Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Júlia Barroso do Nascimento
Dinâmica molecular dos flavonoides
Naringin e Naringenin em modelo de
surfactante pulmonar
Trabalho de Conclusão de Curso
Trabalho apresentado como requisito para obtenção do título de Bacharel pelo
Programa de Graduação em Química do Departamento de Química
Orientador: Prof. Dr. André Silva Pimentel
Rio de Janeiro
Dezembro 2018
Departamento de Química
2
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus, por sempre me presentear com excelentes opor-
tunidades quando os planos iniciais não dão certo.
Em seguida, gostaria de agradecer à instituição PUC-Rio pela bolsa concedida, vi-
abilizando meus estudos na instituição.
À minha família, meus pais, Mauro e Katia, e meus irmãos, Ana Carolina e Caio,
por todo o apoio e amor incondicional que me dão desde sempre.
Ao professor André pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório e por me
orientar na vida acadêmica.
Aos colegas de laboratório Lucas, Franccesca, Felipe e, especialmente, Aline, por
toda a ajuda e carinho.
Aos meus amigos, Lorrayne, Matheus, Bruna, Rodrigo, Isabela e Valentina, e ao
meu namorado, Thiago, por toda a torcida para meu sucesso e toda a compreensão
pela minha falta de tempo livre.
Departamento de Química
3
RESUMO
O surfactante pulmonar é uma mistura complexa de fosfolipídios e proteínas pre-
sente nos alvéolos pulmonares com a função de reduzir a tensão superficial da in-
terface ar-água, impedindo que os mesmos colapsem durante a expiração.
As simulações de dinâmica molecular Coarse Grained do modelo de surfactante
Curosurf® interagindo com moléculas de Naringin e Naringenin foram realizadas
com sucesso na temperatura de 298K, não havendo colapso da monocamada no
tempo de simulação de 2μs.
Os modelos Coarse Grained do Naringin e do Naringenin foram parametrizados e
validados comparando os valores de coeficiente de partição calculados com valo-
res preditos presentes na literatura. Os valores encontrados para os coeficientes de
partição do Naringin e do Naringenin foram, respectivamente, -0,46 e 2,56, com
erros relativos aos valores preditos de 14,73% e 1,72%.
As dinâmicas contendo 20 moléculas demonstraram, pelo coeficiente de difusão
lateral e pelo parâmetro de ordem, que uma maior quantidade de flavonoides im-
plica numa maior organização do filme. O estudo de distribuição de densidade in-
dica que o Naringin e o Naringenin interagem com as cabeças polares do filme.
Ao final, concluiu-se que o surfactante pulmonar pode ser utilizado como carrea-
dor dos flavonoides. Os resultados deste trabalho podem ser usados para a elabo-
ração de novos tratamentos para doenças pulmonares inflamatórias, como a fi-
brose pulmonar idiopática e a doença pulmonar obstrutiva crônica.
Departamento de Química
4
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Estruturas moleculares dos flavonoides (a) Naringin e (b) Naringenin
Figura 2 – Representação gráfica do mapeamento Coarse Grained do Naringin
Figura 3 - Representação gráfica do mapeamento Coarse Grained do Naringenin
Figura 4 – Sistemas (a) Octanol-água-octanol com o flavonoide Naringin e (b)
Água-octanol-agua com o flavonoide Naringenin na pressão de 1 bar à 298K. As
moléculas de água são representadas em azul, as moléculas de octanol estão em
vermelho e o Naringin e Naringenin em laranja
Figura 5 – Sistema do filme Curosurf® com os flavonoides (a) Naringin e (b) Na-
ringenin na pressão de 1 bar à 298K. As cadeias carbônicas do lipídios estão repre-
sentadas em azul celeste, em rosa, as cabeças polares, em amarelo, a proteína SP-
B, e em cinza, a água.
Figura 6 – Sistema Curosurf®(verde) com vinte moléculas (a)Naringin (azul) e
(b)Naringenin (laranja) na pressão de 1 bar à 298K. As moléculas de água estão
representadas pela cor cinza, e a proteína SP-B está representada em marrom.
Figura 7 – Representação inicial de final do sistema octanol-água-octanol contendo
o flavonoide Naringin(laranja) na pressão de 1 bar à 298K. O octanol e a água estão
representados em rosa e em azul, respectivamente.
Figura 8 – Representação inicial de final do sistema água-octanol-água con-tendo
o flavonoide Naringenin (laranja) na pressão de 1 bar à 298K. O octanol e a água
estão representados em rosa e em azul, respectivamente.
Figura 9 – Energia livre do flavonoide Naringin (kcal mol-1) com a coordenada de
reação (nm) da transferência do octanol para água na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 10 –Energia livre do flavonoide Naringenin (kcal mol-1) com a coordenada
de reação (nm) da transferência da fase aquosa para o octanol na pressão de 1 bar à
298K.
Figura 11 – Histograma de amostragem de transferência do Naringin do octanol
para a água na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 12 - Histograma de amostragem de transferência do Naringenin da água para
o octanol na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 13 – Configurações inicial e final do filme Curosurf® com uma molécula de
Naringin (azul) na tensão superficial de 30 mN m-1 a 298K. As cadeias carbônicas
do lipídio estão representadas em azul celeste, e em rosa, as cabeças polares. A água
está representada pela cor cinza e a SP-B em amarelo.
Figura 14 – Configurações inicial e final do filme Curosurf® com uma molécula de
Naringenin (laranja) na tensão superficial de 30 mN m-1 a 298K. As cadeias carbô-
nicas do lipídio estão representadas em azul celeste, e em rosa, as cabeças polares.
A água está representada pela cor cinza e a SP-B em amarelo.
Departamento de Química
5
Figura 15 – Energia livre do flavonoide Naringin (kcal mol-1) com a coordenada de
reação (nm) da transferência do vácuo para o filme na pressão de 1 bar à 298K
Figura 16 – Energia livre do flavonoide Naringenin (kcal mol-1) com a coordenada
de reação (nm) da transferência do vácuo para o filme na pressão de 1 bar à 298K
Figura 17 – Histograma de amostragem de transferência do Naringin do vácuo para
o filme na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 18 – Histograma de amostragem de transferência do Naringenin do vácuo
para o filme na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 19 – Configurações inicial (a) e final (b) de 20 moléculas do Naringin (azul)
na tensão de 10 mN m-1 a 298K. O modelo do Curosurf® está representado em
verde com o modelo da proteína SP-B em marrom.
Figura 20 – Configurações inicial (a) e final (b) de 20 moléculas do Naringenin
(laranja) na tensão de 10 mN m-1 a 298K. O modelo do Curosurf® está representado
em verde com o modelo da proteína SP-B em marrom.
Figura 21 – O parâmetro de ordem (–Scd) da cauda SN1 do DPPC no surfactante
puro (vermelho) e no sistema com vinte moléculas de Naringin (azul) na tensão
superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Figura 22 – O parâmetro de ordem (–Scd) da cauda SN1 do DPPC no surfactante
puro (vermelho) e no sistema com vinte moléculas de Naringenin (azul) na tensão
superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Figura 23 – Perfil de distribuição de densidade do Naringin (amarelo), das cabeças
polares dos fosfolipídios (azul) e das caudas dos fosfolipídios (vermelho) na tensão
superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Figura 24 – Perfil de distribuição de densidade do Naringenin (amarelo), das cabe-
ças polares dos fosfolipídios (azul) e das caudas dos fosfolipídios (vermelho) na
tensão superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Figura 25 – Número de agregados para o Naringin durante o tempo de simulação
de 2 μs na tensão superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Figura 26 – Histograma do número médio de moléculas por agregado do Naringin
durante o tempo de simulação de 2 μs na tensão superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Departamento de Química
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Quadro comparativo entre os Log P preditos e os calculados para os
flavonoides Naringin e Naringenin na pressão de 1 bar à 298K.
Tabela 2 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do mo-
delo de Curosurf® puro em cm2 s-1 na tensão de 30 mN m-1 a 298K, calculado
para um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utili-
zando o método de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença entre
duas metades do intervalo selecionado.
Tabela 3 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do mo-
delo de Curosurf® com Naringin em cm2 s-1 na tensão de 30 mN m-1 a 298K, cal-
culado para um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados
utilizando o método de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença en-
tre duas metades do intervalo selecionado.
Tabela 4 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do mo-
delo de Curosurf® com Naringenin em cm2 s-1 na tensão de 30 mN m-1 a 298K,
calculado para um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calcula-
dos utilizando o método de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença
entre duas metades do intervalo selecionado.
Tabela 5 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do mo-
delo de Curosurf® puro em cm2 s-1 na tensão de 10 mN m-1 a 298K, calculado
para um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utili-
zando o método de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença entre
duas metades do intervalo selecionado.
Tabela 6 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do mo-
delo de Curosurf® com Naringin em cm2 s-1 na tensão de 10 mN m-1 a 298K, cal-
culado para um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados
utilizando o método de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença en-
tre duas metades do intervalo selecionado.
Tabela 7 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do mo-
delo de Curosurf® com Naringenin em cm2 s-1 na tensão de 10 mN m-1 a 298K,
calculado para um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calcula-
dos utilizando o método de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença
entre duas metades do intervalo selecionado.
Departamento de Química
7
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 8
2. OBJETIVOS ............................................................................................ 10
3. METODOLOGIA .................................................................................... 10
3.1 Resumo ..................................................................................................... 10
3.2 Sistema água-octanol ............................................................................... 11
3.3 Sistema Curosurf® com apenas uma molécula ................................... 13
3.4 Sistema Curosurf® com vinte moléculas .............................................. 15
3.5 Análises .................................................................................................... 15
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................... 17
4.1 Resumo ..................................................................................................... 17
4.2 Sistema água-octanol ............................................................................... 17
4.3 Sistema Curosurf® com apenas uma molécula ................................... 20
4.4 Sistema Curosurf® com vinte moléculas .............................................. 25
Área por molécula ............................................................................... 26
Parâmetro de ordem ............................................................................. 26
Difusão lateral...................................................................................... 27
Distribuição por densidade ................................................................. 28
Cálculo de agregados ........................................................................... 30
5. CONCLUSÕES ........................................................................................ 31
6. PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................. 31
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 32
ANEXO I – Modelos Coarse Grained dos fosfolipídios, da proteína SP-B e
dos flavonoides .............................................................................................. 36
ANEXO II – Gráficos dos parâmetros de ordem dos fosfolipídios do Narin-
gin ................................................................................................................... 37
ANEXO III – Gráficos dos parâmetros de ordem dos fosfolipídios do Na-
ringenin .......................................................................................................... 40
Departamento de Química
8
1. INTRODUÇÃO
Os surfactantes, também conhecidos como tensoativos, são substâncias or-
gânicas que possuem uma porção polar e uma cauda apolar, apresentando
um caráter anfifílico1. Eles possuem uma tendência a se distribuir na inter-
face de líquidos que apresentam diferentes polaridades, afim de diminuir as
tensões superficiais e interfaciais, fazendo com que os surfactantes tenham
aplicações em diversos setores, como a indústria, a agroquímica ou a mine-
ração.
O surfactante pulmonar é um biosurfactante caracterizado como uma mis-
tura complexa de lipídios e proteínas, cuja a função é diminuir a tensão su-
perficial da interface líquido-ar dos alvéolos2, o que facilita a respiração e
impede o colapso dos mesmos. A maior parte de sua composição é lipídica,
cerca de 90% do total, e principalmente formado pela dipalmitoilfosfatidil-
colina (DPPC), correspondente a 40% do total. A parcela proteica é com-
posta por quatro substâncias, duas proteínas hidrofílicas (SP-A e SP-D), que
são removidas no processo de produção do surfactante pulmonar comercial,
e duas proteínas hidrofóbicas (SP-B e SP-C).3,4
Nos pulmões, ele começa a ser produzido por volta da 24a semana de gesta-
ção, e o aumento de produção só se dá próxima a 36a semana gestacional.
Por isto, bebês prematuros podem apresentar doenças respiratórias em fun-
ção da deficiência do surfactante, como a Síndrome do Desconforto do Re-
cém-Nascido (SDR).5 Há cerca de uma década, o uso de surfactante exó-
geno para o tratamento da SDR foi considerado efetivo e seguro 6,7, dimi-
nuindo significativamente o número de mortes de neonatais prematuros 8.
Os surfactantes exógenos podem ser tanto sintéticos quanto naturais, exis-
tindo ambos com diversas composições e sendo diferenciados pela resposta
no tratamento a curto prazo. Os sintéticos conservam as proteínas SP-A e/ou
SP-D e possuem os fosfolipídios em sua composição, enquanto os naturais
são obtidos através de extração em animais, como o porco ou o boi 9.
O surfactante Curosurf ®, comercializado pela Chiesi Farmaceutici, é um
exemplo de surfactante pulmonar de origem natural extraído do pulmão por-
cino, formado majoritariamente por lipídios polares e, com cerca de 1% da
sua composição de proteínas SP-B e SP-C.10 Estudos indicam que bebês
tratados com este surfactante apresentam melhora na oxigenação em menos
tempo quando comparados com os tratados com um surfactante similar de
origem bovina, o Survanta ®.7
Desde a antiguidade, propriedades biológicas presentes em plantas são ex-
ploradas como componentes para tratamentos de doenças, através de chás
ou unguentos 11. Devido à grande biodiversidade de biomassa, a química de
produtos naturais está presente no Brasil desde antes da colonização, sendo
importante para a pesquisa do país até os dias atuais.12
Os flavonoides são compostos polifenólicos que constituem um amplo
grupo com cerca de 4000 moléculas encontradas em plantas. Nestas eles
possuem um papel defensivo, ajudando-as a sobreviver em ambientes ad-
versos, como em geadas ou secas, e atuando principalmente na parede celu-
lar ou membranas. Para os seres humanos, a atratividade dos flavonoides
Departamento de Química
9
advém do amplo espectro de atividade biológica, que apresenta melhorias a
saúde, ou de seus derivados sintéticos, os quais têm potencial terapêutico,
como atividade antioxidante, anticarcinogênica, antiviral, anti-inflamatória
e antimicrobiana, além de serem facilmente absorvidos pelo corpo humano
através da alimentação 13,14. Além disso, eles estão presentes nas cascas de
frutas cítricas nacionais tais como laranja, lima, morcote, ponkan, entre ou-
tras.
Sendo o Brasil um grande produtor de sucos naturais, são gerados diaria-
mente dentro das indústrias um grande volume de resíduos destas frutas,
onde foram quantificados flavonoides relevantes, como Quercetin, Hespe-
ritin, Hesperidin, Naringin e Naringenin, os quais podem ser obtidos com
facilidade e à baixo custo.15
A interação entre esses compostos e bicamadas lipídicas tem sido ampla-
mente investigada e, uma forma de compreender melhor esses sistemas é
utilizando modelos de membranas, as quais são formadas por lipídios que
separam os diferentes componentes celulares do meio extracelular. Mesmo
em organismos simples as membranas presentes têm alta complexidade em
sua composição, devido aos diferentes lipídios, esteróis e proteínas que as
formam. As diferenças entre as cabeças polares e as caudas apolares dos
lipídios alteram propriedades importantes das membranas tais como: tem-
peratura de transição de fase, área por cabeça lipídica, espessura, potencial
transmembrana, entre outras17.
Ainda no século XXI, existem doenças consideradas perigosas e que não
possuem ainda um tratamento adequado, dentre elas, podemos dar desta-
quea duas: a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e a Fibrose Pul-
monar Idiopática (FPI). A DPOC é uma inflamação pulmonar crônica cau-
sada principalmente pelo tabagismo caracterizada pela destruição progres-
siva e irreversível dos brônquios.18 De acordo com estudo realizado por es-
pecialistas da Organização Mundial de Saúde (OMS), projeta-se que a do-
ença pulmonar obstrutiva crônica venha a ser a 3a maior causa de morte no
mundo19.
A Fibrose Pulmonar Idiopática causa cicatrizes no pulmão, endurecendo-o
de modo a reduzir progressivamente sua capacidade de expansão. A FPI
possui um dos piores prognósticos dentre as pulmonares, tendo um paciente
um tempo de vida médio de 2 a 4 anos após seu diagnóstico.20
A dinâmica molecular se apresenta como uma alternativa para simulação de
sistemas biológicos, incluindo membranas lipídicas, como o surfactante pul-
monar, tendo sido estudado tanto através das simulações atomísticas quanto
de simulações Coarse Grained 21, sendo elas extensivamente estudadas pelo
grupo do laboratório nos últimos anos.22,23,24,25.
Enquanto a dinâmica molecular atomística representa de modo explícito
cada átomo, o modelo Coarse Grained agrupa, em média, quatro átomos
pesados para uma representação 21. Neste, um dos campos de força que pode
ser utilizado é o campo de força MARTINI, que é extensivamente utilizado
para pesquisas relacionadas ao surfactante pulmonar 23,24,26,27, pois possui a
vantagem de reduzir o tempo de simulação em sistemas grandes.
Departamento de Química
10
Dentre os flavonoides citados, destacam-se dois de interesse: o Naringin e
o Naringenin. Estas moléculas possuem a estrutura do grupo flavanona,
tendo o Naringin dois grupos glicosídeos como diferença em relação ao Na-
ringenin, como mostrado na figura 1.
(a) (b)
Figura 1 – Estruturas moleculares dos flavonoides (a) Naringin e (b) Naringenin
Ambos se destacam devido ao seu baixo custo de obtenção, suas fortes ati-
vidades antioxidantes e anti-inflamatórias, havendo estudos nos quais se
confirma a capacidade analgésica do Naringenin28 e nos quais o Naringin
apresenta efeitos protetores contra fibrose pulmonar induzida em ratos 20.
2. OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo a caracterização das monocamadas de
Langmuir utilizando simulações por dinâmica molecular Coarse Grained.
O intuito é estudar a interação entre os flavonoides Naringin e Naringenin
com modelos biomiméticos de membrana formados por monocamadas de
modelo de surfactante pulmonar Curosurf ®.
Além disso, verificar-se-á se as propriedades interfaciais do surfactante se-
rão mantidas ao longo de toda a simulação, afim de propor novas alternati-
vas de tratamento para doenças pulmonares.
3. METODOLOGIA
3.1. Resumo
As simulações foram realizadas utilizando o pacote de programas Gromacs
5.0.6 29, com os parâmetros do campo de forças Martini21, para o DPPC,
POPC, POPG, POPE, DPPI, DPPS, LPC, DPSM, proteína SPB, octanol e
água, onde as moléculas dos lipídios são representadas por partículas que
agrupam aproximadamente quatro átomos pesados, obtidos no banco de da-
dos Martini 29,30,31. As estruturas do Naringin e do Naringenin foram geradas
através do programa PyCGTool 32 após um mapeamento, como mostrado
nas figuras 2 e 3, baseando-se nos parâmetros presentes na literatura23.
Departamento de Química
11
Figura 2 – Representação gráfica do mapeamento Coarse Grained do Naringin
Figura 3 – Representação gráfica do mapeamento Coarse Grained do Naringenin
As representações gráficas das moléculas no modelo Coarse Grained po-
dem ser visualizadas no Anexo I.
O modelo de surfactante pulmonar foi construído nas proporções aproxima-
das
DPPC:POPC:POPG:POPE:DPPI:DPPS:LPC:DPSM=40:18:1:5:2:2:5:6,
como descrito na literatura34 com o auxílio do script Insane 30.
O modelo da proteína SP-B foi preparado e parametrizado utilizando a mo-
delagem por homologia realizada por Felipe Rodrigues de Souza23, onde
obteve-se uma estrutura de equilíbrio bastante estável.
As simulações foram feitas em três etapas. A primeira delas consistia em
calcular o coeficiente de partição octanol-água de ambos os flavonoides uti-
lizando o método Umbrella Sampling.34,35,36 Em seguida, realizaram-se di-
nâmicas com a presença do filme de Curosurf®, sendo uma delas feita com
apenas uma molécula de cada flavonoide e outra com vinte moléculas.
O programa VMD foi utilizado para visualizar e obter as imagens dos siste-
mas 37.
3.2. Sistema água-octanol
Um sistema bifásico octanol/água foi preparado, com o auxílio do programa
gmx insert-molecules, em uma caixa retangular, de dimensões 5x5x25 nm,
para o cálculo de energia livre pelo método Umbrella sampling. Os modelos
Coarse Grained da água e do octanol foram obtidos no site Martini31 e seus
parâmetros são padrões para este campo de força.
As estruturas do Naringin e do Naringenin foram inseridas na fase octanol
e na fase água, respectivamente, como mostrado na Figura 4.
Departamento de Química
12
(a) (b)
Figura 4 – Sistemas (a) Octanol-água-octanol com o flavonoide Naringin e (b) Água-oc-
tanol-agua com o flavonoide Naringenin na pressão de 1 bar à 298K. As moléculas de
água são representadas em azul, as moléculas de octanol estão em vermelho e o Naringin
e Naringenin em laranja
O conjunto ao qual o Naringin estava inserido possuía 1475 moléculas de
água e 1777 moléculas de octanol, já o do Naringenin continha 2943 molé-
culas de água e 1108 moléculas de octanol.
Ambos sistemas passaram por uma etapa de minimização que utilizou o al-
goritmo steepest descent até que a energia alcançasse o valor de 100 kJ mol-
1 nm-1; duas etapas de equilíbrio, uma etapa de dinâmica de 10 ns com um
ensemble NVT aplicando um termostato de reescalonamento da veloci-
dade38 com uma constante de tempo τ de 1,0 ps e temperatura de 298K, e
outra etapa utilizando o ensemble NPT de 20 ns, na qual a pressão de equi-
líbrio foi atingida com τ de 1 ns, aplicando o termostato Nose-Hoover39 ,
com constate τ de 1,0 ps e o barostato Barendsen39 com τ a 3,0 ps à pressão
de 1,0 bar e a 298K.
Em seguida, o Naringin foi transferido com uma força constante de 100 kJ
mol-1 e o Naringenin sem aplicações força, de uma fase para a outra através
de uma dinâmica molecular com espaçamentos de 0,5 nm em um tempo 200
ns, utilizando um termostato de reescalonamento da velocidade40 de τ = 1,0
os a 298K e o barostato Parrinello-Rahman41 à 1 bar e τ = 12,0 ps. O aco-
plamento de pressão utilizado foi isotrópico e a compressibilidade foi con-
figurado para 4,5.10-5 bar-1 em todas as direções. Em todos os passos, o
Departamento de Química
13
tempo de integração utilizado foi de 20 fs e a atualização foi feita a cada 10
passos. 23,34. A constante dielétrica relativa utilizada foi de 15, sendo o pa-
drão para este campo de força. As interações de Lennard-Jones foram pa-
rametrizadas em 0, entre 0 e 0,9 nm, e as interações de Coulomb também
foram parametrizadas em 0, entre 0 e 1,2 nm. O algoritmo leap-frog42 foi
usado em todos os passos.
As simulações Umbrella sampling utilizaram constantes de força de 100 kJ
mol-1 nm-2 23 com espaçamento de 0,5 nm a cada janela afim de calcular a
energia livre de Gibbs da transferência de uma fase para outra. Os resultados
dessas janelas são de forma a se obter um valor de potencial. O potencial de
força média foi computado como uma função entre a distância do centro de
massa da molécula e do centro de massa da caixa de água para o Naringin e
de octanol para o Naringenin, utilizando o método de análise do histograma
(do inglês, Weighteid Histogram Analysis Method, WHAM)34.
3.3. Sistema Curosurf® com apenas uma molécula
Este sistema foi montado de maneira similar para o Naringin e para o Na-
ringenin. Eles foram formados por duas monocamadas lipídicas simétricas
e paralelas no plano xy com as cabeças polares voltadas para dentro 34, onde
cada uma possuía 1021 fosfolipídios. Os dois filmes foram espaçados por
uma distância de 6 nm, onde colocou-se uma caixa com cerca de 30000
moléculas de água, construída com o programa gmx insert-molecules, e todo
o sistema foi inserido no vácuo, em uma caixa retangular de dimensões
25x25x40 nm, como mostrado na figura 5.
Departamento de Química
14
(a) (b)
Figura 5 – Sistema do filme Curosurf® com os flavonoides (a) Naringin e (b) Na-
ringenin na pressão de 1 bar à 298K. As cadeias carbônicas do lipídios estão repre-
sentadas em azul celeste, em rosa, as cabeças polares, em amarelo, a proteína SP-B, e
em cinza, a água.
Novamente, o conjunto passou por uma etapa de minimização utilizando o
algoritmo steepest descent até alcançar 100 kJ mol-1 nm-1, e por uma de
equilíbrio com o tempo de simulação de 200 ns, restringindo a posição dos
flavonoides no vácuo. A temperatura foi controlada utilizando o termostato
de reescalonamento da velocidade36 a 298K com uma constante de tempo
de 1,0 ps e a pressão foi controlada usando o barostato de Berendsen40 com
uma tensão superficial de 30 mN m-1 e a pressão aplicada no eixo z foi de 1
bar com a constante de tempo de 3,0 ps. A compressibilidade aplicada foi
de 4,5.10-5 bar-1 no plano xy e 0 no plano z, de modo a manter o compri-
mento no eixo z constante.
Logo depois, o sistema foi submetido a etapa de dinâmica molecular NT
por um tempo de 2 µs, utilizando os mesmos termostatos e barostatos da
simulação octanol-água à uma tensão superficial de 30 mN m-1. A descrição
do protocolo completo encontra-se na literatura23. Posteriormente, os siste-
mas foram submetidos a uma simulação de Umbrella sampling com as cons-
tantes de força de 100 kJ mol-1 nm-2 afim de calcular novamente a energia
livre de Gibbs de transferência do flavonoide de uma fase para outra, sendo,
novamente, os parâmetros iguais ao sistema anterior.
Departamento de Química
15
3.4. Sistema Curosurf® com vinte moléculas
Este grupo de sistemas foi construído de modo semelhante ao que possui
apenas uma molécula de flavonoide, como diferença, apenas que vinte mo-
léculas foram acrescentadas à caixa em dois grupos de dez de forma simé-
trica, assim como representado na figura 6.
(a) (b)
Figura 6 – Sistema Curosurf®(verde) com vinte moléculas (a)Naringin (azul) e
(b)Naringenin (laranja) na pressão de 1 bar à 298K. As moléculas de água estão re-
presentadas pela cor cinza, e a proteína SP-B está representada em marrom.
Este grupo também passou por simulações de minimização, até atingir
100 kJ mol-1 nm-1, e equilíbrio, com um tempo de 20 ns à tensão de
10mN m-1 à 298K e 1 bar, para seguir para uma dinâmica molecular NT
de tempo 2 μs na tensão superficial de 10 mN m-1, utilizando exatamente
os mesmos parâmetros de barostato, termostato, tempo de integração,
constante dielétrica relativa e parâmetros cut-off de Coulomb e Lennard-
Jones iguais as das duas simulações anteriores.
O objetivo desta simulação era se aproximar mais ainda de um sistema
real, para, ao final se obter os valores de área por molécula, parâmetro
de ordem, difusão e formação de aglomerados.
3.5. Análises
Diversas análises foram realizadas neste trabalho.
Primeiramente, fez-se o cálculo do coeficiente de partição de transferên-
cia do Naringin, do octanol para a água, e do Naringenin, da água para
o octanol.
Departamento de Química
16
O logaritmo do coeficiente de partição das fases octanol-água, também
conhecido como Log P, é descrito na literatura como a razão entre as
concentrações de um soluto em dois líquidos imiscíveis, o octanol e a
água. Este parâmetro informa qual a tendência do soluto se distribuir
entre as duas fases.
O cálculo foi feito a partir da seguinte equação:
Log P = −∆Gtransferência
2,303 RT
Onde ΔGtransferência é a variação da energia livre de Gibbs para transferir
o flavonoide de uma fase a outra, calculada em kCal, R é a constante
universal dos gases em kCal mol-1 K-1 e T é a temperatura absoluta do
sistema em K.
Os valores da energia de transferência foram obtidos a partir da simula-
ção Umbrella Sampling pelo método de análise de histograma35 com o
programa gmx wham. O desvio padrão foi obtido através do próprio pro-
grama.
Os sistemas com uma molécula, de Naringin ou de Naringenin, também
foram submetidos ao método WHAM afim de calcular a energia livre de
Gibbs de transição do flavonoide do vácuo para a monocamada. Além
dissos, eles foram submetidos a análise de difusão lateral dos fosfolipí-
dios
A difusão lateral é uma medida da capacidade dos lipídios de se movi-
mentarem ao longo da monocamada, podendo ser comparada com valo-
res teóricos e experimentais. Para os sistemas, ela foi calculada através
do programa gmx msd, eliminando os últimos 100 ns e utilizando os 100
ns anteriores a ele. Seus valores foram divididos por 4, um fator de cor-
reção para análise em modelos Coarse Grained.
Para o sistema com vinte moléculas, foi calculado a difusão lateral da
mesma maneira que para o sistema anterior. Também foram feitas aná-
lises de área por molécula, parâmetro de ordem, distribuição por densi-
dade e cálculo de agregados.
A área por molécula é a razão entre a área total da monocamada pelo
número de moléculas presentes nela e indica a estabilidade do filme,
dando informações de estabilidade e de organização do filme. Ela foi
calculada através do programa gmx energy, no qual o programa calculou
a área do eixo xy e a dividiu pelo número de lipídios.
O parâmetro de ordem relaciona-se com a orientação espacial das mo-
léculas e sua organização na monocamada. Ele pode ser utilizado para
comparar de modo direto a dinâmica molecular com modelo experimen-
tal de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Ele é
calculado através da seguinte equação:
Pz = 1
2(3cos2θ − 1)
Departamento de Química
17
Onde θ é o ângulo entre o eixo z e um vetor de referência dos lipídios.
Se o parâmetro Pz for igual a 1, significa que o alinhamento é perfeito
com a normal. Se Pz for igual a 0,5, ele é perpendicular e, caso seja 0,
significa que a orientação é aleatória.
Na modelagem Coarse Grained, o parâmetro de ordem foi calculado
com o auxílio do script do-order-multi.py, disponível no website Martini 31 e para que se possa comparar com os resultados experimentais ou ato-
místicos, dividiu-se o valor de Pz por 4 de modo a obter Sz, por conta do
mapeamento 4 a 1 do modelo.
O perfil de densidade foi calculado através do programa gmx density, e,
neste caso, o perfil de densidade é a distribuição temporal média da
massa ao longo o eixo z do sistema. O perfil de densidade foi utilizado
para apresentar a posição dos fosfolipídios e do flavonoide.
Agregados são conjuntos de moléculas que se unem através de forças
intermoleculares, como as forças de Van Der Walls. O número de agre-
gados e o número médio de agregados formados no sistema foi calcu-
lado através do programa gmx cluster utilizando o raio 2 nm.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Resumo
Como na parte de Metodologia, os resultados serão divididos em três partes.
O primeiro consiste em validar o modelo de parametrização do Naringin e
do Naringenin através do cálculo da energia de transferências entre as fases
água-octanol.
Em seguida, avaliou-se a espontaneidade do processo de transferência dos
flavonoides, com apenas uma molécula de cada, pelo filme de Curosurf® e
se este colapsa ou não.
Por último, foram calculados os valores de área por molécula, parâmetro de
ordem, difusão e clusters dos sistemas contendo 20 moléculas de cada fla-
vonoide.
4.2. Sistema água-octanol
Após uma dinâmica molecular de tempo de 100 ns, tanto o Naringin foi
transferido de maneira espontânea do octanol para a água, quanto o Narin-
genin foi transferido da água para o octanol. Isto pode ser visualizado nas
figuras 7 e 8 respectivamente.
Departamento de Química
18
Figura 7 – Representação inicial de final do sistema octanol-água-octanol contendo o fla-
vonoide Naringin(laranja) na pressão de 1 bar à 298K . O octanol e a água estão represen-
tados em rosa e em azul, respectivamente.
Figura 8 – Representação inicial de final do sistema água (azul)-octanol(rosa)-água con-
tendo o flavonoide Naringenin (laranja) na pressão de 1 bar à 298K . O octanol e a água
estão representados em rosa e em azul, respectivamente.
As energias livres de Gibbs de transferência do Naringenin e do Naringin
da fase aquosa para octanol foram calculadas a partir do método Umbrella
Sampling e foram encontrados os valores de -3,50 e de -0,63 kCal mol-1,
respectivamente, como pode-se visualizar nas figuras 9 e 10.
Departamento de Química
19
Figura 9 – Energia livre do flavonoide Naringin (kcal mol-1) com a coordenada de reação
(nm) da transferência do octanol para água na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 10 –Energia livre do flavonoide Naringenin (kcal mol-1) com a coordenada de rea-
ção (nm) da transferência da fase aquosa para o octanol na pressão de 1 bar à 298K.
A partir dos valores de energia livre de transferência, os valores de log P
foram calculados e comparados com os dados preditos encontrados na lite-
ratura 43, como se mostra na Tabela 1.
Flavonoide Log P
Experimental
Log P
Calculado
Erro (%)
Naringin -0,54 -0,46 14,73%
Naringenin 2,52 2,56 1,72%
Tabela 1 – Quadro comparativo entre os Log P preditos e os calculados para os flavonoi-
des Naringin e Naringenin na pressão de 1 bar à 298K.
Os histogramas gerados no método Umbrella Sampling, indicaram uma boa
amostragem e boa escolha na constante de força aplicada. Os histogramas
Departamento de Química
20
gerados para o Naringin e o Naringenin são mostrados nas figuras 11 e 12,
respectivamente.
Figura 11 – Histograma de amostragem de transferência do Naringin do octanol para a
água na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 12 – Histograma de amostragem de transferência do Naringenin da água para o oc-
tanol na pressão de 1 bar à 298K.
4.3.Sistema Curosurf® com apenas uma molécula
Depois de passarem por dinâmicas moleculares de 2 µs na pressão de 1 bar
e na temperatura de 298K, ambos os flavonoides atravessaram o filme, mas
mantiveram-se visualmente próximos as cabeças polares dos fosfolipídios,
como pode ser visto nas figuras 13 e 14.
Departamento de Química
21
Figura 13 – Configurações inicial e final do filme Curosurf® com uma molécula de Na-
ringin (azul) na tensão superficial de 30 mN m-1 a 298K. As cadeias carbônicas do lipídio
estão representadas em azul celeste, e em rosa, as cabeças polares. A água está represen-
tada pela cor cinza e a SP-B em amarelo.
Figura 14 – Configurações inicial e final do filme Curosurf® com uma molécula de Na-
ringenin (laranja) na tensão superficial de 30 mN m-1 a 298K. As cadeias carbônicas do
lipídio estão representadas em azul celeste, e em rosa, as cabeças polares. A água está re-
presentada pela cor cinza e a SP-B em amarelo.
A partir do método Umbrella Sampling, foi possível calcular a energia livre
de transferência e aferir a espontaneidade desta. Ao final da simu-lação,
pode-se concluir que o processo é espontâneo, como pode ser visto nas fi-
guras 15 e 16, e em seus histogramas nas figuras 17 e 18.
Departamento de Química
22
Figura 15 – Energia livre do flavonoide Naringin (kcal mol-1) com a coordenada de rea-
ção (nm) da transferência do vácuo para o filme na pressão de 1 bar à 298K
Figura 16 – Energia livre do flavonoide Naringenin (kcal mol-1) com a coordenada de rea-
ção (nm) da transferência do vácuo para o filme na pressão de 1 bar à 298K
Departamento de Química
23
Figura 17 – Histograma de amostragem de transferência do Naringin do vácuo para o
filme na pressão de 1 bar à 298K.
Figura 18 – Histograma de amostragem de transferência do Naringenin do vácuo para o
filme na pressão de 1 bar à 298K.
Para este mesmo sistema, foi feito o cálculo de difusão lateral dos fosfolipí-
dios, utilizando os penúltimos 100 ns.
Os valores calculados para os sistemas com o surfactante puro, com Narin-
gin e com Naringenin, para cada filme, estão presentes nas tabelas 2,3 e 4.
Cabe ressaltar, que a proteína SP-B se encontra no filme superior, o que faz
com que o valor de da difusão lateral desta monocamada seja um pouco
menor.
Difusão Lateral Surfactante puro (10-7 cm2 s-1)
Fosfolipídio Filme Superior Filme Inferior
DPPC 1,96 ± 0,06 2,18 ± 0,12
POPC 1,53 ± 0,01 2,08 ± 0,57
POPG 1,48 ± 0,46 1,49 ± 0,06
Departamento de Química
24
POPE 1,81 ± 0,47 2,85 ± 1,24
DPPI 1,86 ± 0,16 2,05 ± 0,69
DPPS 1,46 ± 0,00 1,61 ± 0,36
LPC 2,48 ± 0,98 2,56 ± 0,02
DPSM 1,89 ± 0,38 2,52 ± 0,37 Tabela 2 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do modelo de
Curosurf® puro em cm2 s-1 na tensão de 30 mN m-1 a 298K, calculado para um tempo de
100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utilizando o método de Einstein e
os erros foram obtidos através da diferença entre duas metades do intervalo selecionado.
Difusão Lateral Naringin (10-7 cm2 s-1)
Fosfolipídio Filme Superior Filme Inferior
DPPC 2,58 ± 1,26 2,80 ± 2,02
POPC 2,16 ± 0,48 2,40 ± 1,64
POPG 1,44 ± 0,60 1,88 ± 1,16
POPE 1,65 ± 0,28 2,01 ± 1,24
DPPI 1,50 ± 0,50 1,92 ± 1,20
DPPS 1,53 ± 0,48 1,92 ± 1,18
LPC 1,55 ± 0,58 1,99 ± 1,26
DPSM 1,72 ± 0,14 2,03 ± 1,34 Tabela 3 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do modelo de
Curosurf® com Naringin em cm2 s-1 na tensão de 30 mN m-1 a 298K, calculado para um
tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utilizando o método de
Einstein e os erros foram obtidos através da diferença entre duas metades do intervalo se-
lecionado.
Difusão Lateral Naringenin (10-7 cm2 s-1)
Fosfolipídio Filme Superior Filme Inferior
DPPC 1,91 ± 0,73 2,01 ± 0,64
POPC 1,69 ± 0,21 1,85 ± 0,45
POPG 1,45 ± 0,03 1,66 ± 0,20
POPE 1,52 ± 0,13 1,71 ± 0,24
DPPI 1,46 ± 0,01 1,66 ± 0,20
DPPS 1,48 ± 0,02 1,70 ± 0,24
LPC 1,53 ± 0,08 1,74 ± 0,31
DPSM 1,58 ± 0,18 1,74 ± 0,30 Tabela 4 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do modelo de
Curosurf® com Naringenin em cm2 s-1 na tensão de 30 mN m-1 a 298K, calculado para
um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utilizando o método
de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença entre duas metades do intervalo
selecionado.
De acordo com dados presentes na literatura36, estes valores estão adequa-
dos, pois estão na faixa de 1,0-3,0.10-7 cm2 s-1, calculados experimental-
mente para vesículas e bicamadas, respectivamente. Estes dados também se
assemelham com os encontrados para uma dinâmica similar com a claritro-
micina25.
Departamento de Química
25
4.4.Sistema Curosurf® com vinte moléculas
Ao final da simulação de 2 μs, todas as vinte moléculas de ambos sistemas
seguiram em direção ao filme, tendo algumas interagido com a proteína SP-
B, outras com os fosfolipídios e algumas até mesmo atravessado o filme por
completo e terminado na região aquosa, como mostra as figuras 19 e 20.
(a) (b)
Figura 19 – Configurações inicial (a) e final (b) de 20 moléculas do Naringin (azul) na
tensão de 10 mN m-1 a 298K. O modelo do Curosurf® está representado em verde com o
modelo da proteína SP-B em marrom.
(a) (b)
Departamento de Química
26
Figura 20 – Configurações inicial (a) e final (b) de 20 moléculas do Naringenin (laranja)
na tensão de 10 mN m-1 a 298K. O modelo do Curosurf® está representado em verde com
o modelo da proteína SP-B em marrom.
Área por molécula:
A área por lipídio calculada para a monocamada superior, a que contem a
proteína SP-B, na temperatura de 298K e pressão de 1 bar para o Naringin
foi de 46,83 ± 0,10 Å2 e para o Naringenin foi de 46,31 ± 0,07 Å2. Para essa
mesma tensão, o valor da área por lipídio do filme Curosurf® puro é de
46,35 ± 0,06 Å2, logo, a área por lipídio não variou de maneira significativa
com o acréscimo das vinte moléculas.
Parâmetro de Ordem:
Os valores encontrados para os fosfolipídios do sistema na temperatura de
298K e pressão de 1 bar contendo Naringin e Naringenin, e seus respectivos
gráficos, podem ser visualizados no Anexos II e III. A análise foi feita para
a trajetória completa da simulação de 2μs e o valor encontrado é uma média
para cada lipídio.
Uma comparação da cauda SN1 do DPPC foi feita entre o surfactante puro
e cada sistema com flavonoide. Esses gráficos podem ser visualizados nas
figuras 21 e 22.
Figura 21 – O parâmetro de ordem (–Scd) da cauda SN1 do DPPC no surfactante puro
(vermelho) e no sistema com vinte moléculas de Naringin (azul) na tensão superficial de
10 mN m-1 a 298K.
Departamento de Química
27
Figura 22 – O parâmetro de ordem (–Scd) da cauda SN1 do DPPC no surfactante puro
(vermelho) e no sistema com vinte moléculas de Naringenin (azul) na tensão superficial
de 10 mN m-1 a 298K.
Através destes gráficos, pode-se observar que a inserção dos flavonoides no
sistema, aumenta a ordenação do sistema. Uma possível explicação para tal
fato é que os flavonoides podem estar interagindo com as cabeças polares
de tal modo a aproxima-las, fazendo com que as caudas sejam aproximadas
também.
Difusão lateral:
Assim como foi feito nos sistemas contendo apenas uma molécula de fla-
vonoide, calculou-se a difusão lateral dos fosfolipídios através do programa
gmx msd e nesses valores também foi aplicada a correção para o modelo.
Os dados se encontram nas tabelas 5,6 e 7.
Difusão Lateral Surfactante puro (10-7 cm2 s-1)
Fosfolipídio Filme Superior Filme Inferior
DPPC 2,01 ± 0,42 2,04 ± 0,96
POPC 1,53 ± 0,14 1,90 ± 0,79
POPG 1,64 ± 0,40 1,19 ± 0,90
POPE 1,92 ± 0,04 2,49 ± 1,16
DPPI 1,56 ± 0,32 1,45 ± 1,22
DPPS 2,44 ± 0,62 1,48 ± 1,06
LPC 1,99 ± 0,52 2,54 ± 0,99
DPSM 1,91 ± 0,10 2,08 ± 1,09 Tabela 5 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do modelo de
Curosurf® puro em cm2 s-1 na tensão de 10 mN m-1 a 298K, calculado para um tempo de
100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utilizando o método de Einstein e
os erros foram obtidos através da diferença entre duas metades do intervalo selecionado.
Departamento de Química
28
Difusão Lateral Naringin (10-7 cm2 s-1)
Fosfolipídio Filme Superior Filme Inferior
DPPC 0,28 ± 0,08 0,57 ± 0,46
POPC 0,29 ± 0,04 0,60 ± 0,53
POPG 0,27 ± 0,04 0,65 ± 0,58
POPE 0,29 ± 0,07 0,58 ± 0,44
DPPI 0,32 ± 0,10 0,58 ± 0,40
DPPS 0,28 ± 0,04 0,57 ± 0,45
LPC 0,32 ± 0,08 0,58 ± 0,60
DPSM 0,28 ± 0,04 0,56 ± 0,50 Tabela 6 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do modelo de
Curosurf® com Naringin em cm2 s-1 na tensão de 10 mN m-1 a 298K, calculado para um
tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utilizando o método de
Einstein e os erros foram obtidos através da diferença entre duas metades do intervalo se-
lecionado.
Difusão Lateral Naringenin (10-7 cm2 s-1)
Fosfolipídio Filme Superior Filme Inferior
DPPC 0,61 ± 1,48 0,84 ± 0,64
POPC 0,62 ± 1,45 0,86 ± 0,59
POPG 0,60 ± 1,43 0,80 ± 0,72
POPE 0,62 ± 1,48 0,84 ± 0,66
DPPI 0,65 ± 0,83 0,82 ± 0,64
DPPS 0,56 ± 1,33 0,85 ± 0,58
LPC 0,62 ± 1,39 0,92 ± 0,54
DPSM 0,60 ± 1,48 0,85 ± 0,62 Tabela 5 – Coeficiente de difusão lateral dos fosfolipídios na monocamada do modelo de
Curosurf® com Naringenin em cm2 s-1 na tensão de 10 mN m-1 a 298K, calculado para
um tempo de 100 ns de simulação. Os coeficientes foram calculados utilizando o método
de Einstein e os erros foram obtidos através da diferença entre duas metades do intervalo
selecionado
Observa-se que o acréscimo de 20 moléculas do flavonoide, independente-
mente de ser o Naringin ou o Naringenin, diminui o valor da difusão lateral,
o que indica que eles aumentam a organização da monocamada.
Estudos realizados com a prednisolona44 demonstram que maiores frações
da mesma, também aumentam a ordenação do filme.
Distribuição por densidade:
Os perfis de densidade do Naringin e do Naringenin foram calculados para
todo o tempo de simulação podem ser verificados nas figuras 23 e 24, res-
pectivamente.
Departamento de Química
29
Figura 23 – Perfil de distribuição de densidade do Naringin (amarelo), das cabeças pola-
res dos fosfolipídios (azul) e das caudas dos fosfolipídios (vermelho) na tensão superficial
de 10 mN m-1 a 298K.
Figura 24 – Perfil de distribuição de densidade do Naringenin (amarelo), das cabeças po-
lares dos fosfolipídios (azul) e das caudas dos fosfolipídios (vermelho) na tensão superfi-
cial de 10 mN m-1 a 298K.
Estes gráficos acima indicam que o Naringin possui grande afinidade com
as cabeças polares dos fosfolipídios. Já o Naringenin também possui grande
interação com a parte polar da monocamada, porém, também encontra-se
distribuído na fase aquosa e nas caudas apolares. Também é possível ver nas
figuras 23 e 24 que ambos os flavonoides interagem com a proteína SP-B.
Departamento de Química
30
Cálculo de agregados:
O número médio de agregados foi calculado para 2 μs de simulação e fica
entre 8 e 10 para o Naringin, como mostrado na figura 25, tendo um número
médio de duas moléculas por agregado, visualizado na figura 26. Já o Na-
ringenin, não forma agregados nesta quantidade de 20 moléculas.
Figura 25 – Número médio de agregados para o Naringin durante o tempo de simulação
de 2 μs na tensão superficial de 10 mN m-1 a 298K
Figura 26 – Histograma do número médio de moléculas por agregado do Naringin durante
o tempo de simulação de 2 μs na tensão superficial de 10 mN m-1 a 298K.
Departamento de Química
31
5. CONCLUSÕES
Todas as simulações por dinâmica molecular Coarse Grained utilizando o
campo de força Martini foram bem sucedidas, não havendo colapso em ne-
nhum filme de Curosurf® na temperatura de 298K e nas tensões de 10 e 30
mN m-1. Por este motivo, pode-se considerar a possível utilização do sur-
factante pulmonar como carreador dos flavonoides.
Através da parametrização feita nos sistemas octanol-água, foi possível con-
cluir que os modelos Coarse Grained construídos dos flavonoides foram
adequados, pois os erros são pequenos quando comparados com valores ex-
perimentais, sendo o erro do Naringin de 14,7% e do Naringenin de 1,7%,
logo, considera-se que ambos podem ser utilizados para estudar suas intera-
ções com o surfactante pulmonar.
As simulações contendo apenas uma molécula de flavonoide mostraram que
o processo de transferência é espontâneo e que uma única molécula não al-
tera de maneira significativa a organização da monocamada.
No entanto, as simulações com vinte moléculas de flavonoides demonstra-
ram que uma maior concentração das moléculas organiza mais a monoca-
mada como demonstrado nas análises de difusão e de parâmetro de ordem.
Estas simulações também mostraram que os flavonoides possuem certa afi-
nidade com as cabeças polares dos fosfolipídios.
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
As perspectivas futuras deste trabalho são:
Realizar simulações com maiores números de moléculas
Análises dos dados dos experimentos realizados no Laboratório Na-
cional de Luz Sincrotron
Publicar este trabalho em uma revista internacional
Departamento de Química
32
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Daltin, D. Tensoativos: química, propiedades e aplicações. Edgard Blu-
cher Ltda, 2012.
2. Bernhard, W. Lung surfactant: Function and composition in the context
of development and respiratory physiology. Ann. Anat. 208, 146–150
(2016).
3. Baoukina, S. & Tieleman, D. P. Lung Surfactant Protein SP-B Promotes
Formation of Bilayer Reservoirs from Monolayer and Lipid Transfer be-
tween the Interface and Subphase. Biophysical Journal 100, 1678–1687
(2011).
4. Shelley, S. A. et al. Biochemical-composition of adult human-lung sur-
factant. Lung, v. 160, n. 4, p. 195-206, 1982.
5. Grenache, D.G., Gronowski, A. M. Fetal lung maturity. Clinical Bio-
chemistry. 1-10. (2006)
6. Hoekstra, R. E., Jackson, J.C., Myers, T.F., Frantz III, I.D., Stern, M.E.m
Powers, W.F., Maurer, M., Raye, J.R., Carrier, S.T., Gunkel, J.H., Gold,
A.J. Improved Neonatal Survival Following Multiple Doses of Bovine Sur-
factant in Very Premature Neonates at Risk for Respiratory Distress Syn-
drome. Pediatrics. PubMed: 2057245 (1991)
7. Kattwinkel J, Bloom BT, Delmore P, Davis CL, Farrell E, Friss H, Jung
AL, King K, Mueller D. Prophylactic administration of calf lung surfactant
extract is more effective than early treatment of respiratory distress syn-
drome in neonates of 29 through 32 weeks' gestation. Pediatrics. PubMed:
8516091. (1993)
8. Blanco, O. & Pérez-Gil, J. Biochemical and pharmacological differences
between preparations of exogenous natural surfactant used to treat Respira-
tory Distress Syndrome: Role of the different components in an efficient
pulmonary surfactant. Eur. J. Pharmacol. 568, 1–15 (2007).
9. Rebello, C. M., Proença, R. S. M., Troster, E. J. & Jobe, A. H. Terapia
com surfactante pulmonar exógeno: o que é estabelecido e o que necessita-
mos determinar. J. Pediatr. (Rio. J). 78, 215–226 (2002).
10. Chiesi, Curosurf ®. Registro no Ministério da Saúde, no 100580067.
11. Costa, P. R. R. Natural products as starting point for the discovery of
new bioactive compounds: Drug candidates with antiophidic, anticancer
and antiparasitic properties. Rev. Virtual Química 1, 58–66 (2009).
Departamento de Química
33
12. Pinto, A. C., Silva, D. H. S., Bolzani, V. D. S., Lopes, N. P. & Epifanio,
R. D. A. Current status, challenges and trends on natural products in Brazil.
Quim. Nova 25, 45–61 (2002).
13. Taleb-Contini, S. H., Schorr, K., Costa, F. B. Da & Oliveira, D. C. R.
De. Detection of flavonoids in glandular trichomes of Chromolaena species
(Eupatorieae, Asteraceae) by reversed-phase high-performance liquid chro-
matography. Rev. Bras. Ciências Farm. 43, 315–321 (2007).
14. Tarahovsky, Y. S., Kim, Y. A., Yagolnik, E. A. & Muzafarov, E. N.
Flavonoid-membrane interactions: Involvement of flavonoid-metal com-
plexes in raft signaling. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838, 1235–
1246 (2014).
15. Pereira, R. M. S. et al. Quantification of Flavonoids in Brazilian Orange
Peels and Industrial Orange Juice Processing Wastes. Agric. Sci. 08, 631–
644 (2017).
16. Kopec̈, W., Telenius, J. & Khandelia, H. Molecular dynamics simula-
tions of the interactions of medicinal plant extracts and drugs with lipid bi-
layer membranes. FEBS J. 280, 2785–2805 (2013).
17. Heimburg, T. Thermal Biophysics of Membranes. Wiley‐VCH Verlag
GmbH & Co. KGaA, 2007.
18. Nie, Y. et al. Anti-Inflammatory Effects of Naringin in Chronic Pulmo-
nary Neutrophilic Inflammation in Cigarette Smoke-Exposed Rats. 894–
900 (2012). doi:10.1089/jmf.2012.2251
19. World Health Organization (WHO), em português: Organização Mun-
dial de Saúde (OMS). COPD predicted to be third leading cause of death in
2030. (2008). Disponível em:
<https://www.who.int/respiratory/copd/World_Health_Statis-
tics_2008/en/>, acesso em: 23/12/18, às 21:40.
20. Turgut, N. H. et al. The Protective Effect of Naringin against Bleomy-
cin-Induced Pulmonary Fibrosis in Wistar Rats. Pulm. Med. 2016, (2016).
21. Marrink, S. J., Risselada, H. J., Yefimov, S., Tieleman, D. P. & De Vries,
A. H. The MARTINI force field: Coarse grained model for biomolecular
simulations. J. Phys. Chem. B 111, 7812–7824 (2007).
22. Ortiz-Collazos, S. et al. Interaction of levofloxacin with lung surfactant
at the air-water interface. Colloids Surfaces B Biointerfaces 158, 689–696
(2017).
Departamento de Química
34
23. Estrada-López, E. D., Murce, E., Franca, M. P. P. & Pimentel, A. S.
Prednisolone adsorption on lung surfactant models: Insights on the for-
mation of nanoaggregates, monolayer collapse and prednisolone spreading.
RSC Adv. 7, 5272–5281 (2017).
24. Souza, L. M. P., Nascimento, J. B., Romeu, A. L., Estrada-López, E. D.
& Pimentel, A. S. Penetration of antimicrobial peptides in a lung surfactant
model. Colloids Surfaces B Biointerfaces 167, 345–353 (2018).
25. Ortiz-Collazos, S., Souza, L. M. P., Souza, F.R., Oliveira, N.B., Cava-
leiro, J., Soares, C.A., Picciani, P.H.S., Oliveira Jr, O. N., Pimentel, A.S (no
prelo). Clarithromycin does not affect the stability of a lung surfactant mo-
nolayer at the air-water interface.
26. Baoukina, S. & Tieleman, D. P. Computer simulations of lung surfac-
tant. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1858, 2431–2440 (2016).
27. Duncan, S. L., Dalal, I. S. & Larson, R. G. Molecular dynamics simula-
tion of phase transitions in model lung surfactant monolayers. Biochim. Bi-
ophys. Acta - Biomembr. 1808, 2450–2465 (2011).
28. Manchope, M. F. et al. Naringenin: an analgesic and anti-inflammatory
citrus flavanone. Oncotarget 8, 3766–3767 (2017).
28. Berendsend, H.J.C.,Van Der Spoel, D., Van Drunen, R. GROMACS: A
message-passing parallel molecular dynamics implementation. Computer
Physics Communications. 0010-4655(95)00042 (1995)
29. Monticelli, L.; Kandasamy, S. K.; Periole, X.; Larson, R. G.; Tieleman,
D. P.; Marrink, S. J. The MARTINI Coarse-Grained Force Field: Extension
to Proteins. J. Chem. Theory Comput. (2008), 4 (5), 819–834.
30. Wassenaar, T. A.; Ingólfsson, H. I.; Böckmann, R. A.; Tieleman, D. P.;
Marrink, S. J. Computational Lipidomics with Insane: A Versatile Tool for
Generating Custom Membranes for Molecular Simulations. J. Chem. The-
ory Comput. (2015), 11 (5), 2144–2155.
31. Melo, M. N.; Ingólfsson, H. I.; Marrink, S. J. Parameters for Martini
Sterols and Hopanoids Based on a Virtual-Site Description. J. Chem. Phys.
(2015), 143 (24), 243152.
32. Graham, J. A., Essex, J. W. & Khalid, S. PyCGTOOL: Automated Gen-
eration of Coarse-Grained Molecular Dynamics Models from Atomistic
Trajectories. J. Chem. Inf. Model. 57, 650–656 (2017).
Departamento de Química
35
33. Zhang, H., Fan, Q., Wang, Y. E., Neal, C. R. & Zuo, Y. Y. Comparative
study of clinical pulmonary surfactants using atomic force microscopy. Bi-
ochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1808, 1832–1842 (2011).
34. Laing, C.; Baoukina, S.; Tieleman, P. Molecular Dynamics Study of the
Effect of Cholesterol on the Properties of Lipid Monolayers at Low Surface
Tensions. Phys. Chem. Chem. Phys. (2009), 11, 1916–1922.
35. Kumar, S.; Rosenberg, J. M.; Bouzida, D.; Swendsen, R. H.; Kollman,
P. A. The Weighted Histogram Analysis Method for Free-Energy Calcula-
tions on Biomolecules. I. The Method. J. Comput. Chem. (1992), 13 (8),
1011–1021.
36. Torrie, G. M.; Valleau, J. P. Nonphysical Sampling Distributions in
Monte Carlo Free-Energy Estimation: Umbrella Sampling. J. Comput.
Phys. (1977), 23 (2), 187–199.
37. Humphrey, W.; Dalke, A.; Schulten, K. VMD: Visual molecular dynam-
ics. Journal of Molecular Graphics & Modelling, v. 14, n. 1, p. 33-38, Feb
1996.
38. Bussi, G.; Donadio, D.; Parrinello, M. Canonical Sampling through Ve-
locity Rescaling. J. Chem. Phys. (2007), 126 (1), 14101.
39. Evans, D. J.; Holian, B. L. The Nose-Hoover Thermostat. J. Chem. Phys.
(1985), 83 (8), 4069–4074.
40. Berendsen, H. J. C.; Postma, J. P. M.; Van Gunsteren, W. F.; Dinola,
A.; Haak, J. R. Molecular Dynamics with Coupling to an External Bath. J.
Chem. Phys. (1984), 81 (8), 3684–3690.
41. Parrinello, M.; Rahman, A. Polymorphic Transitions in Single Crystals:
A New Molecular Dynamics Method. J. Appl. Phys. (1981), 52 (12), 7182–
7190.
42. Hockney, R. W.; Goel, S. P.; Eastwood, J. W. Quiet High-Resolution
Computer Models of a Plasma. J. Comput. Phys. (1974), 14 (2), 148–158.
43. 1. Szegezdi, J. & Csizmadia, F. Prediction of dissociation constants us-
ing microconstants. Am. Chem. Soc. Natl. Meet. 2–3 (2004).
44. López, E. D. E. Dinâmica molecular da adsorção de prednisolona em
um modelo de surfactante pulmonar. (2017). Tese (mestrado em Química).
Pontifícia universidade Católica do Rio de Janeiro.
Departamento de Química
36
ANEXO I - Modelos Coarse Grained dos fosfolipídios, da proteína SP-B e
dos flavonoides
(a) (b) (c)
(d) (e) (f) (g)
(h) (i) (j) (k)
As estruturas sao: (a) Naringin, (b) Naringenin, (c) proteína SP-B, (d) DPPC, (e)
POPC, (f) POPG, (g) POPE, (h) DPPI, (i) DPPS, (j) LPC e (k) DPSM
Departamento de Química
37
ANEXO II – Gráficos dos parâmetros de ordem dos fosfolipídios do Naringin
Departamento de Química
38
Departamento de Química
39
Departamento de Química
40
ANEXO III – Gráficos dos parâmetros de ordem dos fosfolipídios
do Naringenin
Departamento de Química
41
Departamento de Química
42