DIGESTIÓN DE DNA CON

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN

OBJETIVO Someter a una digestión el DNA plasmídico (plásmido pEGFP-N1) con la enzima de restricción EcoR1, observando el efecto de dicha restrictasa en la estructura de DNA por medio de una electroforesis en gel de agarosa.

METODOLOGÍA

Buffer 10x 10µL

EcoR1 0.5µL

DNA 3.3µL

Agua 5.2 cbp 10µL

Cálculo1058.7ng DNA -----------1µL3500ng DNA-------------- x= 3.3059µL

DNAt-----------1058.7ng/µLRNA-------------- 846.4 ng/µL

RESULTADOS

Figura No. 1 Resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 1% del plásmido pEGFP–N1 de Escherichia coli (DHS∝) obtenidos de los equipos pares, donde se observa muy poco DNA plásmidico, pero si una gran cantidad de RNA. Dónde: 1) Marcador de 100 pb 2) Muestra de DNA digerido por la enzima de restricción EcoR1 3) muestra de DNA plásmidico sin digerir.

DISCUSIÓN Las moléculas de DNA plasmídico de una bacteria son circulares pero, al igual que el cromosoma bacteriano, están retorcidas debido a la enzima GIRASA, que es una topoisomerasa de tipo II. Cuando dos regiones bicatenarias de DNA se aproximan, la girasa puede añadir superenrollamientos al DNA. Para hacer esto, corta ambas hebras de una de las regiones del DNA, pasa la otra región a través de la brecha y une de nuevo los extremos resultantes del corte anterior. Debido a que las moléculas superenrolladas son más compactas, su volumen es menor, se mueven con más facilidad a través del gel, y las encontramos más lejos del punto de origen. Las moléculas circulares relajadas y las moléculas lineales de longitud completa avanzan más lentamente que las superenrolladas.

La banda más cercana al punto de partida corresponde al DNA plásmidico en su forma circular relajada, la segunda banda más cercana al punto de partida corresponde al DNA plásmidico digerido por la endonucleasa, es decir su forma lineal y por último la banda más cercana del punto partida corresponde al DNA plásmidico en la isoforma superenrrollada.

Mapa de restricción del plásmido pEGFP-N1 resistente a kanamicina

Al usar una sola enzima de restricción se esperó un solo fragmento del plásmido que en realidad solo fue la molécula abierta. El plásmido usado, pEGFP–N1 de 4733 pb extraído de la cepa Escherichia coli DH5α que le confiere resistencia a la Kanamicina, tiene una sola zona de reconocimiento (secuencia: GAATTC) para la enzima de restricción EcoR1 extraído de la cepa Escherichia coli RY13 por lo tanto solo se le hizo un corte a todo el plásmido disponiéndolo en conformación lineal.

En la electroforesis la muestra se observó digerida y sin digerir, observándose bandas solamente para RNA, interpretándose que, al no haber bandas en la zona esperada, el DNA plásmidico se obtuvo en muy poca cantidad; la causa probable de lo ocurrido es el tiempo del cultivo bacteriano, pues la técnica miniprep establece la recolección de la bacteria a las 16 horas de sembrada, justo en la transición de la fase logarítmica a estacionaria, en la que el DNA se encuentra en mayor cantidad que el RNA. Al usar un cultivo bacteriano que haya sobrepasado las 16 horas se encuentra en la fase estacionaria, momento en el que el DNA se compacta en el nucleoide y disminuye su metabolismo, encontrándose el RNA en mayor cantidad.

CONCLUSIONES Se realizó el aislamiento y purificación del plásmido pEGFP-N1 proveniente de la cepa bacteriana Escherichia coli (DHS∝) mediante el método de mini prep, así como la digestión del DNA plásmidico, utilizando la enzima de restricción EcoR1, pudiéndose observar mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, la presencia del plásmido purificado, con tres formas topológicamente diferentes; la forma superenrrollada, la forma circular relajada, así como su forma lineal producto de la misma digestión de DNA plásmidico.

ARTICULO

Demostrar que la cepa empleada en el producto cubano biolarvicida Bactivec, presenta idéntico patrón genético al de la cepa de referencia 266 de Bacillus thuringiensis del Instituto Pushkin del antiguo Leningrado y con ello aportar una herramienta más para el control decalidad del producto.

OBJETIVO

MÉTODOSe estudiaron 3 cepas 266 de Bacillusthuringiensis H-14

- Cepa No. 1 es la cepa 266 de referencia- Cepa No. 2 es la cepa 266 extraída directamente del producto Lote del 2001 - Cepa No. 3 corresponde a la cepa 266 extraída directamente del producto

Lote del 2002.

Se cultivaron las cepas en caldo soja/triptona por 18 h a 30 ºC, la masa bacilar fue concentrada por centrifugación y se procedió a la extracción del ADN cromosomal

El ADN cromosomal de cada cepa fue digerido con las enzimas Hindlll y EcoRl, para ello se realizó el ensayo siguiendo las recomendaciones del proveedor para cada enzima. La electroforesis del producto se llevó a cabo en gel de agarosa a 0.8% a 30V durante 16h, al término de las cuales se fotografió el gel que contenía los patrones de digestión obtenidos.

Si los organismos son genéticamente iguales, el análisis de restricción permite obtener patrones idénticos de fragmentos polimórficos del ADN, y para incrementar el rigor de discriminación, se recomienda la digestión con una segunda enzima, lo que ayuda a confirmar la identidad de sus patrones.

ANALISIS

Con el empleo de las enzimas de restricción HindIII y EcoRI se logró obtener la digestión del ADN de las cepas estudiadas, con un único patrón para cada enzima. Estos resultados indican que las huellas genéticas de las cepas aisladas del producto se han mantenido y por otro lado estos patrones pueden ser utilizados como punto de comparación para estudios posteriores.

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•Tejada, M. et al. (2010) Aislamiento de DNA de un plásmido bacteriano. Universidad de Ranabales: Colombia.

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