Diseño de Biorreactor Para Penicilina

INTRODUCCIÓN

Desde hace milenios el hombre ha usado en el tratamiento de heridas y algunas enfermedades, tierra y plantas que son fuentes de hongos y bacterias productores de antibióticos (Lozano Valdés, et al., 1998).

Los antibióticos son productos del metabolismo microbiano capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos (Defillo M., 1984).

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“José María Morelos y Pavón”

DIVISIÓN DE ESTUDIOS PROFESIONALES

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA Y QUÍMICA

“INGENIERÍA DE BIORREACTORES”

PROYECTO 3: DISEÑO DE UN BIORREACTOR PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA

PRESENTAN:

Cortés Jaramillo Rodrigo

Díaz Vega Diana

Huerta Chávez Claudia Andrea

Marín Magaña Alma Guadalupe

Soria Calderón Nayeli Alejandra

PROFESOR: MIGUEL ÁNGEL ZAMUDIO JARAMILLO

MORELIA MICH. JUNIO DE 2014

Miguel Angel Zamudio Jaramillo, 04/06/14,

Diseño: 85Redacción: 100Calidad de la información: 100Información faltante: 85Calificación: 92.5

Las penicilinas fueron los primeros antibióticos que se usaron en terapéutica siendo estos de origen microbiológico, a partir de cultivos de Penicillium notatum, posteriormente se lograron mejores resultados con P. chrysogenum (Cué Bruguera & Morejón Garcia, 1998) .

En la actualidad, se utiliza el término penicilina para referirse a un a un grupo de antibióticos de origen natural y semisintético, que tienen un núcleo base común (ácido 6-aminopenicilánico) (Cué Bruguera & Morejón Garcia, 1998;Mendoza Patiño, 2014). Ver Figura 1.

Figura 1. Ácido 6-aminopenicilánico (Estructura base de la penicilina).

Existen diversos tipos de penicilinas, en la Tabla 1 se muestra la clasificación de acuerdo a Valdés et al. en el año 1998.

DISEÑO DE UN BIORREACTOR PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA

Tabla 1. Clasificación de las penicilinas (Lozano Valdéz, et al., 1998).

Clasificación de las penicilinas por grupos

Subclasificación

Bencilpenicilina y sus formas parenterales de acción prolongada:

BelcilpenicilinaPenicilina benetaminaPenicilina benzatínica (penicilina G)Penicilina clemizonPenicilina procaínica

Penicilinas absorbibles oralmente, semejantes a la bencilpenicilina:

AzidocillínFenetecillínFenoximetilpenicilina (penicilina V)

Penicilinas resistentes a β-lactamasas staphylocócicas:

Isoxazolil-penicilina:CloxacillínDicloxacillínOxacillínFluoroxacillín

MeticillínNafcillín

Penicilinas de amplio espectro Ampicillín Ésteres del ampicillín

BacampicillínLenampicillín

Compuestos similares al ampicillín

AmoxicillínMecillinam (amdinocilina)Ciclacillín

Penicilinas antipseudomónicasPenicilinas resistentes a β-lactamasas

(de enterobacterias)

AcilureidopenicilinasAzlocillínMezlocillínPiperacillín

CarboxipenicilinasCarbenicillínTicarcillín

Penicilinas resistentes a β-lactamasas (de enterobacterias)

ForamidocillínTemocillín

Existen penicilinas que son de carácter hidrofóbico al presentar una cadena lateral de ácido fenilacético (penicilina G o bencilpenicilina), ácido fenoxiacético (penicilina V), mientras que otras presentan una cadena lateral hidrofílica de ácido L-α-aminoadípico (isopenicilina N) (González, 2013).

El trabajo se basa en la producción de penicilina G ya que se considera de las más importantes, siendo el fármaco de elección de gran variedad de enfermedades infecciosas como son del árbol bronquial, pulmonares, cardíacas, del sistema nervioso central, etc. (Lozano Valdés, et al., 1998;González, 2013). Esta al ser una penicilina con una cadena lateral hidrofóbica, es exclusivamente sintetizada por hongos filamentosos, como es el caso de


especies del género Penicillium tales como: P. chrysogenum, P. nalgiovense y P. griseofulvum (González, 2013).

ANTECEDENTES

El método de superficie fue el primer sistema para la producción de penicilina, donde el cultivo se vierte en bandejas y el crecimiento del hongo se da en la superficie. En 1994, se desarrolló el método de fermentación sumergida el cual permitió disminuir los requerimientos de espacio y los costos de producción. Los fermentadores utilizados en la producción de penicilina alcanzan entre 20.000 y 115.000 L de capacidad. Casi el 10% del cultivo total corresponde al inóculo y se prepara a partir de un cultivo starter (Dowden & Hutchinson-Ross,1974).

El medio de cultivo para la fermentación se compone de un caldo de maíz, el agregado un 2 a un 3 % de lactosa y compuestos inorgánicos (fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc). Posteriormente se ajusta el pH en un rango de 4.5 – 5.0, el cual pasa a un fermentador equipado con un agitador vertical y un sistema de inyección de aire estéril, manteniendo asi un rango de temperatura de 23- 25 ºC (Dowden &Hutchinson-Ross, 1974).

Pasando un tiempo de 50 a 90 horas el crecimiento del hongo disminuye, el fermentador debe enfriarse a 5 °C, previniendo la desestabilización del antibiótico y el hongo se separa por filtración (ArgenBio, 2007).

Aunque la penicilina es producida por diversas especies del género Penicillium, la producción industrial de penicilina está basada en el hongo P. chrysogenum (González, 2013).


ASPECTOS TEORICOS RELEVANTES

Penicillium chrysogenumClasificación taxonómica de Penicillium chrysogenum (Volk, 2003)

o Phylum: Ascomycotao Clase: Euascomyceteso Orden: Eurotialeso Familia: Trichocomaceae

Este es un género que se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada semejante a un pincel que termina en células conidiógenas llamadas fiálides (Carrillo, 2003).

Penicillium chrysogenum es hongo filamentoso que presenta conidióforos tabicados de pared lisa (200-300 μm), ramificado al final, con métulas de 8-12 μm y fiálides en forma de botella (de 7-12 μm), donde nacen conidios lisos, elipsoidales (de 2,5-4 μm) azules o verde-azulados en cadenas, sin ramificar, con un penacho o pincel característico (Thom, 2002). Es ampliamente distribuido en la naturaleza, suele formar colonias verdeazuladas (ver Figura 2) sobre el pan duro y los cítricos, sus esporas se encuentran frecuentemente en el polvo doméstico. Su temperatura óptima de crecimiento es de 23 °C, pero crece entre 5 y 37 °C (Volk, 2003).

Figura 2. A) Cultivo de Penicillium chrysogenum; B) Penicillium chrysogenum en pan.


A B

Biosíntesis de penicilina en Penicillium chrysogenumLa biosintésis de penicilinas (Figura 3) comienza con la condensación no ribosómica de los aminoácidos: ácidos L-α-amonoadípico, L-cisteína y L-valina, para la síntesis del tripéptido δ(-L-α-aminoadipil)-L-cistenil-D-valina , catalizado por la ACV sintetasa, la cual activa el ATP de los tres aminoácidos precursores, codificada por el gen pcbAB (Díez, et al., 1990; Smith, et al., 1990; MacCabe, etal., 1991; Gutiérrez, et al., 1991; Coque, et al., 1991).

El tripeptido ACV se cicla al formar un enlace tiazolidínico, formando la isopenicilina N (intermediario con actividad antibiótica) que contiene el anillo β-lactámico y el anillo tiazolidínico (característico de las penicilinas). Partiendo de la isopenicilina N, la cadena lateral L-α-aminoadípico hidrofilica puede remplazarse por una cadena lateral hidrofóbica o conservarse (NaranjoBriceño, 2003).

Figura 3. Biosíntesis de la penicilina G (Naranjo Briceño, 2003)


Medio de cultivoNaranjo Briseño (2003) menciona el uso del medio MDFP como medio definido de producción de Penicillium compuesto de tres soluciones A, B, y C, cuya composición se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición de las soluciones A, B y C para el medio de cultivo (elaboración propia con información de: Naranjo Briseño, 2003).

Solución A Solución BSolución A1 Lactosa 30 g

Ácido cítrico 10 g FeSO4.7H2O 0.05 gÁcido acético 2,5 g ZnSO4.7H2O 0.01 g Agua

destilada 0.1 L

Etilamina 3 g CuSO4.5H2O 0.01 g(NH4)2SO4 5 g MnSO4.4H2O 0.01 g Solución C

KH2PO4 1 g CoSO4 0.005 gMgSO4.7H2O 0.5 g Agua destilada 0.8 L Sacarosa 10 g

Solución A2Glucosa 40 g Agua

destilada 0.1 L

Agua destilada 0.2 L

Las soluciones A1, A2, B y C se esterilizan por separado y se mezclan antes de su uso. Para 80 ml de solución A se añaden 20 ml de solución A2. Para 80 ml de medio MDFP se añaden 10 ml de solución B y 10 ml de solución C (NaranjoBriceño, 2003).

Tipos de biorreactores Un biorreactor o fermentador es “aquel dispositivo que proporciona un medio ambiente controlado que permite el crecimiento eficaz de las células y la formación de un producto” (Ward & Acribia, 1991).

Estos deben tener un ambiente adecuado (niveles óptimos de temperatura, pH, sustrato, sales y oxigeno) para lograr convertir las materias primas en productos específicos (metabolitos) de interés (Schügerl, 1990).

Existen distintos tipos de biorreactores, básicamente tres (McNeil & Harvey,1990) los cuales se describen brevemente en la Tabla 3.


Tabla 3. Tipos de biorreactores

Biorreactor Características Referencias

Agitado por aire (air-lift)

Existen etapas de contacto de agitación neumática, gracias a la diferencia de densidades entre el gas inyectado y el resto de fases que residen en los tanques.

El movimiento del líquido hace que las burbujas de gas en las zonas de flujo ascendente suban más rápido, por lo que se disminuye la fricción de gas retenido y la diferencia de presión hidrostática.

Pueden generar altas velocidades de circulación de las fases densas a lo largo del tanque sin necesidad de sistemas mecánicos auxiliares.

Posee fracciones de gas retenido menores con parado con una columna de burbujas

Distribución más uniforme de la fase gaseosa a través de la sección transversal de la zona de flujo ascendente

(Vazquez, Orozco,& Ordaz, 2007)

(Díaz, 2001)

De tanque

agitado

Son los más utilizados en la industria farmacéutica

Mayor eficiencia para realizar el contacto entre un gas y un liquido

(Williams, 2002)

(Sousa, et al.,2001)

Columna de

burbujas

Se encuentran en una amplia gama de industrias.

Las interacciones dinámicas entre burbujas y líquido afectan el rendimiento de la columna.

Existen etapas de contacto de agitación neumática, gracias a la diferencia de densidades entre el gas inyectado y el resto de fases que residen en los tanques.

La mezcla se produce inmediatamente en la parte superior al punto de inyección del caudal de gas y únicamente se debe a la dispersión de la fase gaseosa en el seno del tanque.

Se han utilizado en la industria química por su bajo costo de capital, configuración simple y costos reducidos de operación debido a los bajos requerimientos energéticos

(Lain &Sommerfeld, 2004)

(Díaz, 2001)

DISEÑO DE ALTERNATIVAS

El diseño implica la consideración de diferentes aspectos basándose principalmente en los siguientes:

Reglas de diseño de agitación y mezclado Tanque agitado Columna de burbujeo


Smith, Lilly y Fox (2004) utilizaron fermentadores de 10 y 100L agitados a diversas velocidades de aireación y de agitación demostrando que la punta del impulsor y la turbulencia no ocasionan ningún daño a las hifas.

Ayazi (2000) empleo fermentadores de 5, 100 y 1000 dm3, a una velocidad de punta del impulsor de 2.5 a 6.3 m/s donde demostraron que la agitación en la fermentación genera fuerzas de corte afectando al microorganismo desde su estructura celular, cambios en su morfología, variación en su crecimiento e incluso en la formación del producto, por lo que se realizó el diseño de una columna de burbujeo (Makagiansar, Ayazi, Thomas, & Lilly, 1993).

Tabla 4. Correlacciones para Penicilliun chrysogenum

Tanque agitado por lotes:Para la producción de 100 g de penicilina se procedió a utilizar un software simulador que se integra con el paquete de simulación CVODE a través de Netlib (Illinois Institute of Technology, 2000).

El programa se lleva a cabo en la simulación dinámica de un biorreactor de tanque agitado por lotes para la producción de penicilina por medio de Penicillum chrysogenum.

La simulación se basa en el modelo mecanicista de Bajpai y Reuss (Bajpai y Reuss, 1980), el modelo mecanicista ha sido aumentado sustancialmente por la inclusión de velocidad de aireación, potencia de agitación, las tasas de flujo de alimentación de sustrato y oxígeno, concentración de dióxido de carbono, temperaturas de biorreactor, el calor generado y el pH del medio. La representación esquemática del proceso se muestra en la Figura 4.


CORRELACIÓN REFERENCIA

Kla=α √ fg ¿ (Gülnur, Cenk, & Ali, 2001)

kla=0.32¿ (Hassan, Nik, Abdul, & Karim,1995)

Figura 4. Representación esquemática del proceso.

Se llega a la fase estacionaria después de 40 horas en el proceso de producción de penicilina en un biorreactor por lotes como se muestra en la Figura 5.

Figura 5. Comportamiento del proceso

Se emplearon las siguientes ecuaciones y se utilizaron los parámetros mostrados en la tabla 5.

Crecimiento de biomasa.

dXdt

=μX− XV

dVdt


Donde μrepresenta la tasa específica de crecimiento e incluye los efectos de las variables ambientales, tales como pH y temperatura, así como la fuente de carbono y el oxígeno en su expresión cinética.

Producción de penicilina

dPdt

=μpp X−KP−dVdt

Donde μpp es la tasa específica de producción de penicilina que contiene biomasa, la fuente de carbono, y una concentración de oxígeno en su expresión cinética

Sustrato consumido.

dSdt

=−μY xs

X−μpp

Y ps

X+F− SV

dVdt

Consumo de oxígeno.

d C L

dt=−μ

Y xo

X−μpp

Y po

X−μo X+k L a (CL¿−CL)−

CL

VdVdt

Donde kLa se calcula mediante la correlación de Bailey y Ollis (1986) (Schell, etal., 2001):

KLa(s-1) = 0.0026( Pg

V )0.4

us0.5

La cual es válida para fluidos coalescentes y altamente Newtonianos. Ésta ecuación es válida para V<2600 L y 500<Pg/V< 10,000 W/m3 ( 5-10 hp/1000 gal).

De acuerdo con Bajpai y Reuss (2000) para la producción de 100 g de penicilina se utiliza un volumen de 100 L (0.1 m3) en un tanque agitado por lotes.

Si se considera la altura del rector es igual al diámetro del reactor se tiene lo siguiente:

DT=3√ v (4 )

( π )=

3√ 0.1m3(4)( π )

=1.46

De acuerdo a los resultados obtenidos con Tomasino (2003) se consideró una agitación con turbina tipo Rushton de 0.08 rps en la cual no causa daños graves en la biomasa.


Miguel Angel Zamudio Jaramillo, 04/06/14,

Según quién?

Para el cálculo de la potencia fue necesario considerar la viscosidad y la densidad del agua esto si es una solución muy diluida y donde se tiene que el diámetros del biorreactor es DI= 1/3 DT.

Primero es necesario el cálculo del número de Reynolds.

ℜ= ρ Di20.08 rps3

µ=3122.23

De tablas para turbinas tipo Rushton se consideró Np igual a 8.

Pw= ρNp DI5N3

Pw=(997 kg

m3 ) (8 ) (1.46m)5 (0.08 rps )3=20216.41Watts=29.09HP

Los parámetros cinéticos en los que se basa la simulación se muestran en la tabla siguiente:

Tabla 5. Parámetros cinéticos

Parámetro Unidades UnidadConcentración de sustrato de alimentación: S f

g/L 600

Tasa de flujo de alimentación: F

L/h

Temperatura de alimentación de sustrato: Tf

K 298

Constante de rendimiento: Yx/s

g biomasa/g glucosa

0.45

Constante de rendimiento: Yx/o

g biomasa/g oxígeno

0.04

Constante de rendimiento: Yp/s

g penicilina/g glucosa

0.9

Constante de rendimiento Yp/o

g penicilina/g oxígeno

0.2

Constante: K1 mol/L 10-10

Constante: K2 mol/L 7x10-5

Coeficiente de mantenimiento de sustrato 𝜇x

h-1 0.01

Coeficiente de mantenimiento de oxígeno: 𝜇o

h-1 0.47

Constante de CO2 en relación con el crecimiento: α1

mmol CO2/g biomasa

0.14

Constante CO2 en mmol CO2/g 4x10-7


relación con el mantenimiento de la energía: α2

biomasa h

Constante de CO2 en relación con la producción de penicilina: α3

mmol CO2/L h 10-4

Tasa específica de crecimiento máximo: 𝜇x

h-1 0.09

Constante de Contois de saturación: Kx

g/L 0.15

Constante de oxígeno limitante: Kox, Kop

Sin límite 0

Constante de oxígeno limitante: Kox, Kop

Con límite 2x10-2, 5x10-4

Tasa específica de producción de penicilina: mp

h-1 0.01

Constante de inhibición: Kp

g/L 0

Constante de inhibición por producto: Kl

g/L 0.1

Constante: p 3Tasa de hidrólisis constante de penicilina: K

h-1 0.04

Constante de Arrhenius para crecimiento: kg

7x103

Energía de activación para crecimiento: Eg

cal/mol 5100

Constante de Arrhenius para células muertas: kd

1033

Energía de activación para células muertas: Ed

cal/mol 50000

Densidad por capacidad calorífica del medio: ρ C p

1/L℃ 1/1500

Densidad por capacidad calorífica del líquido de refrigeración: ρ C pc

1/L℃ 1/2000


Rendimiento de la generación de calor: rq2

cal/g biomasa 60

Constante en la generación de calor: rq2

cal/ g biomasa 1.6783x10-4

Coeficiente de transferencia de calor del líquido de refrigeración con el de calentamiento: a

cal/h℃ 1000

Tasa de flujo del líquido de refrigeración: Fc

L/h

Constante: b 0.6Constantes en kLa: α, β

70, 0.4

Constante en Floss: ʎ h-1 2.5x10-4

Las condiciones iniciales fueron las siguientes de la tabla 6.

Tabla 6. Consideraciones iniciales

Condición inicial Valor UnidadConcentración de sustrato

15 g/L

Concentración de oxígeno disuelto

1.16 g/L

Concentración de biomasa

0.1 g/L

Volumen 100 LConcentración de dióxido de carbono

0.5 g/L

Temperatura del reactor

298 K

Velocidad de aereación

8.6 L/h

Potencia 29.09 WVelocidad de flujo 0.0426 L/hSampling interval 0.5 hTiempo 200 hpH 5

De acuerdo al simulación para la producción de 100 g de penicilina utilizando el software simulador que se integra con el paquete de simulación CVODE a través de Netlib (Illinois Institute of Technology, 2000), los resultados se describen en la siguiente tabla donde muestran las gráficas la velocidad de


aireación, poder de agitación, consumo de sustrato, concentración de oxígeno disuelto, concentración de biomasa y concentración de producto.

Tabla 7. Gráficas de la velocidad de aireación, poder de agitación, consumo de sustrato, concentración de oxígeno disuelto, concentración de biomasa y concentración

de producto.

Gráficas de acuerdo al software

Reglas de diseño de agitación y mezcladoPor reglas de diseño en un tanque agitado


o La agitación suave se obtiene haciendo circular el líquido con un impulsor a velocidades superficiales de 0.1 a 0.2 m/s, y una agitación intensa a 0.7 a 1.0 m/s.

o Las intensidades de agitación con el impulsor en tanques con deflectores se miden por la entrada de energía, HP/100 gal, y velocidades en el extremo del impulsor (Walas, 1990).

o Las proporciones de un tanque agitado con relación al diámetro D: D = nivel de líquido; diámetro del impulsor de la turbina = D/3; nivel impulsor por encima del fondo = D/3; ancho de la hoja del impulsor = D/15; cuatro deflectores verticales con anchura = D/10.

o Las propelas son hechas a un máximo de 18in, el impulsor de la turbina a 9ft.

o El burbujeo del gas se introducirá en agitación suave a una velocidad de gas superficial de 1 ft/min, la agitación severa de 4 ft/min.

o La suspensión de solidos con una velocidad de asentamiento de 0.03 ft/s es acompañado con cualquier turbina o impulsor de hélice, pero cuando la velocidad de ajuste está por encima de 0.15 ft/s se necesita una agitación intensa.

o La energía para conducir una mezcla gas-líquido puede ser de 25-50% menor que la potencia necesaria para impulsar el líquido solo.

o Los mezcladores en línea son adecuadas cuando el tiempo de contacto es suficiente de uno o dos segundos, con una potencia de entrada de 0.1-0.2 HP/gal.

Columna de burbujeo Diseño de una columna de burbujeo.

Para el diseño de una columna de burbujeo se tomaron los mismos datos que para el caso anterior, es decir, se producirán 100 g de penicilina, además, ya que el medio de cultivo será el mismo, se consideraron las mismas propiedades del fluido.

Cálculo del diámetro de la columna:

DC=3√ v (4 )

(π )=3√ 0.1m3(4 )

(π )=0.5030m

Debido a que la relación h/DC= 2-5 (Guevara, 2004), el cálculo de la altura es

hDC

=3.5

h=3.5DC=(3.5 ) (0.5030m )=1.7605m

El área transversal de la columna se determinó de la siguiente manera:


A=π r2

A=π ( 0.5030m2 )

2

=0.1987m2

Se tomará en cuenta una columna de burbujeo cuyas dimensiones son las siguientes:

Dimensiones UnidadDiámetro de la columna (DC) 0.5030 m

Diámetro de impulsor (DI) 0.166 m Volumen (V) 0.1 m3

Área transversal de la columna (A) 0.1987 m2

Altura de la columna (h) 1.7605 mPara este caso, se empleó la correlación de Hassan, et al., 1995:

k L a=0.32(V g∗Po

P )0.7

Dónde:

V g=QA

V g=1.183x 10−8m3/s0.1987m2 =5.9536 x10−8m / s

De tal manera, se realizó el cálculo para obtener la Po, utilizando una

correlación de k L a= 1.77x10-3 s-1 para columnas de burbujeo (Guevara, 2004).

k L a=0.32(V g∗Po

P )0.7

Despejando po se obtiene:

po=V g p

0.7√ kL a

0.32

De tal manera:


po=(5.9536 x10−8m / s)(100000 pa)

0.7√ 1.77 x 10−3 s−1

0.32

=9.9843 pa

PROPUESTA FINAL

Se consideró el uso de un reactor por lotes agitado de acero inoxidable, debido a que se proporcionan un tiempo de contacto mayor entre las burbujas que ascienden y el líquido, así, la presión hidrostática es mayor en el fondo del reactor, además, la aireación permite el suministro necesario de oxígeno a los microorganismos, incluso, la agitación ayuda a mantener las condiciones uniformes dentro del reactor (Doran, 1998). Los fermentadores agitados de utilizan normalmente para cultivos aerobicos, el suministro de oxígeno es suministrados mediante la creación de burbujas de aire debajo del impulsor, lo cual permite que se disperse mejor el oxígeno. Se empleará una turbina tipo Rushton, ya que ésta tiene un diseño sencillo, cabe destacar que la agitación no daña las hifas (Akitson, 1986).

El medio de cultivo MDFP es el adecuado para el crecimiento de este microorganismo, debido a que contiene los nutrimentos necesarios para que se obtenga una buena producción de penicilina.

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Diseño de Biorreactor Para Penicilina