Định lượng bốn loại kháng sinh nhóm Tetracylines (TC, OTC, CTC, DOXY) trong thủy sản bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ (UPLC-MSMS)

8/19/2019 Định lượng bốn loại kháng sinh nhóm Tetracylines (TC, OTC, CTC, DOXY) trong thủy sản bằng sắc ký lỏng siêu hiệ…

http://slidepdf.com/reader/full/dinh-luong-bon-loai-khang-sinh-nhom-tetracylines-tc-otc-ctc 1/84

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TR ẦN VĂN PHƯỚ C

ĐỊNH LƯỢ NG BỐN LOẠI KHÁNG SINH NHÓM

TETRACYCLINES (TC, OTC, CTC, DOXY) TRONG

THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNGGHÉP KHỐI PHỔ (UPLC-MS/MS)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA HỌC

2014

W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY





TR ẦN VĂN PHƯỚ C


TETRACYCLINE (TC, OTC, CTC, DOXY) TRONG

THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNGGHÉP KHỐI PHỔ (UPLC-MS/MS)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚ NG DẪN

ThS. NGUYỄN THỊ DIỆP CHI

2014




Luận văn tố t nghiệp đại học Tr ần Văn Phướ c

LỜ I CẢM ƠN

*

Trong suốt thờ i gian học tậ p và rèn luyện ở trường Đại học Cần Thơ, tôiđã học hỏi đượ c nhiều kiến thức cũng như những k ỹ năng sống quý báu từ sự giảng dạy, truyền thụ tận tình của quý thầy cô. Đặc biệt, trong quá trình thựchiện luận văn, tôi đã tiế p thu nhiều kiến thức chuyên môn, k ỹ năng bổ ích,thiết thực góp phần hỗ tr ợ công việc sau này. Để đạt đượ c k ết quả như ngàyhôm nay, tôi xin gửi lờ i cảm ơn chân thành đến:

Quý thầy, cô trường Đại học Cần Thơ nói chung và Bộ môn Hóa

Học, khoa Khoa học Tự nhiên nói riêng đã tận tâm truyền thụ nhữngkiến thức quý báu, bổ ích.

Cô Nguyễn Thị Diệ p Chi – giảng viên hướ ng dẫn luận văn tốt nghiệ p,cô đã tận tình hướ ng dẫn, dạy bảo tôi trong suốt thờ i gian học tậ pcũng như thực hiện đề tài luận văn.

Cô Phạm Bé Nhị – Cố vấn học tậ p – đã giúp đỡ , góp ý, tạo điều kiện

để tôi thực hiện luận văn. Công ty Intertek Việt Nam, chi nhánh Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt

nhất cho tôi thực hiện luận văn. Anh Huỳnh Văn Tú cùng các anh, chị làm việc tại phòng Hóa – Công

ty Intertek Việt Nam đã chỉ bảo, hướ ng dẫn về các k ỹ thuật thực

nghiệm cũng như những kinh nghiệm sống quý báu. Ông bà, cha mẹ - những người đã sinh thành, nuôi dưỡ ng tôi – luôn

ủng hộ, tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần để tôi học tậ p. Tậ p thể lớ p Hóa Dược K37 đã động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong

suốt thờ i gian qua.

Xin chân thành cảm ơn!

C ần Thơ , ngày …tháng … năm 2014

Sinh viên thực hiện

Trần Văn Phướ c





Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập - Tự do - Hạnh phúcBộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Diệp Chi

2. Đề tài: Định lượng bốn loại kháng sinh nhóm tetracycline (OTC, TC,CTC, DOXY) trong thủy sản bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năngghép khối phổ (UPLC-MS/MS)

3. Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phước MSSV: 2112073

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................

.............................................................................................................................. Những vấn đề còn hạn chế:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

d) Kết luận, đề nghị và điểm: ............................................................................................................................................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

ThS. Nguyễn Thị Diệp Chi





Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập - Tự do - Hạnh phúcBộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………

2. Đề tài: Định lượng bốn loại kháng sinh nhóm tetracycline (OTC, TC,CTC, DOXY) trong thủy sản bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năngghép khối phổ (UPLC-MS/MS)

3. Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phước MSSV: 2112073

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37 4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

............................................................................................................................................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Cán bộ phản biện





TÓM TẮT

Một phương pháp đơn giản và hiệu quả đã đượ c phát triển để xác địnhđồng thờ i các kháng sinh Oxytetracycline (OTC), Tetracycline (TC),Chlortetracycline (CTC) và Doxycyline (DOXY) trong thủy sản bằng sắc kýlỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ (UPLC-MS/MS). Chất phân tích đượ c chiếtvới đệm EDTA-McIlvaine (pH=4) từ mẫu thủy sản k ết hợ p vớ i các quá trìnhnhư đánh siêu âm, lắc và đượ c làm sạch bở i cột chiết pha r ắn. Quy trình địnhlượ ng sử dụng phương pháp nội chuẩn và được đánh giá theo tiêu chuẩn củaCộng đồng châu Âu 2002/657/EC. Độ tuyến tính nằm trong khoảng 10 – 100

ppb vớ i hệ số tương quan (r) > 0,99. Độ thu hồi của các chất ở các nồng độ nằm trong khoảng 90,47-100,69% vớ i RSD từ 2,49-10,49%. Giớ i hạn địnhlượ ng của OTC, TC, CTC, DOXY tương ứng là 23,1 ppb, 24,92 ppb, 24,32

ppb và 29,27 ppb. K ết quả trên cho thấy, phương pháp có độ đúng, độ nhạycao và có thể dùng để xác định ở mức độ vết các kháng sinh nhómtetracyclines trong thủy sản.

K ết quả phân tích 30 mẫu thủy sản đượ c chọn ngẫu nhiên tại công tyIntertek Việt Nam cho thấy chỉ có 5 mẫu (chiếm 16,67%) nhiễm tetracyclinestrong giớ i hạn cho phép theo tiêu chuẩn 657/2002/EC của Cộng đồng châuÂu.





ABSTRACT

A simple and effective method was developed for the simultaneousdetermination of Oxytetracycline (OTC), Tetracycline (TC), Chlortetracycline(CTC) and Doxycycline (DOXY) in aquatic samples using ultra performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Analyteswere extracted in EDTA-McIlvaine buffer (pH = 4) from aquatic samples byultrasonication and shaking, purified using Oasis cartridges, quantified using ainternal standard calibration curve and validated according to CommissionDecision 2002/657/EC. The responses were linear in the range of 10 to 100

ppb with correlation coefficients (r) > 0,99. The overall recoveries were in therange of 90,47 to 100,69% with RSD of 2,49 to 10,49%. The limits ofquantification (LOQ) were 23,1 ppb, 24,92 ppb, 24,32 ppb and 29,27 ppb for

OTC, TC, CTC, DOXY, respectively. The results showed that the developedmethod is sensitive, accurate and can be used to determine the levels oftetracycline antibiotics in aquatic samples.

The result analysis of 30 aquatic samples showed that there were only 5samples (16.67%) infected tetracyclines in the limit allowed by the standard657/2002/EC of the European Community.





BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO



______________ ____________________________

Năm học 2014 – 2015


TETRACYCLINE (OTC, TC, CTC, DOXY) TRONGTHỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNGGHÉP KHỐI PHỔ (UPLC-MS/MS)

LỜI CAM ĐOAN

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày...... tháng……năm 2014

Luận văn tốt nghiệ p ngành Hóa học

Mã số: ………

Đã bảo vệ và đượ c duyệt

Hiệu trưởng:……………………………………

Trưởng khoa:……………………………………

Trưở ng chuyên ngành Cán bộ hướ ng dẫn

..................................... Nguyễn Thị Diệ p Chi





MỤC LỤC

Tóm tắt .............................................................................................................. iv

Abstract .............................................................................................................. vChương 1: GIỚI THIỆU .................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1

1.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................ 2

Chương 2: TỔ NG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3

2.1. Tổng quan về nhóm tetracycline ............................................................. 3

2.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển ....................................................... 3

2.1.2. Đặc điểm và tính chất ....................................................................... 3

2.1.3. Quy định sử dụng tetracyclines trên thế giớ i .................................... 8

2.2. K ỹ thuật chiết pha r ắn (SPE) ................................................................... 9

2.2.1. Giớ i thiệu .......................................................................................... 9

2.2.2. Phân loại ............................................................................................ 9

2.2.3. Tương tác thứ hai trong SPE ........................................................... 10

2.2.4. Quy trình sử dụng SPE.................................................................... 11

2.3. Một số phương pháp định lượ ng tetracyclines ...................................... 13

2.3.1. Phương pháp HPLC-UV/Vis .......................................................... 13

2.3.2. Phương pháp HPLC-PAD ............................................................... 14

2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) ................. 14

2.4. Thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 15

2.4.1. Khái niệm ........................................................................................ 15

2.4.2. Các loại quy trình phân tích ............................................................ 16

2.4.3. Các yêu cầu thẩm định của một quy trình phân tích ....................... 17

2.5. Sơ lượ c về hệ thống UPLC-MS/MS ..................................................... 21

2.5.1. Thành phần hệ thống UPLC-MS/MS ............................................. 22

2.5.2. Ứ ng dụng trong phân tích của hệ thống UPLC-MS/MS ................ 23

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U ................................................. 24





3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................ 24

3.2. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 24

3.2.1. Thiết bị ............................................................................................ 24

3.2.2. Dụng cụ ........................................................................................... 25

3.2.3. Hóa chất và thuốc thử ..................................................................... 26

3.2.4. Cách pha các dung dịch, thuốc thử ................................................. 26

3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 28

3.4. Hoạch định thí nghiệm .......................................................................... 28

3.4.1. Tối ưu hóa hệ thống UPLC-MS/MS ............................................... 28

3.4.2. Tối ưu hóa quy trình chiết ............................................................... 283.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................. 28

3.4.4. Thí nghiệm trên một số mẫu thật ở công ty Intertek Việt Nam ...... 28

3.5. Tiến hành thí nghiệm ............................................................................. 29

3.5.1. Tối ưu hóa hệ thống UPLC-MS/MS ............................................... 29

3.5.2. Tối ưu hóa quy trình chiết ............................................................... 31

3.5.3. Thẩm định quy trình phân tích ........................................................ 343.5.4. Thí nghiệm trên một số mẫu thật ở công ty Intertek Việt Nam ...... 36

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ....................................................... 38

4.1. Tối ưu hóa hệ thống UPLC-MS/MS ..................................................... 38

4.1.1. Tối ưu hóa điều kiện chạy máy UPLC ............................................ 38

4.1.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ ........................................................ 39

4.2. Tối ưu hóa quy trình chiết ..................................................................... 40

4.2.1. Quy trình chiết lỏng-lỏng ................................................................ 40

4.2.2. Quy trình chiết pha r ắn ................................................................... 41

4.3. K ết quả thẩm định ................................................................................. 42

4.3.1. Độ tuyến tính ................................................................................... 42

4.3.2. Độ đúng ........................................................................................... 42

4.3.3. Độ chính xác ................................................................................... 43

4.3.4. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng ..................................... 43





4.4. K ết quả phân tích một số mẫu thủy sản ở công ty Intertek Việt Nam .. 44

Chương 5: KẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ ....................................................... 45

5.1. K ết luận ................................................................................................. 45

5.2. Kiến nghị ............................................................................................... 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47







DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cơ chế đề kháng kháng sinh .............................................................. 6

Hình 2.2. Tetracyclines gây xám men răng (phía trên) ..................................... 8

Hình 2.3. Sự chiết chọn lọc .............................................................................. 11

Hình 2.4. Quá trình r ửa chọn lọc ..................................................................... 12

Hình 2.5. Quá trình giải ly chọn lọc ................................................................ 12

Hình 2.6. Các loại quy trình phân tích ............................................................. 16

Hình 2.7. Hệ thống UPLC-MS/MS ................................................................. 22

Hình 3.1. Một số thiết bị phân tích .................................................................. 24Hình 3.2. Một số dụng cụ phân tích ................................................................. 25

Hình 3.3. Quy trình thứ nhất chiết tách tetracyclines ...................................... 31

Hình 3.4. Quy trình thứ hai chiết tách tetracyclines ........................................ 32

Hình 3.5. Quy trình thứ nhất chiết pha r ắn ...................................................... 33

Hình 3.6. Quy trình thứ hai chiết pha r ắn ........................................................ 33

Hình 3.7. Quy trình phân tích tetracyclines ..................................................... 37Hình 4.1. Quy trình thứ nhất chiết tách tetracyclines ...................................... 40

Hình 4.2. Quy trình thứ hai chiết tách tetracyclines ........................................ 40

Hình 4.3. Quy trình chiết pha r ắn đượ c lựa chọn ............................................ 41

Hình 4.4. Độ thu hồi của OTC, TC, CTC, DOXY .......................................... 42

Hình 4.5. Độ lệch chuẩn tương đối của OTC, TC, CTC, DOXY ở 10 ppb, 20 ppb, 100 ppb .................................................................................................... 43





DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa ACN AcetonitrileCAC Codex Alimentarius CommissionCAS Chemical Abstract Service Registry NumberCTC ChlortetracyclineDOXY DoxycyclineEC European CommunitiesEU European UnionFA Formic AcidFDA Food and Drug AdministrationHPLC High Performance Liquid ChromatographyICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements

for Registration of Pharmaceuticals for Human UseINNs International Nonproprietary NamesIUPAC International Union of Pure and Applied ChemistryLC-DAD Liquid Chromatography-Diode Array DetectionLC-FLD Liquid Chromatography-Fluorescence DetectionLC-MS/MS Liquid Chromatography tandem Mass SpectrometryLC-UV Liquid Chromatography-UltravioletLLE Liquid-Liquid ExtractionLOD Limit Of DetectionLOQ Limit Of QuantitationMeOH Methanol

MRLs Maximum Residue Limits NAFIQAD Cục Quản lý Chất lượ ng Nông lâm sản và Thủy sản Việt NamOTC OxytetracyclinePAD Photodiode Array DetectorRSD Relative Standard DeviationS/N Signal to NoiseSD Standard DeviationSPE Solid Phase ExtractionTC TetracyclineUPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry





Chương 1: GIỚ I THIỆU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh nhóm tetracyclines (Tetracycline (TC), Oxytetracycline(OTC), Chlortetracycline (CTC), Doxycycline (DOXY)) đượ c sử dụng r ộngrãi trong dượ c phẩm do hoạt tính phổ r ộng kháng lại hầu hết vi khuẩn gram âmvà gram dương. Với đặc điểm này, tetracyclines r ất có hiệu quả trong việc

phòng ngừa và điều tr ị một số bệnh truyền nhiễm. Ngoài ra, tetracyclines còn đượ c sử dụng phổ biến trong nông nghiệ p

như là chất tăng trưởng, điều tr ị bệnh cho động vật trong chăn nuôi. Hiện nay,nhiều nhà chăn nuôi sử dụng tetracyclines quá mức dẫn đến việc xuất hiệnnhiều chủng vi sinh vật kháng thuốc. Không những thế, dư lượ ng tetracyclinestồn tại trong các sản phẩm thủy sản, gia súc, gia cầm ảnh hưở ng nguy hiểmđến sức khỏe của người tiêu dùng như: gây độc gan, thận, biến đổi màu răngcủa tr ẻ em, dị tật thai nhi…

Đồng bằng sông Cửu Long là nơi phát triển mạnh mẽ lĩnh vực nôngnghiệp, đặc biệt là nuôi tr ồng thủy sản. Nhiều mặt hàng thủy sản nướ c ngọtđượ c xuất khẩu trên thị trườ ng thế giới như cá tra, cá basa, tôm… Tuy nhiên,việc lạm dụng tetracyclines dẫn đến nhiều sản phẩm thủy sản bị nhiễm dưlượ ng tetracyclines vượ t quá giớ i hạn cho phép. Cụ thể, theo Cục Quản lýChất lượ ng Nông lâm sản và Thủy sản Việt Nam (NAFIQAD), chưa đầy 4tháng đầu năm 2014, EU và Nhật Bản đã cảnh báo 11 lô hàng tôm nuôi nhậ pkhẩu từ Việt Nam do bị phát hiện dư lượng Oxytetracycline vượ t mức giớ i hạncho phép.

Vì vậy, cần phát triển phương pháp đơn giản và hiệu quả để định lượ ngkháng sinh tetracyclines trong các sản phẩm thủy sản, chăn nuôi. Nhiều

phương pháp định lượng tetracyclines đã đượ c phát triển như LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS… Ngày nay, vớ i sự phát triển của khoa học k ỹ thuật, nhiều thiết bị phân tích đượ c cải tiến để nâng cao hiệu quả phân tích.Trong đó, kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) ghép khối phổ (MS)làm tăng tính chính xác, độ nhạy cũng như rút ngắn thờ i gian phân tích. Do đó,

phát triển một quy trình phân tích k ết hợ p vớ i hệ thống UPLC-MS/MS là k ỹ thuật hiện đại định lượ ng kháng sinh tetracyclines.

Nhằm xây dựng quy trình hiện đại phân tích một số kháng sinh nhómtetracyclines trong thủy sản đáp ứng nhu cầu thị trườ ng, đề tài “Định lượ ng

bốn loại kháng sinh nhóm tetracyclines (TC, OTC, CTC, DOXY) trong thủysản bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ (UPLC-MS/MS)” đã đượ cthực hiện.





1.2.

MỤC TIÊU CỤ THỂ

Trong khuôn khổ của một luận văn tốt nghiệ p với điều kiện trang thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm thuộc công ty Intertek Việt Nam-Chi nhánh CầnThơ, đề tài hướng đến mục tiêu:

Tiến hành thẩm định quy trình phân tích định lượ ng bốn loại khángsinh nhóm tetracyclines (OTC, TC, CTC, DOXY) bằng UPLC-MS/MS, đưa phương pháp vào phân tích trong phòng thí nghiệm.

Áp dụng quy trình phân tích, định lượ ng 30 mẫu thủy sản đượ c chọnngẫu nhiên ở công ty Intertek Việt Nam.





Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ TETRACYCLINES [1]

2.1.1.

Lịch sử nghiên cứ u và phát triểnTetracyclines là một họ lớ n của kháng sinh, các hợ p chất đầu tiên có

nguồn gốc từ chi Streptomyces, ngành Actinobacteria. Chlortetracycline đượ c phân lậ p từ Streptomyces aureofaciens vào năm 1944. Vài năm sau đó,Oxytetracycline và Demeclocycline cũng đượ c phân lậ p từ Streptomyces

rimosus và Streptomyces aureofaciens. Những năm đầu của thậ p niên 60,Tetracycline đã đượ c tạo ra bằng việc hydro giải (hydrogenolysis)Chlortetracycline, trong khi đó Doxycycline là dẫn xuất bán tổng hợ p củaOxytetracycline. Glycylcyclines là nhóm phụ của tetracyclines, điển hình là

Tigecycline đượ c giớ i thiệu năm 2005.

2.1.2. Đặc điểm và tính chất

2.1.2.1. Danh pháp và cấu trúc hóa học

Kháng sinh nhóm tetracyclines có nhiều chất khác nhau dựa trên khungsườ n tetracene. Danh pháp và cấu trúc hóa học đượ c thể hiện qua Bảng 1.

Bảng 2.1. Danh pháp và cấu trúc hóa học các chất nhóm tetracyclines

INN IUPAC Name,Molecular Fomularand CAS Registry No.

Chemical Structure pKa

Chlortetracycline

(4S ,4aS ,5aS ,6S ,12aS , Z )-2-[amino(hydroxy)methylene]-7-chloro-4-(dimethylamino)-6,10,11,12a-tetrahydroxy-6-methyl-4a,5,5a,6-tetrahydrotetracene-1,3,12(2 H ,4 H ,12a H )-trione

C22H23ClN2O8 57-62-5

HA 3.3HA 7.4HB+ 9.3

4-epi-Chlortetracycline

4 R,4aS ,5aS ,6S ,12aS )-7-Chloro-4-(dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-

pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthacenecarboxamide

monohydrate

C22H23ClN2O8 14297-93-9

HA 3.7HA 7.7HB+ 9.2





Demeclocycline

(2E,4S,4aS,5aS,6S,12aS)-2-[Amino(hydroxy)methylidene]-7-chloro-4-(dimethylamino)-6,10,11,12a-tetrahydroxy-

1,2,3,4,4a,5,5a,6,12,12a-decahydrotetracene-1,3,12-trione

C21H21ClN2O8 127-33-3

HA 3.3

HA 7.2HB+ 9.3

Doxycycline

4S ,4a R,5S ,5a R,6 R,12aS )-4-(Dimethylamino)-3,5,10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydrotetracene-2-carboxamide

C22H24 N2O8 564-25-0

HA 3.2HA 7.6HB+ 8.9HA 11.5

Methacycline

(2 Z ,4S ,4a R,5S ,5a R,12aS )-2-(Amino-hydroxymethylidene)-4-dimethylamino-5,10,11,12a-tetrahydroxy-6-methylidene-4,4a,5,5a-

tetrahydrotetracene-1,3,12-trione

C22H22 N2O8 914-00-1

HA 3.5HA 7.6

HB+ 9.5

Minocycline

2 E ,4S ,4a R,5aS ,12a R)-2-(Amino-hydroxy-methylidene)-4,7-

bis(dimethylamino)-10,11,12a-trihydroxy-4a,5,5a,6-tetrahydro-4 H -tetracene- 1,3,12-trione

C23H27 N3O7 10118-90-8

HA 2.8HA 5.0HA 7.8HB+ 9.5

Oxytetracycline

[4S -(4α,4aα,5α,5aα,-6 β ,12aα)]-4-(Dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octa-hydro-3,5,6,10,12,12a-hexahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthacenecarbox-amide

C22H24 N2O9 79-57-2

HA 3.3HA 7.3HB+ 9.1





4-epi-

Oxytetracycline

[4S -(4α,4aα,5α,5aα,-6β,12aα)]-4-(Dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,5,6,10,12,12a-hexahydroxy-6-methyl-

1,11-dioxo-2-naphthacenecarboxamide

C22H24 N2O9 14206-58-7

Notavailabledata

4-epi-Tetracycline

[4S -(4α,4aα,5aα,6β,-12aα)]-4-(Dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,-11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-

pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthacenecarboxamide

C22H24 N2O8 79-85-6

HA 4.8HA 8.0HB+ 9.3

2.1.2.2. Tính chất lý – hóa

Các dẫn xuất của tetracycline là những chất lưỡ ng tính, có thể tạo muốivớ i cả acid và base. Muối hydrochloride là dạng thườ ng sử dụng phổ biếnnhất.

Tetracyclines tương đối ổn định trong môi trường acid nhưng không bền

trong môi trườ ng base và chúng có thể phân hủy nhanh chóng dưới tác độngcủa ánh sáng và oxy không khí. Sự phân hủy có thể làm giảm bằng cách chứadung dịch chuẩn trong chai màu hổ phách hoặc làm khô mẫu bằng khí N2, bảoquản trong phòng tối. Tetracyclines dễ dàng chuyển sang cấu hình 4 – epimertrong dung dịch nướ c hoặc trong quá trình xử lý mẫu.

Vì bản chất phân cực, tetracyclines có thể liên k ết mạnh vớ i proteincũng như cũng như tạo phức chelate vớ i ion kim loại hóa tr ị hai. Do đó, quátrình chiết thườ ng dùng dung môi acid k ết hợ p vớ i tác nhân tạo phức chelatekim loại, góp phần loại protein. Đệm thườ ng sử dụng nhất là Na2EDTA-McIlvaine (pH = 4). Đệm McIlvaine gồm acid citric và disodium hydrogen

phosphate.





2.1.2.3.

Tính chất dượ c lý

a. Phổ kháng khuẩn, cơ chế tác động và cơ chế đề kháng khángsinh

Phổ kháng khuẩn

Tetracyclines có hoạt tính kìm khuẩn nhưng cũng thể hiện tính diệt khuẩnđối vớ i một số vi khuẩn nhạy cảm ở nồng độ cao, bao gồm vi khuẩn Gramdương, Gram âm và cả vi khuẩn k ỵ khí. Một số vi khuẩn nhạy cảm như

Escherichia coli, loài Klebsiella, loài Pasteurella, loài Salmonella và loàiStreptococcus. Ngoài ra, tertracyclines còn có hoạt tính vớ i chlamydia,mycoplasmas, protozoa, rickettsiae.

Cơ chế tác động

Tetracyclines là kháng sinh phổ r ộng, ức chế chế tổng hợ p protein của

vi khuẩn. Cơ chế tác động: thuốc gắn vào receptors trên tiểu phần 30S củaribosome, ngăn cản tRNA chuyển axit amin vào vị trí A trên phức hợ p mRNA

– Ribosome để tạo chuỗi polipeptide.

Cơ chế đề kháng kháng sinh

Sự đề kháng tetracyclines đượ c thể hiện qua ít nhất ba cơ chế.Thứ nhấ t , gene kháng thuốc sẽ mã hóa cho một protein ở màng tế bào

bơm thuốc ra khỏi tế bào vi khuẩn. Thứ hai, một gene sẽ mã hóa cho protein ngăn cản tetracyclines liên k ết vớ i receptors trên tiểu phần 30S

của ribosome. Thứ ba, một dạng hiếm thấy, vi khuẩn sẽ tiết ra enzymeacetyl hóa tetracyclines thành dạng bất hoạt.

Hình 2.1. Cơ chế đề kháng kháng sinh





b.

Tác dụng của tetracyclines

Ðiều tr ị các nhiễm khuẩn do Chlamydia, Rickettsia, lậu cầu, xoắn khuẩn,tả, nhất là các nhiễm khuẩn đườ ng hô hấ p, sinh dục, tiết niệu, mắt, tiêu hoá vàmụn tr ứng cá. Ngoài ra, tetracycline còn dùng để điều tr ị nhiễm trùng tử cung

cấ p tính, bạch hầu, nhiễm trùng giác mạc, viêm phổi.Vì tetracyclines tương đối r ẻ tiền, mọi người thườ ng sử dụng trong chăn

nuôi như là chất kháng khuẩn dòng đầu, đặc biệt đối với động vật nhai lại vàheo. Tetracyclines tr ị nhiễm trùng da và mô mềm ở gia súc, viêm phổi ở heo…Tetracyclines cũng đượ c sử dụng để tăng cườ ng khả năng ăn của gia súc, heo,cừu, gà tây.

c. Dược động học

Tetracyclines thường đượ c sử dụng dướ i dạng hợ p chất mẹ

(oxytetracycline dihydrate) hoặc dạng muối (oxytetracycline hydrochloride).Khả năng thân dầu của chúng ở khoảng từ trung bình (oxytetracycline andchlortetracycline) đến cao (doxycycline and minocycline). Vì thế chúng có thể qua màng tế bào tương đối dễ dàng. Sau khi uống, sinh khả dụng củatetracyclines khác nhau giữa các thuốc, thấ p nhất vớ i oxytetracycline,chlortetracycline và cao nhất vớ i doxycycline. Nhìn chung, các tetracyclinestr ừ doxycycline có sinh khả dụng tương đối thấp. Như một “zwitterions”,tetracyclines chỉ đượ c ion ở pH của dịch tiêu hóa. Hơn thế nữa, thức ăn cũngcó thể làm giảm sinh khả dụng do tetracyclines tạo phức với ion đa hóa trị như

Fe2+; ngoài ra còn có Ca2+, Mg2+, Al3+,…Sau khi hấ p thu, tetracyclines liên k ết vớ i protein huyết tương. Khả

năng liên kết vớ i protein huyết tương: 46 – 51% (chlortetracycline), 28 – 41%(tetracycline), 21 – 76% (oxytetracycline) và 84 – 92% (doxycycline).

d. Độc tính

Tiêm nhanh tetracyclines đường tĩnh mạch gây ngộ độc cấ p tính ở hầuhết các loài động vật. Oxytetracycline có thể gây kích ứng tại chỗ nếu tiêm

bắ p. Lạm dụng tetracycline là nguyên nhân gây ra sự phát triển quá mức của

các loại vi khuẩn không nhạy cảm vớ i thuốc trong một số loài động vật; ở ngựa có thể dẫn đến viêm đại tràng và tiêu chảy nặng. Đặc biệt, sử dụngtetracyclines trong thờ i gian mang thai hoặc trong quá trình phát triển răng, trẻ có thể bị biến đổi màu răng.





Hình 2.2. Tetracyclines gây xám men răng (phía trên)

2.1.3.

Quy định về sử dụng tetracyclines trên thế giớ i

Việc hạn chế sử dụng Oxytetracycline (OTC), Tetracycline (TC),Chlortetracycline (CTC), Doxycycline (DOXY) cho các loài động vật dùng để sản xuất thực phẩm đã được quy định trên toàn cầu. Như vậy, dư lượ ng của

bốn hợ p chất nên là tr ọng tâm chính của phương pháp mới đang đượ c pháttriển. Không những các hợ p chất “gốc” ban đầu mà các hợ p chất chuyển hóacủa tetracyclines cũng đượ c quan tâm. Tetracyclines dễ dàng bị biến đổi hóahọc như đồng phân hóa, epime hóa trong môi trườ ng acid yếu, acid mạnh,

base mạnh, nhiệt. Đồng phân 4-epimer của CTC, TC, OTC cũng đượ c tính vàogiớ i hạn dư lượ ng tối đa theo quy định của châu Âu.

Theo CAC (Codex Alimentarius Commission (đượ c thành lậ p bở i FAOvà WHO năm 1963 nhằm phát triển hài hòa thực phẩm quốc tế, bảo vệ sứckhỏe người tiêu dùng và đảm bảo công bằng trong thương mại thực phẩm))cho phép sử dụng với lượng dư kháng sinh như sau: cơ thịt 200 µg/kg, gan600 µg/kg, thận 1200 µg/kg, sữa 100 µg/kg và tr ứng 400 µg/kg.

Theo Cục quản lý thực phẩm và dượ c phẩm Hoa K ỳ (FDA (Food andDrug Administration)) đánh giá trên tổng dư lượng kháng sinh. Theo đó, tổng

dư lượ ng kháng sinh tối đa cho phép như sau: cơ thịt 2000 µg/kg, gan 6000µg/kg, mỡ và thận 12000 µg/kg, tr ứng 400 µg/kg and sữa 300 µg/kg.

Trong khi đó, dư lượng kháng sinh tetracyclines được EU quy định cụ thể, thể hiện qua Bảng 2.2.





Bảng 2.2. Dư lượ ng kháng sinh tetracyclines tối đa (MRLs) theo quy định củachâu Âu (EU)

Individual DrugsMarker Residue

(Par = Parent Drug)

Animal

Speciesa

Target Tissuesb

And MRL (µg/kg)Chlortetracycline

Sum of par and its 4-epimer

AllM100, L300, K600, Mi100Eg200

Doxycyline ParBPPo

M100, L300, K600M100, F300, L300, K600M100, F300, L300, K600

OxytetracyclineSum of par & its4-epimer

AllM100, L300, K600, Mi100Eg200

TetracyclineSum of par & its4-epimer

AllM100, L300, K600, Mi100Eg200

aAbbreviations used in this column: all=all food-producing species;B=bovine; P=porcine; Po=poultry.

bAbbreviations used in this column: M=muscle; F=fat; L=liver; K=kidney;Mi=milk; Eg=eggs.

2.2. K Ỹ THUẬT CHIẾT PHA R ẮN (SPE) [2]

2.2.1. Giớ i thiệuChiết pha r ắn (SPE) là k ỹ thuật chuẩn bị mẫu đượ c sử dụng ngày càng

phổ biến. Vớ i SPE, các vấn đề liên quan đến quá trình chiết lỏng-lỏng (LLE)có thể đượ c cải thiện như sự tách pha không hoàn toàn, độ thu hồi thấ p, sử dụng nhiều dung môi hữu cơ. SPE sử dụng hiệu quả hơn LLE vì dễ dàng thựchiện, nhanh chóng và có thể tự động hóa. Dung môi chiết sử dụng tương đối ítvà thờ i gian thực hiện cũng đượ c rút ngắn. SPE thườ ng sử dụng để chuẩn bị mẫu lỏng vớ i chất tan ít hoặc không bay hơi. Đồng thời, SPE cũng có thể dùngchuẩn bị mẫu r ắn – hòa tan vào dung môi thích hợp trướ c khi chiết vớ i SPE.Các sản phẩm SPE thật sự hữu ích cho quá trình chiết, cô đặc và làm sạchmẫu. Chúng có cấu tạo đa dạng bở i nhiều chất hấ p phụ cũng như kích cỡ khác

nhau. Việc lựa chọn một sản phẩm phù hợ p vớ i mỗi chất hay mỗi mẫu phântích là r ất quan tr ọng.

2.2.2. Phân loại

2.2.2.1. SPE pha đảoSPE pha đảo gồm pha động phân cực hoặc phân cực trung bình (mẫu

nền) và pha tĩnh không phân cực. Chất phân tích thườ ng không phân cực hoặckém phân cực. Pha tĩnh đượ c tạo bở i những hạt silica tạo liên k ết vớ i gốc -alkyl hoặc – aryl. Ở đây, nhóm silanol phân cực (kích thướ c hạt 40 m, kíchthươc lỗ 60Å) đã đượ c tạo liên k ết hóa học vớ i nhóm chức không phân cực

như – alkyl, -aryl.





Sự lưu giữ chất phân tích hữu cơ từ dung dịch phân cực trên pha tĩnhSPE chủ yếu là do lực tương tác giữa liên k ết carbon – hydrogen của chất phântích và nhóm chức không phân cực trên bề mặt của silica. Lực tương táckhông phân cực – không phân cực còn đượ c gọi là lực khuếch tán hay lực Vander Waals. Để giải ly chất phân tích, dung môi giải ly thườ ng không hoặc ít

phân cực.

2.2.2.2. SPE pha thườ ng

SPE pha thườ ng vớ i chất phân tích phân cực, có mẫu nền (pha động) íthoặc không phân cực và một pha tĩnh phân cực. Pha tĩnh cấu tạo bở i silica liênk ết vớ i các nhóm chất phân cực như -CN, -NH2, -diol…Sự lưu giữ chất phântích dưới điều kiện pha thường là do tương tác giữa nhóm chức phân cực củachất phân tích và nhóm chức phân cực trên bề mặt chất hấp thu. Tương tác này

bao gồm liên k ết hydrogen, tương tác - , tương tác lưỡ ng cực – lưỡ ng cực,tương tác lưỡ ng cực – cảm ứng… Dung môi giải ly thường có độ phân cực caohơn so vớ i dung môi trong mẫu nền ban đầu.

2.2.2.3. SPE trao đổi ion

SPE trao đổi ion thườ ng dùng cho các chất phân tích mang điện tíchtrong dung dịch. Cơ chế lưu giữ chủ yếu dựa trên lực hút tĩnh điện của nhómchức mang điện tích trên chất phân tích và nhóm chức mang điện tích trên bề mặt liên k ết với silica. Để hợ p chất lưu giữ bằng cơ chế trao đổi ion thì pH củamẫu nền phải làm cho chất phân tích và nhóm chức trên bề mặt silica mangđiện tích. Một dung dịch có pH mà cho chất phân tích hoặc nhóm chức phâncực trên silica tr ở về tr ạng thái trung hòa điện thì có thể dùng như chất giải ly.Bở i vì khi một trong các nhóm chức này ở tr ạng thái trung hòa thì lực hút tĩnhđiện giữa chúng sẽ mất đi và hợ p chất đượ c giải ly. Ngoài ra, dung dịch có

tính ion hóa mạnh hoặc chứa các ion có thể thay thế chất phân tích cũng đượ cdùng để r ửa giải.

2.2.3. Tương tác thứ hai trong SPE

Cơ chế lưu giữ chủ yếu các hợ p chất phân tích bằng SPE đã đượ c mô tả ở trên. Tuy nhiên, do khung sườ n silica, một số tương tác thứ hai với lượng dưnhóm silanol có thể xảy ra.

Trong SPE pha đảo, nếu chất giải ly không phân cực giải ly không hiệuquả chất phân tích thì sự thêm vào dung môi phân cực hơn (methanol) là cầnthiết để loại bỏ bất k ỳ tương tác nào lưu giữ hợ p chất. Vì trong trườ ng hợ p





này, methanol tạo liên k ết hydrogen mạnh mẽ hơn vớ i vớ i nhóm hydroxyl trên bề mặt silica so vớ i chất phân tích. Nhóm silanol trên bề mặt silica mang tínhacid, có thể tồn tại dướ i dạng Si-O- ở pH nhỏ hơn 4. Kết quả là khung sườ nsilica có thể trao đổi cation (lực tương tác thứ hai), giữ lại cation hoặc chất

phân tích. Trong trườ ng hợp này, điều chỉnh pH của dung môi giải ly là cầnthiết để loại bỏ tương tác thứ hai này.

Với SPE pha thường, tương tác thứ hai có thể xảy ra khi chất phân tíchtương tác vớ i chuỗi alkyl ngắn trong nhóm chức liên k ết vớ i silica. Trongtrườ ng hợ p này, một dung môi ít phân cực hơn hoặc hỗn hợ p dung môi phâncực và không phân cực cần thiết cho sự giải ly.

Với SPE trao đổi ion, tương tác thứ hai có thể là tương tác không phâncực (phân cực) của chất phân tích vớ i phần không phân cực (phân cực) củanhóm chức liên k ết silica. Ngoài ra, còn tương tác trao đổi cation giữa chất

phân tích và khung sườn silica. Do đó, việc lựa chọn pH, độ mạnh ion, phatĩnh là rất cần thiết cho việc giải ly hiệu quả.

2.2.4. Quy trình sử dụng SPE

2.2.4.1.

Cơ chế

Chiết pha r ắn thường đượ c sử dụng để tách các chất phân tích ra khỏimẫu, theo 3 cách sau:

Quá trình chiết chọn lọc: Chọn chất hấ p thụ SPE liên k ết một cách

chọn lọc vớ i các chất – chỉ chất phân tích hoặc chỉ các chất khác củamẫu.Chất đượ c chọn sẽ lưu giữ lại trên pha tĩnh khi cho mẫu qua cột.Sau đó, hoặc giải ly chất phân tích ra khỏi cột hoặc loại bỏ cột hấ p thunhững tạ p chất.

Hình 2.3. Sự chiết chọn lọc

Quá trình rử a chọn lọc: Chất phân tích và tạ p chất được lưu giữ lại pha tĩnh khi cho mẫu qua cột. Tạ p chất sẽ đượ c r ửa đi bở i mộtdung dịch mà chất phân tích vẫn có thể lưu giữ lại.





Hình 2.4. Quá trình r ửa chọn lọc

Sự giải ly chọn lọc: Các chất phân tích giữ trên cột sẽ đượ c giải ly bở imột dung môi mà tạ p chất đủ mạnh để có thể giữ lại trên cột.

Hình 2.5. Quá trình giải ly chọn lọc

2.2.4.2. Quy trình sử dụng SPE

1. Chọn cột SPE thích hợ p 2. Hoạt hóa cột SPE 3. Cho mẫu qua cột

4. R ửa cột cột 5. Giải ly chất phân tích





Lưu ý : kh ối lượ ng của ch ấ t phân tích đượ c chiết phải nh ỏ hơn 5% sovớ i khối lượ ng v ật l i ệu nh ồi c ột . Ví dụ: vớ i loại cột 100 mg/1 mL thì khôngcho vào chiết quá 5 mg chất phân tích.

2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢ NG TETRACYCLINES

2.3.1. Phương pháp HPLC-UV/Vis [3]

Nhóm nghiên cứu của Pavlína NaVrátiloVá (University of Veterinaryand Pharmaceutical Sciences, Brno, Czech Republic) đã tiến hành định lượ ngtetracyclines trong sữa bò bằng phương pháp HPLC-UV/Vis.

Quy trình phân tích đượ c thực hiện tóm tắt như sau: Mẫu sữa đượ c làmnóng đến 40oC, khuấy tr ộn, sau đó làm lạnh về 20oC. Lấy 15 mL mẫu sữachiết với 25 mL đệm McIIvaine, tiế p tục ly tâm ở tốc độ 4.000 vòng/phút ở 5oC trong vòng 10 phút. Loại bỏ lớ p chất béo phía trên cùng, phần dịch lỏng

còn lại (25 mL) cho qua cột SPE Oasis HLB.

Cột đượ c hoạt hóa bở i 3 mL methanol, r ửa cột với 2 mL nước. Sau đómẫu cho qua cột và r ửa vớ i 1.5 mL dung dịch 5% methanol (MeOH) trongnướ c. Giải ly với 2 mL methanol, cô quay trong môi trườ ng chân không.

Định mức vớ i 1mL dung dịch pha động, lọc qua màng lọc nylon 0,2 µm.Đem mẫu phân tích HPLC.

Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.

Pha động: Acetonitrile: Methanol: Oxalic acid (50 mM) tỉ lệ 13:13:74.Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút.

Bướ c sóng phát hiện: 365 nm.

Nhận xét:

Phương pháp định lượ ng trên đạt độ đúng cao với độ thu hồi trongkhoảng từ 88,1% (CTC) đến 93,5% (OTC). Độ chính xác đạt vớ i OTC và TC,tuy nhiên CTC có độ chính xác thấ p vớ i RSD = 20,6% vớ i giớ i hạn phát hiệnlà 20 ppb trong khi OTC và TC là 5 ppb.

HPLC/UV-Vis là phương pháp định lượng thường đượ c sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm vớ i các chất có nhóm chức hấ p thu ánh sángtrong trong khoảng UV-Vis. Tuy nhiên, mức độ hấ p thu của nhóm chức trongcấu trúc của tetracyclines yếu dẫn đến độ chọn lọc của phương pháp khôngcao.





2.3.2.

Phương pháp HPLC-PAD (Photodiode Array Detector) [4]

Một nhóm nghiên cứu khác do A. K. BISWAS, thuộc Viện nghiên cứuThú y Ấn độ đã tiến hành phân tích kháng sinh tetracyclines trong thịt bò xuấtkhẩu bằng phương pháp HPLC-PAD.

Quy trình và k ết quả phân tích đượ c tóm tắt như sau: Mẫu (10 g) sau khiđược đồng hóa sẽ chiết với 3 mL đệm McIIvaine (pH 3,85), vortex và lắc 5

phút. Sau đó, mẫu đem ly tâm lạnh ở tốc độ 3.500 vòng/phút trong 10 phút.Lấy phần dịch nổi, phần r ắn đượ c chiết lần hai vớ i 2 mL đệm.

Dịch chiết đượ c gom lại cho qua cột Oasis SPE (200 mg/6 mL) sau khiđượ c hoạt hóa với 3 mL methanol và 2 mL nước. Sau đó, mẫu đượ c r ửa vớ i 5mL nướ c và giải ly vớ i 4,5 mL Oxalic acid 10mM trong methanol. Lấy 1 mLdung dịch giải ly lọc qua màng lọc nylon 0,22 µm, vortex và phân tích HPLC.

Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.Pha động: Oxalic acid 10 mM trong MeOH: Acetonitrile: MeOH

(77:18:5, v/v/v).

Tốc độ dòng: 0,6 mL/phút.

Bướ c sóng phát hiện: 355 nm.

Nhận xét:

Với độ thu hồi ở 31 ppb trong khoảng từ 78,3% (TC) đến 98,6% (OTC)

và độ lệch chuẩn tương đối từ 2,1% - 11,45%, phương pháp có độ đúng và độ chính xác cao. Tuy nhiên, giớ i hạn phát hiện (31 ppb) và giớ i hạn định lượ ng(62 ppb) khá cao so với phương pháp HPLC-UV/Vis nêu trên.

2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) [5]

Nhóm nghiên cứu thuộc trường Đại học Thượ ng Hải, Bộ Nông nghiệ pTrung Quốc đã tiến hành phân tích tetracyclines trong tổ ong.

Quy trình phân tích cơ bản như sau: Mẫu (5 g) sau khi đồng hóa đượ c ủ 30 phút. Sau đó, thêm vào mẫu 20 mL hexane, 20 mL đệm EDTA-McIlvaine,

vortex 30 giây, lắc 20 phút và đánh siêu âm trong 10 phút ở tần số 40 kHz.Mẫu tách thành 3 lớ p sau khi ly tâm ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 3 phút.Lấy lớ p dung dịch đệm phía dướ i, chiết vớ i 10 mL hexane, vortex 1 phút vàloại bỏ lớ p dịch hexane.

Dung dịch thu đượ c qua cột Oasis HLB sau khi hoạt hóa vớ i 5 mLmethanol và 5 mL nướ c. Cột r ửa vớ i 5 mL dung dịch MeOH 5% trong nướ c(v/v). Chất phân tích đượ c giải ly vớ i 10 mL MeOH. Dung dich giải ly đượ clàm khô bằnng cách cô quay trong môi trườ ng chân không.

Định mức 1 mL vớ i dung dịch MeOH 40% (v/v). Lọc vớ i màng lọcnylon 0,22 µm, sau đó phân tích LC-MS/MS.





Thể tích tiêm mẫu: 10 µL.

Pha động: (A): Methanol; (B): Formic acid 0,1% (v/v)

Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút.

Nguồn MS: ESI+.

Nhận xét:

Với độ thu hồi 73,8-103,7% và độ lệch chuẩn tương đối 1,57-6,85% phương pháp có độ đúng và độ chính xác cao. Không những thế độ nhạy của phương pháp cao vớ i giớ i hạn định lương < 1 ppb, rất thích hợ p phân tíchtetracyclines ở mức độ vết. Tuy nhiên, thiết bị LC-MS/MS đắt tiền, vận hànhmáy khá phức tạp nên thường ít đượ c trang bị ở các phòng thí nghiệm thôngthườ ng.

2.4.

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH (VALIDATION OFANALYTICAL PROCEDURES) [6]

2.4.1. Khái niệm

2.4.1.1. Định nghĩa

Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình (procedure) tiến hànhthiết lậ p bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh r ằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến.

Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu chúng ta

phải chứng minh một cách khoa học r ằng khi tiến hành thí nghiệm các saisố mắc phải là r ất nhỏ và chấ p nhận đượ c.

2.4.1.2. Vai trò

Xây dựng quy trình phân tích (quy trình thử nghiệm) nhằm mục đích: Giúp cho việc kiểm tra chất lượ ng của tiêu chuẩn cũng như thực

hiện các chỉ tiêu đề ra cho tiêu chuẩn đó.

Chứng tỏ r ằng quy trình đề xuất đáp ứng vớ i yêu cầu dự kiến.

Sau khi đượ c thẩm định có thể được đưa vào Dược điển hoặc tiêu

chuẩn cơ sở để xin đăng ký lưu hành.





2.4.2.

Các loại quy trình phân tích

2.4.2.1. Phân loại

Các loại quy trình phân tích đượ c thể hiện qua hình sau:

Hình 2.6. Các loại quy trình phân tích

a.

Thử định tính

Là các phép thử nhằm đảm bảo r ằng chất cần phân tích có mặt trong mẫuđem thử (so sánh các loại phổ, các đặc trưng về sắc ký, các phản ứng hóa học).

b. Thử tinh khiếtLà thử định lượ ng hay thử giớ i hạn của chất không tinh khiết có trong

mẫu thử nhằm xác định mức độ tinh khiết của mẫu cần thử.

c. Thử định lượ ng

Nhằm vào việc đo lườ ng chất cần thử trong mẫu thử.Vớ i nguyên liệu làm thuốc: là xác định hàm lượ ng của thành phần chính

có trong mẫu thử.Vớ i chế phẩm: là xác định hàm lượ ng của các hoạt chất có trong mẫu chế

phẩm đem thử.

2.4.2.2. Tiêu chuẩn của một quy trình phân tích

a.

Định nghĩa Quy trình phân tích (phương pháp thử) là sự mô tả chi tiết các bướ c cần

thiết để thực hiện một thử nghiệm.

b. Tiến hànhQuy trình phân tích gồm chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các

thuốc thử, sử dụng các dụng cụ máy móc, xây dựng đườ ng cong chuẩn độ, chođến sử dụng công thức để tính toán và biện giải k ết quả…

Các loại quy trình phân tích

Thử định tính

(Identification Tests)

Thử tinh khi ế t

(Impurity Tests)

Thử định lượng

(Assay Procedures)





2.4.3.

Các yêu cầu thẩm định của một quy trình phân tích

2.4.3.1. Tính đặc hiệu

a. Định nghĩa

Tính đặc hiệu (độ nhiễu của phương pháp) là khả năng của quy trình cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích và không bị ảnh hưở ng bở i sự có mặt của các chất khác trong mẫu thử.

Vớ i thử định tính: đảm bảo xác định đúng chất cần thử.Vớ i thử tinh khiết: đảm bảo xác định đúng và chính xác hàm lượ ng hoặc

giớ i hạn của các tạ p chất liên quan, kim loại nặng, chất phân hủy, cắn củadung môi… có trong mẫu thử.

b. Cách xác định tính đặc hiệu

Chuẩn bị mẫu: Mẫu giả định: có công thức và thành phần của hoạt chất hoàn toàngiống như mẫu thử.

Mẫu tr ắng: bao gồm thành phần giống hệt như mẫu đem thử chỉ không chứa hoạt chất cần thử.

Xác định các mẫu trên bằng phương pháp đề xuất. K ết quả thu đượ c sovớ i mẫu tr ắng.

Xác định hiệu hay độ sai lệch thu đượ c:

2.4.3.2. Tính tuyến tính

a. Khái niệm

Theo ICH 1994:

Sự tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng thu đượ c các k ết quả thử nghiệm tỷ lệ thuận vớ i nồng độ (số lượ ng) của chất phân tích có trong mẫu

thử (trong khoảng nồng độ cho phép).Tính chất tuyến tính đượ c thể hiện bằng hệ số tương quan r .

Định nghĩa khác: Tính tuyến tính là khả năng luận ra các k ết quả của phương pháp dựa

vào: Đườ ng biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo

đượ c và nồng độ là một đườ ng thẳng (tương quan tỷ lệ giữa đại lượ ngđo đượ c và nồng độ phải có sự phụ thuộc tuyến tính).





Biểu thị bằng hệ số tương quan r .

trong đó: là các giá trị thực nghiệm là các giá trị trung bình.

r phải nằm trong khoảng giá trị từ -1 đến 1. Nếu: r =1: có tương quan tuyến tính rõ r ệt.

r >0: có tương quan đồng biến.r <0: có tương quan nghịch biến.r <0,5: coi như không có tương quan tuyến tínhr>0,5: có phụ thuộc tuyến tính.

Sau khi đã xác định đượ c khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể

xây dựng phương trình hồi quy của khoảng này, tức là đi tìm hệ số góc a và bcủa phương trình trên theo công thức:

b.

Tiến hành xác định phương trình hồi quyXác định độ đáp ứng của ít nhất 5 nồng độ. Tìm phương trình

y = ax + b. Nếu tuyến tính: áp dụng phân tích thống kê tìm tương quan hồi quy bằng

phương pháp bình phương tối thiểu.Biểu thị: hệ số tương quan 0,99 r 1; slope a, intercept b.

2.4.3.3.

Miền giá trị

Miền giá tr ị (Khoảng tuyến tính) của một quy trình phân tích là khoảng

giữa nồng độ thấ p nhất và nồng độ cao nhất của chất cần phân tích có trongmẫu thử.

Bất k ỳ nồng độ nào trong khoảng này đều đáp ứng về độ chính xác lẫnđộ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp.

Biểu thị: bằng khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá tr ị đođượ c và nồng độ.

r





2.4.3.4.

Độ chính xác

a. Khái niệm

Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các k ết quả thử riêng r ẻ xi vớ i giá tr ị trung bình thu đượ c khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu

thử đồng nhất trong điều kiện xác định.Độ chính xác bị ảnh hưở ng bở i sai số ngẫu nhiên.Độ chính xác cho biết mức độ phân tán của phép thử và nó có thể đánh

giá qua độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD vớ i n lần đo:

b. Cách tiến hành

Trên mẫu thử đã được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất n lần (n từ 6 – 10 hay nhiều hơn), sau đó áp dụng công thức tínhSD, RSD (hay còn gọi là khoảng biến động CV) .

Yêu cầu: RSD càng nhỏ, phương pháp càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đưa ra. Theo tiêu chuẩn của Cộng đồng châu Âu (EC),

RSD 10%.2.4.3.5. Độ đúng

a. Định nghĩa

Độ đúng là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi ápdụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trongcùng một điều kiện xác định.

Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống. Đại lượng đặc trưng cho độ đúng: Bias (hiệu giữa hàm lượng thực thêm

vào mẫu μ và hàm lượng tìm lại được bằng quy trình.





b.

Cách xác định

Có thể xác định độ đúng của phương pháp theo 4 cách sau đây: Đo dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết chính xác. Tỷ số giữa kết quả

đo và trị số đã biết thể hiện độ đúng của phương pháp.

So sánh hai kết quả của phương pháp mới và phương pháp cũ đã biếtđộ đúng.

Phương pháp thêm chuẩn: thêm lượng đã biết của chất chuẩn vàomẫu thử đã biết nồng độ. Dùng phương pháp thử tìm lại giá trị saukhi thêm vào.

Phương pháp mẫu trắng: thêm lượng đã biết (nồng độ dự kiến) củachất chuẩn vào mẫu trắng. Dùng phương pháp phân tích tìm lại giá trịsau khi thêm vào.

Yêu cầu: Độ đúng phải nằm trong khoảng từ 80% - 110% theo EC. 2.4.3.6. Giới hạn phát hiện

a. Định nghĩa

Giới hạn phát hiện là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn cóthể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng.

Giới hạn phát hiện thường được biểu thị bằng phần trăm, phần ngàn, phần triệu (ppm), phần tỉ (ppb)…

b. Cách xác định giới hạn phát hiện

Phương pháp không dụng cụ: phân tích những mẫu có nồng độ đã biết sau đó giảm dần bằng nồng độ pha loãng ½ cho tới khi đạt tớimức tối thiểu nào đó còn phát hiện được bằng quy trình đề xuất.

Phương pháp dụng cụ:

Có thể tiến hành xác định bằng cách xác định phương trình hồi quyy = ax + b.

với a: độ dốc của đường tuyến tính SD: độ lệch chuẩn của kết quả đo chất phân tích

Đo tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N (noise), tín hiệu thu được từmẫu thử là S. Thiết lập tỷ số này với S/N=2/1 hoặc 3/1 là chấp nhậnđược.





2.4.3.7.

Giới hạn định lượng

a. Định nghĩa

Giới hạn định lượng là lượng thấp nhất của chất thử trong mẫu thử còncó thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.

Biểu thị bằng sự cho phép có mặt của chất cần thử trong mẫu đem thửvới nồng độ phần trăm, phần ngàn…

b. Cách xác định giớ i hạn định lượ ng

Phương pháp không dụng cụ: pha loãng đến nồng độ tối thiểu để cònchấp nhận được sự phát hiện chất cần thử với độ chính xác và độđúng yêu cầu.

Phương pháp dụng cụ: có thể tiến hành bằng cách xác định phương

trình hồi quy y = ax + b.

2.5. SƠ LƯỢ C VỀ HỆ THỐNG UPLC-MS/MS [7,8,9]

Hệ thống Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ (Ultra performanceliquid chromatography – tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)) là thiết

bị phân tích hiện đại, giúp quá trình phân tích nhanh chóng và chính xác trên

nhiều nền mẫu khác nhau.

K ỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) dựa trên việc sử dụng cộtvới kích thướ c hạt 1,7 μm, có thể tách sắc ký r ất tốt thông qua hệ thống áp suấtcao (có thể lên đến 1000 atm). Hệ thống áp suất cao đượ c tạo bằng máy bơmcó độ chính xác cao k ết nối vớ i hệ thống ống nối chịu đượ c áp suất cao củachất lỏng. Điều này cải thiện độ phân giải peak, độ nhạy, cũng như tốc độ

phân tích.

Đây là thiết bị đượ c phát triển từ ứng dụng của hệ thống HPLC. Ở hệ

thống HPLC, thời gian lưu của chất phân tích kéo dài từ 40-60 phút, việc táchchất trên cột mất nhiều thời gian. Trong khi đó, thời gian lưu trong hệ thốngUPLC sẽ giảm 2-3 lần so vớ i hệ thống HPLC mà không làm mất chất phântích trong quá trình sắc ký. Thêm vào đó, thờ i gian r ửa cột cũng ngắn hơn thờ igian r ửa cột trong hệ thống HPLC.

Peak sắc ký thu đượ c r ất nhọn và hẹ p vớ i thờ i gian r ửa giải ngắn, khoảng10-20 giây.





2.5.1.

Thành phần hệ thống UPLC-MS/MS

Hình 2.7. Hệ thống UPLC-MS/MS

Hệ thống UPLC gồm các bộ phận sau:

1. Bơm cao áp

Gồm 2 bơm, 6 kênh kết nối vớ i 6 hệ dung môi khác nhau tiện cho việc

phân tích nhiều chỉ tiêu, cũng như rửa hệ thống trong quá trình phân tích.Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký và r ửa giải

chất tan khỏi cột sắc ký, bơm được điều chỉnh từ (0-15000 psi (1020 atm)) để tạo ra những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợ p cho quá trìnhsắc ký.

2. Buồng tiêm mẫu

Gồm có thiết bị định vị ba chiều Oxyz giúp định vị, bơm, hút mẫu từ khay đựng mẫu theo chế độ autopsamler.

Khay đựng mẫu gồm 2 khay, mỗi khay có thể chứa 48 vial chất phântích.

3. Cột tách

Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình sắc ký, yếu tố quyết định hiệuquả sắc ký của hỗn hợ p chất mẫu.

Cột đượ c làm bằng thép không gỉ, chiều dài thườ ng từ 10-30 cm, đườ ngkính trong từ 4-10 mm, cỡ hạt pha tĩnh từ 3-10 µm. Thườ ng dùng cột dài 15cm, 25 cm, đườ ng kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm. Vớ i UPLC, cột dài khoảng

10 cm, đườ ng kính trong 1-4,6 mm, cỡ hạt 1,7 µm.





4.

Đầu dò (Detector)Trong UPLC có thể đượ c trang bị vớ i các thiết bị đầu dò quang học như

tunable ultraviolet (TUV), photodiode array (PDA)…hoặc đượ c k ết nối vớ imáy khối phổ.

Với máy đo khối phổ, các chất phân tích sau khi qua cột sẽ được đưa vàomáy khối phổ phân tích. Tại đây, dướ i tác dụng của điện thế, các ion bị bắn

phá và đượ c bẫy lại sau đó qua các bộ phận như phân tích khối lượ ng, thunhận tín hiệu để phát hiện, phân tích chất.

5. Thiết bị ghi k ết quả

Tín hiệu đo đượ c k ết nối vớ i một hệ thống máy tính cài đặt sẵn phầnmềm vận hành MassLynx 4.1.

2.5.2.

Ứ ng dụng trong phân tích của hệ thống UPLC-MS/MSCùng vớ i các k ỹ thuật phân tích hiện đại khác, k ỹ thuật UPLC đã đóng

vai trò quan tr ọng trong việc tách, phân tích các chất ở nhiều lĩnh vực khácnhau như: hóa dượ c (chuyển hóa thuốc), sinh hóa (các hợ p chất nội sinh:hormones, steroid, lipid, carbohydrate, amino acid…), hóa thực phẩm (các sản

phẩm biến chất, tạ p chất, chất chuyển hóa), hóa dầu, các loại chất độc hại,lượng dư thuốc bảo vệ thực vật, phân tích môi trường…

Máy có thể phân tích trên nhiều nền mẫu khác nhau như mẫu sinh học(máu, huyết tương, nướ c tiểu, mật, mô), trong các mẫu thử nghiệm in vitro,thực phẩm, nướ c giải khát, mẫu môi trường (đất, nước…), các mẫu pháp y vàcác sản phẩm khác trong phòng thí nghiệm.





Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

3.1.

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂMThờ i gian: 01/7/2014-25/9/2014.

Địa điểm: Phòng Hóa – Trung tâm dịch vụ phân tích Intertek Việt Nam(M10, M11, M12, M13 Khu đô thị Nam sông Cần Thơ, phườ ng Phú Thứ,quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ).

3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨ U

3.2.1. Thiết bị Hệ thống UPLC-MS/MS (Accuty);

Máy ly tâm UNIVERSAL 320R và EPA của HETTICH;

Cân k ỹ thuật có độ chính xác 0,001 g;

Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g; Bộ chiết pha r ắn;

Máy vortex;

Máy đánh siêu âm;

Bể thổi khí N2.

a) Máy ly tâm UNIVERSAL b) Bể thổi khí N2

c) Bộ chiết pha r ắn d) Máy siêu âm

Hình 3.1. Một số thiết bị phân tích





3.2.2.

Dụng cụ

Kim tiêm 1 mL;

Vial 1 mL;

Màng lọc nylon 0,22 μm;

Pipetteman;

Transferpipette 50 μL, 200 μL;

Ống ly tâm nhựa có nắ p 15 mL, 50 mL;

Pipette Pasteur;

Cột chiết pha r ắn Agilent C18 500 mg/6 mL;

Máy xay mẫu.

a) Màng lọc nylon 0,22 µm b) Vial 1,5 mL

c) Máy xay mẫu d) Kim tiêm

Hình 3.2. Một số dụng cụ phân tích





3.2.3.

Hóa chất và thuốc thử Chuẩn Tetracycline (TC) Dr. Ehrenstorfer, Đức (Độ tinh khiết 98%);

Chuẩn Oxytetracycline (OTC) Dr. Ehrenstorfer, Đức (Độ tinh khiết97,5 %);

Chuẩn Chlortetracycline (CTC) Dr. Ehrenstorfer, Đức (Độ tinh khiết93%);

Chuẩn Doxycycline (DOXY) Dr. Ehrenstorfer, Đức (Độ tinh khiết98,7%);

Nội chuẩn Demeclocycline (DMCLC) Dr. Ehrenstorfer, Đức (Độ tinhkhiết 98,5%);

Khí N2 có độ tinh khiết 99,99%;

Methanol HPLC (Merck);

Nướ c HPLC (Merck); Acetonitrile HPLC (Merck);

Acid formic (FA) PA 98% (Merck);

Titriplex III (EDTA) 99-101% (Merck);

Disodium hydrogen phosphate 99,5% (Merck);

Oxalic acid dihydrate (Merck);

Citric acid monohydrate (Merck);

NaOH tinh khiết phân tích (Merck)

Ethyl acetate (Fisher).

3.2.4. Cách pha các dung dịch, thuốc thử

3.2.4.1. Acid citric 0,1M (dung dịch A)

Cân 21.014 g acid citric vào bình định mức 1000 mL, định mức bằngnướ c cất đến vạch.

Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong vòng 6 tháng.

3.2.4.2. Dung dịch Na2HPO4 0,2 M (dung dịch B)

Cân 34,836 g Na2HPO4 vào bình định mức 1000 mL, định mức bằngnướ c cất đến vạch.


3.2.4.3. Dung dịch Mcllvaine (pH = 4 0,05)

Tr ộn 1000 mL dung dịch A và 625 mL dung dịch B. Sau đó chỉnh pH về 4 bằng dung dịch NaOH 20%.





3.2.4.4.

Đệm Mcllvaine-EDTA

Tr ộn 60,5 g Na2EDTA.2H2O vào 1625 mL dung dịch đệm Mcllvainetrên.

Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh, dung dịch bền trong vòng 6 tháng.3.2.4.5. Dung dịch nướ c 0,1% FA

Hút 1 mL acid formic cho vào bình định mức 1000 mL có sẵn khoảng300 mL nướ c HPLC, lắc và định mức đến vạch bằng nướ c HPLC.


3.2.4.6. Dung dịch Acetonitrile (ACN)

Hút 3 mL ACN cho vào bình định mức 1000 mL, định mức bằng nướ cHPLC đến vạch, lắc đều, đuổi khí.


3.2.4.7. Dung dịch NaOH 20%

Cân 20 g NaOH cho vào cốc nhựa 100 mL, cho khoảng 40 mL nướ c cất,khuấy hòa tan hoàn toàn và thêm nướ c vừa đủ 100 mL.

Bảo quản dung dịch trong chai nhựa, ở nhiệt độ phòng. Dung dịch bềntrong vòng 1 năm.

3.2.4.8. Dung dịch 5mM acid Oxalic trong MeOH

Cân chính xác 0,053 g acid Oxalic vào bình định mức 100 mL, thêmkhoảng 40 mL MeOH, lắc hòa tan. Sau đó thêm MeOH vừa đủ tớ i vạch.

Bảo quản dung dịch trong chai kín. Dung dịch pha trướ c khi dùng.

3.2.4.9. Dung dịch chuẩn gốc Tetracyclines (TC, OTC, CTC), DMCLC(IS) 1000 ppm (Lưu ý khi pha chuẩn phải chú ý độ tinh khiết và

gốc liên k ết)Cân một lượng tương đương 500,05 mg mỗi chuẩn TCs bằng cân phân

tích, chuyển vào bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 30 mL MeOH đặt vào bể siêu âm cho đến khi TCs tan hoàn toàn, để cho tr ở lại nhiệt độ phòng, địnhmức tớ i vạch bằng MeOH.

Bảo quản trong tủ đông, dung dịch bền trong một năm.





3.2.4.10.

Hỗn hợ p dung dịch chuẩn TCs trung gian 10 ppm, IS TCs 10ppm

Hút chính xác 0,1 mL chuẩn gốc TC, OTC, CTC 1000 ppm vào bìnhđịnh mức 10 mL, thêm MeOH cho đến vạch định mức. Đậy nắ p thật chặt, lắc

đều.

Bảo quản dung dịch trong tủ đông, dung dịch bền trong vòng 6 tháng.

3.2.4.11. Hỗn hợ p chuẩn làm việc 1ppm và IS TCs 1 ppm

Hút chính xác 1 mL chuẩn TCs trung gian 10 ppm vào bình định mức 10mL. Định mức đến vạch bằng MeOH. Đậy nắ p, lắc đều.

Tránh ánh sáng, bảo quản trong tủ đông, dung dịch bền trong vòng 2tháng.

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Phương pháp lấy mẫu: mẫu phân tích (30 mẫu thủy sản gồm tôm và cánguyên liệu) đượ c chọn ngẫu nhiên tại công ty Intertek Việt Nam – Chi nhánhCần Thơ.

Phương pháp phân tích: Mẫu đượ c chiết lỏng-lỏng với đệm EDTA-Mcllvaine pH = 4, sau đó làm sạch và làm giàu mẫu bằng k ỹ thuật chiết phar ắn. Cuối cùng, tiến hành phân tích mẫu bở i hệ thống UPLC-MS/MS.

Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu đượ c xử lý bằng chương trình ứngdụng Microsoft Excel.

3.4. HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM

3.4.1. Tối ưu hóa hệ thống UPLC-MS/MS

3.4.2. Tối ưu hóa quy trình chiết

3.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định quy trình phân tích theo Commision Decision 2002/657/ECcủa Cộng đồng Châu Âu (European Communities).

Tiến hành các thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 1: Khảo sát tính tuyến tính của phương pháp

Thí nghiệm 2: Khảo sát về độ đúng của phương pháp

Thí nghiệm 3: Khảo sát về độ chính xác của phương pháp

Thí nghiệm 4: Tìm giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng của phương pháp

3.4.4. Thí nghiệm trên một số mẫu thật ở công ty Intertek Việt Nam





3.5.

TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

3.5.1. Tối ưu hóa hệ thống UPLC-MS/MS [5, 11]

Khảo sát một số điều kiện chạy máy UPLC-MS/MS đượ c công bố trênmột số bài báo uy tín, k ết hợp điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm để chọncác thông số tối ưu cho hệ thống.

Điều kiện hệ thống UPLC-MS 1:

Cột ACQUITY UPLC C18, 100 mm x 2,1 mm, 1,7 µm.Pha động A: 0.1% formic acid in waterPha động B: 0.1% formic acid in acetonitrile

Bảng 3.1. Thành phần và tỉ lệ pha động

Thờ i gian (phút)Tốc độ dòng

(mL/phút)

Phần trăm

A

Phần trăm

BBắt đầu 0,4 85 152,5 0,4 60 403,9 0,4 5 954,9 0,4 5 95

5 0,4 85 157 0,4 85 15

Thể tích tiêm: 7 L.

Nhiệt độ cột: 30oC.

Bảng 3.2. Một số thông số cài đặt cho MS

Source ESI+

Capillary (kV) 2,8

Cone Gas Flow (L/Hr) 30

Extractor (V) 3

Source temperature (oC) 150

Desolvation Gas Flow (L/hr) 1000

Collistion Gas Flow (mL/min) 0.15





Điều kiện hệ thống UPLC - MS 2:Pha động A: MeOH

Pha động B: H2O 0,1% FABảng 3.3. Thành phần và tỉ lệ pha động

Thờ i gian (phút)Tốc độ dòng

(mL/phút)Phần trăm

APhần trăm

BBắt đầu 0,3 60 40

1 0,3 5 953 0,3 5 956 0,3 60 409 0,3 60 40




Source ESI+

Ion spray Voltage (V) 5500

Source temperature (oC) 450

Collision Gas 7Ion Sour Gas 1 45

Ion Sour Gas 2 60

Bảng 3.5. Điều kiện phân mảnh ion

ComponentPrecursorion (m/z)

Product ion(m/z)

CollisionEnergy

(eV)

TC 445,3445,3

428410

715

OTC461,2461,2

426,2444,4

1515

CTC479,2479,2

462,3444,3

1510

DC 445,2410,2339,2

1515





3.5.2.

Tối ưu hóa quy trình chiết [5, 10]

3.5.2.1. Chiết lỏng-lỏng

Hai quy trình chiết lỏng-lỏng tetracyclines được đề nghị như sau:

Quy trình 1

Hình 3.3. Quy trình thứ nhất chiết tách tetracyclines

Thêm 4 mL đệm McIlvaine-EDTA (pH=4) vào mẫu

Vortex 1 phút, đánh siêu âm 5 phút

Chiết lần 2 vớ i 4 mL đệm McIlvaine-EDTA

Chuyển vào ống ly tâm 15 mL

Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 5 phút, ở 40C

Phần dung dịch Phần r ắn





Quy trình 2

Hình 3.4. Quy trình thứ hai chiết tách tetracyclines

Tiến hành khảo sát hai quy trình trên, so sánh về độ thu hồi, thờ i gianthực hiện, hiệu quả kinh tế để chọn ra quy trình tối ưu.

8 mL hexane + 8 mL đệm Mcllvaine-EDTA vào mẫu

Loại bỏ lớ p hexane, dịch chiết đệm giữ lại tiế p tục phân tích

Lấy lớ p dung dịch đệm phía dướ i + 10 mL hexane, vortex 1 phút

Vortex 1 phút, lắc 20 phút, đánh siêu âm 10 phút

Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 3 phút





3.5.2.2.

Chiết pha rắn (SPE)

Khảo sát hai quá trình làm sạch mẫu bằng cột chiết pha r ắn C18 (Agilent500 mg/6 mL) như sau:

Quy trình 1

Hình 3.5. Quy trình thứ nhất chiết pha r ắn

Quy trình 2

Hình 3.6. Quy trình thứ hai chiết pha r ắn

Tiến hành khảo sát 2 quy trình trên so sánh khả năng làm sạch mẫu dựa

trên độ thu hồi, độ nhạy, thời gian phân tích cũng như hiệu quả kinh tế củamỗi quy trình. Từ đó chọn ra quy trình tối ưu.

Hoạt hóa cột bằng 5 mL MeOH: 5 mL H2O

Giải ly bằng 5 mL Ethyl Acetate

R ửa mẫu trên cột vớ i 5 mL H2O

Cho mẫu qua cột vớ i tốc độ khoảng 1 mL/phút

Hoạt hóa cột bằng 5 mL MeOH: 5 mL H2O

Giải ly bằng 5 mL Oxalic acid 5 mM trong MeOH







3.5.3.

Thẩm định quy trình phân tích

3.5.3.1. Thí nghiệm về độ tuyến tính

a. Mục đích, yêu cầu

Khảo sát tính tuyến tính của quy trình ở các nồng độ 10 ppb, 20 ppb, 50 ppb, 80 ppb, 100 ppb vớ i nồng độ nội chuẩn là 25 ppb.

Xác định phương trình hồi quy y = ax + b, hệ số tương quan r giữa nồngđộ chuẩn/nồng độ nội chuẩn và diện tích peak chuẩn/diện tích peak nội chuẩn.

Yêu cầu: r 2 > 0,99.

b. Tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử

Xay nhuyễn ít nhất 200 g mẫu, bảo quản trong bao PE trong tủ đông chotớ i khi phân tích.

Cân 20,05 g mẫu đã đượ c xay vào ống ly tâm nhựa 50 mL.

Dựng đườ ng chuẩn

Tiến hành thêm vào mẫu thử các chất chuẩn và nội chuẩn vớ i thể tích vànồng độ tương ứng đượ c thể hiện qua Bảng 3.4.

Bảng 3.6. Thể tích, nồng độ chất chuẩn và nội chuẩn ở mỗi điểm của

đườ ng chuẩn

Kí hiệu mẫuThể tích ( L) Nồng độ trong mẫu (ppm)

TCs 1 ppm TCs IS 1 ppm TCs TCs IS

S1 20 50 10 25

S2 40 50 20 25

S3 100 50 50 25

S4 160 50 80 25

S5 200 50 100 25

Khi thêm chuẩn và nội chuẩn xong, mẫu được để yên 15 phút.

Tiến hành quy trình chiết lỏng-lỏng (quy trình 1). Sau đó làm sạch mẫuvớ i quy trình chiết pha r ắn.

Làm khô dịch chiết bằng khí N2 trong bể thổi khí.

Hòa tan cặn khô bằng 1 mL dung dịch acid oxalic 5 mM. Vortex 30 giây.





Lọc qua màng lọc 0,22 m vào vial và đem phân tích bằng máy LC-MS/MS.

3.5.3.2.

Thí nghiệm về độ đúng

a.

Mục đích, yêu cầuXác định độ đúng của phương pháp thông qua việc so sánh giá tr ị tìm

đượ c và giá tr ị thực ở nồng độ 10 ppb, 20 ppb, 100 ppb.

Tiến hành phân tích mỗi nồng độ 10 mẫu. Độ thu hồi mỗi mẫu phải nằmtrong khoảng từ 80-110%.

b. Bố trí thí nghiệm

Cân 20,05 g mẫu đã đượ c xay vào ống ly tâm nhựa 50 mL. Thêm vào

mẫu 50 µL dung dịch nội chuẩn Demeclocycline (DMCLC) 1 ppm, 20 µLdung dịch chuẩn tetracyclines 1 ppm (tương ứng 10 ppb). Để yên 15 phút.

Tiến hành chiết lỏng-lỏng như quy trình 1, làm sạch bằng chiết pha r ắn.




Tiế p tục khảo sát ở các nồng độ 20 ppb (40 µL chuẩn tetracyclines 1 ppm), 100ppb (200 µL chuẩn tetracyclines 1 ppm).

3.5.3.3. Thí nghiệm về độ chính xác

a. Mục đích, yêu cầu

Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của quá trình định lượ ng ở cácnồng độ 10 ppb, 20 ppb, 100 ppb. RSD càng nhỏ, phương pháp càng chínhxác.

Theo Commision Decision 2002/657/EC của Cộng đồng Châu Âu (EC),RSD 10%.





b.

Tiến hành

Cân 20,05 g mẫu đã đượ c xay vào ống ly tâm nhựa 50 mL. Thêm vàomẫu 50 µL dung dịch nội chuẩn Demeclocycline (DMCLC) 1 ppm, 20 µLdung dịch chuẩn tetracyclines 1 ppm. Để yên 15 phút.

Tiến hành chiết lỏng – lỏng như quy trình 1, làm sạch bằng chiết pha r ắn.




Tiế p tục khảo sát ở các nồng độ 20 ppb (40 µL chuẩn tetracyclines 1 ppm), 100ppb (200 µL chuẩn tetracyclines 1 ppm), từ đó xác định độ lệchchuẩn tương đối RSD ở mỗi nồng độ.

3.5.3.4. Giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

a. Mục đích

Xác định các giá tr ị (LOD) và (LOQ) đối vớ i mỗi chất nhómtetracyclines khi sử dụng phương pháp phân tích trên.

b. Cách xác định

Tính độ lệch chuẩn (SD) giữa nồng độ thêm vào và nồng độ phục hồi ở các ở các nồng độ 10 ppb, 20 ppb, 50 ppb, 80 ppb, 100 ppm. Mỗi nồng độ lặ plại 10 lần.

Tính hệ số dốc a biểu thị độ tuyến tính giữa nồng độ thêm vào và nồngđộ phục hồi ở các mức nồng độ trên.

Từ SD, a ta tính đượ c giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng.

3.5.4. Tiến hành phân tích trên một số mẫu thật ở công ty Intertek

Áp dụng quy trình đã thẩm định, tiến hành phân tích trên 30 mẫu thủysản đượ c chọn ngẫu nhiên tại công ty Intertek Việt Nam.

K ết quả phân tích được đánh giá bằng cách so sánh vớ i tiêu chuẩn657/2002/EC của Cộng đồng châu Âu (Dư lượ ng tối đa mỗi chất nhómtetracyclines không vượ t quá 100 ppb).

Quy trình chung phân tích 30 mẫu thủy sản đượ c tiến hành như Hình 3.7.





Hình 3.7. Quy trình phân tích tetracyclines

Cân 2±0,05 g mẫu xay nhuyễn

Thêm 50 µL nội chuẩn 1 ppm, vortex, đợ i 10 phút


Vortex 1 phút, đánh siêu âm 5 phút


Phần dung dịch Phần r ắn


Chuyển vào ống ly tâm 15 mLHoạt hóa 5 mL MeOH: 5 mL H2O



Giải ly bằng 5 mL Ethyl Acetate (EtOAc)

Lấ 2 mL EtOAc, thổi khô bằn khí N2

Định mức 1 mL acid Oxalic 5 mM

Lọc qua màng lọc 0,22 µm, cho vào vial, vortex. Phân tích LC-MS/MS





Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. TỐI ƯU HÓA HỆ THỐNG UPLC-MS/MS

4.1.1. Tối ưu hóa điều kiện chạy máy UPLCSau quá trình khảo sát đã chọn được điều kiện tối ưu cho hệ thống

UPLC-MS/MS như sau:

Cột ACQUITY UPLC C18, 100 mm x 2,1 mm, 1,7 µm.Pha động A: AcetonitrilePha động B: H2O 0,1% FA

Bảng 4.1. Thành phần và tỉ lệ pha động

Thờ i gian (phút)

Tốc độ dòng

(mL/phút)

Phần trăm

A

Phần trăm

BBắt đầu 0,2 10 90

0,6 0,2 10 901,5 0,2 20 802,5 0,2 50 50

3 0,2 99 13,5 0,2 10 90

4 0,2 10 90



Thứ tự tiêm mẫu như sau:

Mẫu chuẩn để xây dựng đườ ng chuẩn

Mẫu tr ắng

Mẫu thử

Mẫu kiểm soát.





4.1.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ

Các thông số cài đặt cho MS đượ c tóm tắt trong Bảng 4.2.


Source ESI+Capillary (kV) 0.5Cone (V) 26Extractor (V) 3Source temperature (oC) 150Desolvation Gas Flow (L/hr) 800Collistion Gas Flow (mL/min) 0.14LM 1 Resolution 2,8HM 1 Resolution 14,8Ion Energy 1 0,6LM 2 Resolution 2,8HM 2 Resolution 14,8Ion Energy 2 0,9Multiplier (V) 509,16

Bảng 4.3. Điều kiện phân mảnh ion

ComponentPrecursor

ion (m/z)

Product ion

(m/z)

Dwell

time (s)

Fragmentor

(V)

CollisionEnergy

(eV)TC

445445

428410

0.20.2

100100

715

OTC461461

426444

0.20.2

100100

187

CTC479479

461.8444

0.20.2

100100

715

IS 465448430

0.2 1001020





4.2.

TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT

4.2.1. Quy trình chiết lỏng-lỏng

Hai quy trình chiết lỏng-lỏng đượ c lựa chọn để thử nghiệm như sau:

Quy trình 1

Hình 4.1. Quy trình thứ nhất chiết tách tetracyclines

Quy trình 2

Hình 4.2. Quy trình thứ hai chiết tách tetracyclines


Vortex 1 hút đánh siêu âm 5 hút

8 mL hexane + 8 mL đệm Mcllvaine-EDTA vào mẫu


Chuyển vào ống ly tâm 15 mL


Loại bỏ lớ p hexane, dịch chiết đệm giữ lại tiế p tục phân tích

Lấy lớ p dung dịch đệm phía dướ i + 10 mL hexane, vortex 1 phút

Phần dun dịch Phần r ắn

Vortex 1 phút, lắc 20 phút, đánh siêu âm 10 phút

Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 3 phút





Nhận xét:

Vớ i quy trình thứ nhất: Chỉ sử dụng đệm McIlvaine-EDTA (pH=4)

để loại protein đồng thờ i chiết hiệu quả tetracyclines, tổng thờ igian thực hiện chiết khoảng 25 phút/mẫu.

Vớ i quy trình thứ hai: Sử dụng đệm McIlvaine-EDTA (pH=4) để loại protein, chiết tetracyclines đồng thờ i sử dụng hexane để loại

béo. Tổng thờ i gian thực hiện chiết khoảng 35 phút/mẫu.

Quy trình thứ hai chiết vớ i 2 loại dung môi (tốn chi phí) đồng thờ ithờ i gian chiết (35 phút/mẫu) lâu hơn quy trình 1 (25 phút/mẫu) trongkhi hiệu quả chiết tương đương nhau. Đồng thờ i quy trình chiết thứ nhất không cần phải loại béo vì sau khi chiết lỏng-lỏng, mẫu có thể đượ c loại béo trong quá trình chiết pha r ắn. Do đó, chọn quy trình 1

chiết tetracyclines.4.2.2. Quy trình chiết pha rắn (Cột SPE C18)

Sau quá trình khảo sát, quy trình r ửa giải vớ i etyl acetate đượ c lựa chọnvới độ thu hồi, độ nhạy tốt hơn. Thêm vào đó, etyl acetae dễ bay hơi nên quátrình thổi khô mẫu bằng khí N2 nhanh hơn so vớ i r ửa giải bằng Oxalic acid.

Hình 4.3. Quy trình chiết pha r ắn đượ c lựa chọn

Hoạt hóa cột bằn 5 mL MeOH: 5 mL H2O

Giải ly bằng 5 mL Ethyl Acetate







4.3.

K ẾT QUẢ THẨM ĐỊNH

4.3.1. Độ tuyến tính

Trong khoảng nồng độ từ 10-100 ppb, phương trình hồi quy của các chấtOTC, TC, CTC, DOXY có độ tuyến tính cao vớ i hệ số r 2 > 0,99.

Bảng 4.4. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của các chất

Chất Phương trình hồi quy r2

Oxytetracycline y = 19,521x – 3,7044 0,9936

Tetracycline y = 25,977x – 7,155 0,9975

Chlortetracycline y = 1,8506x – 0,0736 0,9986

Doxycycline y = 7,07x – 0,8344 0,9987

4.3.2. Độ đúng

Độ thu hồi của các tetracyclines ở các nồng độ 10 ppb, 20 ppb, 100 ppbđượ c thể hiện qua Hình 4.4.

Hình 4.4. Độ thu hồi của OTC, TC, CTC, DOXY

Nhận xét: Độ thu hồi của các chất OTC, TC, CTC, D OXY ở các nồng độ

10 ppb, 20 ppb, 100 ppb đạt từ 90,4-100,69% Phương pháp có độ đúngcao (Theo EC độ thu hồi đạt trong khoảng từ 80-110%).

90.5

93.3 99.1 100.1

96.85 98.3

90.47

95.05100.69 99.42 99.31 99.72

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

OTC TC CTC DOXY

%

Chất

Độ thu hồi

10 20 100





4.3.3.

Độ chính xác

Độ chính xác của OTC, TC, CTC, DOXY ở các nồng độ 10 ppb, 20 ppb,100 ppb đượ c thể hiện qua Hình 4.5.

Hình 4.5. Độ lệch chuẩn tương đối của OTC, TC, CTC, DOXY ở 10 ppb,20 ppb, 100 ppb

Nhận xét: Với độ lệch chuẩn tương đối của OTC, TC, CTC, DOXY ở

các nồng độ nằm trong khoảng từ 2,36-10,49% phương pháp phân

tích có độ chính xác cao. Ở nồng độ 100 ppb có độ chính xác cao nhấtvớ i RSD có giá tr ị nhỏ hơn 4%.

4.3.4. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng

Bảng 4.5. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng của OTC, TC, CTC,DOXY

OTC TC CTC DOXY

Độ lệch chuẩnSD (ppb)

2,1599 2,2983 2,2439 2,7156

Hệ số dốc a 1,0184 1,0044 1,0045 1,0102

LOD (ppb) 7,00 7,55 7,37 8,87

LOQ (ppb) 23,10 24,92 24,32 29,27

Nhận xét: Phương pháp có giớ i hạn phát hiện các chất thấ p nằm trong

khoảng từ 7-8,87 ppb và giớ i hạn định lượ ng từ 23,1-29,27 ppb.

7.49

8.61

5.33

10.47

6.71

8.357.89

10.49

3.72

2.63 2.36 2.6

0

2

4

6

8

10

12

OTC TC CTC DOXY

RSD (%)

10 ppb 20 ppb 100 ppb





4.4.

K ẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THỦY SẢN TẠI CÔNGTY INTETRTEK

Qua quá trình phân tích trên 30 mẫu thủy sản, chỉ phát hiện 5 mẫu phântích (chiếm 16,67%) nhiễm tetracyclines nhưng trong mức cho phép theo tiêu

chuẩn 657/2002/EC là 39208, 39212, 39238 (mẫu tôm); 39362, 39365 (mẫucá).

Bảng 4.6. K ết quả phân tích nồng độ các tetracyclines trên các mẫu

Mẫu

Tôm nguyên liệu

Mẫu

Cá tra nguyên liệu

Hàm lượ ng phân tích (ppb) Hàm lượ ng phân tích (ppb)

OTC TC CTC DOXY OTC TC CTC DOXY

39206 0 0 0 0 39362 48,04 59,51 55,04 64,75

39208 17,20 0 0 0 39365 31,64 0 0 0

39210 0 0 0 0 38877 0 0 0 0

39212 13,38 0 0 18,89 39410 0 0 0 0

39240 0 0 0 0 39411 0 0 0 0

39246 0 0 0 0 39412 0 0 0 0

39254 0 0 0 0 39413 0 0 0 0

39234 0 0 0 0 39414 0 0 0 0

39236 0 0 0 0 39415 0 0 0 0

39242 0 0 0 0 39416 0 0 0 0

39244 0 0 0 0 39417 0 0 0 0

39248 0 0 0 0 39418 0 0 0 0

39238 0 0 0 4,27 39430 0 0 0 0

39252 0 0 0 0 39431 0 0 0 0

39256 0 0 0 0 39432 0 0 0 0





Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. K ẾT LUẬN

Qua quá trình khảo sát quy trình định lượ ng 4 chất nhóm tetracyclines bằng phương pháp UPLC-MS/MS, luận văn đã đạt đượ c các k ết quả như sau:

Lựa chọn đượ c điều kiện chạy hệ thống UPLC-MS/MS tối ưu cho

tetracyclines.

Tối ưu hóa quy trình chiết tetracyclines với đệm EDTA-McIlvaine

pH = 4 đồng thờ i làm sạch mẫu bằng cột chiết pha r ắn vớ i dung môigiải ly ethyl acetate.

Thẩm định quy trình phân tích bằng UPLC-MS/MS cho thấy độ

đúng, độ chính xác cao, giá tr ị LOD, LOQ thấ p. Các giá tr ị đượ c thể hiện cụ thể qua Bảng 5.1.

Bảng 5.1. K ết quả quy trình phân tích tetracyclines

OTC TC CTC DOXY

10ppb

20ppb

100ppb

10ppb

20ppb

100ppb

10ppb

20ppb

100ppb

10ppb

20ppb

100ppb

Độ tuyến tính(R 2)

0,9936 0,9975 0,9986 0,9987

Độ đúng (%) 90,5 96,85 100,69 93,3 98,3 99,42 99,1 90,47 99,31 100,1 95,05 99,72

Độ chính xác(RSD, %)

7,49 6,71 3,72 8,61 8,35 2,63 5,33 7,89 2,36 10,47 10,49 2,6

LOD (ppb) 7,00 7,55 7,37 8,87

LOQ (ppb) 23,10 24,92 24,32 29,27

K ết quả phân tích trên 30 mẫu thủy sản đượ c chọn ngẫu nhiên ở côngty Intertek Việt Nam – Chi nhánh Cần Thơ cho thấy các mẫu hầu hết

không nhiễm tetracyclines, chỉ có 5 mẫu (chiếm 16,67%) nhiễmtetracyclines trong nhưng trong mức cho phép so vớ i tiêu chuẩn657/2002/EC của Cộng đồng châu Âu.





5.2. KIẾN NGHỊ

Nếu có thêm thời gian và điều kiện vật chất, luận văn sẽ mở r ộng nghiêncứu:

Chiết pha r ắn:

o Khảo sát quy trình làm sạch, làm giàu mẫu vớ i cột Oasis HLB

o Khảo sát một số chất r ửa giải cột như Oxalic acid 10 mM trong

MeOH, MeOH, Acetonitrile…

Thử nghiệm so sánh quy trình định lượ ng bằng HPLC-UV/Vis và LC-MS/MS.

Mở r ộng định lượ ng thêm một số chất khác nhóm tetracyclines nhưMethacycline, Minocycline.






PHỤ LỤC A: BẢNG

Phụ lục A.1. Thông tin hóa chất pha chuẩn gốc

Phụ lục A.2. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Oxytetracycline

MẫuNồng độ

chuẩn(Cs, ppb)

Nồng độ nội chuẩn(CIS, ppb)

Diện tíchpeak chuẩn

(SS)

Diện tíchpeak nộichuẩn

(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 1522,4 1896,4 0,4 0,8028

S2 20 25 2903,7 2003,9 0,8 1,4490

S3 50 25 6558 1782,4 2,0 3,6793

S4 80 25 10286,7 1723,8 3,2 5,9675

S5 100 25 13271,5 1824,5 4,0 7,2740

Tên hóa chấtDanh pháp

CASCông thức phân tử

M(g/mol)

M(g/mol)

tinh

khiết

Độ tinhkhiết

(%)

Môi trườ ng

Dung môi pha chuẩn

Nhiệtđộ

(0C)

Độ ẩm

(%)Oxytetracyclinehydrochloride

2058-46-0 C22H24 N2O9.HCl 496,9 460,434 97,5

25 76 MeOH

Tetracycline

hydrochloride

64-75-5 C22H24 N2O8.HCl 480,9 444,435 98

Chlortetracycline

hydrochloride

64-72-2 C22H23ClN2O8.HCl 515,3 478,88 93

Doxycyclinehyclate

24390-14-5 C22H24ClN2O8.

HCl.1

2C2H6O.

1

2H2O

512,9 444,43 98,7

Demeclocyclinehydrochloride

64-73-3 C21H21ClN2O8.HCl 501,31 464,81 98,5


WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



Phụ lục A.3. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Tetracycline

MẫuNồng độ chuẩn

(Cs, ppb)

Nồng độ nội chuẩn

(CIS, ppb)


(SS)

Diện tíchpeak nội

chuẩn

(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 1449,3 1896,4 0,4 0,7642

S2 20 25 3351 2003,9 0,8 1,6722

S3 50 25 7926 1782,4 2,0 4,4468

S4 80 25 13022,2 1723,8 3,2 7,5544

S5 100 25 17677,7 1824,5 4,0 9,6891

Phụ lục A.4. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Chlortetracycline


(Cs, ppb)



(SS)

Diện tích peaknội chuẩn

(SIS)CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 1358,8 1896,4 0,4 0,7165

S2 20 25 2929,7 2003,9 0,8 1,462

S3 50 25 6178,7 1782,4 2,0 3,4665

S4 80 25 10008,6 1723,8 3,2 5,8061

S5 100 25 13550,9 1824,5 4,0 7,4272

Phụ lục A.5. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Doxycycline


(Cs, ppb)



(SS)


chuẩn(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 4167,2 1896,4 0,4 2,1974

S2 20 25 9763,1 2003,9 0,8 4,8720

S3 50 25 22624,3 1782,4 2,0 12,6932

S4 80 25 38271,3 1723,8 3,2 22,2017

S5 100 25 49976,2 1824,5 4,0 27,3917





Phụ lục A.6. Độ thu hồi của Oxytetracycline ở 10 ppb

OXYTETRACYCLINE

Ngày Nồng độ thêm vào (ppb) Nồng độ thu hồi (ppb)Phần trăm thu hồi

R (%)

1 10 8,46 84,62 10 9,14 91,4

3 10 8,17 81,7

4 10 9,44 94,4

5 10 8,91 89,1

6 10 8,86 88,6

7 10 8,43 84,3

8 10 10,5 105

9 10 8,98 89,8

10 10 9,6 96

TB 9,05 90,5

Phụ lục A.7. Độ thồi của Oxytetracycline ở 20 ppb

OXYTETRACYCLINE


R (%)1 20 18,74 93,7

2 20 19,04 95,2

3 20 19,79 98,95

4 20 21,57 107,855 20 19,13 95,65

6 20 21,36 106,8

7 20 19,05 95,25

8 20 18,45 92,25

9 20 17,37 86,8510 20 19,22 96,1

TB 19,37 96,85





Phụ lục A.8. Độ thu hồi của Oxytetracycline ở 100 ppb

OXYTETRACYCLINE

Ngày Nồng độ thêm vào (ppb) Nồng độ thu hồi (ppb) Phần trăm thu hồiR (%)

1 100 94,75 94,75

2 100 100,14 100,14

3 100 99,47 99,47

4 100 98,08 98,08

5 100 98,48 98,48

6 100 99,92 99,92

7 100 102,42 102,42

8 100 100,15 100,15

9 100 106,04 106,04

10 100 107,42 107,42

TB 100,69 100,69

Phụ lục A.9. Độ thu hồi của Tetracycline ở 10 ppb

TETRACYCLINE


R (%)1 10 8,41 84,1

2 10 9,11 91,1

3 10 9,14 91,4

4 10 8,42 84,2

5 10 10,99 109,9

6 10 8,62 86,2

7 10 9,42 94,2

8 10 9,31 93,1

9 10 9,81 98,1

10 10 10,07 100,7

TB 9,33 93,3






TETRACYCLINE


R (%)

1 20 18,81 94,052 20 20,66 103,3

3 20 19,22 96,1

4 20 20,3 101,5

5 20 20,67 103,35

6 20 15,7 78,5

7 20 19,18 95,9

8 20 21,73 108,65

9 20 19,85 99,25

10 20 20,49 102,45

TB 19,66 98,3


TETRACYCLINE


R (%)1 100 97,25 97,25

2 100 99,61 99,61

3 100 99,62 99,62

4 100 99,25 99,25

5 100 98,44 98,44

6 100 96,8 96,8

7 100 101,05 101,05

8 100 99,39 99,39

9 100 105,78 105,78

10 100 97,01 97,01

TB 99,42 99,42





Phụ lục A.12. Độ thu hồi của Chlortetracycline ở 10 ppb

CHLORTETRACYCLINE


R (%)1 10 10,67 106,7

2 10 10,1 101

3 10 10,27 102,7

4 10 9,76 97,6

5 10 8,84 88,4

6 10 9,89 98,9

7 10 9,9 99

8 10 9,74 97,4

9 10 9,44 94,4

10 10 10,5 105

TB 9,91 99,1


CHLORTETRACYCLINE


R (%)

1 20 20,28 101,42 20 20,03 100,15

3 20 19,28 96,4

4 20 17,67 88,35

5 20 18,69 93,45

6 20 16,42 82,1

7 20 18,43 92,15

8 20 21,72 108,6

9 20 18,77 93,85

10 20 17,98 89,9

TB 18,93 90,47






CHLORTETRACYCLINE


R (%)1 100 94,14 94,14

2 100 98,93 98,93

3 100 99,51 99,51

4 100 97,28 97,28

5 100 101,66 101,66

6 100 100,32 100,32

7 100 100,17 100,17

8 100 98,15 98,15

9 100 101,91 101,91

10 100 101,03 101,03

TB 99,31 99,31

Phụ lục A.15. Độ thu hồi của Doxycycline ở 10 ppb

DOXYCYCLINE


R (%)

1 10 8,85 88,52 10 10,86 108,6

3 10 10,58 105,8

4 10 10,67 106,7

5 10 10,74 107,4

6 10 8,88 88,8

7 10 10,99 109,9

8 10 10,9 109

9 10 9,38 93,8

10 10 8,25 82,5

TB 10,01 100,1






DOXYCYCLINE


R (%)1 20 16,61 83,05

2 20 21,06 105,3

3 20 20,63 103,15

4 20 19,83 99,15

5 20 21,59 107,95

6 20 15,98 79,9

7 20 18,84 94,2

8 20 20,43 102,15

9 20 18,13 90,65

10 20 17,04 85,2

TB 19,01 95,05


DOXYCYCLINE


R (%)

1 100 95,73 95,732 100 99,68 99,68

3 100 101,1 101,1

4 100 100,7 100,7

5 100 96,08 96,08

6 100 104,02 104,02

7 100 99,39 99,39

8 100 98,73 98,73

9 100 99,13 99,13

10 100 102,66 102,66

TB 99,72 99,72





Phụ lục A.18. Độ chính xác của Oxytetracycline

Phụ lục A.19. Độ chính xác của Tetracycline

Ngày S1 (10 ppb) S2 (20 ppb) S5 (100 ppb)

1 8,41 18,81 97,25

2 9,11 20,66 99,61

3 9,14 19,22 99,62

4 8,42 20,3 99,25

5 10,99 20,67 98,446 8,62 15,7 96,8

7 9,42 19,18 101,05

8 9,31 21,73 99,39

9 9,81 19,85 105,78

10 10,07 20,49 97,01

TB 9,33 19,66 99,42

SD 0,80 1,64 2,62

RSD8,61 8,35 2,63

Ngày S1 (10 ppb) S2 (20 ppb) S5 (100 ppb)1 8,46 18,38 94,75

2 9,14 19,94 100,143 8,17 21,13 99,47

4 9,44 19 98,08

5 8,91 20,2 98,48

6 8,86 20,52 99,92

7 8,43 18,06 102,42

8 10,5 20,65 100,15

9 8,98 17,04 106,04

10 9,6 19,62 107,42

TB 9,05 19,45 100,69

SD 0,68 1,30 3,75

RSD 7,49 6,71 3,72





Phụ lục A.20. Độ chính xác của Chlortetracycline


2 10,1 20,03 98,93

3 10,27 19,28 99,514 9,76 17,67 97,28

5 8,84 18,69 101,66

6 9,89 16,42 100,32

7 9,9 18,43 100,17

8 9,74 21,72 98,15

9 9,44 18,77 101,91

10 10,5 17,98 101,03

TB 9,91 18,93 99,31

SD 0,53 1,49 2,34

RSD 5,33 7,89 2,36

Phụ lục A.21. Độ chính xác của Doxycycline


17 10,86 21,06 99,68

18 10,58 20,63 101,1

18 10,67 19,83 100,7

19 10,74 21,59 96,08

19 8,88 15,98 104,02

20 10,99 18,84 99,39

21 10,9 20,43 98,73

23 9,38 18,13 99,13

28 8,25 17,04 102,66

TB 10,01 19,01 99,72

SD 1,05 1,99 2,60

RSD 10,47 10,49 2,6





Phụ lục A.22. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Oxytetracycline

Mẫu

Nồng độ

chuẩn(Cs, ppb)

Nồng độ

nội chuẩn(CIS, ppb)

Diện tíchpeak

chuẩn(SS)


chuẩn(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 1522,4 1896,4 0,4 0,8028

S2 20 25 2903,7 2003,9 0,8 1,4490

S3 50 25 6558 1782,4 2,0 3,6793

S4 80 25 10286,7 1723,8 3,2 5,9675

S5 100 25 13271,5 1824,5 4,0 7,2740

Phụ lục A.23. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Tetracycline

MẫuNồng độ

chuẩn(Cs, ppb)


Diện tíchpeak

chuẩn(SS)


chuẩn(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 1449,3 1896,4 0,4 0,7642

S2 20 25 3351 2003,9 0,8 1,6722

S3 50 25 7926 1782,4 2,0 4,4468

S4 80 25 13022,2 1723,8 3,2 7,5544

S5 100 25 17677,7 1824,5 4,0 9,6891





Phụ lục A.24. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Chlortetracycline


(Cs, ppb)

Nồng độ

nội chuẩn(CIS, ppb)

Diện tích

peak chuẩn(SS)


chuẩn(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 1358,8 1896,4 0,4 0,7165

S2 20 25 2929,7 2003,9 0,8 1,462

S3 50 25 6178,7 1782,4 2,0 3,4665

S4 80 25 10008,6 1723,8 3,2 5,8061

S5 100 25 13550,9 1824,5 4,0 7,4272

Phụ lục A.25. K ết quả phép xác định độ tuyến tính của Doxycycline

MẫuNồng độ

chuẩn(Cs, ppb)


Diện tíchpeak

chuẩn(SS)


chuẩn(SIS)

CS/CIS SS/SIS

S1 10 25 4167,2 1896,4 0,4 2,1974

S2 20 25 9763,1 2003,9 0,8 4,8720

S3 50 25 22624,3 1782,4 2,0 12,6932S4 80 25 38271,3 1723,8 3,2 22,2017

S5 100 25 49976,2 1824,5 4,0 27,3917





PHỤ LỤC B: HÌNH

Phụ lục B.1. Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính của Oxytetracycline

Phụ lục B.2. Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính của Tetracycline

y = 19.521x - 3.7044

R² = 0.9936

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

S s

/ S

I S

CS/CIS

Oxytetracycline

y = 25.977x - 7.155

R² = 0.9975

0

20

40

60

80

100

120

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

S S

/ S

I S

CS/CIS

Tetracycline





Phụ lục B.3. Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính của Chlortetracycline

Phụ lục B.4. Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính của Doxycycline

y = 1.8506x - 0.0736

R² = 0.9987

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

S S

/ S

I S

CS/CIS

Chlortetracycline

y = 7.07x - 0.8344

R² = 0.9987

0

5

10

15

20

25

30

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

S S

/ S

I S

CS/CIS

Doxycycline





Phụ lục B.5. Đồ thị sự phụ thuộc giữa nồng độ thu đượ c và nồng độ spike của

Oxytetracycline


Tetracycline






Chlortetracycline


Doxycycline





PHỤ LỤC C: SẮC KÝ ĐỒ

Phụ lục C.1. Sắc ký đồ mẫu Blank của TC, DOXY, OTC

Time2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

180914 TCs BLANK-TT F1445.14 > 410.1 (TC)

2.21e31.28

2.56

3.83

180914 TCs BLANK-TT F1445.14 > 154.01 (TC)

1.60e31.02

1.43 2.98

3.333.93

180914 TCs BLANK-TT F1445.1 > 428 (DOXY)

1.51e32.891.01 1.68 3.80

180914 TCs BLANK-TT F1445.1 > 154 (DOXY)

2.34e31.482.37

2.913.243.93

180914 TCs BLANK-TT F1461.1 > 381 (OTC)2.31e3

2.41

1.72 2.76

3.763.62 3.89

180914 TCs BLANK-TT F1461.1 > 426 (OTC)

4.78e3

2.40

2.15

2.44

3.682.97 3.81





Time

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

100

180914 TCs BLANK-TT MRM of 14 Channels ES+479.1 > 444 (CTC)

7.80e3

2.88

2.77

2.71

3.083.39 3.83 3.88

180914 TCs BLANK-TT MRM of 14 Channels ES+479.1 > 154 (CTC)

9.60e3

2.89

2.631.13 2.12

2.93

3.02

180914 TCs BLANK-TT MRM of 14 Channels ES+465.11 > 448 (IS)

1.15e5

2.76

2.63

3.34





Phụ lục C.2. Sắc ký đồ của TC, DOXY, OTC, CTC ở 20 ppb

Time2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

180914 TCs S1-TT F1445.14 > 410.1 (TC)

3.86e52.35

180914 TCs S1-TT F1445.14 > 154.01 (TC)

2.44e5

2.94

180914 TCs S1-TT F1445.1 > 428 (DOXY)

1.91e5

2.65

180914 TCs S1-TT F1445.1 > 154 (DOXY)

2.78e5

2.95

180914 TCs S1-TT F1461.1 > 381 (OTC)

6.80e42.41

2.47

180914 TCs S1-TT F1

461.1 > 426 (OTC)4.62e5

2.41





Time2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

180914 TCs S1-TT F1479.1 > 444 (CTC)

7.49e4

2.76

180914 TCs S1-TT F1479.1 > 154 (CTC)

6.75e4

2.76

2.91

180914 TCs S1-TT F1465.11 > 448 (IS)

2.44e5

2.62





Phụ lục C.3. Sắc ký đồ của TC, DOXY, OTC, CTC ở 100 ppb

Time2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

180914 TCs S5-TT F1445.14 > 410.1 (TC)

3.09e6

2.362.94

180914 TCs S5-TT F1445.14 > 154.01 (TC)

2.04e6

2.95

180914 TCs S5-TT F1445.1 > 428 (DOXY)

1.98e62.66

180914 TCs S5-TT F1445.1 > 154 (DOXY)

2.14e6

2.35 2.95

180914 TCs S5-TT F1461.1 > 381 (OTC)

5.02e5

2.41

180914 TCs S5-TT F1461.1 > 426 (OTC)

3.52e62.41





Time

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

2.00 3.00

%

0

180914 TCs S5-TT F1479.1 > 444 (CTC)

9.60e5

2.77

180914 TCs S5-TT F1479.1 > 154 (CTC)

6.63e5

2.76

180914 TCs S5-TT F1465.11 > 448 (IS)

2.64e5

2.62





PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU GỐC


Documents

Định lượng bốn loại kháng sinh nhóm Tetracylines (TC, OTC, CTC, DOXY) trong thủy sản bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ (UPLC-MSMS)