 min bei 200 g).

Auswertungg Vom letzten Riickstand wurde der Gesamtchlorophyllgehalt nach ARNON (1949) und das

mit 90% igem Methanol extrahierbare HC-Mannitol szintillations-spektrometrisch bestimmt. Graphisch ausgewertet wurde jeweils die Mannitolaufnahmerate pro mg Chlorophyll abzug­lich der HC-Aufnahme einer unbehandelten Kontrollprobe.

Ergebnisse

Die enzymatiseh gewonnene Protoplastenfraktion setzt sieh zusammen aus plasti­denfreien Epidermisprotoplasten (12,70/0) und Protoplasten des assimilierenden Pa­renehyms (87,30/0). Beide Typen differieren deutlieh im durehsehnittliehen Volu­men (Fig. 1), wurden aber nieht voneinander getrennt.

('I.) 40

30

20

10

Mean volume (/0 311m3)

_ epidermal 13,4

= parenchymatous 4.3 protoplasts of Valerianella locusta

,- ...... 2 4 6 8 10 12 14 16 182022 RadlUs(pm)

0.30.92.1 4.27.2 12 1724 34 45 Volume(/03I'm3)

Fig. 1: Size distribution of 1100 isolated protoplasrs measured microscopically.

Fig. 2 gibt den Eintransport von HC-Mannitol in Abhangigkeit von der auGeren Feldsdirke bei versehiedenen Zeitkonstanten i fUr die Entladung der Speieherkon­densatoren wieder. Die Aufnahmekurven zeigen bei PulsHingen von 14-175 I1see einen sigmoiden Verlauf. Oberhalb von 1400 V I em wird eine sinkende Eintrans­portrate pro mg Chlorophyll dureh fortsehreitende Protoplastenzerstorung vorge­tauseht. Bei dem sehr kurzen PuIs von 2,3 I1sec seheint sieh die Aufnahmekurve der Epidermisprotoplasten (200-660 V lem) mit derjenigen der Mesophyllprotoplasten (1200-1400 V lem) zu iibersehneiden. Dazwisehen spiegelt die sinkende Aufnahme­rate einen zunehmenden Verlust an epidermalen Protoplasten wider, was sieh mit Iiehtmikroskopisehen Beobaehtungen deekt.

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(Jlsec )

-50 -26 -175

-110

· .. ······ .. ·····-8

................... _2.3

600 1000 1400 1800 (Volt) Electric field strength (V.cm-I)

Fig. 2: Dielectric breakdown of Valerian ella locusta protoplasts in homogeneous electric fields. The 14C-mannitol uptake is plotted as a function of the external field strength for various pulse lengths 't (that are different time constants 't for the discharge of the capaci­tors). The pulse length was varied between 2,3 and 175 ftsec by changing the storage capa­citor of the high voltage circuit. The suspension density was 1 part protoplasts to 30 parts solution. All values are above control level.

~3

l ~Ol

(V.cm- I)

__ ----e 1400

1600 1200

1000

e 800

600

180 Pulse length r (psec)

Fig. 3: 14C-mannitol uptake as a function of increasing pulse length 't at different electric field strengths. For experimental conditions, sec Fig. 2. Symbols as in Fig. 2. .

In Fig. 3 ist fur verschiedene Feldstarken die Mannitolaufnahme gegen die Puls­lange aufgetragen. Bei gegebener elektrischer Feldstarke und mit steigender Pulslan­ge nimmt die Rate zunachst zu. 1m Bereich von 1600 V fcm zeigt die sinkende Auf­nahmerate eine Schadigung der Protoplasten an. Bei mittleren Feldstarken laBt der weitere Kurvenverlauf vermuten, daB mit wachsender PulsHinge die Mannitolauf-

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.~ 8 !:: <> .. 6 i:jj

20 40 60 80 100 120 140 160 180

Pulse length '[ (psec)

Fig. 4: Electric field strength required for a half maximal value of HC-mannitol uptake as a function of increasing pulse length T. The electric field strength increases rapidly at very short pulse lengths. At longer pulse lengths an asymptotic value of the electric field strength seemes to be reached. For experimental conditions, see Fig. 2. The data are taken from Fig. 2.

nahme nicht weiter gesteigert werden kann. Sehr kurze Pulse bewirken bei allen Feldstarken eine verschieden starke Permeationssteigerung fiir Mannitol, was auf die beiden unterschiedlichen Protoplastentypen zuriickgefiihrt werden konnte.

Unter Verwendung der Megdaten aus Fig. 2 und Fig. 3 ist diejenige Feldstarke in Fig. 4 gegen die Pulslange aufgetragen, welche einen halbmaximalen Eintrans­port von Mannitol in Mesophyllprotoplasten induziert. Die aug ere Feldstarke hangt hyperbelformig von der Pulslange abo Wenn man annimmt, dag die halbma­ximalen Aufnahmeraten am Wendepunkt der sigmoiden Kurven (Fig. 2) den die­lektrischen Durchbruch im Plasmalemma von Protoplasten mit durchschnittlichem Volumen (4300 .um3) wiedergeben, dann lagt sich aus der Auftragung 111' als asymptotischer Grenzwert 980 V / cm ermitteln (Fig. 5). Diese «kritische» aug ere Feldstarke ermoglicht eine Losung der Laplace Gleichung (ZIMMERMANN et aI., 1976), und es ergibt sich fiir Protoplasten des assimilierenden Parenchyms eine «kritische» Membranspannung von 1,3 V .

.r 16 'S e ~~" !:'" ., C> 12 • ~.:: ~ 10.

8

6

•

0.05 0.1 0.15 Vt' (I'S~c-1)

Fig. 5: Plot of the electric field strength versus the reciprocal pulse length (1 IT) for 14C_ mannitol uptake by isolated protoplasts. A linear relationship can be observed between the electric field strength required and 1 IT. For T -+ 00, the electric field strength ist found to be 980 V! cm. The data are taken from Fig. 4.

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10 20 30 40 50 60 ~ Resealing period (min)

Fig. 6: The 14C-mannitol uptake by protoplasts is plotted against the resealing period at various temperatures. 14C-mannitol is added immediately after dielectric breakdown or af­ter different resealing times.

Die praktische Anwendungsmoglichkeit des dielektrisc'hen Durchbruches hangt entscheidend davon ab, ob die Protoplasten Ausheil- (resealing-)Eigenschaften besit­zen und die urspriinglichen Membraneigenschaften restaurieren konnen, d. h., daB mit fortschreitender Erholungszeit die Mannitolaufnahme bis auf das MaB einer un­gereizten Kontrollprobe sinkt. In Fig. 6 ist einedeutliche Temperaturabhangigkeit dieses Ausheilprozesses ablesbar: Nach 30 min bei 25°C ist keine Permeationsstei­gerung fiir 14C-Mannitol mehr zu erkennen, wahrend die auf 10°C bzw. 5°C un­terkiihlten Protoplasten die Membraninstabilitat zwar langer aufrechterhalten, je­doch innerhalb von 120 min nicht vollstandig ausheilen konnen.

Diskussion

Die im Ergebnisteil beschriebenen Versuche zeigen, daB die Permeation von Man­nitol bei Erreichen einer kritischen Membranspannung von 1,3 V stark ansteigt. Nach RIEMANN et al. (1975) hangt dieser Wert ausschlieBlich von der Membran­struktur abo Demgegeniiber solI sich das Protoplastenvolumen in der jeweils anzule­genden kricischen auBeren Feldstarke niederschlagen. Da aber der Feinbau des PI as­malemmas von sehr vielen entwicklungsphysiologischen Faktoren abhangt und zu­satzlich hohe Anforderungen an die Reinheit und Volumenkonstanz der Protopla­stenfraktion zu stellen sind, erweisen sich quantitative Untersuchungen mit isolier­ten Protoplasten als sehr schwierig. Der dielektrische Zusammenbruch von Zell­membranen solI deshalb an dieser Stelle nur unter dem Gesichtspunkt der Permea­tionssteigerung fiir nieder- und hohermolekulare Substanzen betrachtet werden, zu-

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mal auch bei Erythrozyten die Porenentstehung noch kontrovers diskutiert wird (KINOSITA and TSONG, 1977 a, b).

Bei Valerian ella locusta zeichnet sich die leicht zu isolierende Protoplastenfrak­cion durch Reinheit und Stabilitat aus, was eine zusatzliche Trennung von intakten und defekten Protoplasten uberflussig macht. Besonders wichtig fur die praktische Anwendung der Entladungskammer ist die Tatsache, daB dieelektrisch induzierte Membraninstabilitat bei 25°C vollig reversibel ist und bei 5°C bzw. 10°C Hinger aufrechterhalten werden kann als bei 25°C. Somit bietet sich fur weitere Aufnah­mestudien folgende Methode an: Oberlange Pulse (> 50 /-lsec) bei 1000-1400 V/cm, eine Puls- bzw. Erholungstemperatur von 10°C (30 min), danach vollstandi­ge Ausheilung bei 25-28 °C (30 min). In weiteren Versuchen wird nun gepruft, ob dieser Arbeitsgang auf Protoplasten anderer Species ubertragbar ist, welche fur die Pflanzengenetik wichtigen Makromolekule mit dieser Methode in regenerierbare Protoplasten eingeschlossen werden konnen und ob nach einem dielektrischen Zu­sammenbruch die Regeneration von Protoplasten zu Pflanzen zu erreichen ist.

Herrn Prof. U. ZIMMERMANN und seinen Mitarbeitern danke ich fiir die Einfiihrung in die Problematik des dielektrischen Durchbruchs von Zellmembranen und die wertvolle technische Hilfe.

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Dr. HANS-HENNING STEINBISS, MPI fur Zuchtungsforschung, Abteilung Straub, D-5000 Koln-Vogelsang, Bundesrepublik Deutschland.

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