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La dinamica delle proteine Se queste molecole fondamentali per la vita fossero immobili non sarebbero in grado di funzionare; i movimenti interni che costituiscono la base di ogni loro attività vengono oggi analizzati mediante simulazioni al calcolatore di Martin Karplus e J. Andrew McCammon L o studio delle modalità seguite dalle proteine per soddisfare i fabbiso- gni di un organismo vivente costi- tuisce un esempio curioso di come un me- todo che ha determinato progressi signifi- cativi abbia anche portato a una erronea concezione. Quel metodo è la cristallogra- fia a raggi X, grazie alla quale la struttura delle molecole in un cristallo di proteina viene determinata dal modo in cui il cri- stallo diffrange, o diffonde, un fascio di raggi X. La bellezza intrinseca e il notevo- le dettaglio delle strutture ottenute median- te la cristallografia a raggi X hanno fatto pensare che le proteine fossero molecole rigide e quindi hanno portato erroneamen- te a concludere che gli atomi in una protei- na avessero posizioni fisse. La maggior parte dei tentativi volti a spiegare la fun- zione delle proteine (per esempio a spiega- re come agiscono da catalizzatori biologici o enzimi) si è basata su strutture statiche e si è presunto che la specificità con cui un enzima si lega a una particolare molecola, il substrato, e l'efficacia con cui esso cata- lizza una particolare reazione biochimica abbiano origine da interazioni che sono state assimilate al modo in cui una chiave si adatta alla rispettiva serratura. I casi in cui si sapeva che la conformazione, o for- ma, di una certa proteina cambiava, come quando l'emoglobina si lega all'ossigeno, venivano in genere trattati come brusche transizioni tra strutture altrimenti statiche. Negli ultimi 10 anni, questa concezione statica delle proteine ha subito una fonda- mentale revisione: oggi si riconosce che gli atomi in una molecola proteica sono in costante movimento e per questa ragione ciò che il cristallografo trova in un cristallo è, nel migliore dei casi, una rappresenta- zione della struttura media di una protei- na. Attorno a questa media, gli atomi che si trovano in ogni molecola proteica mo- strano considerevoli fluttuazioni di elevata frequenza. In breve, una proteina è dina- mica e modifica costantemente i partico- lari della sua conformazione. Un cristallo preparato per essere analizzato ai raggi X può consistere di qualche cosa come 1020 molecole proteiche, eppure è estremamen- te improbabile che, in un qualunque istan- te, anche solo una singola molecola pro- teica abbia la struttura media che risulta dall'analisi. È indubbio che la conoscenza delle po- sizioni medie occupate dagli atomi in una proteina risulta di immenso valore: serve infatti come punto di partenza per i tenta- tivi di fornire descrizioni più complete del- l'attività proteica. Il quadro dinamico di una proteina permette di capire fenomeni che non sono spiegabili con il modello sta- tico. Le descrizioni relative alla dinamica delle proteine confluiscono da numerose fonti; tecniche sperimentali, tra le quali la cristallografia a raggi X, forniscono in proposito importanti contributi. Tuttavia, anche lo studio teorico ha svelato, sui mo- vimenti delle proteine, particolari che sono ben oltre quello che si poteva sperare di trovare mediante misurazioni sperimenta- li. In alcuni casi le simulazioni al calcola- tore dei movimenti degli atomi all'interno di una proteina hanno chiaramente dimo- strato che l'attività della proteina non sa- rebbe possibile se la molecola fosse fissa nella sua struttura media. a struttura specifica e le fluttuazioni 1-/ delle proteine fanno si che esse possa- no compiere numerose attività indispensa- bili al funzionamento dell'organismo al quale appartengono. Tanto per comincia- re, tutti gli enzimi sono proteine; cioè le proteine sono i catalizzatori che accelera- no le reazioni essenziali dei sistemi viventi (tra cui la sintesi delle stesse proteine) in modo che possano procedere alla velocità necessaria. Altre proteine servono per tra- sportare piccole molecole, elettroni ed e- nergia alle parti dell'organismo dove sono richiesti. Molte proteine, infine, hanno ruoli strutturali; per esempio, sono costi- tuenti di tessuti fibrosi e muscoli. A causa delle loro svariate funzioni, le proteine sono necessarie in grande quanti- tà e diversità. Un organismo unicellulare, il noto batterio Escherichia coli, possiede ben 3000 differenti proteine, con molte co- pie di qualcuna di esse; per questo motivo un unico batterio può includere circa un milione di molecole proteiche. Ogni protei- na consta di un numero specifico di picco- le unità, i vari amminoacidi. Ciascuno dei 20 diversi amminoacidi è caratterizzato da una catena laterale, un gruppo chimico peculiare che varia come complessità dal semplice atomo di idrogeno nel più sempli- ce amminoacido che è la glicina, a elabo- rati anelli di atomi nell'amminoacido più complesso, il triptofano. In una proteina gli amminoacidi sono legati in una fila li- neare, la catena polipeptidica. In genere le proteine consistono di un numero di am- minoacidi variabile da 50 a 500, il che corrisponde a 500-5000 atomi. L'esatta sequenza degli amminoacidi determina la In una simulazione di dinamica molecolare realizzata al calcolatore vengono illustrati i movimenti di una proteina su una scala temporale di picosecondi (bilionesimi di secondo), sovrapponendo sette posizioni di una molecola di mioglobina osservate a intervalli di cinque picosecondi. Come tutte le altre proteine, la mioglobina consiste di amminoacidi uniti in una catena polipeptidica (in blu). Questa catena viene mostrata in una versione semplificata che include soltanto la posizione dell'atomo di carbonio centrale di ogni amminoacido. Essa è ripiegata in una caratteristica con- formazione tridimensionale che, nella mioglobina, consiste di otto segmenti, le alfa-eliche, uniti da corti cappi, ciascuno costituito da soli pochi amminoacidi. Nella simulazione le eliche si muovono ma conservano la propria forma. La molecola di mioglobina contiene anche una molecola organica complessa, il gruppo eme (in arandone). Legando una molecola di ossigeno all'atomo di ferro che si trova al centro di questo gruppo, essa immagazzina ossigeno nel tessuto muscolare. L'immagine accanto e le altre che corredano questo articolo sono state generate al calcolatore da John Kuriyan della Harvard University e del Massachusetts Institute of Technology utilizzando il programma HYDRA di grafica al calcolatore, scritto da Roderick E. Hubbard, oggi all'Università di York. 30

Dinamica delle proteine

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La dinamica delle proteineSe queste molecole fondamentali per la vita fossero immobili non sarebberoin grado di funzionare; i movimenti interni che costituiscono la base di ogniloro attività vengono oggi analizzati mediante simulazioni al calcolatore

di Martin Karplus e J. Andrew McCammon

L

o studio delle modalità seguite dalleproteine per soddisfare i fabbiso-gni di un organismo vivente costi-

tuisce un esempio curioso di come un me-todo che ha determinato progressi signifi-cativi abbia anche portato a una erroneaconcezione. Quel metodo è la cristallogra-fia a raggi X, grazie alla quale la strutturadelle molecole in un cristallo di proteinaviene determinata dal modo in cui il cri-stallo diffrange, o diffonde, un fascio diraggi X. La bellezza intrinseca e il notevo-le dettaglio delle strutture ottenute median-te la cristallografia a raggi X hanno fattopensare che le proteine fossero molecolerigide e quindi hanno portato erroneamen-te a concludere che gli atomi in una protei-na avessero posizioni fisse. La maggiorparte dei tentativi volti a spiegare la fun-zione delle proteine (per esempio a spiega-re come agiscono da catalizzatori biologicio enzimi) si è basata su strutture statichee si è presunto che la specificità con cui unenzima si lega a una particolare molecola,il substrato, e l'efficacia con cui esso cata-lizza una particolare reazione biochimicaabbiano origine da interazioni che sonostate assimilate al modo in cui una chiavesi adatta alla rispettiva serratura. I casi incui si sapeva che la conformazione, o for-ma, di una certa proteina cambiava, comequando l'emoglobina si lega all'ossigeno,venivano in genere trattati come bruschetransizioni tra strutture altrimenti statiche.

Negli ultimi 10 anni, questa concezionestatica delle proteine ha subito una fonda-mentale revisione: oggi si riconosce che gliatomi in una molecola proteica sono incostante movimento e per questa ragioneciò che il cristallografo trova in un cristalloè, nel migliore dei casi, una rappresenta-zione della struttura media di una protei-na. Attorno a questa media, gli atomi chesi trovano in ogni molecola proteica mo-strano considerevoli fluttuazioni di elevatafrequenza. In breve, una proteina è dina-mica e modifica costantemente i partico-lari della sua conformazione. Un cristallopreparato per essere analizzato ai raggi Xpuò consistere di qualche cosa come 1020

molecole proteiche, eppure è estremamen-te improbabile che, in un qualunque istan-te, anche solo una singola molecola pro-teica abbia la struttura media che risultadall'analisi.

È indubbio che la conoscenza delle po-sizioni medie occupate dagli atomi in unaproteina risulta di immenso valore: serveinfatti come punto di partenza per i tenta-tivi di fornire descrizioni più complete del-l'attività proteica. Il quadro dinamico diuna proteina permette di capire fenomeniche non sono spiegabili con il modello sta-tico. Le descrizioni relative alla dinamicadelle proteine confluiscono da numerosefonti; tecniche sperimentali, tra le quali lacristallografia a raggi X, forniscono inproposito importanti contributi. Tuttavia,anche lo studio teorico ha svelato, sui mo-vimenti delle proteine, particolari che sonoben oltre quello che si poteva sperare ditrovare mediante misurazioni sperimenta-li. In alcuni casi le simulazioni al calcola-tore dei movimenti degli atomi all'internodi una proteina hanno chiaramente dimo-strato che l'attività della proteina non sa-rebbe possibile se la molecola fosse fissanella sua struttura media.

a struttura specifica e le fluttuazioni1-/ delle proteine fanno si che esse possa-no compiere numerose attività indispensa-bili al funzionamento dell'organismo alquale appartengono. Tanto per comincia-

re, tutti gli enzimi sono proteine; cioè leproteine sono i catalizzatori che accelera-no le reazioni essenziali dei sistemi viventi(tra cui la sintesi delle stesse proteine) inmodo che possano procedere alla velocitànecessaria. Altre proteine servono per tra-sportare piccole molecole, elettroni ed e-nergia alle parti dell'organismo dove sonorichiesti. Molte proteine, infine, hannoruoli strutturali; per esempio, sono costi-tuenti di tessuti fibrosi e muscoli.

A causa delle loro svariate funzioni, leproteine sono necessarie in grande quanti-tà e diversità. Un organismo unicellulare,il noto batterio Escherichia coli, possiedeben 3000 differenti proteine, con molte co-pie di qualcuna di esse; per questo motivoun unico batterio può includere circa unmilione di molecole proteiche. Ogni protei-na consta di un numero specifico di picco-le unità, i vari amminoacidi. Ciascuno dei20 diversi amminoacidi è caratterizzatoda una catena laterale, un gruppo chimicopeculiare che varia come complessità dalsemplice atomo di idrogeno nel più sempli-ce amminoacido che è la glicina, a elabo-rati anelli di atomi nell'amminoacido piùcomplesso, il triptofano. In una proteinagli amminoacidi sono legati in una fila li-neare, la catena polipeptidica. In genere leproteine consistono di un numero di am-minoacidi variabile da 50 a 500, il checorrisponde a 500-5000 atomi. L'esattasequenza degli amminoacidi determina la

In una simulazione di dinamica molecolare realizzata al calcolatore vengono illustrati i movimentidi una proteina su una scala temporale di picosecondi (bilionesimi di secondo), sovrapponendosette posizioni di una molecola di mioglobina osservate a intervalli di cinque picosecondi. Cometutte le altre proteine, la mioglobina consiste di amminoacidi uniti in una catena polipeptidica (inblu). Questa catena viene mostrata in una versione semplificata che include soltanto la posizionedell'atomo di carbonio centrale di ogni amminoacido. Essa è ripiegata in una caratteristica con-formazione tridimensionale che, nella mioglobina, consiste di otto segmenti, le alfa-eliche, uniti dacorti cappi, ciascuno costituito da soli pochi amminoacidi. Nella simulazione le eliche si muovonoma conservano la propria forma. La molecola di mioglobina contiene anche una molecola organicacomplessa, il gruppo eme (in arandone). Legando una molecola di ossigeno all'atomo di ferro chesi trova al centro di questo gruppo, essa immagazzina ossigeno nel tessuto muscolare. L'immagineaccanto e le altre che corredano questo articolo sono state generate al calcolatore da John Kuriyandella Harvard University e del Massachusetts Institute of Technology utilizzando il programmaHYDRA di grafica al calcolatore, scritto da Roderick E. Hubbard, oggi all'Università di York.

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GRUPPOPEPTIDICO/

----:CATENA LATERALEDELLATIROSINA

CATENALATERALEDELLALISINA

ORADICALE

• CARBONIO

• AZOTO

OSSIGENO

O IDROGENO

In una catena polipeptidica i punti flessibili tanno piegare la catena stessa nella conformazionecaratteristica della proteina; essi facilitano anche le fluttuazioni degli atomi della proteina rispettoalle loro posizioni medie. Lo schema presenta solo gli atomi principali di una catena polipeptidica.L'impalcatura di questa (legami in nero) consiste di atomi di carbonio e di azoto; i legami, chiamatilegami peptidici, sono rigidi, mentre quelli che si intercalano tra di essi rendono possibili le rotazioni(frecce curve). Una catena laterale (legami in colore) è unita all'atomo di carbonio centrale di ogniamminoacido. Le catene laterali mostrate contengono anch'esse legami in grado di ruotare.

La simulazione della dinamica molecolare fornisce una descrizione particolareggiata dei movimen-ti che hanno luogo in una proteina, trattando gli atomi che la compongono come particellenewtoniane. I legami tra questi atomi sono considerati come molle rigide; gli atomi che non sonolegati assieme interagiscono, invece, mediante forze più deboli. Una simulazione consiste di unaserie di molti piccoli passi successivi (della durata di 10- 15 secondi) per ciascuno dei quali sonocalcolate la posizione e la velocità di ogni atomo. Date le posizioni e le velocità a un tempo ti edato un metodo per determinare le intensità e le direzioni delle forze che agiscono sugli atomi inquel preciso momento, risolvendo le equazioni di Newton per il moto si ottengono le posizioni e levelocità al tempo 12, cioè dopo un certo intervallo di tempo. I calcoli delle forze al tempo 12

permettono di determinare le posizioni e le velocità al tempo 13. Calcoli eseguiti successivamenteforniscono i dati sui movimenti interni di una proteina per periodi di anche 10- 9 secondi.

struttura media e altre proprietà di unaproteina. In particolare, l'equilibrio traforze di attrazione e forze di repulsione trai singoli atomi dei quali sono costituiti gliamminoacidi fa sì che la catena di una pro-teina globulare si ripieghi nel modo carat-teristico che è essenziale per le sue fluttua-zioni e per lo svolgimento delle sue variefunzioni.

Il primo passo verso la comprensionedel ruolo delle fluttuazioni degli atomi nel-la funzione svolta da una proteina consistenel determinare la natura delle fluttuazionistesse, il che include lo studio della loroampiezza, della loro probabilità di svolger-si e della loro scala temporale (cioè dellaloro durata). Il modo più diretto per af-frontare la dinamica delle proteine consi-ste nel considerare ogni atomo presentenella proteina come una particella che rea-gisce alle forze nel modo prestabilito dal-la fisica newtoniana, secondo le leggi diNewton che regolano il moto.

Una semplice analogia di quanto appe-na descritto è il calcolo del moto di unpendolo o di una particella sospesa a unamolla. Date la posizione e la velocità dellaparticella, e inoltre l'intensità e la direzionedella forza che agisce su di essa in un par-ticolare istante, si possono ottenere perestrapolazione, o integrazione delle equa-zioni di moto, la posizione e la velocità

della particella in un tempo leggermentesuccessivo. I risultati sono precisi se l'in-tervallo di estrapolazione, o l'intervallo ditempo, è sufficientemente piccolo da far sìche la forza in corrispondenza della nuovaposizione non sia molto diversa dalla forzain corrispondenza della posizione origina-ria. Ripetendo molte volte il procedimentodi estrapolazione (cioè integrando per unperiodo di tempo più lungo le equazioni dimoto) si ricava la traiettoria della particel-la, che è in definitiva una successione diposizioni e velocità in tempi che si susse-guono, con una posizione e una velocitàper ogni intervallo di tempo.

In una proteina, i legami chimici tra ato-mi, lungo la catena polipeptidica, asso-

migliano moltissimo a molle. Vi sono peròanche, tra atomi non uniti da legami, forzepiù deboli, che comprendono quelle forzeche impediscono a più di un atomo di oc-cupare lo stesso punto nello spazio in unqualsiasi momento. Così, in una proteinaformata da molti atomi la forza comples-siva che agisce su un atomo qualsiasi in unqualsiasi momento dipende dalle posizio-ni di tutti gli altri atomi. Non sorprende,dunque, che la soluzione delle equazioni diNewton relative al moto, per determinarele posizioni e le velocità di tutti gli atomi inuna proteina, necessiti di un calcolatore a

elevata velocità. Calcoli del genere costi-tuiscono una simulazione della dinamicamolecolare.

Per cominciare la simulazione occorreun insieme rappresentativo di posizioniiniziali derivate dalle posizioni degli atomiche si ricavano dai dati cristallografici.Queste posizioni non possono di per sé ser-vire da struttura iniziale. Dato che corri-spondono a una struttura media, alcuniatomi si trovano in posizioni che non sonocaratteristiche di alcuna struttura reale(per esempio, due atomi possono esseretroppo vicini tra loro). Questa distorsionestrutturale può dare origine, a sua volta, aforze intense, non reali, che agiscono suparte degli atomi.

Un procedimento, detto equilibramentodinamico, permette di superare questa dif-ficoltà e prepara la proteina in uno statoche abbia posizioni e velocità adatte perl'inizio del calcolo della traiettoria. In es-so, le posizioni cristallografiche degli ato-mi della proteina (e delle molecole del sol-vente circostante che si potrebbe voler in-cludere nella simulazione) sono aggiustateper allentare le forze non reali. Quindi ven-gono assegnate agli atomi piccole velocitàcasuali, corrispondenti a una determinatatemperatura vicina allo zero assoluto. (Latemperatura di una molecola è una misuradella grandezza delle velocità medie deisuoi atomi.) Stabilito questo insieme di po-sizioni, di velocità e di valori delle forzeistantanee, tutti gli atomi vengono lasciatimuovere per 100 intervalli di tempo circa,secondo le equazioni di moto newtoniane.Insiemi di velocità casuali progressiva-mente più elevate vengono quindi assegna-ti e di nuovo gli atomi vengono lasciatimuovere fino a quando si raggiunge latemperatura desiderata (per esempio latemperatura ambiente); l'equilibramento ècompleto quando si fa evolvere spontanea-mente il sistema per un certo periodo ditempo, integrando le equazioni di moto fi-no al punto da far rimanere stabili la tem-peratura media e la struttura media.

La simulazione della dinamica moleco-lare assume come punto di partenza laproteina così equilibrata. Poiché a ognipasso successivo della simulazione, le for-ze tra gli atomi che costituiscono la protei-na devono modificarsi solo lievemente, gliintervalli temporali devono essere brevi inconfronto alla scala temporale dei movi-menti più rapidi che si svolgono nella pro-teina. Un tipico intervallo temporale è del-l'ordine di 10-15 secondi (un femtosecon-do). Le posizioni e le velocità calcolate de-gli atomi sono registrate su nastro magne-tico e conservate per una successiva ana-lisi e visualizzazione grafica. In una tipicasimulazione, la traiettoria traccia la dina-mica della proteina in un periodo di 10-1°secondi (100 picosecondi); calcolatori piùrecenti e più veloci permettono simulazio-ni in un intervallo di tempo di l 0-9secondi(un nanosecondo). (Queste ultime simula-zioni, che richiedono anche un milione diintervalli temporali, possono impegnareun moderno supercalcolatore anche perparecchie centinaia di ore di calcolo.) For-

tunatamente molti interessanti movimentidi una proteina possono venire interamen-te sviluppati in 100 picosecondi o anchemeno. Anche in questo breve tempo laquantità di particolari immagazzinati inuna traiettoria è prodigiosa; il calcolatoreintroduce di fatto il ricercatore all'internodella proteina.

T movimenti degli atomi all'interno diuna proteina, così come vengono rive-

lati dalle simulazioni della dinamica mole-colare, tendono ad avere certe caratteristi-che in comune, che si possono spiegare intermini di struttura fondamentale delleproteine. Come la maggior parte dei poli-meri, la catena polipeptidica che costitui-sce una proteina è flessibile perché moltidei legami forti che tengono unite coppiedi atomi sono liberi di ruotare. Questa ro-tazione permette a una parte della catenapolipeptidica di cambiare posizione rispet-to a un'altra. A mano a mano che la cate-na polipeptidica ruota le varie catene late-rali che possiede si spostano con essa. An-che queste catene possiedono legami attor-no ai quali possono svolgersi delle rotazio-ni, che impartiscono così ulteriore flessibi-lità alla molecola.

La flessibilità dell'impalcatura polipep-tidica e delle catene laterali è il fattore chepermette a ogni proteina globulare di ripie-garsi nella sua caratteristica conformazio-ne nativa, o media. Anche nella proteinaripiegata, però, l'energia termica che cor-risponde alle velocità atomiche a tempera-tura ambiente consente movimenti di rota-zione. Questi sono la fonte primaria dellefluttuazioni degli atomi nella proteina. Mapoiché una proteina globulare ha i propriatomi fittamente ammassati, le fluttuazio-ni di questi sono limitate. Cionondimeno,l'insieme di molti piccoli movimenti loca-lizzati può produrre spostamenti più glo-bali di una parte della proteina nei riguardidi un'altra.

Per brevi periodi di tempo, per esempioper intervalli di alcuni decimi di picosecon-do, le fluttuazioni più rilevanti all'internodi una proteina sono i movimenti localiz-zati nei quali gruppi della catena polipepti-dica e delle catene laterali ruotano di an-goli che variano da 20 a 60 gradi attornoai legami covalenti che uniscono i gruppial resto della catena polipeptidica. In que-sti movimenti si riscontra in genere unascarsa coerenza. È probabile che i gruppisoggetti a rotazione collidano con i gruppivicini e per questo motivo il movimento diogni gruppo risulta frequentemente inter-rotto. Di conseguenza il movimento diogni gruppo all'interno della proteina as-somiglia un poco a quello di una molecolain un liquido, nel quale le collisioni dellamolecola con le molecole del solvente nerallentano per attrito la velocità e dannoluogo a una traiettoria erratica, associataa un percorso casuale noto come motobrowniano diffusivo.

Per periodi di tempo più lunghi, peresempio intervalli di parecchi picosecondi,le caratteristiche rilevanti dei movimentiall'interno di una proteina assomigliano

sempre meno a quelle in un liquido e sem-pre più a quelle in un solido. In particolare,le forze che mantengono la struttura nati-va di una proteina non permettono ai sin-goli atomi di spostarsi di molto dalle loroposizioni medie. I movimenti che ricorda-no gli spostamenti in un solido tendono aessere oscillazioni collettive più che oscil-lazioni localizzate. Essi variano da sposta-menti simultanei di solo pochi amminoaci-di vicini a deformazioni dell'intera mole-cola proteica: tutti movimenti che sonosmorzati dall'attrito che ha origine da col-lisioni tra atomi della proteina e tra atomidella proteina e molecole del solvente. Imovimenti collettivi che si sviluppano perperiodi di parecchi picosecondi tendonocionondimeno a essere la componente piùrappresentativa delle varie fluttuazioni de-gli atomi in una proteina. La ragione èchiara: dato lo stretto impaccamento chesi ha all'interno di una proteina, un atomotipico non può muoversi di molto a menoche non si spostino anche gli atomi suoivicini. I movimenti più ampi si svolgonoalla superficie della proteina, dove le limi-tazioni dovute all'impaccamento si fannosentire meno. I singoli atomi all'internodella proteina possono avere fluttuazionidi 0,05 nanometri, una distanza parago-nabile al raggio di un atomo. Gli atomisuperficiali, invece, possono anche com-piere escursioni di 0,2 nanometri.

Una proteina globulare in cui la dinami-ca molecolare è importante per la

funzione della molecola stessa è la mioglo-bina, che immagazzina ossigeno nel tessu-to muscolare. Nei cetacei, per esempio,una notevole scorta di mioglobina forniscel'ossigeno necessario per i lunghi periodidurante i quali l'animale è in immersione.

La mioglobina è la prima proteina di cui siè definita la struttura grazie al lavoro diJohn C. Kendrew dell'Università di Cam-bridge, il quale ha sottoposto ad analisicristallografica mediante raggi X mioglo-bina di balena spermaceti, la cui carne ve-niva consumata dalla popolazione inglesedurante la seconda guerra mondiale.

In termini generali, i meccanismi d'a-zione della mioglobina sono ben noti. Lamolecola di ossigeno immagazzinata inquesta proteina si lega reversibilmente al-l'atomo di ferro situato al centro di unamolecola organica complessa, appiattita,il gruppo eme. Il gruppo eme si lega inprofondità alla molecola di mioglobina epertanto la proteina globulare così fitta-mente aggrovigliata che lo circonda loprotegge dall'acqua. (L'acqua ossiderebbel'atomo di ferro dell'eme dal suo stato fer-roso bivalente, Fe 2± , allo stato ferrico tri-valente, Fe3+ , in cui non può legare l'ossi-geno.) Tuttavia, l'impaccamento è così fit-to che l'ossigeno non riesce a penetrarenell'eme. Se gli atomi nella mioglobina fos-sero nelle posizioni fisse riscontrate nellastruttura messa in evidenza dalla cristallo-grafia a raggi X, la mioglobina sarebbeinutile: il tempo necessario perché una mo-lecola di ossigeno si leghi al gruppo eme ose ne stacchi di nuovo, quando necessario,sarebbe molto più lungo della durata dellavita di una balena.

Da ciò che si è detto nei riguardi dellefluttuazioni degli atomi nelle proteine, èpossibile congetturare come il problemasarà risolto: le barriere energetiche che im-pediscono all'ossigeno di entrare e di usci-re da una proteina rigida sono abbassateda una combinazione di movimenti loca-lizzati. Per esplorare questa possibilità, so-no state esaminate le vie che portano, nella

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Un canale che permette a una molecola di ossigeno, legata al gruppo emedi una molecola di mioglobina. di sfuggire viene aperto dalle rotazionidelle catene laterali di tre amminoacidi. L'immagine in alto mostra lastruttura statica della mioglobina determinata mediante cristallografia araggi X. Non esiste un passaggio dalla superficie della molecola (puntiin arancione) a una cavità interna alla molecola stessa, che si trovaproprio sopra il gruppo eme (in blu). La cavità si trova vicino al sito dovel'atomo di ferro dell'eme si lega alla molecola di ossigeno. Nell'immaginein basso le catene laterali di tre amminoacidi (in porpora) appaiono

ruotate. Di conseguenza si apre un passaggio. Nella simulazione eseguitaal calcolatore, rimangono invariate le posizioni degli altri atomi appar-tenenti sia alla catena principale, sia alle catene laterali (in verde). Se lastruttura della mioglobina fosse rigida, tanto da impedire le rotazionidelle catene laterali, una molecola di ossigeno impiegherebbe miliardi dianni a entrare o a uscire dal sito di legame. Simulazioni particolareggiatesuggeriscono che una molecola di ossigeno incontra nel suo percorsoverso l'eme una successione di barriere e per questo segue un tragitto«casuale», che ricorda quello di una piccola molecola in un liquido.

mioglobina, alla cavità contenente l'eme ela barriera lungo queste vie è stata calco-lata sia per la proteina rigida (cioè unamolecola di mioglobina con la strutturache si ottiene mediante cristallografia airaggi X) sia per un modello più realistico,in cui la struttura si può rilassare allorchél'ossigeno passa attraverso la matrice pro-teica. Per tutte le vie che sono state analiz-zate le barriere energetiche della proteinarigida sono risultate di almeno 100 chilo-calorie per mole. Per barriere di quest'or-dine di grandezza il tempo necessario auna molecola di ossigeno per entrare ouscire da esse sarebbe valutabile in moltimiliardi di anni.

Per simulare le possibili fluttuazioni chepotrebbero aprire all'ossigeno vie di in-gresso o di uscita nella mioglobina, sonostati presi in considerazione i movimentidelle catene laterali che producono la bar-riera a elevata energia. Per una particolarevia, è sembrato che le catene laterali dei treamminoacidi designati come istidina E7,treonina El0 e valina E 11 fossero gli osta-coli dominanti. Simulando la rotazione diciascuna di queste tre catene laterali, è sta-ta determinata l'energia necessaria perspostarle dalla posizione normale. Unaquantità di energia di 8,5 chilocalorie permole è sufficiente ad aprire la via che fadiminuire la barriera energetica per l'ossi-geno a circa 5 chilocalorie per mole. L'e-nergia totale necessaria si riduce pertantoda 100 chilocalorie per mole a circa 14,una quantità dell'ordine di grandezza sug-gerito dagli esperimenti che misurano ef-fettivamente la barriera energetica per illegame con l'ossigeno.

Infine, per esaminare nei particolari ilmovimento dell'ossigeno è stata calcolatauna serie di traiettorie di dinamica mole-colare per le molecole di ossigeno, a parti-re dall'eme. Poiché ogni traiettoria simu-lata ha potuto essere seguita solo per unlimitato periodo di tempo, non tutte le mo-lecole di ossigeno sono sfuggite; alcune so-no rimaste in una sacca vicino all'eme ealtre sono finite altrove, sempre all'internodella molecola. Inoltre, molte sono passateall'esterno. In una via tipica, la molecoladi ossigeno ha incontrato una serie di osta-coli, ciascuno con una propria barrie-ra energetica. L'ossigeno trascorrerebbemolto tempo in un dato «pozzo» energeti-co, muovendosi e scontrandosi con le pa-reti di quest'ultimo. Quindi, qualora unafluttuazione della proteina abbassasse inmisura significativa la barriera del pozzi:),o la molecola di ossigeno venisse arricchi-ta di energia a seguito di collisioni con ato-mi che sono contenuti iella proteina, o idue eventi si svolgesserasimultaneamente(l'evenienza più probabile), l'ossigeno su-pererebbe rapidamente la barriera e passe-rebbe nel pozzo successivo dove il proces-so si ripeterebbe.

La complessità di ogni via e il numero dipossibili vie rendono probabile il fatto cheil movimento dell'ossigeno attraverso laproteina abbia un carattere diffusivo. Unavolta che l'ossigeno supera una barriera,non deve necessariamente portarsi alla

barriera successiva: la direzione nella qua-le si sposta può essere casuale a motivodelle collisioni che subisce e può anche ri-attraversare la stessa barriera nella dire-zione sbagliata. Ciò che ne consegue è unandamento del tutto casuale, analogo aquello di una molecola di soluto che si dif-fonde all'interno di una soluzione.

L'analisi della mioglobina suggerisceche quello che succede in questa proteinaglobulare ha un significato generale. I li-gandi, cioè le molecole che si legano a mol-te proteine, possono non essere in grado dipenetrare nella proteina oppure di uscireda essa, se si trovano nel suo interno, qua-lora gli atomi di quella proteina siano co-stretti a occupare le loro posizioni medie.Pertanto negli enzimi le fluttuazioni dellecatene laterali o di altre costellazioni diatomi possono essere spesso un requisitonecessario perché i substrati entrino in essie si leghino e i prodotti di reazione lascinol'enzima.

Molte importanti fasi del funzionamen-to di una proteina impiegano periodi

di tempo relativamente lunghi: periodi dinanosecondi (10-9 secondi), di millisecon-di (10-3 secondi) o anche più. Per esem-pio, la velocità della reazione catalizzatada alcuni enzimi è limitata dal tempo cheè necessario al passaggio di alcuni gruppidi atomi, nell'enzima, da una conforma-zione a un'altra, nella quale possono par-tecipare alla catalisi. Il passaggio in sé,quando ha luogo, è rapido; la lunga scalatemporale è determinata dal fatto che igruppi atomici interessati nella transizionevengono attivati solo raramente. In altreparole, le fluttuazioni che rendono possi-bile la transizione sono eventi rari.

Una simulazione convenzionale delladinamica molecolare è di scarsa utilità nel-lo studio dei processi attivati; il raro rea-lizzarsi di una transizione conformaziona-le fa sì che sia estremamente improbabileche essa abbia luogo nell'intervallo di tem-po occupato dalla simulazione. Eppure, sesi conoscono a grandi linee gli spostamentiche hanno luogo nella transizione, diventapossibile studiare il processo nei particola-ri mediante un buon metodo di simulazio-ne specializzato.

Simulazioni di questo tipo vengono rea-lizzate in due fasi. In primo luogo, da unasequenza di simulazioni viene calcolata lagrandezza della barriera energetica che sioppone alla transizione; queste simulazio-ni sono di tipo convenzionale, tranne peril fatto che la molecola simulata è costrettaa muoversi soltanto all'interno di una suc-cessione di regioni limitate, che l'accom-pagnano lungo tutto il percorso della tran-sizione. Quindi si calcolano le traiettorieche hanno inizio dalla molecola in confi-gurazioni prossime alla, o coincidenti conla, sommità della barriera energetica. Inquesto modo si elimina la necessità di at-tendere l'evento casuale di una molecolaattivata. Le traiettorie che possono emer-gere da queste simulazioni, assieme al cal-colo della grandezza della barriera energe-tica, permettono di prevedere la velocità

con la quale si svolgerà la transizione.L'applicazione di questo metodo di di-

namica attivata ad alcuni processi sempli-ci ha fatto luce sulla natura delle fluttua-zioni locali interessate nell'attivazione diuna transizione conformazionale. La tran-sizione che descriveremo (più come esem-pio rappresentativo di un processo attiva-to che come transizione con un importanteruolo biologico) è la rotazione di un anellodella tirosina, situato in profondità nellaproteina globulare nota come inibitore del-la tripsina pancreatica bovina. Come im-plica il suo nome, questa proteina puòbloccare l'attività di un enzima digerente,la tripsina, legandosi al sito attivo in cor-rispondenza del quale l'enzima catalizza lascissione delle molecole proteiche. Da par-te sua, la catena laterale dell'amminoacidotirosina include sei atomi di carbonio cheformano un anello esagonale, piatto. Lerotazioni di questo anello sono interessan-ti: infatti sono state studiate sperimental-mente mediante risonanza magnetica nu-cleare. La tecnica di simulazione della di-namica molecolare dimostra che la rota-zione ha un carattere collettivo, nel sensoche è preceduta da uno spostamento diuna sezione della catena polipeptidica si-tuata al di sopra di una faccia dell'anello.

Lo spostamento della catena rappre-senta un contributo d'importanza crucialeal meccanismo della rotazione; infatti por-ta gli atomi fuori dal percorso dell'anello,provocando così una sostanziale riduzionedella barriera energetica che impedisce larotazione. L'energia necessaria per la di-storsione dell'impalcatura della molecola èmolto inferiore a quella che ha origine dalcontatto repulsivo tra gli atomi dell'anelloe l'impalcatura non distorta. Inoltre la flut-tuazione collettiva favorisce l'avvio dellarotazione. Essa schiude un piccolo spazioentro il quale l'anello può ruotare comereazione alle collisioni che provoca con irestanti atomi vicini. La conseguente ten-denza alla rotazione permette all'anello diaccumulare l'energia cinetica rotazionalenecessaria a sormontare la rimanente bar-riera energetica.

In questo modo, il verificarsi di unasemplice transizione conformazionale (larotazione della tirosina) è regolato da mo-vimenti collettivi all'interno della proteina.Dato lo stretto impaccamento degli atominelle proteine globulari, è probabile chetransizioni come queste siano un eventocomune. Poiché le loro velocità sono sen-sibili a proprietà della struttura proteica discala relativamente grande, esse possonorappresentare un modo per regolare l'atti-vità di una proteina. Per esempio, il lega-me di una piccola molecola a un sito par-ticolare di una proteina può alterare i mo-vimenti di questa proteina in modo da mo-dificare la cinetica di un processo in corri-spondenza di un secondo sito.

Un esempio di una proteina in cui ven-gono coinvolti nell'attività enzimati-

ca movimenti su larga scala è rappresen-tato dall'alcooldeidrogenasi epatica, l'en-zima che ossida l'alcool etilico e, in questo

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Un anello esagonale di atomi di carbonio caratterizza la catena laterale dell'amminoacido tirosina(in color magenta), che si nota nella proteina chiamata inibitore della tripsina pancreatica dibovino. I legami formano un anello (linee in color magenta) e inoltre la superficie di van der Waalsdi quest'ultimo (punti in color magenta) si adatta perfettamente alla struttura statica della proteina(punti in blu). Nella proteina rigida, l'anello della tirosina potrebbe ruotare di 180 gradi.

modo, contribuisce a limitare l'intossica-zione che consegue al bere vino e altri al-colici. (Coloro che sono privi dell'enzimasono eccezionalmente sensibili all'alcool.)Si ritiene che il vero ruolo dell'alcooldei-drogenasi epatica sia la catalisi di qualchealtra reazione biochimica, anche perchénon sembrerebbero esservi ragioni del fat-to che l'evoluzione abbia prodotto un en-zima dealcolizzante. In ogni caso, l'alcool-deidrogenasi epatica è il prototipo di que-gli enzimi e di quelle altre proteine, comele immunoglobuline, che consistono di dueo più domini uniti da segmenti di catenapolipeptidica che fungerebbero da cernie-re. In molti enzimi la regione catalitica èdelimitata da due domini globulari e per-tanto l'accesso a essa è regolato da defor-mazioni dell'intera molecola proteica lega-te a un'apertura o a una chiusura dellacerniera, deformazioni che o separano idomini globulari o li riavvicinano. Pertan-to la velocità con la quale i substrati silegano o i prodotti della reazione vengonorimossi dipende dalla dinamica dei domini.

L'alcooldeidrogenasi epatica è un dime-ro, cioè una molecola costituita da dueunità (monomeri) identiche. A sua volta,ogni monomero consta di due domini aforma di lobo. L'analisi cristallografica araggi X, condotta da Carl Brànden, HansEcklund e collaboratori all'Università diUppsala, in Svezia, rivela che il monomeroha due configurazioni: vi è una strutturaaperta, l'apoenzima, in cui i lobi sono di-

stanziati; e una struttura chiusa, l'oloenzi-ma, in cui i lobi sono pressati l'uno control'altro con un coenzima (molecola sussi-diaria che partecipa alla reazione enzima-tica) legato a uno di essi. In questo caso ilcoenzima è il NADH, una molecola che tra-sporta elettroni. La struttura aperta offreal coenzima una via per raggiungere il pro-prio sito di legame, mentre la strutturachiusa offre un ambiente in cui substratoe coenzima sono protetti e la reazione puòprocedere in modo efficiente (il secondolobo è il dominio catalitico dell'enzima). Areazione avvenuta, una fluttuazione diapertura allontana i due domini, il prodot-to della reazione è rimosso e l'enzima èpronto per un altro ciclo di reazione.

Cpunto di partenza per l'esame

•—• delle fiuttu azioni di apertura e dichiusura, si è pensato di considerare che idue domini di un monomero dell'alcool-deidrogenasi epatica si muovessero comecorpi rigidi connessi da una cerniera. Que-sta ipotesi può essere provata sovrappo-nendo le strutture cristalline aperta e chiu-sa (cioè le configurazioni dette apoenzimae oloenzima). Quando i domini dell'apoen-zima e dell'oloenzima che si legano alcoenzima vengono fatti coincidere, le po-sizioni degli atomi nei domini catalitici dif-feriscono di molto; se, invece, il dominiocatalitico dell'apoenzima viene ruotato ri-gidamente in modo che la cerniera tra ilobi si chiuda di un angolo di circa 10 gra-

di; la maggior parte degli atomi nel domi-nio catalitico dell'apoenzima diventa so-vrapponibile agli atomi equivalenti nel cor-rispondente dominio dell'oloenzima.

Tuttavia l'ipotesi di una rotazione rigi-da è una semplificazione grossolana. Unmodello che incorpori i tipi di interazionenecessari per calcolare le forze delle qualitenere conto in una simulazione di dinami-ca molecolare dimostra che la configura-zione tipo oloenzima, prodotta per rota-zione rigida del dominio catalitico dell'a-poenzima, ha un'energia superiore di pa-recchie migliaia di chilocalorie per molerispetto a quella posseduta dalla strutturadell'apoenzima. Questa energia corrispon-de a un'immensa barriera rispetto all'ener-gia termica disponibile. Una barriera cheimpedirebbe qualsiasi rotazione e che vie-ne introdotta senza tener conto delle pic-cole fluttuazioni locali degli atomi, l'esi-stenza delle quali si dimostra mediante si-mulazioni di dinamica molecolare. Perchéla cerniera possa chiudersi a temperaturenormali è essenziale che possano rilassarsiinterazioni atomiche sfavorevoli, generatedalla rotazione.

Nel simulare per la cerniera un movi-mento di questo tipo, si può procedere aun calcolo potenziale adiabatico. Median-te questo procedimento, un dominio nelmonomero della alcooldeidrogenasi epati-ca viene ruotato rispetto all'altro di un pic-colo angolo, per esempio di un grado. Nel-la regione della cerniera e nelle aree di con-tatto tra i due domini, la posizione degliatomi è quindi sottoposta a fluttuazione,che rende minima l'energia della strutturaruotata. Viene quindi introdotta una rota-zione di un altro grado, un piccolo incre-mento, e viene anche ripetuta l'operazionedi minimizzazione dell'energia. Il risultatofinale, che è dovuto alla somma di tuttauna serie di rotazioni incrementali e di ri-lassamenti di interazioni tra atomi, è unavalutazione dell'energia potenziale dellamolecola come funzione dell'angolo di ro-tazione della cerniera. La curva dell'ener-gia, che copre l'arco di tempo dall'apoen-zima all'oloenzima, risulta piuttosto piat-ta; di fatto i moti browniani casuali dei lobidella molecola in soluzione a temperaturaambiente avrebbero energia sufficiente perprodurre chiusure e aperture spontanee, suuna scala temporale di nanosecondi.

Gli spostamenti degli atomi che deter-minano il rilassamento del monomero so-no, tranne alcune eccezioni, inferiori a0,05 nanometri e sono così paragonabili,per dimensioni, ai movimenti degli atomiin una proteina che hanno luogo a tempe-ratura ambiente. Come detto sopra, essi sisvolgono su una scala temporale di pico-secondi e pertanto sono di gran lunga piùrapidi dello stesso movimento su grandescala della cerniera. Questo fatto giustificala tecnica di simulazione: ogni cambia-mento nell'angolo di rotazione dà ampiotempo ai rilassamenti locali, introdotti dal-la minimizzazione dell'energia. L'analisidell'alcooldeidrogenasi epatica (e di diver-se altre proteine con cerniere che sono sta-te studiate teoricamente) chiarisce l'im-

La rotazione dell'anello della tirosina all'interno dell'inibitore della tripsi-na pancreatica e un esempio dei processi molecolari nei quali fluttuazionicasuali all'interno di una molecola proteica permettono un'improvvisatransizione conformazionale. In questa simulazione di dinamica moleco-lare il campo di osservazione include l'anello e, inoltre, una parte dellacatena polipeptidica principale, che entra in contatto con la faccia supe-riore dell'anello, come appare nella precedente illustrazione. L'anello estato realizzato con i lati in colori diversi per facilitare l'osservazione

della sua rotazione: il bordo sinistro è di una tinta che si avvicina al rossomentre quello destro è verde. La sua posizione iniziale (I ) viene ripetutacome riferimento nei passi successivi della simulazione (esagono biancoin 2-6). Nelle prime fasi della simulazione la catena principale si allon-tana dall'anello della tirosina. Questa fluttuazione dà origine a uno spazionel quale l'anello può ruotare; le sue collisioni con i rimanenti atomi vicinitendono a dirigere la rotazione. Le immagini coprono un tempo di duepicosecondi, durante il quale si svolge una rotazione di 180 gradi.

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DOMINIOCATALITICO (I)

DOMINIODI LEGAMECON ILCOENZIMA

(I)

ATOMO DI ZINCOCATALITICO DOMINIO

DI LEGAMECON ILCOENZI MA

(Il)

ASSE DI ROTAZIONE

portante ruolo che assumono le piccolefluttuazioni a frequenza elevata nel facili-tare alcuni movimenti più ampi e più col-lettivi delle proteine.

Unodegli obiettivi delle simulazioni didinamica molecolare consiste nel for-

nire una descrizione quantitativa e parti-colareggiata di come gli enzimi incremen-tino le velocità delle reazioni biochimiche.Si ritiene che gli enzimi agiscano attraver-so una serie di meccanismi combinati. Le-gandosi ai reagenti, li mettono l'uno in pre-senza dell'altro. Inoltre, essi possono piaz-zare delle cariche elettriche, associate conla catena laterale di certi amminoacidi, inposizioni tali da favorire la reazione, e cosìvia. E ancora, nessuna reazione enzimati-ca è compresa a sufficienza da permetteredi prevederne la velocità. I movimenti de-gli atomi che compongono l'enzima, i rea-genti e addirittura le molecole d'acqua chefungono da solvente, in corrispondenzadel sito attivo dell'enzima o nelle sue im-mediate vicinanze, hanno tutti probabil-mente una significativa influenza sulla ve-locità di reazione. In molti enzimi il sitoattivo rimane accessibile al solvente pertutta la reazione e l'acqua stessa funge da

reagente; in altri enzimi (come l'alcooldei-drogenasi epatica) il solvente tende a esse-re escluso.

Nella catalisi enzimatica, come in gene-rale nelle reazioni chimiche, i movimentidegli atomi hanno chiaramente un ruoloessenziale. Pertanto un modo di affrontar-ne lo studio, basato sulla dinamica mole-colare, dovrebbe essere molto fruttuoso.La simulazione al calcolatore di un interoenzima e del suo solvente sarebbe un modoinefficace (e costoso) di studiare la dinami-ca locale direttamente interessata in unareazione catalizzata. Al contrario la simu-lazione di dinamica molecolare può esserelimitata a una «zona di reazione», che in-clude il sito attivo e i suoi dintorni, il sub-strato e le vicine molecole di solvente. Ilresto del sistema non può essere ignorato:esso è sostituito da una regione limite incui le molecole del solvente non vengonolasciate sfuggire grazie a una forza repul-siva e gli atomi della proteina sono con-trollati da forze le quali fanno si che essiabbiano le fluttuazioni che avrebbero se lasimulazione contemplasse l'intera protei-na. Inoltre, le equazioni relative al movi-mento degli atomi della proteina e dellemolecole del solvente nella regione limite

sono modificate in modo da includere ter-mini di accoppiamento di tipo browniano,che permettono a questi atomi e molecoledi assorbire o liberare energia come se fos-sero circondati dal resto del sistema.

Il metodo di simulazione del limite vieneoggi applicato a numerose proteine, tra cuil'enzima ribonucleasi che scinde l'acido ri-bonucleico (RNA) tra due nucleotidi, cioèdue delle unità che costituiscono il filamen-to di RNA. Le simulazioni sono state rea-lizzate, in realtà, per l'enzima nativo (cioèper la ribonucleasi senza nucleotidi delsubstrato legati a essa) e per vari compostiintermedi che si susseguono sulla via direazione lungo la quale l'enzima scinde ilfilamento di RNA. Un risultato emerso daicalcoli riguarda la stabilità delle parti dellastruttura della ribonucleasi che sono inte-ressate nel legame con il substrato e che,proprio per questo motivo, sono importan-ti nella determinazione della specificitàdell'enzima.

Le simulazioni hanno dimostrato, peresempio, che numerosi amminoacidi nellaribonucleasi formano una rete di legami aidrogeno in direzione del substrato; questilegami sono di natura elettrostatica e sistabiliscono tra coppie di atomi dotati di

a C

Il movimento di chiusura a cerniera dell'enzima alcooldeidrogenasi epa-tica avvicina i due lobi della molecola, fornendo un ambiente protettoalla reazione chimica catalizzata da quell'enzima. Nelle immagini otte-nute da Cari Brànden dell'Università di Uppsala, in Svezia, mediantegrafica al calcolatore, sono riportate delle simulazioni relative alle partidei lobi che si incontrano: con un angolo della cerniera di 30 gradi (a),cioè a cerniera aperta, con un angolo di zero gradi (b) e con un angolo

125LU

O2 100cxLuo_Lu

75O

oO 50

o25

ccLu

050 40 30 20 10 0 —10 —20 —30 —40 —50

ANGOLO DI ROTAZIONE (GRADI)

di —40 gradi (c), cioè a cerniera chiusa. L'angolo di zero gradi ponel'enzima nella conformazione da apoenzima, relativamente aperta, che siosserva con la cristallografia a raggi X. Le simulazioni stabiliscono chei movimenti di chiusura, se la cerniera fosse rigida (curva in nero nelgrafico in basso), richiederebbero molta più energia di quella disponibilea temperatura ambiente. Se invece gli atomi nella molecola fluttuasserodurante la chiusura (curva in colore), quest'ultima diventerebbe possibile.

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Il metodo di simulazione del limite elimina la necessità di simulare un intero enzima in una «scatola»d'acqua. Al contrario si simula il sito attivo dell'enzima e si introduce una regione limite che confinale molecole d'acqua del sito e permette uno scambio di energia attraverso il confine tra il sito attivoe l'ambiente circostante. Questa immagine al calcolatore, ottenuta da Axel Briinger dell'Universitàdi Harvard, mostra il sito attivo dell'enzima ribonucleasi e le molecole d'acqua essenziali (inarancione e in bianco) in corrispondenza del sito attivo. Le ombre su quest'ultimo e sullo sfondosuggeriscono la rimanente parte dell'enzima, non considerata esplicitamente nella simulazione. Lemolecole d'acqua osservate nella simulazione (linee in colore nello schema in basso) formano unarete di legami a idrogeno (linee punteggiate in colore) che connettono nel sito attivo catene latera-li cariche. In ciascun legame un atomo di idrogeno è condiviso tra una molecola d'acquae un amminoacido. Legami di questo tipo aiutano a conservare la conformazione del sito.

carica elettrica o parzialmente carichi (po-lari) che hanno un atomo di idrogeno incomune. Alcune reti di legami a idrogenointeressano la catene laterali dell'asparagi-na 67, della glutammina 69 e dell'aspara-gina 71 (che formano il sito di legame del-l'enzima per il nucleotide adenina) comepure della treonina 45 e della serina 123(che formano il sito di legame per il nucleo-tide citosina). In assenza di un substrato,le molecole d'acqua occupano le posizionidegli atomi polari del substrato nei siti dilegame e danno origine a una rete di lega-mi a idrogeno che imitano le interazionidel substrato e rendono stabili le posizionidegli amminoacidi che costituiscono il sitodi legame. Dato che queste molecole esco-no quando il substrato subentra, il legamee la rimozione delle molecole del solventedevono costituire una parte essenziale delmeccanismo di reazione, una parte chepuò essere ottimamente analizzata permezzo della dinamica molecolare.

Numerosi amminoacidi (per esempiol'istidina 119 e la lisina 41) risultano esse-re assai più flessibili. Le loro posizioni re-lative nella struttura nativa della ribonu-cleasi sono mantenute in primo luogo dauna rete di molecole d'acqua che fanno daponte, rese stabili dalle cariche nette pre-senti sulle catene laterali di questi ammi-noacidi. Come risultato, gli amminoacidisono relativamente liberi di essere posti inuna nuova posizione in presenza di un sub-strato o di un composto intermedio dellareazione. In questo modo essi prendonopresumibilmente parte in modo più effi-ciente alla catalisi. Un'analisi completadella reazione di scissione delfRNA, cata-lizzata dalla ribonucleasi, richiederà unaquantità di lavoro decisamente superiore,ma anche i risultati attuali dimostranoquanto sia importante arricchire i dati ot-tenuti mediante la cristallografia a raggi Xcon simulazioni di dinamica molecolare.

T a metodologia e i risultati che abbiamo1—/ delineato permettono di prevedere fa-cilmente il futuro delle simulazioni di dina-mica molecolare. Un'ampia gamma diproblemi biologici che riguardano le pro-teine (per non citare gli acidi nucleici e lemolecole lipidiche presenti nelle membra-ne cellulari) è pronta per essere studiata.Negli anni futuri gli scienziati dovrebberoessere in grado di imparare a calcolare levelocità delle reazioni enzimatiche, il lega-me di piccole molecole a grandi molecolee molti altri processi importanti sotto l'a-spetto biologico. Il ruolo della flessibilità edelle fluttuazioni nella funzione delle ma-cromolecole verrà compreso in modo as-sai più particolareggiato. Dovrebbe diven-tare possibile determinare come particola-ri condizioni del solvente e sequenze am-minoacidiche producano certi tipi di flut-tuazione delle proteine. Con l'aumentodelle capacità di previsione, lo studio delladinamica delle proteine potrà essere appli-cato a problemi pratici dell'ingegneria ge-netica o in tentativi volti a modificare unenzima in modo che possa essere meglioutilizzato nei processi industriali.

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