DIFERENCIAS GENÉTICAS ENTRE RATAS … · 2009-04-07 · El linaje UChA se diferencia del linaje UChB en el gen Aldh2: ... Nd5 y Nd6 de ambos linajes y el gen Nd4 del linaje UChA

UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica Laboratorio de Farmacoterapia Génica

DIFERENCIAS GENÉTICAS ENTRE RATAS ABSTEMIAS (UChA) Y BEBEDORAS DE ALCOHOL (UChB)

EN LOS GENES DE SIETE SUBUNIDADES DEL COMPLEJO I CODIFICADAS EN EL GENOMA MITOCONDRIAL

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE BIOQUÍMICO

GINEZ ANDRÉS GONZÁLEZ MARTÍNEZ

Patrocinante y Directora de Memoria Dra. Amalia Sapag Muñoz de la Peña

Santiago, Chile 2007

Esta memoria se realizó en el Laboratorio de Farmacoterapia Génica con fondos

provenientes del Proyecto FONDECYT 1050480 y, a la fecha (Agosto de 2007), ha

dado origen a las siguientes comunicaciones.

Sapag A, González-Martínez G, Encina L, Lobos-González L, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Four complex I proteins encoded in the mitochondrial genome are different in low drinker UChA and high drinker UChB rats” Panel 30th Annual Scientific Meeting of the Research Society on Alcoholism (RSA). Hyatt Regency Chicago, Chicago, Illinois, EE.UU. 7-12 de Julio, 2007 Alcoholism: Clinical and Experimental Research 31(6) Suppl.: 192A, 733 (2007)

González-Martínez G. “Beber o no beber alcohol: el poder de los genes” Oral XII Semana Nacional de la Ciencia y Tecnología. Colegio Teresiano Enrique de Ossó, Santiago, Chile. 5 de Octubre, 2006

Sapag A, González-Martínez G, Lobos-González L, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Maternal inheritance, mitochondrial complex I and alcohol consumption: differences between nondrinker (UChA) and drinker (UChB) rats in three mitochondrial genes” Panel 13th Congress of the International Society for Biomedical Research on Alcoholism (ISBRA). Wentworth Sydney, Sidney, Australia. 10-13 de Septiembre, 2006 Alcoholism: Clinical and Experimental Research 30(9) Suppl.: 155A, 810 (2006) González-Martínez G, Lobos-González L, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Herencia materna en alcoholismo: genes del complejo I mitocondrial. Diferencias entre ratas bebedoras de alcohol (UChB) y abstemias (UChA)” Oral XXIII Congreso de la Asociación Nacional de Estudiantes de Bioquímica (ANEB). Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. 2-4 de Agosto, 2006 Libro de resúmenes, página 31.

González-Martínez G, Lobos-González L, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Alcoholismo y herencia materna: diferencias en genes del complejo I mitocondrial entre ratas abstemias (UChA) y bebedoras de alcohol (UChB)” Panel XXVIII Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. Centro de Convenciones Paso Pehuenches, Talca, Chile. 9-12 de Enero, 2006 Libro de resúmenes, página 43.

González-Martínez G, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Búsqueda de factores genéticos mitocondriales que determinan aversión al alcohol: diferencias entre ratas UChA y UChB” Panel XLVIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile. Gran Hotel Pucón, Pucón, Chile. 13-16 de Octubre, 2005 Biological Research 38: R-88, 20 (2005)

“ El hecho de que tenga los pies en la tierra es sólo una casualidad ”

AGRADECIMIENTOS En primer lugar agradecer a mi madre y a mi hermano por la paciencia (que

probablemente yo no la hubiese tenido) y el apoyo durante toda la carrera, en especial,

durante el período de redacción de la tesis. También a mi padre, por su apoyo.

A mis profesores, en especial a mi directora de tesis Dra. Amalia Sapag, no sólo por su

gran dedicación y entrega en temas científicos sino también por sus consejos en el

ámbito profesional. Además, agradecer muy especialmente al director del laboratorio

Dr. Yedy Israel por su gran aporte a este trabajo. Gracias a ambos por la paciencia que

han tenido conmigo.

A mis compañeros de laboratorio, Gabriel, Gonzalo, Giuliana, Javier, Mario, Paula, y

Robel, por sus aportes en temas científicos, de diario vivir y por compartir momentos

recreacionales en el Santa Inés.

También, muy especialmente a mis compañeros y amigos de la generación que entró

el año 2000 a la carrera Bioquímica y a los que he ido conociendo durante el

transcurso de la tesis. Con todos ellos he compartido una etapa importante de mi vida y

que no se olvidará jamás.

Al final, pero no menos importante, a mis amigos del mundo exterior que hacen de

cable a tierra y ayudan a pensar en otras cosas. En especial a mi gran amigo del

colegio Jorge, a mis compañeros de baby-fútbol, y a los amigos de parranda.

ABREVIATURAS ALDH2: deshidrogenasa aldehídica mitocondrial DNA: ácido desoxirribonucleico EDTA: etilendiaminotetraacetato FAD: flavina adenina dinucleótido gDNA: ácido desoxirribonucleico genómico Km: constante de Michaelis-Menten mRNA: ácido ribonucleico mensajero NAD+: nicotinamida adenina dinucleótido nt: nucleótido pb: pares de bases PCR: reacción en cadena de la polimerasa RNA: ácido ribonucleico UV: ultravioleta

RESUMEN La predisposición al alcoholismo está en gran parte determinada por factores genéticos

que son difíciles de abordar en humanos, por lo que se han desarrollado en el mundo

líneas de ratas bebedoras y no bebedoras de alcohol para estudiar los factores

permisivos y protectores del alcoholismo. En Chile se encuentran la línea UChA

(Universidad de Chile, Abstemias) y la línea UChB (Universidad de Chile, Bebedoras)

que corresponden a ratas derivadas de la cepa Wistar. Las ratas UChA beben entre

0,1 y 1 g de etanol/kg/día, en cambio las ratas UChB beben entre 4 y 6 g/kg/día.

En la rata y el hombre la metabolización del etanol ocurre principalmente en el hígado,

donde la deshidrogenasa alcohólica (ADH) transforma el etanol en acetaldehído que es

transformado en acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). La

ADH y la ALDH2 utilizan NAD+ como cofactor en las reacciones de oxidación.

El linaje UChA se diferencia del linaje UChB en el gen Aldh2: el alelo Aldh22 se

encuentra exclusivamente en el linaje UChA y los alelos Aldh21 y Aldh23 se encuentran

en el linaje UChB, siendo el alelo Aldh23 exclusivo del linaje bebedor. Además, el linaje

UChA se diferencia del UChB en la capacidad de generación de NAD+ de las

mitocondrias: menor en las mitocondrias del linaje UChA que en las del linaje UChB.

En ratas, la variante ALDH23 es suficiente para generar un consumo elevado de

alcohol, independientemente de la mitocondria que posean. En cambio, la variante

ALDH22 es necesaria pero no suficiente para determinar un bajo consumo de alcohol,

fenotipo que sí se manifiesta cuando, además de la ALDH22, las ratas tienen

mitocondrias de menor capacidad de generar NAD+. Las diferencias en las

capacidades respiratorias mitocondriales se deben al complejo I (deshidrogenasa de

NADH) formado por 46 subunidades. Nueve de ellas son de herencia exclusivamente

materna, dos codificadas en el cromosoma X y siete en el genoma mitocondrial. En

esta memoria se estudiaron los genes mitocondriales que codifican subunidades del

complejo I de las ratas UChA y UChB con el propósito de identificar las bases

moleculares de las diferencias bioquímicas entre ambos linajes.

Se amplificaron, secuenciaron y analizaron, de cinco ratas UChA (Aldh22/Aldh22) y

cinco ratas UChB (Aldh23/Aldh23), siete genes mitocondriales que codifican sendas

subunidades del complejo I mitocondrial. No se encontró heteroplasmia puesto que hay

un sólo tipo de mitocondria por linaje, es decir, para cada gen, las cinco ratas UChA

son iguales entre sí y las cinco ratas UChB también son iguales entre sí.

Se encontró que las ratas UChA (no bebedoras) y UChB (bebedoras de alcohol) se

diferencian en los genes mitocondriales Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I.

No se encontraron diferencias nucleotídicas en el gen Nd4L. Los genes Nd1 y Nd3 sólo

tienen diferencias nucleotídicas silentes mientras que los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6

tienen además diferencias nucleotídicas conducentes a cambios aminoacídicos, por lo

que ambos linajes difieren en cuatro proteínas. Las subunidades ND2 se diferencian en

cuatro posiciones aminoacídicas, (UChA/UChB) posiciones 150 (Ser/Asn), 265

(Thr/Ala), 304 (Met/Thr) y una inserción de histidina en la posición 318 (His/---). Estas

variaciones aminoacídicas en la proteína ND2 determinan cambios estructurales que

se manifiestan de manera evidente en un modelo tridimensional y en el número de

segmentos de transmembrana: nueve en el linaje UChA y diez en el linaje UChB. Las

subunidades ND4 se diferencian en las posiciones 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu), las

subunidades ND5 se diferencian en la posición 37 (Val/Ile) y las subunidades ND6 en

la posición 139 (Val/Ile).

Siete de las catorce secuencias genéticas obtenidas en este trabajo son variantes

nuevas entre los roedores: los genes Nd1, Nd5 y Nd6 de ambos linajes y el gen Nd4

del linaje UChA. Las secuencias aminoacídicas deducidas de la subunidad ND5 de los

linajes UChA y UChB y la secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND4 del

linaje UChA corresponden a secuencias proteicas nuevas entre los roedores.

Concluyendo, los polimorfismos génicos aquí reportados en subunidades del

complejo I mitocondrial, en especial los responsables de variaciones aminoacídicas,

pueden establecer nuevos factores (permisivos o protectores) de herencia

exclusivamente materna que influyen en la capacidad mitocondrial de regenerar el

NAD+ y, por lo tanto, en el consumo de alcohol.

SUMMARY

“Genetic differences between alcohol nondrinker rats (UChA) and drinker rats (UChB) in the genes

for seven subunits of complex I encoded in the mitochondrial genome” The predisposition to alcoholism is determined mainly by genetic factors. Given the

complexity of unraveling these factors in humans several lines of alcohol drinker and

nondrinker rats have been bred around the world in order to study permissive and

protective factors in alcoholism. In Chile there are two Wistar derived lines of rats: the

UChA lineage (Universidad de Chile, Abstemious) and the UChB lineage (Universidad

de Chile, Bibulous). UChA rats drink between 0.1 and 1 g of ethanol/kg/day whereas

UChB rats drink between 4 and 6 g/kg/day.

In the rat and in man alcohol is metabolized mainly in the liver where alcohol

dehydrogenase (ADH) transforms ethanol into acetaldehyde which is then transformed

into acetate by mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2). Both ADH and ALDH2

use NAD+ as cofactor for the oxidation reactions.

The UChA and UChB lineages differ in the Aldh2 gene: the Aldh22 allele is found only in

the UChA line while alleles Aldh21 and Aldh23 are both common in the UChB line, the

latter being exclusively present in drinker rats. The UChA and UChB lineages also differ

in the capacity of their mitochondria to generate NAD+: the UChA line has a lower

capacity than the UChB line.

In rats, the ALDH23 variant determines a high alcohol consumption phenotype

independently of the type of mitochondria. In contrast, the ALDH22 variant is necessary,

but not sufficient, to determine a low alcohol consumption phenotype which develops

only when rats also carry mitochondria with a low capacity to generate NAD+. The

differences in the respiratory capacity of the mitochondria from both lineages has been

ascribed to complex I (NADH dehydrogenase), a macromolecular assembly of 46

subunits, nine of which are inherited exclusively through the maternal line; of these, two

are encoded in the X chromosome and seven in the mitochondrial genome. In this

work, the mitochondrial genes encoding complex I subunits from the UChA and UChB

rat lines were studied with the purpose of identifying the molecular basis for the

biochemical differences between both lineages.

The seven mitochondrial genes which encode subunits of mitochondrial complex I were

amplified from the genomic DNA of five UChA (Aldh22/Aldh22) rats and five UChB

(Aldh23/Aldh23) rats and were then sequenced and analysed. Heteroplasmy was not

apparent given that a single type of mitochondria for each lineage was found; the five

UChA rats were identical for each gene as were the five UChB rats amongst them.

It was found that the nondrinker UChA rats differ from the drinker UChB rats in six

mitochondrial genes of complex I, namely Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 and Nd6, while no

nucleotide differences were found in the Nd4L gene. There are only silent nucleotide

differences in the Nd1 and Nd3 genes whereas genes Nd2, Nd4, Nd5 and Nd6 have

both silent variations and nucleotide differences which lead to amino acid changes, thus

establishing that both lineages differ in four proteins. The ND2 subunits have four

variations found at positions (UChA/UChB) 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304 (Met/Thr)

and 318 where a single amino acid insertion was detected (His/---). These amino acid

variations in the ND2 protein determine structural changes which are evident in a three

dimensional model and in the number of predicted transmembrane segments, nine in

the UChA protein and 10 in the UChB protein. The ND4 subunits differ in residues 23

(Thr/Ile) and 419 (Pro/Leu). The ND5 subunits differ only in residue 37 (Val/Ile) and the

ND6 subunits vary in residue 139 (Val/Ile).

Seven of the fourteen gene sequences obtained in this work are new variants for

rodents: the Nd1, Nd5 and Nd6 genes of both lineages and the Nd4 gene of the UChA

line. Likewise, the deduced amino acid sequences for the ND5 subunit of both lineages

and the ND4 subunit of the UChA line are new protein sequences amongst rodents.

Overall, the nucleotide polymorphisms reported herein for subunits of the mitochondrial

complex I, particularly those accounting for amino acid variations, may establish new

(permissive or protective) factors inherited through the maternal line that influence the

mitochondrial capacity to generate NAD+ and hence the alcohol drinking behavior.

1. INTRODUCCIÓN

Cerca de cinco millones de personas son consumidoras de alcohol en Chile según el

Sexto Estudio Nacional de Drogas en Población General de Chile realizado por el

Consejo Nacional para el Control de Estupefacientes (CONACE) en el año 2004. De la

población entre 12 y 64 años, uno de cada diez individuos presenta dependencia

alcohólica y serios trastornos en la vida familiar y social a causa del consumo excesivo

de bebidas alcohólicas que incluso puede llegar a un nivel de alcoholismo crónico

(CONACE, 2004).

Numerosos estudios demuestran que la predisposición al alcoholismo está en gran

parte determinada por factores genéticos (Radel y Goldman, 2001). A partir de

observaciones realizadas en gemelos y mellizos (Prescott y Kendler, 1999) se ha

determinado que el alcoholismo tiene una heredabilidad entre el 50 y el 60% y que la

predisposición a desarrollar alcoholismo es multigénica. El otro 40% está relacionado

con factores medioambientales que pueden predisponer o proteger contra el

alcoholismo. Así, la interacción de factores genéticos y medioambientales determina

qué tan protegida o expuesta está una persona al alcoholismo.

Debido a la gran complejidad que presenta el estudio de factores genéticos permisivos

y protectores en humanos, se han desarrollado modelos animales para el estudio del

alcoholismo. Entre ellos se encuentran líneas de ratas bebedoras y no bebedoras de

alcohol que han sido obtenidas en diversas partes del mundo. En Chile se encuentran

la línea UChA (Universidad de Chile, Abstemias) y la línea UChB (Universidad de

Chile, Bebedoras) que corresponden a ratas derivadas de la cepa Wistar. Estos

animales han sido obtenidos mediante cruzamientos dirigidos realizados durante más

de 50 años seleccionando las ratas según su consumo voluntario de bajas (UChA) y

altas (UChB) cantidades de alcohol (Mardones y Segovia-Riquelme, 1983; Quintanilla y

cols., 2006). Las ratas UChA beben entre 0,1 y 1 g/kg/día (g de alcohol por kg de peso

por día), en cambio las ratas UChB beben entre 4 y 6 g/kg/día (Quintanilla y cols.,

2006). Además, las ratas bebedoras de alcohol presentan fenómenos de tolerancia y

dependencia, por lo que constituyen buenos modelos para estudiar los determinantes

biológicos que predisponen al alcoholismo así como aquellos que son protectores.

Tanto en la rata como en el hombre la metabolización del etanol ocurre principalmente

en el hígado, donde la deshidrogenasa alcohólica (ADH), una enzima citosólica,

transforma el etanol en acetaldehído. Adicionalmente, otras dos enzimas son capaces

de realizar esta transformación: la citocromo P450 2E1 y la catalasa, pero en menor

grado que la transformación realizada por la ADH (Caballería, 2003). El acetaldehído,

metabolito aversivo que al acumularse genera efectos disfóricos asociados a una

ingesta alcohólica, es transformado en acetato por la deshidrogenasa aldehídica

mitocondrial (ALDH2). Tanto la ADH como la ALDH2 utilizan NAD+ como cofactor para

realizar las reacciones de oxidación.

En humanos existe una población que presenta deficiencias en la metabolización del

acetaldehído debido a una variante de la ALDH2: la población asiática oriental. Se ha

visto que entre 30 y 40% de esta población presenta una mutación puntual dominante

en el gen de la ALDH2 (alelo ALDH2∗2) que resulta en el cambio Glu487Lys,

produciendo una ALDH2 mitocondrial prácticamente sin actividad (Yoshida y cols.,

1984). Los individuos que tienen uno o ambos alelos de la ALDH2 mutados presentan

niveles de acetaldehído circulante entre 5 y 20 veces mayores que los de individuos

que poseen la versión silvestre de la ALDH2 (ALDH2∗1) (Peng y cols., 1999). Así, los

individuos heterocigotos para esta mutación están protegidos contra el alcoholismo

entre 66 y 95% y pueden beber sólo un tercio de lo que beben los individuos que no

portan la mutación. En cambio, los individuos homocigotos ALDH2∗2/ALDH2∗2 son

prácticamente abstemios (Tu e Israel, 1995).

En ratas también hay variantes alélicas de la ALDH2. En particular, al determinar las

propiedades cinéticas de la ALDH2 de las ratas desarrolladas en Chile se encontró que

las ratas UChA difieren de las ratas UChB en la actividad de esta enzima (ver más

abajo) y al estudiar el gen Aldh2 se encontraron tres variantes alélicas: Aldh21, Aldh22 y

Aldh23 (Sapag y cols., 2003). La variante Aldh22 se encuentra exclusivamente en las

ratas de bajo consumo de etanol (UChA) y los otros dos alelos (Aldh21 y Aldh23) se

encuentran en la línea de alto consumo de etanol (UChB), siendo el alelo Aldh23

exclusivo de ella. Estos alelos codifican proteínas que se diferencian sólo en dos

posiciones aminoacídicas (aminoácidos 67 y 479): el alelo Aldh21 tiene Gln67 y

Glu479, el alelo Aldh22 tiene Arg67 y Glu479 y el alelo Aldh23 tiene Arg67 y Lys479.

Además, estas tres proteínas se diferencian en su Km por el NAD+ de acuerdo a su

fenotipo de consumo de alcohol: la ALDH22 de las ratas UChA tiene una Km de 132 µM

y las enzimas asociadas a las ratas UChB (ALDH21 y ALDH23) tienen una Km de 43 y

41 µM respectivamente. En cambio, no se pudo establecer una relación entre el

fenotipo bebedor o abstemio y las diferentes Vmax (36, 27 y 28 nmol NADH/mg

proteína/min para las variantes ALDH21, ALDH22 y ALDH23 respectivamente) (Sapag y

cols., 2003) aunque sí hay una diferencia significativa entre el consumo de ratas UChB

homocigotas Aldh21/1 y el de ratas UChB homocigotas Aldh23/3, siendo menor el de

estas últimas (Quintanilla y cols., 2005a). De lo anterior se desprende que las variantes

de la ALDH2 deben sus diferencias entre linajes principalmente a su afinidad por el

cofactor NAD+, siendo la enzima ALDH2 de las ratas no bebedoras UChA menos

eficiente en la transformación de acetaldehído a acetato que la enzima ALDH2

proveniente de las ratas bebedoras UChB.

Si bien los cruzamientos selectivos permiten obtener animales con características

específicas de una condición, es posible que en ellos se seleccionen genes que no

necesariamente están relacionados con un determinado fenotipo debido a que se

encontraban en los individuos primordiales. Por ejemplo, es posible que los alelos

Aldh22 y Aldh23 de la ALDH2 se hayan encontrado en las parejas de ratas iniciales y

que estos alelos se hubieran segregado en los linajes no bebedor y bebedor de alcohol

por azar. Sin duda, el hecho de que sean alelos de un gen codificante de una enzima

del metabolismo del alcohol es muy sugerente pero para poner a prueba su efecto real,

se realizaron cruzamientos entre las líneas bebedora y no bebedora con el fin de

barajar los genomas y determinar si estos alelos de la ALDH2 (Aldh22 y Aldh23)

influyen en el fenotipo del consumo de alcohol al estar combinados con otros genes.

Se cruzaron entonces ratas hembras UChA (Aldh22/Aldh22) con ratas machos UChB

(Aldh23/Aldh23) y viceversa, empleando animales previamente fenotipificados según su

consumo de alcohol (Quintanilla y cols., 2005b) obteniéndose una F1 que tiene sólo

ratas hembras y machos heterocigotos para la ALDH2 (Aldh22/Aldh23). Luego se

cruzaron estas ratas entre ellas y se obtuvo una generación F2 que posee ratas

homocigotas (Aldh22/Aldh22 y Aldh23/Aldh23) y heterocigotas (Aldh22/Aldh23). Las ratas

se clasificaron en dos grupos según su origen materno: un grupo que provenía de ratas

F0 hembras UChA y otro grupo que provenía de ratas F0 hembras UChB. Además,

cada rata de la F2 se clasificó según la genotipificación del gen Aldh2 y su consumo de

alcohol. Se encontró que todas las ratas Aldh22/2 de la F2 bebían más alcohol que las

ratas UChA y que todas las ratas Aldh23/3 bebían menos que las UChB, ratificando que

son múltiples los genes que condicionan el beber alcohol. Además, las ratas de la F2

genotipificadas como Aldh23/3, independientemente del tipo de hembra F0 de la que

provenían (hembra bebedora o no bebedora), siempre tuvieron un elevado consumo de

alcohol. En cambio, de las ratas F2 genotipificadas como Aldh22/2, sólo las provenientes

de hembras de alto consumo de alcohol bebieron tanto como las ratas F2

genotipificadas como Aldh23/3, poniendo en evidencia un fenómeno de epistasis en el

cual la expresión de uno o varios genes, en este caso de herencia materna, anula el

fenotipo determinado por otro gen, el alelo Aldh22.

Considerando que i) la mitocondria es de herencia exclusivamente materna (Strachan y

Read, 1999), ii) en la cadena respiratoria mitocondrial se produce, entre otras cosas,

NAD+ a partir de NADH, y iii) el NAD+ es necesario como cofactor para las enzimas que

participan en el metabolismo del etanol (ADH y ALDH2) (Figura 1), se estudió la

capacidad de oxidación del NADH de las ratas F2 considerando su origen materno: de

hembras F0 bebedoras de alcohol (UChB) o de hembras F0 no bebedoras de alcohol

(UChA). En particular, se determinó la capacidad de las mitocondrias de ratas de la

generación F2 (descrita más arriba) de transportar electrones por los distintos

componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, midiendo el consumo de oxígeno

en presencia de sustratos que aportan electrones en distintos puntos de la cadena, ya

sea como NADH o FADH2 (Quintanilla y cols., 2005b). No se encontraron diferencias

entre las ratas UChA y UChB de la F2 en la capacidad respiratoria de las mitocondrias

al agregar sustratos que aportan FADH2, en cambio, sí se encontraron diferencias en la

Figura 1. Metabolismo del alcohol y cadena respiratoria mitocondrial Arriba: reacción de transformación del alcohol en acetaldehído y acetato. Se indican las enzimas y los cofactores que participan. Abajo: cadena respiratoria mitocondrial. Se incluyen los cinco complejos y los cofactores accesorios (figura adaptada de Matthews y cols., 2003).

capacidad respiratoria mitocondrial cuando el sustrato aporta NADH, concluyendo que

las ratas que tienen mitocondrias provenientes de hembras de alto consumo de alcohol

tienen una mayor capacidad de regenerar el NAD+ que las ratas que tienen

mitocondrias que provienen de hembras de bajo consumo de etanol. Dichos estudios

indican que las mitocondrias de las dos líneas F0, UChA y UChB, son de distinto tipo, y

que hay diferencias funcionales en el complejo I de ambos linajes.

Los resultados de los cruzamientos sugieren que el origen del complejo I influye sobre

el consumo de alcohol, puesto que el fenotipo de bajo consumo, asociado al alelo

Aldh22, es revertido por la presencia del complejo I propio del linaje UChB proveniente

de una hembra de alto consumo de alcohol (Quintanilla y cols., 2005b). Este fenómeno

puede explicarse si el complejo I del linaje UChB es capaz de suministrar las

cantidades de NAD+ necesarias para que la ALDH2, aunque de alta Km (propia de las

ratas UChA), pueda transformar eficientemente el acetaldehído en acetato,

favoreciendo un mayor consumo de etanol. Entonces, un complejo I eficiente siempre

permite metabolizar el acetaldehído rápidamente (independientemente de la variante

de la ALDH2), en cambio, un complejo I deficiente en la generación de NAD+ se

manifiesta fenotípicamente sólo en presencia de la variante de Km alta de la ALDH2

(ALDH22) que contribuye a determinar un bajo consumo de etanol (Figura 2).

El complejo I mitocondrial de mamíferos está compuesto por alrededor de

46 subunidades polipeptídicas distintas, tiene una masa aproximada de 1 MDa y una

estructura conformada por dos partes: un brazo hidrofílico que se encuentra apuntando

hacia la matriz mitocondrial y un brazo hidrofóbico inserto en la membrana interna de la

mitocondria (Figura 3). El brazo hidrofílico es el responsable de sustraer los electrones

del NADH, para formar NAD+, y hacerlos pasar por los distintos transportadores que

posee el complejo I (grupo del mononucleótido de flavina y ocho centros de hierro-

azufre) hasta el aceptor lipídico ubiquinona (Lodish y cols., 1995). El brazo hidrofóbico

es el responsable de pasar los protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio

intermembrana, generando una gradiente de protones que lleva a la producción de

ATP mediante la acción de la ATPasa o complejo V.

Figura 2. Características bioquímicas y consumo de alcohol de ratas híbridas Se muestran las características del complejo I mitocondrial y de la ALDH2 de las ratas híbridas (homocigotas) estudiadas por Quintanilla y cols. (2005b); también se indica su consumo de alcohol. Las ratas híbridas son ratas de la F2 correspondiente al cruzamiento entre las líneas UChA (ratas no bebedoras de alcohol) y UChB (ratas bebedoras de alcohol).

Figura 3. Subunidades del complejo I de herencia materna Modelo del complejo I mitocondrial (adaptado de Yagi y cols., 2003) en el cual se muestra la ubicación de las nueve subunidades de herencia materna. La tabla indica la ubicación de los nueve genes, la estequiometría de las subunidades, su peso molecular y el número de segmentos de transmembrana. *Estequiometría, masa y número de segmentos de transmembrana determinados para las subunidades del complejo I bovino (Brandt, 2006 y Pocsfavi y cols., 2006).

En el brazo hidrofóbico es donde se ubican todas las subunidades del complejo I de

herencia materna que están codificadas en la mitocondria y en el cromosoma X,

además de otras subunidades.

De las 46 subunidades del complejo I, 39 se encuentran codificadas en el genoma

nuclear y siete en el genoma mitocondrial (ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6)

(Brandt, 2006). Los genes de dos de las subunidades codificadas en el núcleo, MWFE

(gen Ndufa1) (Zhuchenko y cols., 1996) y ESSS (gen Ndufb11) (Carroll y cols., 2002)

se encuentran en el cromosoma X y los genes de las otras 37 subunidades se

encuentran repartidos en los cromosomas autosómicos. El complejo I tiene, por lo

tanto, nueve subunidades que son de herencia materna, dos codificadas en el

cromosoma X y siete en el genoma mitocondrial.

Con el objeto de determinar las bases genéticas de las diferencias bioquímicas

descritas entre los complejos I de las ratas UChA y UChB, se amplificaron,

secuenciaron y analizaron los siete genes mitocondriales transmitidos por herencia

exclusivamente materna que codifican subunidades del complejo I de las ratas UChA y

UChB, y que corresponden a los genes Nd1, Nd2, Nd3, Nd4L, Nd4, Nd5 y Nd6.

HIPÓTESIS

Las ratas no bebedoras UChA y bebedoras de alcohol UChB, cuyas mitocondrias

difieren en la capacidad del complejo I de oxidar NADH a NAD+, tienen diferencias en

la secuencia de al menos uno de los siete genes mitocondriales codificantes de las

subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 del complejo I que son de

herencia exclusivamente materna y que pueden establecer la base molecular de

factores determinantes del consumo de alcohol.

Objetivo general

Identificar diferencias genéticas entre las ratas no bebedoras UChA y bebedoras de

alcohol UChB en las secuencias de los siete genes mitocondriales que codifican las

subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 del complejo I.

Objetivos específicos 1) Amplificar, de cinco ratas UChA homocigotas (Aldh22/2) y cinco ratas UChB

homocigotas (Aldh23/3), los siete genes mitocondriales que codifican las

subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 del complejo I.

2) Secuenciar, para cada una de las cinco ratas UChA y cinco ratas UChB, los

amplicones que contienen los siete genes mitocondriales del complejo I.

3) Analizar, de cinco ratas UChA y cinco ratas UChB, las secuencias de los siete

genes mitocondriales que codifican las subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4,

ND5 y ND6 del complejo I.

2. MATERIALES

2.1 Mitocondrias de hígado de rata Se utilizaron preparaciones de mitocondrias de hígado de una rata UChA y una rata

UChB obtenidas por María Elena Quintanilla y Lutske Tampier (Facultad de Medicina,

Universidad de Chile). Los animales corresponden a la rata UChA 866-4 de genotipo

Aldh22/2 y a la rata UChB 75S10-3 de genotipo Aldh23/3. De cada rata se tenían 3,6 mL

de suspensión mitocondrial obtenida de aproximadamente cinco gramos de hígado.

2.2 DNA genómico de rata Se trabajó con DNA genómico (gDNA) de hígado de rata disponible en el laboratorio

proveniente de cinco ratas UChA y cinco ratas UChB (Valle, 2003), específicamente de

las ratas A1 (80S11), A2 (80S14), A4 (80S15-7), A7 (81S16-2), A9 (81S5-6) y de las ratas B1

(71S7), B4 (71S12-4), B6 (72S8-9), B7 (72S8-10) y B8 (72S9-7). Estas diez ratas están

genotipificadas según el gen de la ALDH2 (Valle, 2003) y fenotipificadas según su

consumo de alcohol. Las ratas UChA son Aldh22/2 y tienen un consumo de alcohol

entre 0,1 y 0,5 g/kg de peso/día, en cambio las ratas UChB son Aldh23/3 y tienen un

consumo de alcohol entre 4 y 6 g/kg de peso/día.

2.3 Oligonucleótidos Se utilizaron 31 partidores para obtener y secuenciar los distintos amplicones que

contienen los genes del complejo I mitocondrial. Los partidores (Tabla 1) se diseñaron

en base a la secuencia mitocondrial de referencia para la rata Wistar (GenBank acceso

NC_001665.1) y a las lecturas obtenidas en las reacciones de secuenciación. Además,

se consideraron en el diseño su susceptibilidad de formar interacciones inter o intra

moleculares y su temperatura media de apareamiento (Tm, calculada mediante la

fórmula 4CG+2AT). Todos los partidores se sintetizaron en el Centro de Equipamiento

y Servicios de Apoyo Tecnológico (CESAT), Facultad de Medicina Norte, Universidad

de Chile.

Tabla 1. Partidores utilizados para la secuenciación y amplificación de los genes mitocondriales del complejo I Se indican las características de los oligonucleótidos: largo, posición en el genoma mitocondrial (según GenBank NC_001665.1), orientación (sentido > o antisentido <), secuencia y temperatura media de apareamiento (Tm, calculada en base a la fórmula 4CG+2AT). Los partidores están agrupados según el gen para el que fueron utilizados en secuenciación y ordenados según su cercanía al extremo 5’ del gen respectivo.

Gen Partidor Largo (nt) Posición >

< Secuencia (5’- 3’) Tm (°C)

TG-285 23 2673-2695 > GTA ATT GCG TAA GAC TTA AAA CC 64 TG-354 23 2918-2940 < AAT AGT GAT ATT GAG GTG GTT AG 62 TG-327 22 3335-3356 < CTG AGA CTA ATT CTG ATT CTC C 62

Nd-1

TG-286 24 3754-3727 < CCT AGA AAT AAG AGG ATT TAA AAC 64 TG-297 20 3852-3871 > CCC ATA CCC CGA AAA TGT TG 60 TG-355 21 4011-4031 < TTG TTG GCT AGA AGT GGG ATG 62 TG-340 22 4255-4276 > ATT CCC CTA CAC ATT GGA 60 TG-345 22 4458-4479 > AAT AAC AGC AAT CCT TCC ATA C 60

Nd-2

TG-298 22 4976-4955 < TGT TTT CTA AGG GCT TTG AAG G 62 TG-378 23 9343-9365 > GTT TCT ATC TAT TGA TGA GGA TC 62 TG-299 24 9377-9400 > GTA TAA ACA ATA CAA CTG ACT TCC 64 TG-379 22 9850-9871 < AGG AAA GCA GAT GTC ATT GTT G 62

Nd-3

TG-369 23 9885-9907 < CCT AGT AGA GAT AAT GTA AAG GC 64 Nd-4L TG-356 21 10218-10237 < GCT GTA GGA GGT GAC ATT GG 62

TG-301 24 10095-10118 > ATT TCA AAT ACT TAC GGA ACA GAC 64 TG-356 20 10218-10237 < GCT GTA GGA GGT GAC ATT GG 62 TG-346 23 10922-10943 < ATA ATG AGA GGA TGA TGA ATG G 60 TG-338 22 11275-11298 < GTT GCT ATA ACA ATG AAT AAC TCG 64

Nd-4

TG-302 25 11579-11555 < AAT TTG ATT TCC TGT TGT TAG ATT C 64 TG-303 22 11678-11689 > TAA TCC ATT GGT CTT AGG AAC C 62 TG-380 19 11844-11862 > TTC TCA TTC CTC CTT AGC C 56 TG-394 17 11846-11862 > GAG TAA GGA GGA ATC GG 52 TG-385 20 12121-12140 > CTA ACA ATC TAT TCC AAC TC 54 TG-381 20 12121-12140 < GAG TTG GAA TAG ATT GTT AG 54 TG-392 17 12302-12318 > CTC CTG AGA ACT CCA AC 52 TG-393 17 12366-12382 < GTG GCT GCA ATT AGT AG 50 TG-400 18 12768-12785 > CTC AAC GAT GAA CAA GAC 52 TG-304 22 13587-13608 < GCT ACT TGA ATG ATA GTG GTG G 64

Nd-5

TG-397 18 13597-13614 < AGT TGT GCT ACT TGA ATG 50 TG-305 25 13499-13475 < ACT ATA TTT CCT ATC ATT TCT ATC A 64

Nd-6 TG-306 25 14120-14096 > ATG TTT CTA TAG TTG AAT TAC AAC G 64

2.4 Soluciones para electroforesis Tampón TAE: Tris 40 mM, ácido acético 40 mM y EDTA 1 mM.

2.5 Enzima Se usó la DNA polimerasa Taq de Promega (Madison, WI, EE.UU.).

2.6 Reactivos y materiales generales Invitrogen Lifetechnologies (Carlsbad, CA, EE.UU.): agarosa ultra pura y DNAzol.

Merck (Darmstadt, Alemania): etanol absoluto (p.a.), ácido acético glacial (p.a).

Polaroid (St. Albans, Hertfordshire, Inglaterra): película 667.

Promega (Madison, WI, EE.UU.): sistema de purificación de DNA Wizard SV Gel and

PCR Clean-up System, marcador de peso molecular de 1 kb (1 kb ladder), marcador

de peso molecular de 100 pb (100 bp ladder), dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.): Trizma base, acetato de sodio anhidro, azul de

bromofenol, bromuro de etidio, EDTA (sal sódica dihidratada).

Se usó agua destilada, desionizada en el laboratorio con un purificador Barnstead

NANOpure Infinity D8982 (18MΩ-cm) (Dubuque, IA, EE.UU.).

3. MÉTODOS

3.1 Extracción de DNA mitocondrial Se extrajo DNA mitocondrial del hígado de ratas UChA y UChB a partir de mitocondrias

correspondientes a 1,7 g de tejido contenidas en 1,2 mL de suspensión para cada

linaje (ver Materiales). Primero se concentraron las mitocondrias mediante

centrifugación a 15.777 x g (14.000 rpm) en una microfuga Eppendorf 5415C

(Hamburgo, Alemania) durante tres minutos a temperatura ambiente, se desechó el

sobrenadante y se resuspendieron las mitocondrias en 200 µL de agua. Se agregaron

200 µL de DNAzol y luego 1 mL de etanol 100%, mezclando mediante inversión

después de agregar cada uno de los reactivos; la mezcla se dejó un minuto a

temperatura ambiente. Se centrifugó a 4000 x g (7.000 rpm) durante dos minutos a

temperatura ambiente y se realizaron dos lavados con 1 mL de etanol 75%

centrifugando a 7.500 x g (~ 10.000 rpm); el DNA se secó al vacío durante cinco

minutos y se resuspendió en 200 µL de agua. El rendimiento se estimó en 33 ng de

DNA mitocondrial por cada 100 mg de hígado, determinado mediante cuantificación en

gel de agarosa y bromuro de etidio.

3.2 Amplificación de genes que codifican subunidades del complejo I a partir de DNA mitocondrial Se realizaron reacciones de PCR utilizando cantidades variables de molde, desde

0,35 pg (20.000 copias del genoma mitocondrial de rata de 16 kb) hasta 6 ng de DNA

mitocondrial, y las parejas de partidores correspondientes a los cinco amplicones que

contienen los siete genes mitocondriales, tanto para una rata UChA como para una

rata UChB. En las mezclas de reacción, además del DNA mitocondrial y las parejas de

partidores específicos (2 pmol/µL) (ver Tabla 2), se incluyeron MgCl2 1,6 a 2,4 mM, 2 U

de DNA polimerasa Taq en Tris-HCl 10 mM pH 9,0 (25°C), KCl 50 mM y Tritón X-100

0,1%, en un volumen final de 50 µL. Las mezclas de reacción se sometieron a una

etapa de desnaturación a 94°C durante 3 minutos y luego a 35 ciclos de amplificación;

la etapa de desnaturación se realizó a 94°C durante 1 minuto, la de apareamiento entre

60 y 64°C durante 2 minutos y la de polimerización a 72°C durante 2 minutos.

Finalmente, se realizó una etapa de elongación a 72°C durante 10 minutos. Se usó un

termociclador MJ Research Inc. modelo PTC 100 (Watertown, MA, EE.UU.). Los

productos, que corresponden a amplicones cuyos tamaños van desde 600 pb hasta

2400 pb (ver Tabla 2) se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al

1% y bromuro de etidio (12 µg/mL) en tampón TAE y exposición a luz UV de 302 nm en

un transiluminador UVP TM20 (Upland, CA, EE.UU.). Para la electroforesis, se

utilizaron cámaras horizontales CBS Scientific (Del Mar, CA, EE.UU.) y dos fuentes de

poder, modelos VWR EC105 (Holbrook, NY, EE.UU.) y Bio-Rad PowerPac2000

(Hercules, CA, EE.UU.).

Tabla 2. Resumen de amplicones y condiciones utilizadas para la amplificación de genes mitocondriales del complejo I

Se indican los siete genes mitocondriales estudiados, así como los partidores con los que se obtuvieron, y el tamaño de los amplicones que los contienen. Además, se indican las principales condiciones de amplificación utilizadas: las temperaturas de apareamiento y las concentraciones de MgCl2. Se incluye el método para la purificación de amplicones.

Genes Partidores

(>) (<) Amplicón

(pb) T°

(°C) [MgCl2]

mM Método de

Purificación

Nd1 TG-285 TG-286 1082 60 2,0 Precipitación


Nd3-Nd4L TG-378 TG-356 897 62 2,0 Cortar banda de gel


Nd5-Nd6 TG-303 TG-306 2443 62 2,4 Cortar banda de gel

T°, se refiere a la temperatura de apareamiento utilizada en esa reacción de PCR

3.3 Amplificación de genes que codifican subunidades del complejo I a partir de DNA genómico Se realizaron reacciones de PCR utilizando 100 ng de gDNA como molde y las parejas

de partidores correspondientes a los seis amplicones que contienen los siete genes

mitocondriales (ver Tabla 2). Se amplificó el DNA de cinco ratas UChA y cinco ratas

UChB. En las mezclas de reacción se incluyeron, además del gDNA y las parejas de

partidores específicos (2 pmol/µL), MgCl2 1,6-2,4 mM, 2 U de DNA polimerasa Taq en

Tris-HCl 10 mM pH 9,0 (25°C), KCl 50 mM y Tritón X-100 0,1%, en un volumen final de

50 µL. Las mezclas de reacción se sometieron a un programa de termociclado similar

al empleado para amplificar DNA mitocondrial, pero acortando los tiempos de

desnaturación, apareamiento y polimeración de los ciclos de amplificación.

Desnaturación a 94°C durante 3 minutos y luego 35 ciclos de amplificación; la etapa de

desnaturación se realizó a 94°C durante 30 segundos, la de apareamiento entre 60 y

64°C durante 90 segundos y la de polimerización a 72°C durante 90 segundos.

Finalmente, se realizó una etapa de elongación a 72°C durante 10 minutos. Los

productos obtenidos se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y bromuro de

etidio y se visualizaron por exposición a luz ultravioleta. En total se obtuvieron 50

amplicones: cinco para cada una de las diez ratas.

3.4 Purificación de amplicones Una vez obtenida la masa necesaria del amplicón para secuenciar, típicamente

alrededor de 200 ng, se purificaron los amplicones por dos métodos. La elección del

método dependió básicamente de los requisitos del servicio de secuenciación y de los

problemas en las reacciones de secuenciación (ver Resultados). Un método

corresponde a la precipitación con 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes

de etanol 100%, a temperatura ambiente. El otro, corresponde a la purificación del

amplicón mediante el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-up System a partir de la

banda del amplicón cortada del gel de agarosa o directamente a partir de la PCR a

temperatura ambiente. Posteriormente, el DNA precipitado se resuspendió en agua y

se cuantificó mediante visualización en geles de agarosa y bromuro de etidio.

3.5 Secuenciación Los amplicones se enviaron al servicio de secuenciación del Centro de Equipamiento y

Servicios de Apoyo Tecnológico (CESAT) de la Facultad de Medicina Norte de la

Universidad de Chile, al servicio de secuenciación del Departamento de Ecología de la

Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC) o a la división en EE.UU. de Macrogen;

todos estos servicios utilizan el sistema de secuenciación por fluorescencia. El servicio

del CESAT utiliza un secuenciador ABI PRISM 377 (electroforesis en gel vertical) y el

sistema de marcación Dyenamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit de Amersham

Biosciences (Little Chalfort, BU, Inglaterra), en cambio el servicio de la PUC utiliza un

secuenciador ABI PRISM 3100 (electroforesis capilar) y el sistema de marcación

BigDye Terminator v3.1 de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). En cuanto a

Macrogen, sólo se tiene información acerca de los equipos que utilizan que son los

secuenciadores ABI3730XL y ABI3700, que también corresponden a equipos que

emplean electroforesis capilar.

3.6 Análisis de secuencias Las secuencias obtenidas para cada gen se compararon entre ellas y con la secuencia

de referencia del genoma mitocondrial de la rata Wistar (acceso GenBank

NC_001665.1). Las comparaciones se realizaron manualmente y mediante el uso de

alineamientos simples y múltiples con los programas BLAST (basic local aligment

search tool) (variante BLAST two sequences, Altschul y cols., 1990) y ClustalW

(Thompson y cols., 1994) respectivamente. En ambos casos se utilizaron los

parámetros de comparación definidos por defecto. Los cambios nucleotídicos que

conducen a cambios aminoacídicos se analizaron considerando el código genético

alternativo de la mitocondria de mamífero (Osawa y cols.,1992), que además se

encuentra disponible en el sitio del National Center for Biotechnology Information

(NCBI) en Internet.

Además, se realizaron comparaciones utilizando las variantes blastn y blastx (Altschul

y cols., 1997) del programa BLAST para determinar cuáles de las secuencias

nucleotídicas o proteicas deducidas, de ambos linajes, corresponden a secuencias

nuevas que no han sido descritas en las bases de datos de GenBank. Se restringió en

ambos casos el universo de secuencias analizadas sólo a roedores entre las que se

encuentran las secuencias de rata y de ratón. La variante blastn hace una búsqueda

entre las secuencias nucleotídicas descritas para los roedores, en cambio, blastx

primero traduce la secuencia nucleotídica de interés a aminoacídica y luego la compara

con las proteínas descritas en la base de datos.

3.7 Predicción de la estructura tridimensional de la subunidad ND2 Se utilizó el programa Rosetta para predecir la estructura terciaria de la proteína ND2.

Este programa, que funciona en el servidor Robetta (Kim y cols., 2004) de la University

of Washington (Seattle, WA, EE.UU.), elabora estructuras tridimensionales de

proteínas a partir de secuencias aminoacídicas lineales sin la necesidad de disponer

de estructuras cristalográficas homólogas.

3.8 Predicción de segmentos de transmembrana de la subunidad ND2 Se utilizó el programa TMHMM 2.0 (Krogh y cols., 2001), para determinar cuáles de los

aminoácidos que están formando hélices alfa pueden estar formando segmentos de

transmembrana. Dicho programa predice qué hélices atraviesan la membrana y su

orientación en ella, definiendo así en qué lado de la misma se ubican los segmentos

conectores.

4. RESULTADOS

Con el objeto de encontrar diferencias genéticas en los genes de las siete subunidades

del complejo I de herencia exclusivamente materna que pudieran explicar las

diferencias bioquímicas del complejo I entre las ratas UChA y UChB descritas por

Quintanilla y cols. (2005) se amplificaron mediante PCR los siete genes codificados en

la mitocondria (Figura 4) a partir de cinco ratas de cada linaje y se secuenciaron.

El análisis de las secuencias reveló que cada uno de los siete genes es igual en las

cinco ratas de cada linaje, indicando que las secuencias encontradas son

representativas de las ratas UChA y de las ratas UChB. Se encontraron diferencias

nucleotídicas entre ambos linajes en seis de los siete genes (Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5

y Nd6) estudiados. Cuatro de ellos (Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6), determinan además

diferencias aminoacídicas entre ambos linajes, es decir, codifican proteínas distintas.

Hay dos genes que tienen diferencias nucleotídicas silentes (Nd1 y Nd3) y un gen

(Nd4L) que tiene la misma secuencia nucleotídica en ambos linajes.

4.1 Amplificación de genes mitocondriales

4.1.1 Amplificación a partir de mitocondrias En un principio se trabajó con DNA mitocondrial obtenido a partir de mitocondrias de

una rata UChA y una rata UChB. Sin embargo, los rendimientos de los amplicones que

contienen los genes mitocondriales siempre fueron pequeños a pesar de probar

diversas condiciones de magnesio y temperatura en la PCR, así como distintas

concentraciones de molde. En contraste, al trabajar en paralelo con el DNA genómico,

se obtuvieron buenos resultados de amplificación, por lo que no se continuó trabajando

con el DNA mitocondrial (mtDNA).

4.1.2 Amplificación a partir de DNA genómico Se obtuvieron cinco amplicones para cada rata, un amplicón para cada uno de los

genes Nd1, Nd2 y Nd4 y dos que contienen dos genes cada uno, Nd3-Nd4L y Nd5-Nd6

(Figura 5) (ver Tabla 2 en Métodos para detalles de los amplicones).

Figura 4. Representación del genoma mitocondrial de mamíferos Arriba: esquema del genoma mitocondrial completo; se indican los genes que lo conforman. En color se destacan los genes del complejo I que se secuenciaron en esta memoria (figura adaptada de Ruiz-Pesini y cols., 2007). Abajo: representación detallada del contexto de los genes del complejo I. Las flechas indican la orientación de los genes del complejo I así como el sobrelapamiento entre ellos. En achurado se indican las zonas en las que hay sobrelapamiento de dos genes.

Figura 5. Partidores utilizados para amplificar y secuenciar los siete genes del complejo I mitocondrial Se muestran los amplicones (barra gris oscura) y sobre ellos, la ubicación relativa de los partidores utilizados para la amplificación y secuenciación de los genes mitocondriales. La barra negra muestra el segmento del amplicón secuenciado, que incluye el gen de interés más secuencias adyacentes, las barras grises claras indican los límites del gen respectivo. Las zonas grises oscuras corresponden a zonas que no han sido secuenciadas. Los partidores con números en gris no dieron reacciones productivas de secuenciación. Las zonas de sobrelapamiento entre los genes Nd4L y Nd4 y entre los genes Nd5 y Nd6 están indicadas como dos segmentos, uno arriba del otro. Se muestra, a la derecha de los amplicones, su tamaño en pares de bases (pb).

Se realizaron barridos de concentración de magnesio y temperatura de apareamiento,

obteniéndose la mayoría de los amplicones en un rango de temperatura de 60 a 64°C y

entre 2,0 y 2,4 mM de magnesio, es decir, en condiciones no muy estrictas. Además,

los partidores para la amplificación se diseñaron largos y de Tm alta (ver Tabla 1), con

el objeto de darles suficiente especificidad a temperaturas elevadas, requeridas al usar

como molde el DNA total de la rata que contiene DNA mitocondrial y nuclear. Los

amplicones en general se obtuvieron sin productos secundarios y en mayor cuantía

que los obtenidos a partir de mtDNA al visualizarlos por tinción con bromuro de etidio

en geles de agarosa. Todos los genes se amplificaron a partir de gDNA, puesto que se

obtiene mayor cantidad de amplicón y porque se evita la preparación de mitocondrias.

Se realizaron entre tres y cinco reacciones de PCR para cada amplicón con el objeto

de obtener la masa suficiente para secuenciar. Si bien un volumen total de 50 µL

resultó, en general, en reacciones productivas, el amplicón de Nd5-Nd6 (2447 pb) sólo

se obtuvo a un volumen de 25 µL de reacción de PCR, por lo que en este caso fue

necesario realizar cinco reacciones de PCR para cada rata.

4.2 Secuenciación

4.2.1 Secuenciación de amplicones, aspectos generales Los partidores para la amplificación y secuenciación de los genes mitocondriales se

diseñaron pensando en la unión a secuencias que se ubican entre 20 y 45 nucleótidos

del comienzo o fin del gen de interés (Figura 5) dado que los primeros nucleótidos

incorporados durante la reacción de secuenciación están enmascarados por la gran

intensidad de la señal y no pueden ser identificados en el electroforetograma. La

extensión de esta región, que se conoce como “zona ciega”, depende del servicio de

secuenciación y, en definitiva, de la reacción en particular. El margen considerado para

la zona ciega fue insuficiente en varios casos, lo que impedía ver el comienzo o fin de

algunos genes (10 o 20 nucleótidos del extremo 5’ o 3’). En esos casos se sintetizaron

otros partidores en sentido contrario a la zona de interés para poder secuenciarla, por

lo que es recomendable considerar, si es que la situación lo permite, un segmento

holgado de nucleótidos, entre 40 y 50 nt, antes del comienzo o fin del gen de interés.

4.2.2 Secuenciación de amplicones, aspectos particulares En un principio, se logró obtener la mayor parte de la secuencia de los amplicones

correspondientes a los genes Nd1, Nd2 y Nd4 en el servicio de secuenciación del

CESAT sólo purificándolos por precipitación con acetato de sodio y etanol, teniendo la

consideración de diluir la reacción de PCR antes de precipitar, con el objeto de evitar la

coprecipitación de los partidores junto con el amplicón (ver Métodos). En cambio, el

amplicón de los genes Nd3-Nd4L dio repetidamente electroforetogramas con mucha

señal de fondo que no permitía la identificación de los nucleótidos, en especial el

segmento del gen Nd3, ya que el gen Nd4L se secuenció fácilmente. Este fenómeno se

repitió en ambos servicios nacionales (CESAT y PUC), aun cuando se probaron dos

formas distintas de purificación (precipitación y purificación directa por el sistema

Wizard SV Gel and PCR Clean-up System, ver Métodos), hasta que finalmente se

cortó la banda del amplicón de un gel preparativo de agarosa y se purificó luego

mediante cromatografía empleando el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-up

System. Se utilizó este último procedimiento puesto que la purificación directa de los

amplicones con el sistema comercial no logró eliminar del todo los partidores,

observándose, en geles analíticos de agarosa, bandas de intensidad importante

correspondientes a los partidores remanentes no utilizados en la reacción de PCR.

Estos partidores, ya sea uno o los dos de la reacción de PCR, también participan en

las reacciones de PCR del procedimiento de secuenciación, sustentando reacciones

paralelas que compiten con la de interés. Al extraer el amplicón del gel de agarosa, se

eliminó este efecto de los partidores remanentes lo que permitió mejores reacciones de

secuenciación. Sin embargo, en otros casos esto no fue suficiente y fue necesario

sintetizar nuevos partidores para los genes Nd3 y Nd5. Finalmente, los problemas que

surgieron con los genes Nd3 y Nd5 se resolvieron purificando los amplicones, mediante

electroforesis y cromatografía, y secuenciándolos en el servicio de Macrogen.

En general, las secuencias obtenidas en Macrogen (EE.UU.) fueron limpias y largas

(entre 400 y 600 nt), mayores que las obtenidas en cualquiera de los servicios

nacionales (200-500 nt). Además, el gen Nd6, que se encuentra en el mismo amplicón

que el gen Nd5, se secuenció sin problemas en Macrogen. La diferencia principal entre

los requisitos de los servicios nacionales y los de Macrogen es la cantidad de molde:

entre 100 y 300 ng (a una concentración entre 20 y 30 ng/µL) versus 500 ng (a

50 ng/µL) respectivamente.

4.3 Análisis de secuencias

4.3.1 Comparación del gen Nd1 entre ratas UChA y UChB Se encontraron siete diferencias nucleotídicas silentes entre las ratas UChA y UChB en

el gen Nd1 (Tabla 3). Estas diferencias se encuentran distribuidas casi uniformemente

a lo largo del gen (957 pb). Además, todas las diferencias son transiciones

pirimidínicas (C/T) (Figura 6) que corresponden a los cambios más comunes entre

nucleótidos debido a la desaminación de citosinas metiladas (Strachan y Read, 1999).

4.3.2 Comparación del gen Nd2 entre ratas UChA y UChB Se encontraron siete diferencias nucleotídicas entre las ratas UChA y UChB en el gen

Nd2. Una de ellas corresponde a una inserción de tres nucleótidos en las ratas UChA

(codón CCA entre las posiciones 4842 y 4843). Esta inserción lleva a la incorporación

de una histidina en la proteína después del aminoácido 317, lo cual quiere decir que la

subunidad ND2 de las ratas UChA tiene 346 aminoácidos, uno más que la de las ratas

UChB. De los seis cambios nucleotídicos restantes, hay tres que conducen a cambios

aminoacídicos entre ambos linajes (Tabla 3 y Figura 6). Éstos son en las posiciones

4340 (G/A), 4684 (A/G) y 4802 (T/C) (UChA/UChB), y llevan a cambios en los

aminoácidos 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala) y en la posición 304 (Met/Thr)

respectivamente (Figura 7). Dadas las características de los cambios aminoacídicos,

ninguno debiera representar alteraciones muy importantes en la estructura general de

la proteína.

4.3.3 Comparación del gen Nd3 entre las ratas UChA y UChB En el gen Nd3 se encontraron sólo diferencias nucleotídicas silentes, tres en total, y

todas corresponden a transiciones pirimidínicas. Las posiciones son 9519 (T/C), 9654

(C/T) y 9687 (T/C) (UChA/UChB) (Tabla 3 y Figura 6). Ambas proteínas son iguales.

Tabla 3. Variaciones polimórficas en seis de los siete genes mitocondriales del complejo I En la tabla de cada gen se indican las posiciones de cambio en el DNA mitocondrial (según GenBank acceso NC_001665.1) así como la identidad de los nucleótidos, los codones y los aminoácidos respectivos. En negrita, variaciones polimórficas conducentes a cambios aminoacídicos.

Gen Nd-1 (2729-3685) Nucleótido Codón Aminoácido Posición

variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 2825 C T CTA TTA Leu Leu 33 2917 C T CCC CCT Pro Pro 63 2944 C T ATC ATT Ile Ile 72 3367 T C GTT GTC Val Val 213 3418 T C AAT AAC Asn Asn 230 3424 C T ATC ATT Ile Ile 232 3433 T C AAT AAC Asn Asn 235


variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 4340 G A AGC AAC Ser Asn 150 4434 T C TAT TAC Tyr Tyr 181 4542 C T ATC ATT Ile Ile 217 4684 A G ACA GCA Thr Ala 265 4773 A T ACA ACT Thr Thr 294 4802 T C ATA ACA Met Thr 304 ins

4842-4843 CAC ------ CAC-CAC

CAC-CAA His ------ 318


variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 9519 T C AAT AAC Asn Asn 28 9654 C T CTC CTT Leu Leu 73 9687 T C ACT ACC Thr Thr 84

Tabla 3 (continuación).


variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 10212 C T ACC ATC Thr Ile 23 10357 G A TGG TGA Trp Trp 71 10681 C T CTC CTT Leu Leu 179 10807 G A GTG GTA Val Val 221 11113 C A TCC TCA Ser Ser 323 11155 C T ATC ATT Ile Ile 337 11179 C T GCC GCT Ala Ala 345 11374 A G ATA ATG Met Met 410 11400 C T CCA CTA Pro Leu 419


variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 11783 T C TTT TTC Phe Phe 21 11816 T C TTT TTC Phe Phe 32 11829 G A GTT ATT Val Ile 37 11903 T C TAT TAC Tyr Tyr 61 12053 T C GAT GAC Asp Asp 111 12257 T C GAT GAC Asp Asp 179 12335 T C AAT AAC Asn Asn 205 12456 T C TTA CTA Leu Leu 246 12482 A G GTA GTG Val Val 254 12563 C T GGC GGT Gly Gly 281 12623 T C ATT ATC Ile Ile 301 12806 G A ATG ATA Met Met 362 13466 G A GGG GGA Gly Gly 582


variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 13635 G A GTT ATT Val Ile 139 13681 G A TGG TGA Trp Trp 123

Figura 6. Variaciones nucleotídicas en los genes Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I mitocondrial en las ratas UChA y UChB Se indican las posiciones variables numeradas según GenBank NC_001665.1 y las identidades en ambos linajes (UChA/UChB). Arriba (rectángulo gris): genes que sólo tienen variaciones silentes. Abajo: genes que tienen variaciones nucleotídicas conducentes a cambios aminoacídicos resaltadas en gris oscuro.

Figura 7. Variaciones aminoacídicas en las subunidades ND2, ND4, ND5 y ND6 del complejo I mitocondrial de las ratas UChA y UChB Se indican las posiciones aminoacídicas variables deducidas a partir de los genes respectivos.

4.3.4 Comparación del gen Nd4L entre las ratas UChA y UChB El gen Nd4L, el más pequeño de los siete (297 pb), no tiene diferencias nucleotídicas

entre las ratas y por lo tanto las proteínas de ambos linajes son iguales.

4.3.5 Comparación del gen Nd4 entre ratas UChA y UChB El gen Nd4 tiene un tamaño de 1378 pb, es uno de los más grandes, y el análisis de su

secuencia arrojó que hay nueve diferencias nucleotídicas entre las ratas UChA y

UChB. Entre éstas hay transiciones pirimidínicas así como transversiones. Hay dos

diferencias nucleotídicas que conducen a sendos cambios aminoacídicos. Los

nucleótidos 10212 (C/T) y 11400 (C/T) (UChA/UChB) determinan variaciones en los

aminoácidos 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu) respectivamente (Tabla 3, Figuras 6 y 7). Esta

última variación es la que más llama la atención debido a los efectos que puede

provocar la prolina en la estructura secundaria de una proteína.

4.3.6 Comparación del gen Nd5 entre ratas UChA y UChB El gen Nd5 es el más grande de los siete analizados, tiene un tamaño de 1830 pb y

requirió el uso de diez partidores para su secuenciación. Se encontraron 13 diferencias

nucleotídicas, que corresponden al mayor número de diferencias entre las ratas UChA

y UChB (Tabla 3, Figura 6). De estas trece diferencias hay sólo una, situada en el

nucleótido 11829 (G/A) (UChA/UChB), que conduce a un cambio aminoacídico de tipo

conservado en la posición 37 (Val/Ile), siendo ambos aminoácidos de naturaleza

hidrofóbica.

4.3.7 Comparación del gen Nd6 entre ratas UChA y UChB El gen Nd6 se encuentra codificado en sentido inverso a los seis restantes en el

genoma mitocondrial (Figura 4). En él se encontraron tres diferencias nucleotídicas

entre los linajes (Figura 6), sólo una de las cuales, aquella detectada en el nucleótido

13635 (G/A) (UChA/UChB), conduce a un cambio aminoacídico en la posición

139 (Val/Ile), igual al cambio encontrado en el gen Nd5 (Tabla 3 y Figura 7).

4.4 Análisis estructural in silico de la proteína ND2 Se obtuvieron las estructuras tridimensionales de la subunidad ND2 de los linajes

UChA y UChB, y está en curso la determinación de las estructuras tridimensionales

correspondientes a las otras subunidades que también tienen diferencias

aminoacídicas entre ambos linajes (ND4, ND5 y ND6). Para ello se utilizó el programa

Rosetta, que genera estructuras tridimensionales a partir de una secuencia lineal

aminoacídica sin tener estructuras tridimensionales homólogas a la proteína en

cuestión. Este programa funciona en un servidor de la University of Washington

(Seattle, WA, EE.UU.) llamado Robetta (Kim y cols., 2004).

La predicción de la estructura tridimensional de la proteína ND2 de ambos linajes,

UChA y UChB, reveló diferencias estructurales evidentes entre ambas proteínas al

comparar las estructuras en diversos ángulos de rotación y empleando los aminoácidos

de interés como puntos de referencia (Figura 8). Al observar la distancia relativa entre

el aminoácido de la posición 150 y el de la posición 265, es evidente que éstos se

encuentran más separados en la subunidad ND2 del linaje UChA que en la del linaje

UChB. Estas diferencias de separación concuerdan con otras predicciones

estructurales.

Una de las limitaciones del programa Rosetta es que no determina qué segmentos son

de transmembrana, así es que se utilizó el programa TMHMM 2.0 (Krogh y cols., 2001)

para predecir qué aminoácidos estarán en los segmentos de transmembrana y cuáles

no, lo que permite determinar si los elementos conectores se encuentran orientados

hacia la matriz mitocondrial o hacia el espacio intermembrana. La predicción arrojó que

la subunidad ND2 del linaje UChA posee nueve segmentos de transmembrana, en

comparación con los diez que posee la subunidad del linaje UChB (Figura 9). Debido a

ello, y concordando con las diferencias estructurales sugeridas por la predicción de la

estructura tridimensional, el aminoácido 265 y los aminoácidos 304 y 318 se ubican en

lados opuestos de la membrana al comparar ambos linajes: en el linaje UChA la

treonina 265 está en la matriz mitocondrial y los aminoácidos metionina 304 e histidina

318 están en el espacio intermembrana, mientras que en el linaje UChB la alanina 265 Figura 8.

Figura 8. Modelamiento de la subunidad ND2 de los linajes UChA y UChB Las siguientes figuras corresponden a las estructuras tridimensionales de la subunidad ND2 generadas por el programa Rosetta, capaz de predecir estructuras tridimensionales a partir de una secuencia aminoacídica lineal. En la columna de la izquierda se muestran cuatro rotaciones de la subunidad ND2 de las ratas UChA. En la columna de la derecha, se muestran cuatro rotaciones de la subunidad ND2 de las ratas UChB. En amarillo se destacan la metionina amino terminal, la treonina carboxilo terminal y los aminoácidos 150 (Ser/Asn), 265 (Ala/Thr), 304 (Met/Thr), 316 (His/His), 317 (His/His) y 318 (His/---).

Figura 9. Predicción de segmentos de transmembrana de la subunidad ND2 de los linajes UChA y UChB Arriba se muestran dos rotaciones de las estructuras tridimensionales de la subunidad ND2 para ambos linajes; se señalan los extremos amino y carboxilo terminales y las estructuras alfa hélices. En una de las representaciones se indican con flechas los aminoácidos variables entre los linajes. Abajo se muestran dos figuras realizadas con los datos obtenidos del programa TMHMM 2.0. Los cilindros representan los segmentos de trasmembrana y las líneas los segmentos que los conectan. Además, se indican los aminoácidos variables, su posición en la proteína y su orientación con respecto a la membrana. En achurado se muestra el dominio de transmembrana presente en el linaje UChB y ausente en el UChA.

está situada en el espacio intermembrana y la treonina 304 se ubica en la matriz

mitocondrial.

Si bien (i) los tres cambios aminoacídicos encontrados en las posiciones 150, 265 y

304 no llaman la atención debido a que las variaciones no son muy radicales (Ser/Asn,

Thr/Ala y Met/Thr), y (ii) la inserción de un aminoácido (histidina 318) en una proteína

de 345 aminoácidos no representa un cambio muy importante, aparentemente dichas

sustituciones y la inserción son suficientes para producir cambios estructurales en la

proteína y por lo tanto permiten sospechar diferencias funcionales entre los linajes.

Además, la subunidad ND2 se encuentra representada ocho veces en el segmento

hidrofóbico del complejo I a diferencia de las otras subunidades que se encuentran

representadas sólo dos veces. Esto quiere decir que los cambios producidos en esta

subunidad pueden tener más impacto en la actividad general del complejo I.

Ambos análisis predictivos realizados in silico, es decir, el de la estructura

tridimensional de la proteína ND2 y el de los segmentos de transmembrana,

concuerdan en sugerir diferencias estructurales entre la proteína ND2 del linaje UChA y

la del linaje UChB. La subunidad ND2 es, por lo tanto, de interés para realizar estudios

funcionales diseñados para determinar diferencias en su actividad biológica.

4.5 Secuencias nuevas A la fecha, hay 15 genomas mitocondriales completos de rata disponibles en GenBank

entre los que se encuentran genomas de ratas silvestres y genéticamente

seleccionadas para diversos estudios. Se ordenaron estas cepas de ratas según el

número de genes o proteínas iguales (Tablas 4A y 4B respectivamente) que tienen con

los linajes UChA o UChB.

4.5.1 Secuencias génicas nuevas Las secuencias de los siete genes de cada uno de los linajes UChA y UChB se

compararon con las secuencias ya reportadas en la base de datos GenBank mediante

el programa BLAST (Altschul y cols., 1990) con el objeto de determinar si alguna de

Tabla 4. Identidad de los siete genes y las siete subunidades del complejo I de los linajes UChA y UChB con los de otras cepas de ratas Se indican los códigos de acceso GenBank de todos los genomas mitocondriales de rata que se identificaron y analizaron por BLAST. Se consigna si los respectivos genes (Tabla 4A) o subunidades (Tabla 4B) del complejo I que se estudiaron en esta memoria de título son idénticos a los de los linajes UChA (tabla superior) o UChB (tabla inferior). Los puntos indican que dicha cepa tiene un gen o subunidad de tipo A o de tipo B. Las casillas en blanco indican que las ratas correspondientes tienen genes o subunidades distintas a las que poseen los linajes UChA o UChB. En achurado se indican genes o subunidades del linaje UChA o UChB nuevos en la base de datos por lo que no hay ninguna cepa de rata que tenga un gen o subunidad con esa misma secuencia. En gris, genes o subunidades que tienen la misma secuencia en ambos linajes. Ver detalles de las cepas en la Tabla 5.

Tabla 4A.

Siete genes del complejo I mitocondrial: linaje UChA

Acceso GenBank Cepa Nd1 Nd2 Nd3 Nd4L Nd4 Nd5 Nd6

DQ673911 GH/OmrMcwi • • DQ673907 WKY/NCrl • • DQ673913 GK/Swe • • DQ673912 GK/Far • AY769440 F344 x BNF1 • DQ673908 ACI/Eur • DQ673909 F344/NHsd • DQ673910 FHH/Eur • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • DQ673915 T2DN/Mcwi • DQ673917 Wild/Tku • AJ428514 rata silvestre •

NC_001665 BN/SsNHsdMCW • AC_000022 Wistar DQ673916 Wild/Mcwi

Siete genes del complejo I mitocondrial: linaje UChB

Acceso GenBank Cepa Nd1 Nd2 Nd3 Nd4L Nd4 Nd5 Nd6

AY769440 F344 x BNF1 • • • • DQ673908 ACI/Eur • • • DQ673909 F344/NHsd • • • DQ673910 FHH/Eur • • • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • • • DQ673915 T2DN/Mcwi • • • DQ673917 Wild/Tku • • DQ673911 GH/OmrMcwi • DQ673907 WKY/NCrl • DQ673913 GK/Swe • AJ428514 rata silvestre •

NC_001665 BN/SsNHsdMCW • AC_000022 Wistar DQ673912 GK/Far DQ673916 Wild/Mcwi

Tabla 4B.

Siete subunidades del complejo I mitocondrial: linaje UChA

Acceso GenBank Cepa ND1 ND2 ND3 ND4L ND4 ND5 ND6

DQ673911 GH/OmrMcwi • • • • • DQ673907 WKY/NCrl • • • • DQ673912 GK/Far • • • • DQ673913 GK/Swe • • • • DQ673908 ACI/Eur • • • DQ673909 F344/NHsd • • • DQ673910 FHH/Eur • • • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • • • DQ673915 T2DN/Mcwi • • • NC_001665 BN/SsNHsdMCW • • • DQ673916 Wild/Mcwi • • DQ673917 Wild/Tku • • AY769440 F344 x BNF1 • • AJ428514 rata silvestre •

AC_000022 Wistar •

Siete subunidades del complejo I mitocondrial: linaje UChB

Acceso GenBank Cepa ND1 ND2 ND3 ND4L ND4 ND5 ND6

DQ673908 ACI/Eur • • • • • DQ673909 F344/NHsd • • • • • DQ673910 FHH/Eur • • • • • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • • • • • DQ673915 T2DN/Mcwi • • • • • NC_001665 BN/SsNHsdMCW • • • • AY769440 F344 x BNF1 • • • • DQ673916 Wild/Mcwi • • • DQ673911 GH/OmrMcwi • • • DQ673907 WKY/NCrl • • • DQ673912 GK/Far • • • DQ673913 GK/Swe • • • DQ673917 Wild/Tku • • • AJ428514 rata silvestre • • •

AC_000022 Wistar • •

ellas era nueva. Las búsquedas se restringieron a secuencias descritas para roedores

los que incluyen, entre otros, la rata (Rattus norvegicus) y el ratón (Mus musculus).

Se determinó que las secuencias nucleotídicas de los genes Nd1, Nd5 y Nd6, tanto

para la línea UChA como para la UChB, son nuevas. En cambio, las secuencias de los

genes Nd2, Nd3 y Nd4L para ambos tipos de animales resultaron ser idénticas a

alguna secuencia de rata ya descrita en GenBank (Tabla 4A), siendo las variantes de

los genes Nd2 y Nd3 del linaje UChB más comunes que las variantes respectivas del

linaje UChA. En cuanto al gen Nd4 sólo la secuencia de la rata UChA resultó ser una

nueva variante entre roedores. En total, de las catorce secuencias génicas obtenidas

en este trabajo de memoria (siete para cada linaje), siete constituyen alelos nuevos.

4.5.2 Secuencias proteicas (deducidas) nuevas Se sometieron las secuencias nucleotídicas de los siete genes mitocondriales a un

análisis mediante BLAST, pero utilizando la variante blastx (Altschul y cols., 1997), que

traduce primero la secuencia nucleotídica analizada a peptídica, considerando en este

caso el código genético alternativo de la mitocondria, y la compara con las secuencias

proteicas descritas en la base de datos. En este caso también se restringió la

búsqueda sólo a roedores, incluyendo la rata y el ratón.

Se determinó cuál de los alelos nuevos (Nd1, Nd5 y Nd6 de ambos linajes (UChA y

UChB) y Nd4 para la rata UChA) correspondía a una nueva variante proteica

(Tabla 4B). Se encontró que la proteína ND4 del linaje UChA y las dos subunidades

ND5 (UChA y UChB) son nuevas, es decir, no hay secuencias peptídicas de roedores

descritas en la base de datos que sean idénticas a las secuencias (deducidas) de estas

subunidades. En cambio, la proteína deducida de ambos alelos del gen Nd1 y las

proteínas deducidas de los dos alelos del gen Nd6, resultaron ser idénticas a proteínas

ND1 y ND6 de rata ya descritas.

En cuanto a la similitud de los linajes en estudio con las otras cepas de ratas,

considerando el número de subunidades idénticas del complejo I que comparten, la

rata de acceso GenBank DQ673911 es la más parecida al linaje UChA: tiene cinco

proteínas iguales a las del linaje UChA por lo que se encuentra en la primera posición

de la Tabla 4B. Para el linaje UChB, son cinco las ratas que tienen cinco proteínas

iguales a las del linaje UChB (ACI/Eur, F344/NHsd, FHH/Eur, SS/JrHsd/Mcwi y

T2DN/Mcwi). Así como para el linaje UChA, todas las ratas que tienen el mayor

número de subunidades iguales al linaje UChB corresponden a ratas consanguíneas

obtenidas por cruzamientos selectivos (ver Discusión).

Por otra parte, se encontró que las subunidades ND1, ND3 y ND4L se conservan en la

mayoría de las ratas analizadas, es decir, la mayoría de las cepas tienen variantes de

estas subunidades que son iguales a las que comparten las ratas UChA y UChB. En el

caso de las subunidades ND2 y ND6, la mayoría de las ratas analizadas tiene una de

dos variantes que corresponden a las que tienen los linajes UChA y UChB. A partir de

estos análisis las subunidades del complejo I codificadas en la mitocondria se pueden

ordenar en términos de cuan conservadas están entre las ratas que han sido

caracterizadas, siendo el orden de mayor a menor conservación ND4L, ND3, ND1,

ND6, ND2, ND4 y ND5.

4.5.3 Publicación de secuencias en GenBank La combinación de los siete genes que codifican subunidades del complejo I

mitocondrial, tanto para el linaje UChA como para el UChB, constituyen nuevas

variantes no descritas en las bases de datos, es decir, hay dos complejos I nuevos,

uno para la rata UChA y otro para la rata UChB. Se depositaron en la base de datos

GenBank las siete secuencias de los genes del complejo I de cada uno de los linajes,

obteniéndose 14 nuevos códigos de acceso GenBanK, siete para cada linaje. Los

códigos de acceso y las diferencias nucleotídicas y aminoacídicas encontradas, se

resumen en la Figura 10 que se muestra a continuación.

Figura 10 Genes del complejo I mitocondrial: diferencias entre ratas UChA y UChB Se muestran las diferencias nucleotídicas (nt) y aminoacídicas (aa) de los siete genes que codifican siete subunidades del complejo I mitocondrial. Además, se muestran los tamaños de los genes en pares de bases (pb) y los códigos de acceso GenBank obtenidos para los siete genes de los linajes UChA y UChB.

Gen nt aalargo pb

Nd-1 Nd-1 7 957 0EU104717 EU104724

Nd-2 Nd-2 9 1038 4EU104718 EU104725

Nd-3 Nd-3 3 348 0EU104719 EU104726

Nd-4L Nd-4L 0 297 0EU104720 EU104727

Nd-4 Nd-4 9 1378 2EU104721 EU104728

Nd-5 Nd-5 13 1830 1EU104722 EU104729

Nd-6 Nd-6 3 519 1EU104723 EU104730

Accesos GenBank UChA UChB

5. DISCUSIÓN

5.1 Algunas consideraciones de la estructura del genoma mitocondrial de mamíferos y su expresión Si bien las mitocondrias llevan millones de años conviviendo con las células

eucariontes, todavía mantienen características de sus ancestros las protobacterias. En

este sentido hay algunas características de la mitocondria en cuanto a la estructura de

su genoma, a su transcripción y a su traducción que vale la pena mencionar. Por

ejemplo, la mitocondria de los mamíferos posee un genoma de DNA circular con un

tamaño de alrededor de 16 kb (16,3 kb para la rata). En él se encuentran genes de

proteínas que forman parte de los diversos componentes de la cadena respiratoria

mitocondrial (complejos I, II, III, IV y V), así como secuencias que codifican todos los

tRNAs y los RNAs ribosomales que la mitocondria necesita (ver Figura 4). Además, se

pueden identificar en el genoma mitocondrial dos hebras, una pesada y una liviana que

pueden ser separadas mediante una gradiente de CsCl debido a su distinta

composición de G+C. En la hebra pesada se encuentran codificados la mayoría de los

tRNAs, rRNAs y los genes para subunidades de los complejos de la cadena

respiratoria mitocondrial, en cambio en la hebra liviana solamente se encuentran

codificados algunos tRNAs y el gen Nd6 (Taanman, 1999).

Están descritos dos promotores para la expresión de los diversos genes mitocondriales

(ver Figura 4). Uno de ellos se encuentra en la hebra pesada (HSP, heavy strand

promoter, promotor de la hebra pesada) y controla la expresión de todas las

secuencias que se encuentran en esa hebra. El otro promotor se encuentra en la hebra

liviana (LSP, light strand promoter, promotor de la hebra liviana) y controla la expresión

de los genes de esa hebra, entre los que se encuentra el Nd6. Es poco probable que

las diferencias bioquímicas entre las ratas se deban a diferencias en los promotores, es

decir, que el promotor de una subunidad tuviese alguna mutación que afectara su

transcripción y con esto la cantidad del transcrito y de la proteína. De ser así, en la

hebra pesada estaría afectada la transcripción de todos los genes correspondientes,

incluyendo las subunidades de otros complejos, tRNAs y rRNAs, puesto que hay

muchos genes que se encuentran bajo el control de dicho promotor. El mismo

fenómeno ocurriría en la hebra liviana con la diferencia de que no hay secuencias de

rRNAs bajo el control de ese promotor. Así, serían varios los complejos afectados por

este tipo de mutaciones y no sólo el complejo I como lo indica la evidencia

experimental de Quintanilla y cols. (2005b).

Durante la transcripción de los genes mitocondriales de ambas hebras se producen

moléculas largas de RNA, es decir, al igual que en bacterias, un policistrón contiene

todas las secuencias de los rRNAs, tRNAs y mRNAs de esa hebra. Posteriormente,

este transcrito largo de RNA es cortado por RNasas específicas para los tRNAs

(RNasa P y RNasa Z), liberando así mRNAs, tRNAs y rRNAs, formando cistrones

individuales (Taanman, 1999). Son éstos los que son traducidos por el ribosoma, si

corresponde, dando origen a las subunidades peptídicas de los distintos componentes

de la cadena respiratoria mitocondrial. En este punto tiene sentido pensar que las

diferencias nucleotídicas en sí pudieran alterar la estabilidad de los mensajeros (ver

más abajo), y con esto su traducción, ya que son segmentos individuales y no una sola

gran molécula de RNA. Posteriormente, continúa el proceso de maduración de los

distintos mensajeros, por ejemplo los mRNAs son en algunos casos poliadenilados en

su extremo 3’, ya que algunos mensajeros poseen un codón de término incompleto

faltándoles una o dos adeninas. A los precursores de los tRNAs en cambio, se les

agrega en el extremo 3’ un triplete CCA al cual luego se le adicionará el aminoácido

respectivo.

5.2 Acerca de las diferencias genéticas Entre los genes que codifican variaciones aminoacídicas (Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6), hay

dos que llaman la atención. El gen Nd2 tiene diferencias entre linajes que establecen

cuatro diferencias aminoacídicas en la subunidad ND2 que al estar representada ocho

veces en el brazo hidrofóbico del complejo I (Chomyn y cols., 1986), probablemente

tenga un mayor impacto en la estructura y/o actividad del complejo I que las otras

proteínas en estudio que están representadas dos veces. Por otra parte, el gen Nd4

determina dos diferencias aminoacídicas en la subunidad ND4, una de éstas

corresponde a leucina en las ratas UChB y prolina en las ratas UChA y es la más

sugerente de todas las variaciones encontradas debido a que la prolina es un conocido

desarmador de la estructura secundaria. En cuanto a las diferencias encontradas en

ND5 y ND6, si bien no parecen afectar de manera importante la estructura de la zona

donde se encuentran dada la similitud de los aminoácidos en cuestión (en ambas

subunidades hay isoleucina o valina), no hay que descartarlas puesto que alteren o no

la estructura de las proteínas pueden tener consecuencias sobre la función del

complejo I (ver más abajo).

Se encontraron también diferencias nucleotídicas en los genes Nd1 y Nd3. Sin

embargo, estas diferencias son silentes lo cual implica que las subunidades ND1 y

ND3 de ambas ratas son iguales. Por otra parte, no se encontraron diferencias en la

secuencia del gen Nd4L entre las ratas de ambos linajes. Esto sugiere que estas

subunidades (ND1, ND3 y ND4L) deben cumplir un rol importante de manera que tener

diferencias en las proteínas podría llevar a la inhibición completa del complejo I, ya sea

porque no se puede ensamblar correctamente o porque esas subunidades son más

importantes para la actividad del complejo I. Otro efecto que podrían tener las

diferencias nucleotídicas en general es sobre la estabilidad de los mRNAs de manera

tal que puede haber transcritos que sean degradados más fácilmente que otros,

traduciéndose en una menor cantidad de proteína para esa subunidad.

Experimentalmente, se podría investigar si esta proposición se cumple o no midiendo

la estabilidad de los transcritos en cuestión, así como la cantidad de proteína.

5.3 Alteraciones del complejo I determinadas por mutaciones de las subunidades hidrofóbicas Cabe preguntarse si las variaciones encontradas serán capaces de provocar

alteraciones en la actividad del complejo I, que está formado por alrededor de

46 subunidades distintas. En humanos, se han encontrado cambios aminoacídicos

vinculados a diversas enfermedades en todas las subunidades del complejo I

codificadas en la mitocondria. Entre dichas patologías se encuentran la neuropatía

óptica hereditaria de Leber (LHON, Leber hereditary optic neuropathy), la

encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios del tipo infarto (MELAS,

mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), la epilepsia

mioclónica con fibras rojas desgarradas (MERRF, myoclonic epilepsy with ragged red

fibers) y otras más conocidas como son la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de

Alzheimer y la diabetes (Ruiz-Pesini y cols., 2007). Ello indica que todas las

subunidades codificadas en la mitocondria son fundamentales para la actividad normal

del complejo I. También se han descrito variaciones nucleotídicas silentes asociadas a

algunas de las enfermedades mencionadas. Esto apoya en parte lo dicho acerca de la

estabilidad de los transcritos asociada a su desaparición. Así, probablemente hay

transcritos que no alcanzan a tener un procesamiento apropiado, lo que lleva a la

formación de péptidos aberrantes. Estas enfermedades mitocondriales tienen en

común, en general, un complejo I de menor capacidad oxidativa que el de los

individuos que no las poseen (Lenaz y cols., 2004), fenómeno similar a lo que ocurre

con las ratas UChA respecto a las UChB. Esto quiere decir que es posible que tanto

mutaciones silentes como variaciones nucleotídicas que conducen a cambios

aminoacídicos en estas subunidades, independientemente de su naturaleza, alteren la

funcionalidad del complejo I. Entre las variaciones aminoacídicas descritas en la

literatura se encuentran cambios de aminoácidos de la misma familia (Ruiz-Pesini y

cols., 2007), que son los que menos se espera que provoquen algún cambio en la

estructura de una proteína, como por ejemplo valina por isoleucina. Este tipo de

variación es la que se encontró en esta memoria en las subunidades ND5 y ND6 por lo

que no se puede descartar su efecto en la actividad del complejo I.

Otro indicio de que las variaciones entre aminoácidos que tienen características

fisicoquímicas similares pueden alterar la estructura de una proteína y así su función,

viene de los resultados obtenidos de los análisis in silico (predicción tridimensional y de

segmentos de transmembrana) realizados a la subunidad ND2 de ambos linajes. Se

determinó que los cuatro cambios aminoacídicos son responsables de diferencias a

nivel estructural entre las subunidades de ambos linajes. La subunidad ND2 del linaje

UChA posee un segmento de transmembrana menos que la del linaje UChB, lo que se

traduce en (i) ubicaciones distintas de los aminoácidos 265, 304 y 318 respecto a la

membrana y (ii) en la forma más extendida de la subunidad ND2 del linaje UChA con

respecto a la del linaje UChB.

En resumen, podemos suponer que la limitación en la función del complejo I de las

ratas UChA en comparación con la de las ratas UChB debe ser lo suficientemente

importante como para provocar diferencias a nivel bioquímico entre los complejos I

pero no tan importante como para traerle complicaciones a las ratas UChA a nivel de

músculos, visión, etc, como sucede con las personas que padecen alguna de las

enfermedades de la mitocondria asociadas a mutaciones de las subunidades del

complejo I.

Resulta de interés promover estudios orientados a caracterizar en mayor detalle la falla

funcional del complejo I de las ratas UChA y determinar cuáles de las diferencias

aminoacídicas encontradas son las responsables de las diferencias bioquímicas entre

los linajes UChA y UChB. Los estudios de función pueden incluir estudios cinéticos

(usando inhibidores), medición de especies reactivas del oxígeno (ROS) y cambios en

el potencial de membrana de la mitocondria, ofreciendo una imagen más clara de lo

que este fenómeno está produciendo en la célula.

Los estudios funcionales de las diferencias aminoacídicas individuales son, sin duda,

los más difíciles de abordar debido a que el complejo I está compuesto por muchas

subunidades codificadas tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial. Además,

el gran número de mitocondrias que hay en una célula representa una dificultad al

tratar de modificar la mitocondria genéticamente. Sin embargo, una aproximación es

utilizar bacterias para estudiar cuáles son los cambios aminoacídicos que provocan

cambios en la actividad de la estructura bacteriana análoga al complejo I de las

mitocondrias. Existen bacterias que tienen parecidos evolutivos con las mitocondrias

(por ejemplo Paracoccus denitrificans) y que se utilizan para este tipo de estudios, pero

también hay trabajos en que se utiliza Escherichia coli. Las bacterias en general tienen

un complejo I rudimentario llamado NDH1 que está formado por 14 subunidades

distintas (Yagi y cols., 1998). Corresponde a la mínima expresión del complejo I de

mamífero y es capaz de realizar casi las mismas funciones. Estructuralmente, el NDH1

también tiene dos dominios principales, uno que apunta hacia el citoplasma de la

bacteria y otro que se encuentra embebido en la membrana bacteriana y cataliza la

transferencia de electrones desde el NADH o el NADPH a través de otros complejos y

aceptores lipídicos hacia el oxígeno. El complejo NDH1 también posee siete genes que

codifican subunidades de membrana que son homólogas a las siete subunidades del

complejo I codificadas en la mitocondria.

Hay experimentos en los cuales se han incorporado en genes bacterianos del NDH1

variaciones nucleotídicas que conducen a cambios aminoacídicos y que corresponden

a las descritas en enfermedades mitocondriales como LHON y MELAS (ver más

arriba), específicamente, en genes homólogos bacterianos que codifican subunidades

homólogas a ND1 (Kervinen y cols., 2006) y ND4L (Kao y cols., 2005). Al evaluar el

efecto de estos cambios sobre la actividad del complejo bacteriano NDH1, se vio una

disminución importante de la actividad en las mutantes que tenían cambios asociados

a las enfermedades mitocondriales.

La idea es comparar mediante alineamientos múltiples las subunidades bacterianas y

las de ratas UChA y UChB para las cuatro proteínas que tienen diferencias entre ellas

(ND2, ND4, ND5 y ND6) para encontrar las posiciones bacterianas equivalentes a las

ubicaciones en que se encuentran las diferencias aminoacídicas entre los linajes de

ratas. Finalmente, mediante mutagénesis sitio dirigida, incorporar dichas variaciones en

los genes respectivos. Así, se podrían analizar por separado y en conjunto las

variaciones aminoacídicas y su relación con la actividad del complejo I.

5.4 Análisis de secuencias De la Tabla 4B se desprende que las cepas de ratas más parecidas a los linajes UChA

o UChB corresponden a animales consanguíneos que han sido obtenidos mediante

cruzamientos selectivos y que se utilizan para diversos estudios, por ejemplo diabetes

e hipertensión (Tabla 5). En cambio, las secuencias proteicas deducidas de las ratas

silvestres (accesos DQ673917, DQ673916 y AJ428514) están dentro de los animales

que menos proteínas tienen en común con los linajes UChA y UChB.

Es posible que, por ejemplo, debido a factores como la formación de especies

reactivas del oxígeno (ROS), se modifique la secuencia de un gen mitocondrial, de

Tabla 5. Genomas mitocondriales de rata utilizados para los análisis comparativos

Se identifican y ordenan los genomas mitocondriales de rata con los cuales se compararon los genes de los linajes UChA y UChB según su código de acceso GenBank. Se especifican las cepas por nombre y descripción y se incluyen las referencias respectivas. Todos estos archivos GenBank corresponden a genomas mitocondriales completos obtenidos a partir de DNA total de rata. Los códigos de acceso se encuentran ordenados alfabética y numéricamente.

Acceso DNA Cepa Descripción Referencia

AC_000022.2 Wistar sin información Saccone C y cols., GenBank 1989

AJ428514 Rata silvestre capturada sin información Nilsson MA y cols., 2003

AY769440 F344xBNF1 sin información Pak JW y cols., 2005

DQ673907 WKY/NCrl Wistar Kyoto Schlick NE y cols., 2006

DQ673908 ACI/Eur August x Copenhagen Irlanda Schlick NE y cols., 2006

DQ673909 F344/NHsd Fisher 344 Schlick NE y cols., 2006

DQ673910 FHH/Eur Fawn-hooded hipertensa Schlick NE y cols., 2006

DQ673911 GH/OmrMcwi Genéticamente hipertensa Schlick NE y cols., 2006

DQ673912 GK/Far Subcepa Goto-Kakizaki (Florida) Schlick NE y cols., 2006

DQ673913 GK/Swe Subcepa Goto-Kakizaki (Suecia) Schlick NE y cols., 2006

DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi Dahl, sensible a la sal Schlick NE y cols., 2006

DQ673915 T2DN/Mcwi Nefropatía diabética tipo 2 Schlick NE y cols., 2006

DQ673916 Wild/Mcwi Silvestre, Milwaukee Schlick NE y cols., 2006

DQ673917 Wild/Tku Silvestre, Tokyo Schlick NE y cols., 2006

NC_001665.2 BN/SsNHsdMCW Brown Norway McLeod MP y cols., GenBank 2006

manera que teóricamente coexistan en un genoma mitocondrial segmentos de

secuencias génicas que son propios de linajes distintos. Sin embargo, no se encontró

ninguna secuencia mitocondrial en GenBank que codifique simultáneamente proteínas

que son exclusivas de ambos linajes, sólo se encontraron casos en los que las

proteínas son iguales a las del linaje UChA o del linaje UChB.

La cepa GH/OmrMcwi, que corresponde a una rata genéticamente desarrollada para

tener hipertensión, posee las mismas proteínas ND2 y ND6 de las ratas UChA (ver

Tabla 4B). Al cruzar una rata hembra con estas características con alguna rata híbrida

UChA/UChB (de la F2) (ver Figura 2), que posea un genotipo Aldh22/2, una mitocondria

eficiente y fenotípicamente un elevado consumo de alcohol, se obtendría en su

descendencia F2 una rata que tiene un bajo consumo de alcohol con genotipo Aldh22/2

y la mitocondria más parecida a las ratas UChA (mitocondria deficiente) siempre que la

o las subunidades responsables de las diferencias bioquímicas entre los complejos I de

las ratas UChA y UChB sean las proteínas ND2 y ND6. Los otros linajes o cepas de

ratas que también se parecen a las ratas UChA (GK/Swe, GK/Far y WKY/NCrl) tienen

una variante distinta a la subunidad ND2 de los linajes UChA y UChB, pero tienen la

variante del linaje UChA de la subunidad ND6 por lo que también podrían utilizarse

para estudiar el efecto de la subunidad ND6 sobre el consumo de alcohol.

Con respecto al linaje UChB también se pueden utilizar cualquiera de las cinco ratas

que tienen proteínas iguales a las ratas UChB (T2DN/Mcwi, SS/JrHsd/Mcwi, FHH/Eur,

F344/NHsd y ACI/Eur) para cruzarlas, por ejemplo, con una rata UChA macho

genotipificada como Aldh22/2 que posea una mitocondria deficiente y cuyo consumo de

alcohol sea bajo. En su descendencia F2, las ratas homocigotas para el alelo Aldh22 y

que tengan la mitocondria más parecida a las ratas UChB tendrán un consumo elevado

de etanol. El objetivo es tratar de individualizar el o los genes responsables de las

diferencias bioquímicas en el complejo I entre los linajes. Además, se puede medir el

consumo de oxígeno de las mitocondrias de las ratas que tienen estas similitudes con

los linajes bebedor y no bebedor y compararlo con el consumo de oxígeno de las

mitocondrias de las ratas UChA y UChB.

En cuanto a la comparación entre los genes mitocondriales se encontraron menos

relaciones puesto que hay una mayor variación entre sus secuencias nucleotídicas

(44 variaciones) que entre las respectivas proteínas (ocho variaciones). Sin embargo,

se puede decir que la secuencia nucleotídica del gen Nd4L (que es el mismo en ambos

linajes) se encuentra muy conservada entre las ratas analizadas y corrobora lo

encontrado en el análisis de subunidades. Además, las variantes del linaje UChB de

los genes Nd2 y Nd3 son las más conservadas, ya que hay un mayor número de ratas

que también las poseen.

5.5 Genes de herencia materna Se mencionó que el complejo I está formado por múltiples subunidades codificadas en

los cromosomas no sexuales y nueve subunidades de origen materno localizadas en la

membrana de la mitocondria, siete ya abordadas aquí y otras dos codificadas en el

cromosoma X. Éstas son las subunidades MWFE y ESSS, codificadas por los genes

Ndufa1 (Zhuchenko y cols., 1996) y Ndufb11 (Carroll y cols., 2002) respectivamente.

Estas subunidades también pueden ser las responsables de las diferencias en las

capacidades del complejo I de los linajes, por lo que su secuenciación también se ha

abordado. Nuestro grupo de investigación ha secuenciado los tres exones del gen

Ndufa1 (L. Lobos y A. Sapag) y los tres exones del gen Ndufb11 (G. Encina y A.

Sapag) de las mismas diez ratas de este estudio (cinco UChA y cinco UChB). Las

secuencias nucleotídicas de dichos exones son las mismas para las ratas UChA y

UChB haciendo muy improbable que las proteínas MWFE y ESSS determinen

diferencias entre los linajes.

5.6 Secuenciación, detalles experimentales La secuenciación directa de amplicones, es decir, sin clonarlos previamente, arrojó en

general buenos resultados. Si bien se necesitó un gran número de reacciones de

amplificación y secuenciación para secuenciar los genes de las diez ratas, el tiempo

que hubiese tomado la clonación de diez amplicones para cada gen y su posterior

secuenciación llevaron a descartar la clonación como parte de la estrategia

experimental adoptada, aunque la secuenciación de plasmidios es, en general, de

mayor calidad que la de amplicones. Además, con la serie de reacciones de

secuenciación podemos decir que no hay una receta para una secuenciación exitosa.

La concentración del molde y las características de los partidores son algunos de los

elementos que influyen en la calidad de una reacción de secuenciación, pero a una

determinada concentración de molde, hay distintos tipos de partidores, esto es, de baja

o de alta Tm que pueden dar igualmente buenas reacciones de secuenciación. En

general, partidores de baja Tm (entre 50 y 54°C) han dado buenos resultados,

justamente esto es lo que recomienda el servicio de Macrogen para garantizar una

buena corrida, pero algunos partidores de Tms mucho mayores también han dado muy

buenos resultados, por lo que se secuenció con los partidores de la amplificación,

sintetizando unos de baja Tm sólo al requerir partidores adicionales. Para este trabajo

se diseñaron originalmente partidores de alta Tm puesto que el molde sobre el cual se

iba a amplificar contenía DNA genómico total y los partidores de Tm mayores ayudan a

tener una mayor especificidad sobre el molde de interés que en este caso es el del

DNA mitocondrial.

Otro factor que influye en la calidad de la reacción de secuenciación de genes

mitocondriales es la posible coexistencia de variantes mitocondriales (heteroplasmia)

que pueden, dependiendo de su porcentaje y tipo, producir reacciones sobrelapadas

que no son posibles de discriminar y que no permiten obtener secuencias útiles o bien

que generan confusión en la interpretación de los datos.

5.7 Efectos de la heteroplasmia Heteroplasmia quiere decir que en una célula puede haber varios tipos de

mitocondrias, unas con un DNA distinto al de otras y que puede variar en uno o varios

genes. Homoplasmia quiere decir que todas las mitocondrias de una célula poseen el

mismo genoma mitocondrial. El concepto de heteroplasmia es muy importante al

pensar en las enfermedades asociadas a las mitocondrias, puesto que el porcentaje

que se tenga para una determinada mutación va a determinar la gravedad de la

patología (Ruiz-Pesini y cols., 2007). En este trabajo de memoria, al secuenciar los

genes mitocondriales de ambas ratas era posible que surgiera heteroplasmia para

algunos o todos los genes. Sin embargo, esto no ocurrió. Si bien no podemos descartar

la heteroplasmia en algunas posiciones nucleotídicas, hay ciertas cosas que decir al

respecto.

Los posibles casos de heteroplamia corresponden a situaciones en que en el

electroforetograma de secuenciación se observaron dos picos bien definidos

compartiendo el mismo espacio pero de distinta altura. En dichos casos la altura del

pico menor no sobrepasa el 20% de la intensidad del pico mayor, por ejemplo, un pico

de T que tiene superpuesto un pico de C siendo la altura de este último no superior al

20% de la del primero. Dadas las características del método, es decir, la secuenciación

automática por capilar, las heteroplasmias menores al 20% no pueden ser detectadas

porque se confunden con el ruido basal de la señal. Además, ese 20% puede deberse

a mutaciones introducidas por la DNA polimerasa en una de las cinco reacciones de

PCR agrupadas para la secuenciación. Otro aspecto a considerar es que estas ratas

son jóvenes, ya que a mayor edad se acumulan más mutaciones en el mtDNA, por lo

que debiera ser mucho menor la heteroplasmia. Estas ratas han sido seleccionadas

alrededor de 50 años, por lo que si en un principio había heteroplasmia (las primeras

ratas con que comenzaron las series de cruzamientos) se debe haber diluido

estableciéndose en ambas líneas de ratas las variantes mitocondriales dominantes. Si

bien no podemos descartar completamente la existencia de heteroplasmia en algunas

posiciones nucleotídicas, si existiera no debiese ser mayor al 20%, es decir, en una

célula podría haber hasta un 20% de mitocondrias con un genoma distinto al 80%

restante. Además, hay razones para justificar la inexistencia aparente de heteroplasmia

en los genes mitocondriales de las ratas UChA y UChB.

La heteroplasmia puede variar de un tejido a otro, es decir, la población mitocondrial

heterogénea encontrada en el hígado no es necesariamente la misma que la del

pulmón o el cerebro, por ejemplo. Por ello resulta ventajoso que el gDNA disponible

haya sido obtenido del hígado y no de otro tejido como la sangre, ya que el órgano que

contribuye más al metabolismo del alcohol es el hígado.

5.8 Implicancias para el alcoholismo de las diferencias de secuencia encontradas en los genes mitocondriales Las diferencias en los genes mitocondriales heredados exclusivamente por línea

materna establecen nuevos polimorfismos que son posibles determinantes del

consumo de alcohol. En otras palabras, las variaciones en los genes mitocondriales

que codifican las subunidades hidrofóbicas del complejo I pueden jugar un papel

importante en la disponibilidad del NAD+ que es necesario para la transformación de

alcohol a acetaldehído por la ADH y luego de acetaldehído a acetato por la ALDH2

(Figura 1). Entonces, al heredar un complejo I eficiente un individuo podría beber gran

cantidad de alcohol (independientemente de la ALDH2 que tenga) si el medio en que

se encuentra favorece esta conducta. Por el contrario, un complejo I deficiente tendría

que coincidir con una ALDH2 de Km alta para que un individuo consuma poco alcohol.

Entonces, en un medio que favorece el consumo de alcohol, una madre alcohólica

puede tener mayor incidencia sobre su descendencia en el desarrollo del alcoholismo

que un padre alcohólico. Esta hipótesis es corroborada en parte por estudios con niños

adoptados que tenían un padre biológico alcohólico o una madre biológica alcohólica;

los hijos adoptados de madres biológicas bebedoras tienden a ser más bebedores que

los niños que provienen de padres biológicos bebedores y las hijas son más bebedoras

cuando tienen una madre biológica alcohólica que cuando el padre biológico es el

bebedor (Bohman y cols., 1981). Sería interesante determinar en humanos si hay

alguna relación entre la herencia de un complejo I eficiente y el alcoholismo, o bien

analizar los genes mitocondriales ya mencionados y determinar su relación con un

mayor consumo de alcohol.

Otra aproximación es investigar las características de las mitocondrias en individuos de

la población asiática oriental que beben poco alcohol, ya que se espera encontrar un

complejo I deficiente en estas poblaciones similar a lo que ocurre en las ratas UChA.

Esta idea se fundamenta en la evidencia de que la población asiática oriental que no es

bebedora ha heredado no sólo la variante ALDH2∗2 del gen de la ALDH2 como factor

protector del consumo de alcohol, sino que también ha heredado variantes de la ADH

(ADH1B∗2 y ADH1C∗1) que metabolizan rápidamente el alcohol y elevan los niveles de

acetaldehído rápidamente desincentivando el consumo de alcohol (Pöschl y Seitz,

2004). En resumen, el fenotipo no bebedor en la población asiática está asociado a

diversos factores, haciendo lógico pensar que, además de estas variantes de la ADH y

de la ALDH2, los individuos no bebedores hayan heredado una mitocondria deficiente

en la capacidad de transportar electrones a partir del complejo I, como las mitocondrias

que posee el linaje UChA.

Las mitocondrias del linaje UChA, al ser deficientes en comparación con las del linaje

UChB, pueden generar más radicales libres ya que, como se mencionó anteriormente,

las subunidades del complejo I con mutaciones asociadas a enfermedades, conducen,

en general, a menores capacidades respiratorias y mayor producción de ROS (Lenaz y

cols., 2004) que las subunidades silvestres del complejo I. Las ROS son capaces de

modificar, entre otras cosas, las bases nucleotídicas, produciendo mutaciones en el

DNA que alteran la maquinaria celular y en casos extremos provocan su muerte. Esta

proposición concuerda con estudios en la población japonesa bebedora de alcohol y

que posee la variante de la ALDH2 que está asociada al bajo consumo de alcohol

(ALDH2∗2). Se ha encontrado que en este tipo de bebedores hay un aumento de

cánceres de la vía oral, en comparación con los bebedores que tienen la variante

permisiva de esa enzima (ALDH2∗1) (Pöschl y Seitz, 2004). Así, la ingesta de alcohol

en presencia de una mitocondria de baja capacidad transportadora de electrones

puede llevar a una mayor producción de radicales libres que pueden modificar el DNA

y generar así células tumorales. No hay que olvidar el efecto de otros factores que

también pueden generar células tumorales, como es el discutido efecto mutagénico del

acetaldehído, el cual está presente en niveles elevados en la saliva de estos individuos

bebedores. La mayor o menor producción de radicales libres en los distintos tipos de

mitocondrias puede descartarse o corroborarse mediante la medición de la producción

de especies radicalarias en suspensiones mitocondriales de los linajes UChA y UChB,

en la presencia de, por ejemplo, agentes atrapadores de electrones que permiten

estabilizar las especies radicalarias y cuantificarlas mediante resonancia de espín

electrónico (ESR, electron spin resonance). Se espera encontrar que las mitocondrias

del linaje UChA produzcan más especies reactivas que las del linaje UChB sólo cuando

se agregan sustratos que aportan NADH a la mitocondria y no cuando los sustratos

aportan FADH2. Así, la combinación de alcohol y una mitocondria deficiente puede ser

muy perjudicial debido a la mayor generación de ROS que presentan las mitocondrias

deficientes en comparación con las mitocondrias eficientes.

Finalmente, las diferencias nucleotídicas reportadas para los genes mitocondriales del

complejo I, en especial las conducentes a variaciones aminoacídicas como las

encontradas en los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6, establecen una posible base genética

de las diferencias bioquímicas en la actividad del complejo I entre ambos linajes. Los

polimorfismos aquí descritos tienen el potencial de influir en la regeneración del NAD+ y

el consumo de alcohol, constituyendo, por lo tanto, nuevos factores maternos

permisivos o protectores del alcoholismo.

6. CONCLUSIONES

• Los linajes de ratas UChA no bebedoras y UChB bebedoras de alcohol se diferencian

en los genes mitocondriales Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I. No se

encontraron diferencias nucleotídicas en el gen Nd4L entre ambos linajes.

• Los genes Nd1 y Nd3 sólo tienen diferencias nucleotídicas silentes entre ambos linajes.

Los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6 tienen además diferencias nucleotídicas conducentes

a cambios aminoacídicos.

• Cuatro proteínas difieren entre linajes: las subunidades ND2 se diferencian en cuatro

posiciones aminoacídicas, (UChA/UChB) posiciones 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304

(Met/Thr) y una inserción de His en la posición 318 (His/---), las subunidades ND4 se

diferencian en las posiciones 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu), las subunidades ND5 en la

posición 37 (Val/Ile) y las subunidades ND6 en la posición 139 (Val/Ile).

• Las variaciones aminoacídicas en las posiciones 150, 265, 304 y 318 de la proteína

ND2 determinan cambios estructurales evidentes en un modelo tridimensional y en el

número de segmentos de transmembrana.

• Hay un sólo tipo de mitocondria por linaje, es decir, para cada gen, las ratas UChA son

iguales entre sí y las ratas UChB son iguales entre sí; no se encontró heteroplasmia.

• Las secuencias nucleotídicas de los genes Nd1, Nd5 y Nd6 de los linajes UChA y

UChB y la secuencia nucleotídica del gen Nd4 del linaje UChA, son secuencias

génicas nuevas entre los roedores.

• La secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND5 de los linajes UChA y UChB

y la secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND4 del linaje UChA son

secuencias proteicas nuevas entre los roedores.

• Los polimorfismos génicos aquí reportados en subunidades del complejo I mitocondrial,

en especial los responsables de variaciones aminoacídicas, pueden establecer nuevos

factores (permisivos o protectores) de herencia exclusivamente materna que influyen

en la capacidad mitocondrial de regenerar el NAD+ y, así, en el consumo de alcohol.

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8. ANEXO Alineamientos múltiples de las subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 de Rattus norvegicus Se muestran los alineamientos múltiples, realizados mediante el programa ClustalW,

de las subunidades de los linajes UChA y UChB con las secuencias peptídicas

deducidas de genomas mitocondriales completos de Rattus norvegicus. Se utilizaron

los parámetros establecidos por defecto en el programa, entre los que se encuentra la

matriz Gonnet. El asterisco (*) indica que es el mismo aminoácido en toda esa

columna, los dos puntos (:) indican que las variaciones aminoacídicas en esa columna

son conservadas y el punto (.) indica que las variaciones aminoacídicas en esa

columna son semiconservadas. Las posiciones de variación entre el linaje UChA y el

linaje UChB se destacan en un sombreado gris.

A continuación de los alineamientos propiamente tales, se incluye una representación

gráfica de los mismos. Los bloques grises claros representan las zonas de la proteína

que poseen los mismos aminoácidos en los 17 linajes comparados, las barras negras

representan las variaciones aminoacídicas conservadas y las barras grises oscuras

representan las variaciones aminoacídicas semi conservadas.

Alineamiento múltiple de secuencias, subunidad ND1 (CLUSTAL W 1.83)gi|108773517|gb|ABG11806.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773502|gb|ABG11792.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773482|gb|ABG11773.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773474|gb|ABG11766.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|110189715|ref|YP_665629.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 Alelo_UChA_Nd-1 MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 Alelo_UChB_Nd-1 MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773530|gb|ABG11818.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773558|gb|ABG11844.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773544|gb|ABG11831.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773586|gb|ABG11870.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773572|gb|ABG11857.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|54145372|gb|AAV31039.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773600|gb|ABG11883.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773614|gb|ABG11896.1| MYFINTLTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|19577314|emb|CAD21559.1| MYFINTLTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|110189663|ref|AP_004892.1| MYFINILTLLIPILIAMGLLTLVERKILGYMQLRKGPNNEGPYGKLQPFA 50 ***** ***********.:******************* **** ***** gi|108773517|gb|ABG11806.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773502|gb|ABG11792.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773482|gb|ABG11773.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773474|gb|ABG11766.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|110189715|ref|YP_665629.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 Alelo_UChA_Nd-1 DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 Alelo_UChB_Nd-1 DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773530|gb|ABG11818.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773558|gb|ABG11844.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773544|gb|ABG11831.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773586|gb|ABG11870.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773572|gb|ABG11857.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|54145372|gb|AAV31039.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773600|gb|ABG11883.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773614|gb|ABG11896.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|19577314|emb|CAD21559.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|110189663|ref|AP_004892.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 ************************************************** gi|108773517|gb|ABG11806.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773502|gb|ABG11792.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773482|gb|ABG11773.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773474|gb|ABG11766.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|110189715|ref|YP_665629.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 Alelo_UChA_Nd-1 GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 Alelo_UChB_Nd-1 GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773530|gb|ABG11818.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773558|gb|ABG11844.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773544|gb|ABG11831.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773586|gb|ABG11870.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773572|gb|ABG11857.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|54145372|gb|AAV31039.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773600|gb|ABG11883.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773614|gb|ABG11896.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|19577314|emb|CAD21559.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|110189663|ref|AP_004892.1| GMPFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMALYL 150 ** ********************************************: *

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Alineamiento múltiple de secuencias, subunidad ND2 (CLUSTAL W 1.83) gi|108773601|gb|ABG11884.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|110189716|ref|YP_665630.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773615|gb|ABG11897.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773559|gb|ABG11845.1| MNPITLIIIYFTILMGPAITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773475|gb|ABG11767.1| MNPITLIIIYFTILMGPAITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773545|gb|ABG11832.1| MNPITLIIIYFTILMGPAITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773531|gb|ABG11819.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 Alelo_UChA_Nd-2 MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|19577315|emb|CAD21560.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|54145373|gb|AAV31040.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 Alelo_UChB_Nd-2 MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773483|gb|ABG11774.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773503|gb|ABG11793.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773518|gb|ABG11807.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773573|gb|ABG11858.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|108773587|gb|ABG11871.1| MNPITLIIIYFTILMGPVITMSSSNLLLMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 gi|110189664|ref|AP_004893.1| MNPITLTIIYLTTFKGRLITTLSTNLPPMWVGLEMSLLAIIPLLANKKSP 50 ****** ***:* : * ** *:** ********************** gi|108773601|gb|ABG11884.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLAIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|110189716|ref|YP_665630.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773615|gb|ABG11897.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773559|gb|ABG11845.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773475|gb|ABG11767.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773545|gb|ABG11832.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773531|gb|ABG11819.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 Alelo_UChA_Nd-2 RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|19577315|emb|CAD21560.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|54145373|gb|AAV31040.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 Alelo_UChB_Nd-2 RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773483|gb|ABG11774.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773503|gb|ABG11793.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773518|gb|ABG11807.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773573|gb|ABG11858.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|108773587|gb|ABG11871.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 gi|110189664|ref|AP_004893.1| RSTEAATKYFLTQATASMIILLVIILNYKQSGMWTLQQQTNNMLLNMMLI 100 **********************.*************************** gi|108773601|gb|ABG11884.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|110189716|ref|YP_665630.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773615|gb|ABG11897.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773559|gb|ABG11845.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLS 150 gi|108773475|gb|ABG11767.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLS 150 gi|108773545|gb|ABG11832.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLS 150 gi|108773531|gb|ABG11819.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLS 150 Alelo_UChA_Nd-2 SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLS 150 gi|19577315|emb|CAD21560.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILHQFYQLLS 150 gi|54145373|gb|AAV31040.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 Alelo_UChB_Nd-2 SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773483|gb|ABG11774.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773503|gb|ABG11793.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773518|gb|ABG11807.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773573|gb|ABG11858.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|108773587|gb|ABG11871.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 gi|110189664|ref|AP_004893.1| SLAMKLGLAPFHYWLPEVTQGIPLHIGLILLTWQKIAPLSILYQFYQLLN 150 ******************************************:******.

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Alineamiento múltiple de secuencias, subunidad ND6 (CLUSTAL W 1.83) gi|108773578|gb|ABG11863.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 Alelo_UChB_Nd-6 MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773592|gb|ABG11876.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773606|gb|ABG11889.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773620|gb|ABG11902.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773493|gb|ABG11784.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773508|gb|ABG11798.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773511|gb|ABG11800.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|110189674|ref|AP_004903.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|19577325|emb|CAD21570.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|54145383|gb|AAV31050.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|110189726|ref|YP_665640.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGLGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773564|gb|ABG11850.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 Alelo_UChA_Nd-6 MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773550|gb|ABG11837.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773536|gb|ABG11824.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 gi|108773480|gb|ABG11772.1| MTNYMFILSLLFLTGCLGLALKPSPIYGGFGLIVSGCIGCLMVLGFGGSF 50 *****************************:******************** gi|108773578|gb|ABG11863.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 Alelo_UChB_Nd-6 LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773592|gb|ABG11876.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773606|gb|ABG11889.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773620|gb|ABG11902.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773493|gb|ABG11784.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773508|gb|ABG11798.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773511|gb|ABG11800.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|110189674|ref|AP_004903.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|19577325|emb|CAD21570.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|54145383|gb|AAV31050.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|110189726|ref|YP_665640.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773564|gb|ABG11850.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 Alelo_UChA_Nd-6 LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773550|gb|ABG11837.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773536|gb|ABG11824.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 gi|108773480|gb|ABG11772.1| LGLMVFLIYLGGMLVVFGYTTAMATEEYPETWGSNWFIFSFFVLGLFMEL 100 ************************************************** gi|108773578|gb|ABG11863.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 Alelo_UChB_Nd-6 VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773592|gb|ABG11876.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773606|gb|ABG11889.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773620|gb|ABG11902.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773493|gb|ABG11784.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773508|gb|ABG11798.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773511|gb|ABG11800.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|110189674|ref|AP_004903.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|19577325|emb|CAD21570.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|54145383|gb|AAV31050.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|110189726|ref|YP_665640.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGIGVAAIYSCATW 150 gi|108773564|gb|ABG11850.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGVGVAAIYSCATW 150 Alelo_UChA_Nd-6 VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGVGVAAIYSCATW 150 gi|108773550|gb|ABG11837.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGVGVAAIYSCATW 150 gi|108773536|gb|ABG11824.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGVGVAAIYSCATW 150 gi|108773480|gb|ABG11772.1| VVFYLFSLNNKVELVDFDSLGDWLMYEIDDVGVMLEGGVGVAAIYSCATW 150 **************************************:***********

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DIFERENCIAS GENÉTICAS ENTRE RATAS … · 2009-04-07 · El linaje UChA se diferencia del linaje UChB en el gen Aldh2: ... Nd5 y Nd6 de ambos linajes y el gen Nd4 del linaje UChA