Diseño y construcción de vectores para la …tesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/19729/1/Margarita...vii RESUMEN El frijol común (Phaseolusvulgaris) es un cultivo económicamente

i

DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE VECTORES PARA LA TRANSFORMACIÓN DEL CLOROPLASTO DE FRIJOL (Phaseolus vulgaris)

TESIS

Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Bioprocesos

PRESENTA

Margarita Velázquez Sánchez

Ingeniero en Alimentos

DIRIGIDA POR:

Dra. María del Carmen Oliver Salvador

Dr. Jesús Agustín Badillo Corona

México, D.F. Junio del 2012

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESINAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA

ii

iii

iv

v

DEDICATORIA

A mi esposo y mi hija por brindarme su amor, cariño y apoyo.

Ustedes son mi mayor estímulo para salir adelante.

vi

AGRADECIMIENTOS

A Dios por todas las bendiciones que me ha dado, porque siempre me sostiene y me

cuida en los momentos de tribulación y porque me guía cada momento .

A Luis Manuel por ser mi compañero de vida, gracias por tu comprensión, por tu

apoyo y porque a tu lado siempre me he sentido segura protegida y amada. Te amo

muchísimo.

A mi pequeña hija Lizbeth por tu ternura y cariño, gracias porque con tu vida me has

ayudado a esforzarme para ser mejor persona.

A mis Padres, Sergio Velázquez† y Margarita Sánchez y a mis hermanos Sergio, Perla,

Araceli y Fermín, porque siempre han sido un ejemplo de trabajo, esfuerzo y

perseverancia.

A la Dra. María del Carmen Oliver Salvador y al Dr. Agustín Badillo Corona, por su

esfuerzo, dedicación y por su gran amor por la ciencia. Gracias por su gran paciencia,

por haberme brindado su apoyo y dirección en todo momento.

A mis compañeros de laboratorio Víctor, Francisco, Arturo, Cecilia, Pepe, Carla,

Cesar, Alma, Alejandra y Andrea, porque siempre estuvieron dispuestos a tenderme la

mano cuando más lo necesité.

Al Instituto Politécnico Nacional (IPN) y A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnología (UPIBI) por permitirme continuar con mi formación Académica.

Al Consejo Nacional de Cencía y Tecnología (CONACYT) y Al Programa Institucional

de Formación de Investigadores (PIFI) por las becas otorgadas, con las cuales pude

culminar la presente investigación.

vii

RESUMEN

El frijol común (Phaseolusvulgaris) es un cultivo económicamente importante y una de

las principales leguminosas para consumo humano en América Latina, África y Asia. A

pesar de su importancia, el incremento en su producción es limitada debido a

patógenos virales, hongos bacterias e insectos, falta de tolerancia a la sequía y las

deficiencias nutricionales. Por tanto, existe un gran interés en el desarrollo de nuevos

cultivares de frijol con características agronómicas útiles. La mayoría de plantas

transformadas genéticamente obtenidas hasta el momento son el resultado de la

transferencia de ADN al genoma nuclear. Las plantas además contienen un genoma en

la mitocondria y en los plástidos o cloroplastos. Este último puede ser modificado con

genes que confieren características a plantas que pudieran tener aplicaciones en la

industria biotecnológica y muchas ventajas con respecto a la modificación del genoma

nuclear. Entre otras ventajas, se encuentran una estabilidad mayor de los transgenes y

una herencia materna de los cloroplastos, evitando así la presencia de transgenes en el

polen.

En este trabajo se diseño y construyó de un vector específico para la modificación

genética de frijol (Phaseolus vulgaris). Para la construcción del vector se utilizó la

región atpB-rbcL de 3 kb que contiene un sitio único de restricción en la región

intergénica en la cual se insertó un sitio múltiple de clonación. En este sito se insertó el

gen aadA que confiere resistencia a espectinomicina a las especies sensibles a este

antibiótico y el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (gfp). El vector se

caracterizó molecularmente y por secuenciación. La funcionalidad del vector se

comprobó por la capacidad de conferir resistencia a la espectinomicina y por la

capacidad de las células de emitir fluorescencia; así como introduciendo este vector en

cloroplasto de hojas de P. vulgaris por biobalística, observándose fluorescencia en

cloroplastos usando un microscopio confocal de barrido laser. También, se realizaron

ensayos preliminares para establecer un protocolo de regeneración in vitro de P.

vulgaris.

viii

ABSTRACT

Common bean (Phaseolus vulgaris) is an economic important crop and one of the

major grain legumes for human consumption in Latin America, Africa and Asia. Despite

its importance, production growth rates are limited by viral, fungal and bacterial

pathogens, insects, lack of drought tolerances and nutritional deficiencies of soil.

Therefore, there is considerable interest in the development of new bean cultivars

with useful agronomical traits. Most genetically transformed plants obtained so far are

the result of transfer of DNA into the nuclear genome. Plants also contain a genome in

the mitochondria and plastids or chloroplasts. The latter can be modified with genes

that confer characteristics to plants that may have applications in the biotechnology

industry and many advantages over the nuclear genome modification. Other

advantages include greater stability of transgenes and uniformly transmitted maternal

seed progeny, thus avoiding the presence of transgenes in pollen.

In this work, it was completed the design and construction of a specific vector for

common bean (Phaseolus vulgaris) genetic modification. For the construction of the

vector atpB-rbcL of 3 kb first was inserted a multiple cloning site (MCS) and in this site

was inserted the aadA gene that confers resistance to spectinomycin to susceptible

species. And then was inserted gene encoding the green fluorescent protein (gfp). The

vector was molecularly characterized and by sequencing. The functionality of the

vector was verified by the ability to confer resistance to spectinomycin and the ability

of cells to emit fluorescence. This vector was introducing into the chloroplast leaf of P.

vulgaris by biolistic. Chloroplast fluorescence was observed using a laser scanning

confocal microscope. Also, a preliminary study was to establish a protocol for in vitro

regeneration protocol of P. vulgaris

ix

INDICE

Resumen ....................................................................................................................................... vii

Abstract ...................................................................................................................................... viii

1. Introducción............................................................................................................................... 1

2. Marco teórico ............................................................................................................................ 3

2.1 Importancia del fríjol ............................................................................................................... 3

2.2 Regeneración in vitro .............................................................................................................. 4

2.2.1 Regeneración indirecta de Phaseolus ................................................................................... 6

2.2.2 Regeneración directa de Phaseolus ...................................................................................... 6

2.3 Transformación genética de cloroplasto ................................................................................. 7

2.3.1 Plástidos ............................................................................................................................... 7

2.3.2 Cloroplasto ........................................................................................................................... 8

2.3.2 Cloroplasto ........................................................................................................................... 8

2.3.3 Transformación del cloroplasto ............................................................................................ 9

2.4 Métodos de transformación genética .................................................................................. 10

2.4.1Por medio de Agrobacterium .............................................................................................. 11

2.5 Diseño y construcción de vectores ........................................................................................ 11

2.5.1 Plásmidos ........................................................................................................................... 11

2.5.2 Vectores de transformación plastídicos ............................................................................. 12

3. Justificación ............................................................................................................................. 13

4. Objetivos .................................................................................................................................. 14

4.1Objetivo general ................................................................................................................... 14

4.2 Objetivo general ................................................................................................................... 14

5. Materiales y Métodos ............................................................................................................. 15

5.1 Materiales ............................................................................................................................. 15

5.1.1 Reactivos ............................................................................................................................ 15

5.1.2 Medios de cultivo para bacterias y tejidos vegetales ......................................................... 15

5.2 Plásmidos .............................................................................................................................. 16

5.2.1 pBlueScript KS II .................................................................................................................. 16

5.2.2 Iniciadores .......................................................................................................................... 16

5.3 Métodos ................................................................................................................................ 16

5.3.1 Extracción de ADN de células vegetales ............................................................................. 16

5.3.10 Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. .................................. 19

5.3.2 Amplificación de la secuencia homóloga por la técnica de PCR ........................................ 17

5.3.3 Preparación de células químicamente competentes .......................................................... 17

5.3.4 Transformación de E. coli Top 10 F’.................................................................................... 17

x

5.3.5 Extracción de ADN bacteriano ............................................................................................ 18

5.3.6 Construcción del vector transformante. ............................................................................ 18

5.3.7 Digestión de ADN con enzimas de restricción. ................................................................... 19

5.3.8 Ligación de fragmentos de ADN ......................................................................................... 19

5.3.9 Análisis cualitativo de bandas de ADN a partir de geles de agarosa. ................................ 19

5.4 Protocolo para la regeneración in vitro de Phaseolus vulgaris de acuerdo a Malik et al.,

1991. ........................................................................................................................................ 20

5.4.1 Material vegetal ................................................................................................................. 20

5.4.2 Limpieza y sanitizaciòn de semillas .................................................................................... 20

5.4.3Germinación de semillas ..................................................................................................... 20

5.4.4 Inducciòn de callos ............................................................................................................. 20

5.5 Protocolo para la regeneración in vitro de Phaseolus vulgaris de acuerdo a Quintero et al.,

2010 ......................................................................................................................................... 21

5.5.1 Material vegetal ................................................................................................................. 21

5.5.2Limpieza y sanitización de semillas ..................................................................................... 21

5.5.3 inducción y Multiplicaciòn de yemas o brotes .................................................................... 21

5.5.4 Elongación y enraizamiento (ERM) ................................................................................... 21

6. Resultados y discusión ............................................................................................................. 22

6.1 Estrategia de construcción .................................................................................................... 22

6.2 Descripción de la región homologa seleccionada atpB- rbcL ................................................ 23

6.3 Extracción de ADN de frijol y amplificación de la región atpB-rbcL ...................................... 24

6.4 Contrucciòn del plásmido pMV1-aadA .................................................................................. 27

6.5 Contrucciòn del plásmido pMV1-aadA-GFP .......................................................................... 29

7. Regeneración de tejidos vegetales de acuerdo con Malik et al., 1991 ................................... 32

7.1 Germinación .......................................................................................................................... 32

7.2 Formación de callos ............................................................................................................... 33

8. Regeneración de tejidos vegetales de acuerdo con Quintero et al., 2010 ............................. 36

8.1 Formación de grupos de yemas ............................................................................................. 36

8.2 Diferenciación de brotes ........................................................................................................ 37

8.3 Desarrollo de la planta de P vulgaris ..................................................................................... 38

9. Conclusiones ............................................................................................................................ 38

10. Perspectivas ........................................................................................................................... 38

11. Referencias ......................................................................................................................................... 39

Diseño y construcción de vectores para la transformación genética del cloroplasto de frijol (Phaseolus vulgaris).

1

1. Introducción

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una de las leguminosas más importantes para

agricultores de pequeña escala en América Latina y África (Singh, 1996). Además, el cultivo de

frijol es una fuente de proteína de alto nivel de consumo y bajo costo para familias de escasos

recursos (CIAT, 1992 y Rodríguez, 1996).

Una serie de factores bióticos (hongos, bacterias, nematodos, virus, plantas parásitas, insectos)

y factores abióticos (sequía, heladas, salinidad, etc.) afectan gravemente a la producción de

este cultivo. La adaptabilidad y la productividad de las leguminosas es limitada mayormente

por factores abióticos como la sequía, calor, frío, inundaciones, la salinidad y minerales

tóxicos. Aunque el tipo y la gravedad dependen de la ubicación de los cultivos, los daños

causados por factores abióticos pueden ser tan grandes como por los causados por factores

biótico. Además, los cultivos bajo estrés abiótico suelen ser más susceptibles hierbas malas,

insectos y enfermedades, que aumentan considerablemente las pérdidas (Reddy et al.,

2004)

Durante los últimos años, aumentar la producción de frijol común se ha conseguido debido

principalmente a la gran cantidad de productos químicos aplicados (fertilizantes, herbicidas,

pesticidas, o insecticidas), la mecanización, así como las técnicas de mejora. Estas prácticas, sin

embargo, han generado diversos problemas económicos y ecológicos, en particular la

contaminación del medio ambiente y la necesidad de suministro de energía extra. Al mismo

tiempo, los avances en genética y mejoramiento convencional de los granos se vio

obstaculizada en muchos aspectos. Debido al largo proceso de cultivo y selección recurrente,

la diversidad genética del frijol ha sido erosionada y ha llegado a ser muy estrecha. Los

métodos tradicionales de cultivo se vieron limitados por el bajo potencial de recombinación

como resultado de la auto-polinización, la baja capacidad de la herencia de algunos

importantes características (producción total y los componentes de la producción) y aborto del

embrión en algunos híbridos interespecíficos. Los métodos biotecnológicos ofrecen para

superar estas limitaciones y llevar a una mejora de frijol en diferentes maneras: (i)

modificación de los modos de reproducción o el desarrollo de esterilidad del citoplasma, estos

contribuirá a incrementar la resistencia o tolerancia a pesticidas y enfermedades, a factores de

estrés ambiental así como a mejorar la calidad de la semilla y la arquitectura de la planta

(Zambre et al. 2002). Sin embargo, el desarrollo de un sistema óptimo en el regeneración in

vitro sigue siendo un gran desafío (Lonescu et al., 1995).

El programa de mejoramiento genético tradicional se basa en la variabilidad genética natural y

la reproducción sexual. La variabilidad se ve restringida por barreras de cruzabilidad, esta

limitación se ha superado mediante el desarrollado de métodos no sexuales para transferir

genes, como la transformación genética (Díaz et al., 2004). Es por tanto, que la transformación

genética es una herramienta del mejoramiento genético que permite la introducción de genes

específicos a diferentes variedades. Incorporando características como tolerancia a la sequía,

resistencia a plagas y enfermedades, así como aumentar la calidad nutricional (CIAT, 2008). No

obstante, en las especies de Phaseolus estas técnicas se hacen muy difíciles por lo recalcitrante


2

del cultivo in vitro y la poca reproducibilidad de los experimentos, entre otras causas

(Kanchiswamy et al., 2008). Además, la transformación genética de frijol ha sido limitada por la

inexistencia de protocolos eficientes, rápidos y reproducibles para regeneración de la planta.

La mayoría de plantas transformadas genéticamente obtenidas hasta el momento son el

resultado de la transferencia de ADN del genoma nuclear. Las plantas además contienen un

genoma en la mitocondria y en los plástidos. En ambos casos el genoma puede ser modificado

genéticamente pero el plastoma es el que ha recibido creciente atención en los últimos años,

en particular la del cloroplasto, ya que la modificación de éste tiene muchas ventajas y

aplicaciones en la industria biotecnológica (Gaglani et al., 2006).

Las plantas obtenidas por modificación genética del cloroplasto reciben el nombre de

transplástomicas y en comparación con las plantas transgénicas convencionales están

resultando más atractivas ya que ofrecen ventajas y potenciales más seguros. Debido a que el

genoma del cloroplasto es altamente poliploide (Sugiura, 1992), la modificación genética

resulta en la presencia de miles de copias de un transgen, lo cual puede generar niveles

extraordinariamente altos de proteínas recombinantes (De Cosa et al., 2001). El número de

copias de genes codificadas en dos regiones invertidas repetidas de la plantas superiores

alcanza cerca de las 20,000 copias, resultando en altos niveles de expresión de los transgenes.

La expresión de algunas proteínas exógenas ha llegado a ser del 70% de la proteína soluble

total (Oey et al., 2009) niveles de acumulación observado a partir de transgenes nucleares es

generalmente inferior al 1% (Gaglani, 2006).

Otra de las ventajas con gran peso, sobre todo desde el punto de vista de la bioseguridad, es

que en la mayoría de las especies de interés comercial la transmisión del genoma plastídico se

da por vía materna, lo cual limita la dispersión de los transgenes por el polen. Se piensa que

esto podría tener un efecto positivo en la aceptación de los cultivos transgénicos, su uso como

bioreactores y en determinado momento su liberación al medio ambiente (Heifetz, 2000).

Los protocolos existentes para la obtención de plantas transplantómicas se basan en la

transferencia de genes por el método de bombardeo de micropartículas o el método de

polietilenglicol PEG (Newell, 2000). En estos protocolos, los genes son introducidos a los

cloroplastos en un vector de transformación, el cual es bombardeado por micropartículas o

introducido al permeabilizar la membrana con PEG, seguido de un proceso de cultivo y

selección in vitro para recuperar las líneas transformadas. Los vectores de transformación

tienen la particularidad de que contienen secuencias que flanquean al transgen y que son

homologas a secuencias endógenas del plastoma (Darbani et al., 2006).


3

2. Marco teórico

2.1 Importancia del fríjol

El frijol es un cultivo importante para la nutrición humana, ya que complementa con proteínas

los requerimientos nutritivos no proporcionados por otros cultivos como maíz y arroz, que

constituyen la fuente más importante de carbohidratos. Por otro lado, el frijol aunque es rico

en aminoácidos esenciales, es deficiente en aminoácidos que contienen azufre, como la

metionina; sin embargo, las proteínas de los cereales proporcionan este aminoácido, en tanto

que carecen de aminoácidos esenciales como la lisina. Así, el consumo equilibrado de

leguminosas y cereales (1:2), generalmente, alivia estas deficiencias naturales y asegura una

dieta balanceada (Bresanni, 1983). Desafortunadamente, en muchos casos, esta relación

óptima es difícil de alcanzar, ya que los rendimientos en la producción de leguminosa en el

mundo es aún limitante. Esto lleva a la inevitable conclusión de que incrementar los

rendimientos en la producción de leguminosas, en particular frijol para regiones de América

Latina y África, tendría repercusiones importantes en el mejoramiento de la calidad nutritiva y

por tanto de la salud de millones de consumidores particularmente en países en vías de

desarrollo (Alarcón et al., 2003).

El frijol (Phaseolus sp. L) es de los cultivos más antiguos del Nuevo Mundo en combinación con

maíz y yuca, el frijol ha sido, por milenios, uno de los alimentos básicos en las regiones con

latitudes bajas y medias del continente americano. Este cultivo presenta una gran diversidad

no sólo en términos de su adaptabilidad a un amplio intervalo de ambientes, sino también en

cuanto a los métodos de cultivo, a su uso y a su variabilidad morfológica (Shoonhoven et al.,

1991).

En los últimos veinte años, el cultivo de frijol se ha incrementado gradualmente a escala

comercial de tal forma que ahora se ofrece no sólo en mercados regionales sino también

nacionales e internacionales. De hecho, el fríjol es una de las leguminosas de mayor consumo

humano en el mundo. Su producción total rebasa los 23 millones de toneladas cúbicas, de los

cuales siete de ellos se producen en América Latina y África (Roca et al., 1994). En México se

sembraron 1.6 millones de hectáreas (Ha) de frijol en el 2008 con un rendimiento de 0.74

Ton/Ha y un valor de su producción de de poco más de 10,000 millones de pesos. La superficie

de frijol en México ha disminuido paulatinamente en los últimos 10 años (de 2.4 millones de

hectáreas que se sembraron en 1999 a 1.6 en el 2008). El rendimiento del cultivo del frijol en

México se encuentra muy por debajo de su potencial de producción y del obtenido en otras

regiones del mundo como EUA, con un rendimiento de 1.92 ton/Ha.

La problemática del cultivo del frijol en México es compleja debido a las condiciones

biogeografías existentes en las diferentes regiones en las que se produce, así como a las

preferencias regionales de consumo de los distintos tipos de frijol (negros, bayos, peruanos,

etc.). Adicionalmente, el cultivo ha sido desplazado a zonas de temporal cuyo principal

problema es la disponibilidad de agua, con suelos con bajo contenido de materia orgánica,

presencia de plagas y enfermedades y heladas tempranas. Por otro lado un bajo uso de


4

variedades mejoradas, pese a la amplia gama de variedades liberada por la INIFAP. Toda esta

situación es en realidad un problema típico de las regiones agrícolas de América Latina donde

sistemáticamente atribuyen sus problemas a cuestiones de mercado externo y no se corrigen

las diferencias locales (Rodríguez, 1996).

El reto de los productores de frijol es sin duda mejorar su competitividad, reto que resulta

difícil de alcanzar si no se incorpora el uso de tecnologías tradicionales y modernas, con el

objetivo de incrementar la producción de mejorar la productividad de manera sostenible y

eficiente. Dentro de los factores que limitan la productividad del frijol se encuentran la

presencia de organismos patógenos, deficiencias nutricionales y particularmente la limitación

de agua. Adicionalmente a los factores anteriormente expuestos, para mejorar la

productividad del cultivo se deben considerar las diversas regiones de cultivo, el sistema de

producción y la variedad a mejorar (Reddy et al., 2004)

A pesar de los avances alcanzados en la investigación del cultivo del frijol en México, es

necesaria la realización e investigación integral de vanguardia que pueda aplicarse en el corto

tiempo y que incluya un equipo interdisciplinario que pueda abarcar la problemática antes

enunciada y que incluya las problemáticas particulares de cada zona productora del país, así

como las principales variedades consumidas en México.

Por todas estas razones, en el año 2011 diversos centro de investigación del Instituto

Politécnico Nacional con experiencia en diferentes ramas de biotecnología agrícola pusieron el

marcha el megaproyecto para el Fortalecimiento de la Rentabilidad del Sistema Producto

Frijol mediante el uso de Herramientas Biotecnológicas con el fin de resolver de manera

integral los problemas que como se menciono anteriormente, afectan este cultivo. En la

presente tesis se busca la construcción de vectores para la modificación genética de

cloroplastos de frijol así como el establecimiento de un protocolo reproducible de

regeneración que sirva de base para llevar a cabo la modificación genética.

2.2 Regeneración in vitro

La regeneración in vitro de frijol sigue siendo difícil, poco repetible y un proceso de baja

eficiencia (Quintero et al., 2010; Gatica et al., 2011) sugieren que la semilla que esta

leguminosa es altamente recalcitrante, en la regeneración in vitro pudiera resultar de larga

historia de endogamia y selección para genotipos de alto rendimiento, lo que lleva a reducir la

variación en especies nuevas. Para poder transformar esta especie es necesario contar con un

protocolo eficiente de micropropagación y regeneración. La importancia de tener una buena

técnica de micropropagación reside en que se podrá multiplicar vegetativamente nuestra

variedad de manera sencilla y económica, obteniendo así un gran número de individuos

genéticamente idénticos en un corto espacio de tiempo. Disponer de un protocolo de

regeneración es indispensable como paso previo a la transformación (genética) de modo que a

partir de una o varias células transformadas sea posible obtener un individuo adulto con las

características deseadas.


5

Al contrario que en animales, donde la diferenciación celular es generalmente irreversible, en

plantas, incluso en células maduras y diferenciadas, se retiene la capacidad para volver al

estado meristemático. El proceso de reversión de una célula diferenciada a un estado

meristemático se denomina desdiferenciación. La capacidad inherente de una célula vegetal

para dar una planta completa (una capacidad que es, con frecuencia, retenida incluso después

de que experimente una diferenciación final en la planta) es conocida como totipotencia

celular. Para que una célula diferenciada exprese su totipotencia es necesario que primero

experimente una desdiferenciación y a continuación una nueva diferenciación que la capacita

para responder a ciertos estímulos del cultivo o ambientales (Bhojwani et al., 1986). En otras

palabras, la célula adquiere competencia y va a poder expresar su potencial organogénico.

Las células que han adquirido competencia para la morfogénesis in vitro están preparadas para

expresar un patrón de desarrollo en un apropiado medio ambiente in vitro. El patrón de

desarrollo está determinado por los constituyentes del medio y por factores genéticos y

epigenéticos. Aunque algunas especies pueden regenerar a partir de tejido somático de

acuerdo a protocolos estándar, otras especies cercanas podrían no responder a los mismos

protocolos. Las dificultades para regenerar ciertos genotipos podrían ser debidas a que la

adquisición de competencia, inducción y diferenciación celular estarían mediadas de diferente

manera en cada genotipo (Litz et al., 1992). La inducción de formación de yemas en tejido

somático (hojas, tallos, raíces o tejidos florales) se denomina regeneración somática o

adventicia u organogénesis somática, y generalmente se considera que puede ser indirecta si

existe una formación intermedia de callo o directa si ocurre sin callogénesis (Figura 1).

Figura 1. Etapas de la embriogénesis somática (Litz et al., 1992)


6

2.2.1 Regeneración indirecta de Phaseolus

En el caso de organogénesis indirecta a partir de hojas, los callos organogénicos se inician por

división celular de las capas celulares del mesófilo, especialmente alrededor del tejido

vascular, en los primeros 2-6 días después de poner el explante en el medio de cultivo. Las

células comienzan a dividirse al azar y se forman grupos pequeños y densos de centros

meristemáticos aproximadamente 6 días después del cultivo. En el medio de inducción, los

centros meristemoides se agrandan, y cada uno de ellos forma eventualmente un montículo

en la superficie del explante. Los primordios foliares son visibles 14-25 días después del inicio

del cultivo (Welander, M. 1988). En brotes adventicios bien definidos el tejido vascular se

continúa con la masa de callo subyacente.

La propagación por regeneración indirecta conlleva el riesgo de que las plantas regeneradas

difieran genéticamente de la planta madre, lo que se denomina variación somaclonal. Debido a

esto, el uso de callos para su posterior propagación no es recomendado a menos que tengan

una naturaleza altamente organizada. La variación somaclonal es más frecuente en plantas

regeneradas por organogénesis indirecta que las formadas por embriogénesis indirecta

(formación de embriones somáticos), al menos en algunas especies (George, 1993).

Se han descrito tres protocolos de propagación vía organogénesis indirecta en Phaseolus

vulgaris. (Mohamed et al., 1993) trataron de propagar in vitro cinco cultivares de P. vulgaris,

pero solo tuvieron éxito con dos (Tara y Xan-159) que son híbridos obtenidos por cruzamiento

de P. acutifolius x P. vulgaris. Además, sus resultados no pudieron ser repetidos por (Zambre et

al., 1998). El segundo protocolo fue propuesto por (Zambre et al. 1998) quienes obtuvieron

plantas de P. vulgaris a través de organogénesis indirecta en una línea mejorada de Xan-159,

pero sus resultados son altamente dependiente del genotipo usado. Los dos protocolos

inicialmente publicados son poco eficientes y pobremente repetibles, se limitan a

determinados genotipos generalmente de bajo valor comercial (Arellano et al., 2008). El tercer

y más reciente protocolo fue informado por (Arellano et al., 2008). Estos autores formaron

brotes a partir de callos en 10 cultivares de P. vulgaris, pero ha sido demostrado que esta

especie es genotipo dependiente y es muy difícil repetir los protocolos publicados en otras

variedades (Collado et al., 2008).

2.2.2 Regeneración directa de Phaseolus

La organogénesis somática puede ocurrir también directamente desde el explante sin la

formación de callo. Esta forma de regeneración ha sido observada raramente o es desconocida

en algunas especies, y en los casos en los que se ha descrito las evidencias histológicas han

sido, en ocasiones, insuficientes para confirmar estas observaciones (Litz et al., 1992). El

cultivo de tejidos y la regeneración de plantas en P. vulgaris ha tenido serias dificultades desde

los primeros intentos realizados por (Hildebrandt et. al., 1963, citado por García, et al., 2008)

hasta 1975. Varios tipos de explantes han sido utilizados para la regeneración directa de

plantas siguiendo la vía de la organogénesis. Por ejemplo, cultivo de meristemos (Kartha et al.,


7

1981, citado por García et al., 2008), regeneración de brotes de pecíolo de hojas (Radeva et

al., 2005), explantes cotiledonales o cultivo de ejes embrionarios (Mohamed et al., 1992;

Hernández et al., 2002), organogénesis directa a partir de plántulas, sin y en presencia de

meristemos axilares (Mohamed et al., 1992) o en presencia de meristemos axilares (Franklin

et al., 1991, citado en García L. et al., 2008), brotes caulinares (Eissa et al., 2002) y embriones

cigóticos (Popelka et al., 2004). Todos estos explantes al ser multicelulares traen consigo la

aparición de quimeras en las plantas regeneradas después de un evento de transformación

genética. Es por ello que se hace imprescindible la búsqueda de métodos que permitan la

inducción y formación de yemas múltiples, las cuales se forman a partir de una o pocas células

en el tejido (Broetjes et al., 1980; Vuylsteke, D. et al., 1997). Algunas veces la regeneración

directa está acompañada por proliferación celular local, que en algunos casos da lugar a la

formación de un callo primario, por lo que para decidir si la morfogénesis ha sido directa o no

se requiere un estudio histológico de los tejidos (George, 1996). La formación de este callo

puede ser reducida, normalmente, por ajuste de los reguladores del crecimiento del medio de

cultivo (George, 1993).

2.3 Transformación genética de cloroplasto

2.3.1 Plástidos

Las células eucariotas probablemente evolucionaron a partir de asociaciones endosimbiótica

entre diferentes organismos procarióticos, la comparación de secuencias de ARN ribosomal

sugiere que los plástidos vegetales comparten un ancestro en común con las cianobacterias

actuales, tal como el organismo de vida libre Synechococcus lividus (Keeling, 2004). Un

fenómeno actual de endosimbiósis conocido como “endosimbiosis secundaria”, involucra la

adquisición, por ciertos organismos, de plástidos a partir de algas eucarióticas (McFadden,

1999).

Los plástidos son organelos hallados únicamente en células de planta y algas. Los mismos son

responsables de la fotosíntesis, del almacenamiento de una amplia variedad de productos, y

de la síntesis de moléculas requeridas para la arquitectura básica y el funcionamiento de las

células que los contienen. Estos organelos varían en tamaño, forma, contenido y función y,

como puede observarse en la Figura 3, poseen una gran capacidad de diferenciación,

desdiferenciación y rediferenciación. Todos los tipos de plástidos mencionados en la figura 2 se

desarrollan a partir de los pro-plátidos mencionados, que son los precursores presentes en las

regiones meristemáticas de la planta (Keeling, 2004).


8

Figura 2. Ciclo del desarrollo plastídico y la interconversión de varios tipos de plástido (Moller, 2005).

2.3.2 Cloroplasto

Los plástidos como los cloroplastos en plantas superiores son organelos semiautónomos que

cuentan con su propia maquinaria de replicación, transcripción y traducción (Maliga, 2003),

son capaces de llevar a cabo el proceso de la fotosíntesis, y desintetizar compuestos como

aminoácidos, carbohidratos complejos, ácidos grasos y pigmentos, además de proteínas, por lo

que al modificar su genoma es posible sintetizar proteínas recombinantes aprovechando su

maquinaria de replicación, transcripción y traducción (McBride et al., 2006).

El cloroplasto, puede tener de 1,000 a 10,000 copias de su genoma, por tal característica los

genes al estar en gran número de copias, su expresión resulta en una abundancia de los

transcritos y una alta acumulación de proteínas en el cloroplasto, además, de que el genoma

del cloroplasto no se ha descrito fenómenos de silenciamiento de genes. El ADN del

cloroplasto es circular y de doble cadena, en el que se pueden identificar cuatro regiones: una

región mayor de genes de copia simple; una región menor de genes de copia simple y dos

copias de regiones invertidas (IR) que separan las regiones de copias simple (Sugiura, 1992).

Los genomas plastídicos de diferentes especies pueden variar considerablemente en tamaño.

Sin embargo, la mayoría de los genomas plastídicos tienen entre 120 y 220 kb y comparten una

distribución y organización genética similares. Gran parte de la variación encontrada entre


9

genomas plastídicos de distintas especies se debe a cambios en las regiones IR (Wakasugi et

al., 1998). Lo anterior se presenta como una alternativa en el diseño de vectores para la

inserción y expresión de genes sintéticos por recombinación homologa con la finalidad de

expresar una proteína recombinante (Bock, 2001). En general la trasformación de cloroplastos

es una tecnología relativamente nueva y muy prometedora, debido a que presenta múltiples

ventajas como son: niveles de expresión más altos que la transformación nuclear, expresión

estable heredable a la progenie, no hay limitaciones en el tamaño de la secuencia a introducir,

no hay efectos de posición (transformación por recombinación homóloga), introducción de

policistrones y la transferencia horizontal del transgen es escasa o nula (Bock, 2001).

2.3.3 Transformación del cloroplasto

La generación de plantas transgénicas, por modificación genética del núcleo, mediante el

empleo del Agrobacterium, o por métodos directos de transformación ha sido durante mucho

tiempo la principal estrategia para obtener nuevas variedades con características deseadas. Sin

embargo, algunas limitaciones que presenta la transformación nuclear solo pueden ser

eliminadas mediante la introducción selectiva de los nuevos genes en los organelos de la

célula vegetal (Maliga, 2003). En particular, la expresión de genes heterólogos en los plástidos

presenta las siguientes ventajas con respecto a su contraparte nuclear. 1) un nivel de

expresión del transgen de 10 a 50 veces mayor que en el núcleo dado el alto número de copias

de cada genoma del plástido (Bock, 2001); 2) la inserción de los nuevos genes puede ser sitio

especifico por recombinación homologa evitándose los efectos de posición, silenciamiento y

otros fenómenos que influyen sobre la expresión de los genes introducidos al núcleo celular;

3) es posible la expresión de genes en operones, lo cual es muy deseable cuando se trata de

hacer ingeniería de las vías metabólicas o de alterar caracteres que son mutagénicos (Bock,

2001); 4) la heredabilidad de la información genética es materna, por lo que se evita que

mediante el polen se dispersen en el ambiente los nuevos caracteres introducidos,

eliminándose así posibles daños al entorno (Dufourmantel et al., 2004). Adicionalmente, la

expresión de genes en plastidios brinda la posibilidad de acumular allí proteínas heterólogas

que en ese microambiente pudieran tener una mayor estabilidad, o del cual pudieran ser más

fácilmente purificadas (Maliga, 2003).

Diferentes métodos de han reportado para la introducción de genes en plastídios de algas y

plantas superiores. En particular, han sido muy empleados el bombardeo con micropartículas

aceleradas recubiertas de ADN, y en menor escala la transformación de protoplásto vegetales

mediante PEG (ZoubenKo et al., 1994).

Relacionado con la rama de la Biotecnología y más específicamente con la ingeniería Genética

de las Plantas. En particular, se proporcionan construcciones de ADN (plamidos o vectores)

útiles para introducir con alta eficiencia y expresar genes foráneos en plastidos de plantas y se

demuestra la utilidad de las mismas para obtener con alta eficiencia plantas transplantomicas

que expresan proteínas heterólogas.


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2.4 Métodos de transformación genética

Los elementos básicos necesarios para transformación genética en plantas son cuatro: Un

sistema de cultivo de tejidos para regenerar plantas completas y fértiles; Vectores apropiados

para clonar el gen de interés y/o transferir al tejido a transformar; Un protocolo de

transformación con sistema de transferencia de genes y selección del material transformado; y

Herramientas de análisis para detectar la presencia del transgen (Díaz et al., 2004).

La transformación genética requiere la introducción de un fragmento de ADN (gen) en una

célula. Sin embargo, la pared celular impide la entrada del ADN en la célula, la cual es superada

por métodos de transformación genética (Díaz et al., 2004). Existen dos métodos para

desarrollar plantas transgénicas: métodos directos como transformación mediante

Agrobacterium o métodos físicos como biobalística (bombardeo de partículas), tratamiento

con polietilenglicol (PEG), microinyección, electroporación, utilización de láser y abrasión con

fibras.

El co-cultivo de células o tejidos con Agrobacterium tumefaciens es el procedimiento más

utilizado para transformar planta dicotiledóneas (Tecnociencia, 2003). Este método se aplicó

con éxito por primera vez en 1984 en tabaco (Nicotiana tabacum L.) y girasol (Helianthus

annus L.) (Carrasco, 1999). Las gramíneas y en general todas las monocotiledóneas presentan

gran resistencia a Agrobacterium por lo que este método es inviable en un extenso grupo de

plantas de gran importancia económica (Carrasco, 1999). Este método se basa en el

mecanismo natural de infección de la bacteria del suelo A. tumefaciens que introduce un gen

de su plásmido en las células de la planta infectada. Este gen se integra en el genoma de la

planta provocándole un tumor o agalla. Un plásmido es un fragmento de ADN circular y

extracromosómico que contiene información no vital para la bacteria y su tamaño es del orden

del 1 al 3% del cromosoma bacteriano (Carrasco, 1999).

El desarrollo de la patogénesis de la planta por Agrobacterium representa una situación única

en la naturaleza: la transferencia de un elemento genético (T-ADN) de un organismo procariota

a un organismo eucariota superior, con su subsiguiente integración y expresión en el genoma

hospedador. Este mecanismo de ingeniería genética natural es aprovechado para la

transferencia de genes de interés a las plantas. Para lo cual, en el plásmido los oncogenes y

genes de síntesis de opinas, son reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a

transferir (Díaz, et al., 2004).

Según Díaz et al. (2004), la transformación con Agrobacterium en explantes consiste en

inocular un explante con A. tumefaciens, dejar la bacteria con el explante por un tiempo donde

ocurre la transferencia del T-DNA que contiene un gen marcador seleccionable y el transgen de

interés. Después, los explantes se transfieren a un medio de cultivo que contiene un

antibiótico que actúa como bacteriostático y un agente selectivo que corresponde al gen

marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y selección in

vitro, se recuperan las plantas transgénicas (Figura 1).


11

2.4.1 Por medio de Agrobacterium

Un amplio número de especies de leguminosas han sido transformadas genéticamente. El

método basado en Agrobacterium se ha usado mucho con un amplio número de explantes de

tejido produciendo niveles bajos de transformación (0.1-5%), (Atkins et al., 1997). Las

leguminosas son plantas recalcitrantes, es decir que son difíciles de regenerar. (García et al.,

2001) afirman que las leguminosas y en particular el frijol, han presentado dificultad en

organogénesis in vitro y embriogénesis somática; y otros procesos de regeneración usados en

otras especies vegetales no han sido posibles en leguminosas. Ellos señalan que siendo una

familia de gran interés comercial, varios intentos se han realizado para establecer un proceso

de regeneración eficiente en la transformación de algunas variedades. Por lo que la

modificación genética de frijol presenta dificultades ya que no existe un protocolo eficiente de

regeneración.

2.4.2 Por medio de biobalística

La tecnología básica de la transformación genética de cloroplastos fue desarrolla originalmente

para Chlamydomonas reinhardtii (James et al., 2005), y muchas de las técnicas empleadas,

como la transferencia de ADN vía bombardeo de partículas han sido aplicadas directamente a

las plantas. Sin embargo, hay diferencias biológicas entre los plástidos contenidos en un alga

unicelular y una célula vegetal, las cuales incluyen el tamaño de los genomas y genes

presentes, el número de copias del genoma presentes por célula y el número de nucléidos por

plástido, la morfología de las células y el tipo de tejido. En cloroplastos dos métodos básicos se

han empleado para la modificación de su genoma, la biobalística (Svab et al., 1993) y el

tratamiento de protoplastos con polietilenglicol (PEG) (Lelivelt, 2005). En biobalística se asume

que el DNA transformante entra al genoma mediante el impacto mecánico de proyectiles de

oro o tungsteno cubiertos con este DNA transformante, mientras que el mecanismo que sigue

la transformación de los cloroplastos mediante el tratamiento de protoplastos con

polietilenglicol (PEG) es aún desconocido (Koop et al., 2007).

2.5 Diseño y construcción de vectores

La construcción de vectores (plásmidos) es necesaria para llevar a cabo una transformación

exitosa ya que a través de estos, se logrará la expresión de los genes; sin embargo, deben

cumplir con algunas condiciones para que puedan ser efectivos.

2.5.1 Plásmidos

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN, extracromosomales, en su mayor parte

circulares y autoreplicables, que se originan en casi todas las bacterias y también en algunos

eucarióticos, así como en las mitocondrias. El tamaño de los plásmidos varían entre

aproximadamente 1.5 a 300kb. Los plásmidos bacterianos son por lo general circulares,

cerrados covalentemente y superenrrollados. Frecuentemente, portan genes resistentes

frente a antibióticos o metales pesados, genes para la metabolización de sustrato atípico o


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genes para un conjunto de características de tipo específico, como propiedades metabólicas o

factores de virulencia. Se pueden transferir varios plásmidos de una célula a otra célula, debido

a que la patogenicidad de las bacterias, según la visión actual, está en parte condicionada por

las propiedades de los plásmidos, existe un gran interés creciente en el esclarecimiento de las

propiedades del ADN del plásmido.

2.5.2 Vectores de transformación plastídicos

La inserción estable en el genoma plastídico de las secuencias de ADN introducidas, se ha

logrado mayoritariamente utilizando los mecanismos eficientes de recombinación homologa

que naturalmente existen en estos organelos celulares (Bock, 2001). Es de destacar que cuanto

mayores sean las regiones homologas, con mayor frecuencia ocurrirán los eventos de

recombinación, siendo estos despreciables cuando las regiones homologas son menores de

137 pb (Zoubenko et al., 1994).

Muchas regiones han sido propuestas como sitios adecuados de recombinación para insertar

secuencias quiméricas en plástidos vegetales, entre ellas: rbcL-accD, psbE-petA, tmN-rps7/12,

tmN-16SrNA operon, psbA-tmH, tmA-tml, la región 23SrRNA, etc (Maliga, 2005). A pesar de

que algunas regiones se recomiendan como universales para la integración de secuencias

foráneas de ADN en los genomas de plastídios vegetales de diferentes especies de plantas, en

realidad presentan algunas limitaciones en cuanto a su universalidad debido a una o más de las

siguientes razones: 1) sus secuencias o estructuras no son altamente conservadas entre los

genomas plastídicos de plantas de especies diferentes; 2) poseen regiones de alta homología

muy pequeñas seguidas de o interrumpidas por intrones u otras regiones mucho menos

conservadas (lo que disminuye la frecuencia de recombinación homologa y por ende de

obtención de plantas transgénicos (transplantómicas)); 3) se encuentran formando parte de

operones o el correcto procesamiento de los RNA polocistrónicos (Tillich et al., 2006) con las

indeseables consecuencias que esto acarrea para el metabolismo del plastido. De hecho, no es

casual que utilizando vectores portadores de las regiones antes mencionadas como sitios de

recombinación, solo se han reportado adecuadamente documentadas en publicaciones

arbitrarias producciones de plantas trasplantómicas en tabaco (Zoubenco et al., 1994) papa

(Sidorov et al., 1999) y tomate (Ruf et al., 2001), todas especies solanáceas muy cercanas

evolutivamente y a nivel de estructura primaria del ADN. Adicionalmente, es de destacar que

todos los vectores propuestos que utilizan estas regiones de recombinación muestran baja

eficiencia de producción de plantas transplatómicas homoplámicas (plantas con todos sus

genomas plastídicos transformados). Esto último se debe probablemente a que incluyen el uso

de regiones terminadoras y promotores de origen plastídicos mayores de 174 pb (Maliga,

2004) lo que provoca que en muchos eventos de transformación se malogran por

recombinaciones entre elementos del vector y regiones homologas del genoma plastídico

dando lugar a plásmidos no viables (Bock, 2001).


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3. Justificación

El frijol junto con el maíz, representa toda una tradición productiva y de consumo,

convirtiéndolo en un alimento tradicional, siendo uno de los cultivos de mayor importancia

en nuestro país, ya que representa para la economía de los productos nacionales una fuente

importante de ocupación de ingreso, a la vez que es una garantía de seguridad alimentaria.

Por lo que es necesario implementar “Programas de mejoramiento de Frijol”, encaminados a

resolver los principales problemas que afectan este producto; tales como, plagas por

bacterias, hongos e insectos o factores ambientales (sequia), considerándose este último

como el problema más importante en México para la producción de este cultivo.

Para aumentar la productividad del frijol puede ser por medio de transformación genética del

mismo para hacerlo más resistente a factores bióticos o abióticos. La modificación genética

del cloroplasto de frijol (Phaseolus vulgaris) se presenta como una alternativa para introducir

un gen(es) de resistencia (es decir obtener de plantas transplantómicas).

Además, de que la transformación genética del frijol ha sido limitada por la inexistencia de

protocolos eficientes, rápidos y reproducibles para regeneración de la planta.

En este trabajo se propone el diseño y construcción de vector(es) para la modificación

genética del cloroplasto del frijol (Phaseolus vulgaris) así como el establecimiento de un

protocolo de regeneración de P. vulgaris.


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4. Objetivos

4.1 Objetivo general

Establecer un protocolo de transformación genética de cloroplastos de frijol

(Phaseolus vulgaris) con un gen de resistencia a espectinomicina y un gen de

fluorescencia GFP.

4.2 Objetivos específicos

Establecer un protocolo para la regeneración directa de Phaseolus vulgaris in vitro.

Construir un vector específico para la modificación genética de cloroplastos de frijol

con un gen de resistencia a espectinomicina y un gen de fluorescencia como prueba

de concepto.


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5. Materiales y Métodos

5.1 Materiales

5.1.1 Reactivos

Los reactivos utilizados fueron: agarosa grado Biología Molecular, mezcla basal de sales Murashige and Skoog (Sigma Aldrich. USA), 6-bencilaminopurina (BAP) (Sigma Aldrich. USA), sacarosa (Sigma Aldrich. USA), Gamborg (GM), Mio-inositol (Sigma Aldrich. USA), Piroxidina (Sigma Aldrich. USA), Tiamina (Sigma Aldrich. USA), Agar Noble (5.5 g L-1), bencilaminopurina-HCl (10 mg L-1). y Agar Noble (DIFCO), Enzimas de restricción (Fermentas. Canadá), marcadores de peso molecular, DNA polimerasas (Fermentas. Canadá), T4 DNA ligasa (Fementas. Canadá) y T4 DNA polimerasa (Fermentas. Canadá).

5.1.2 Medios de cultivo para bacterias y tejidos vegetales

Medio LB (Luria-Bertani). Triptona (1%w/v), extracto de levadura (0.5%w/v), NaCl (1% w/v). El pH se ajustó a 7.0 con NaOH 5 M. El medio se esterilizó en autoclave por 20 min a 121°C y 15 psi. Medio MS. Mezcla basal de sales (0.43%w/v), sacarosa (3%w/v), Agar Noble (0.55%w/v). El pH se ajustó a 5.7 con HCl 6 N. El medio se esterilizó en autoclave por 20 min a 121°C y 15 psi. Medios MS con citocininas. Medio MS con benzilaminopurina (BAP) a las concentraciones que aparecen en el cuadro 1.

Cuadro 1. Medios MS complementados con sacarosa (30g/L), vitamina B5, Agar Noble (5.5g/L), BAP a diferentes concentraciones.

Medio de cultivo MS Concentración de 6-BAP μM

A 1

B 5

C 10

D 15

E 20

Medio de Inducción y Multiplicación (IMM) consistió en GM (Gamborg et al., 1968, Sigma Aldrich) o adicionado con mio-inositol (100 mg L-1), piroxidina (1 mg L-1), tiamina (10 mg L-1), sa-carosa (2 %w/v), Agar Noble (0.55%w/v), bencilaminopurina-HCl (10 mg L-1) este último como regulador del crecimiento, pH 5.8 ajustado con NaOH 1N.

Medio de elongación y Enraizamineto (ERM) consistió en los mismos componentes que el

IMM, sin reguladores de crecimiento.


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5.2 Plásmidos

5.2.1 pBlueScript KS II

Vector comercial de 3.0 kb. Estuvo integrado por un fragmento del gen lacZ, el cual tiene encriptado un sitio de clonación múltiple (MCS) y su expresión es controlada por el promotor Plac. El fragmento del gen lacZ codifica para la β-galactosidasa. El plásmido contiene promotores T3 y T7 que proceden del fago T3 y T7 respectivamente y que interrumpen el gen lacZ, situándose en los flancos del MCS. Contiene también el origen de replicación de los plásmidos de la serie pUC. Contiene además un gen de resistencia a Ampicilina que permite seleccionar las bacterias que han sido modificadas.

5.2.2 Iniciadores

Iniciadores que se emplearon durante el desarrollo de este trabajo (cuadro2).

Cuadro2. Iniciadores para amplificación

Iniciadores Secuencia

JAB158 gtatGCGCGCaaccggcagaacacctggtagag

JAB159

gtatGCGCGCgtctcataatgttcttcaccaac

JAB200

JAB201

5.3 Métodos

5.3.1 Extracción de ADN de células vegetales

La extracción de ADN de células vegetales se realizó con el Kit ChargeSwitch® gDNA Plant de Invitrogen de acuerdo con las indicaciones de uso del fabricante. Antes de iniciar la extracción de ADN se enfrió el buffer N5 en hielo, posteriormente se congelaron 100 mg de hojas de frijol y un mortero con pistilo a -70ºC. Posteriormente se pulverizó el tejido hasta formar un talco seco que se colocó en un tubo de 1.5 mL. A temperatura ambiente se adicionó 1 mL del buffer de lisis Charge Switch (L18) y 2 μL de RNAsa A y se homogeneizó la mezcla. Se adicionaron 100 μL de SDS al 10% por cada mililitro del lisado de la planta y se incubó la muestra por 5 min, posteriormente se adicionaron 400μl del buffer de precipitación (N5) y se mezcló por inversión para después centrifugar a máxima velocidad por 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se transfirió a un tubo de 1.5 mL estéril. Para continuar con la extracción se resuspendieron las perlas magnéticas del Kit (ChargeSwitch magnetic beads) en su buffer de almacenamiento, después se agregaron 100 μL del detergente (D1) y 40 μL de perlas


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magnéticas a aproximadamente 1.2 mL de lisado que se mezclaron por pipeteo sin formar burbujas. La mezcla se incubó a temperatura ambiente por 1 min. El tubo con la mezcla se colocó en el MagnaRack del kit hasta que se formó un pellet. Este pellet contenía a las perlas magnéticas con el ADN adherido sobre su superficie. El sobrenadante se descartó con una pipeta y el tubo con el pellet se quitó del MagnaRack, se adicionó 1 mL del buffer de lavado (W12) y se mezcló la nueva solución sin formar burbujas. La solución se colocó nuevamente en el MagnaRack y por duplicado se lavó con el buffer de lavado (W12). El tubo con el pellet se quitó del MagnaRack y se agregaron 150 μL del buffer de elución (E6), posteriormente se incubó por 1 min a temperatura ambiente. Se colocó nuevamente el tubo en el MagnaRack y se extrajo el sobrenadante que contenía el ADN.

5.3.2 Amplificación utilizando DNA polimerasa KOD

Se siguieron las recomendaciones sugeridas por el fabricante. Se colocaron en un tubo para PCR 5 μL del buffer para la KOD 10X, 3 μL de MgSO4 25 mM, 5 μL de dNTPs 2 mM, 1.5 μL de cada iniciador a 10 µM, 1-5 μL de DNA molde, 1 μL de KOD Hot Start DNA polimerasa (1 U/μL) y agua desionizada estéril para completar 50 μL. La reacción se llevó a cabo en un termociclador MULTIGENETM MINI TC-020-24 (Labnet) por 30 a 35 ciclos de PCR. Las condiciones de la reacción fueron de 30 s a 94°C para desnaturalizar, 30 s a 55°C para alineación y 20s/kb 72°C para amplificación.

5.3.3 Preparación de células químicamente competentes.

Se sembró una colonia de E. coli en tubo de ensayo con 5 mL de medio de cultivo líquido LB y se mantuvo en agitación constante a 200 rpm durante 16 h y a 37°C. Posteriormente un matraz con 50 mL de medio de cultivo líquido LB fue inoculado con 1 mL del cultivo mencionado y se mantuvo en agitación constante durante 4-5 h a 230 rpm y 37°C (OD 600 nm= 0.4-0.6), al término de este tiempo el matraz se incubo en hielo durante 20 minutos y las células se cosecharon por centrifugación a 7,000 rpm por 6-10 min. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en cloruro de calcio 0.1 M estéril para ser cosechadas nuevamente mediante una centrifugación a 7,000 rpm por 6 min. El sobrenadante se descartó y las células se volvieron a resuspender por segunda ocasión, esta vez en 15 mL de CaCL2 0.1 M para centrifugarse por última vez a 7,000rpm por 6 min. El paquete celular obtenido se resuspendió una última ocasión en 4.5 mL de CaCl2 y se, hicieron alícuotas de 100 μL. Las células se sometieron a modificación con pBsKSII para verificar su competencia química (Sambrook et al., 2001).

5.3.4 Transformación de E. coli Top 10 F’.

Alícuotas de 100 μL de células mantenidas en congelación se mezclaron con 4 μL de DNA plasmídico y se incubaron en hielo por 5 min. Transcurrido este tiempo se inocularon por extensión con varilla en cajas Petri preincubadas a 37°C con los antibióticos necesarios (ampicilina 100 mg/mL y espectinomicina 30 mg/mL). Las cajas se incubaron a 37°C hasta que el crecimiento de colonias fue el idóneo para su uso (Pope, 1996).


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5.3.5 Extracción de ADN bacteriano

La extracción de ADN de células bacterianas se hizo de dos maneras distintas. La primera se realizó con el QIAprep® Spin Miniprep Kit de QIAGEN, bajo las indicaciones del fabricante. Para la extracción con el QIAprep® Spin Miniprep Kit de QIAGEN se inocularon células de E. coli en un tubo con 5mL de medio LB y el antibiótico necesario para después incubar por 14-16 h a 37°C y agitación constante de 200 rpm. Pasado este tiempo se colectaron las células por centrifugación a 18000g por 30 s. Se descartó el sobrenadante y el pellet formado se resuspendió en 250 μL de buffer P1, después se agregaron 250 μL de buffer P2, se mezcló las solución y se incubó por 5 min a temperatura ambiente, finalmente también se adicionaron 350 μL de buffer N3 y se volvió a mezclar por inversión hasta tener una solución homogénea. La solución se centrifugó por 10 min a 18000g y se colectó el sobrenadante para ser depositado en una columna QIAprep. Se incubó a temperatura ambiente por 1 min y se centrifugó nuevamente por 30 s a 18000g. La columna QIAprep se lavó con 0.5 mL de buffer PB y 0.75 mL de buffer PE, centrifugando por 30 segundos a 18000 g entre cada lavado y descartando los filtrados. Se centrifugó por 1 min adicional después del último lavado para eliminar cualquier residuo de etanol. Para eluir el DNA se colocó la columna QIAprep en un tubo de 1.5 mL estéril y se adicionaron de 20 a 50 μL de buffer de elución o agua MilliQ estéril en la columna, dejando incubar por 1 min antes de centrifugar por 1 min a 18000 g. El filtrado contenía el DNA plasmídico bacteriano. La segunda manera se realizó aplicando el protocolo de extracción descrito por Ausubel et al., en 2003. Se inocularon células E. coli en un tubo con 5 mL de medio LB y los antibióticos necesarios, mismo que se mantuvo en incubación a 37°C y agitación constante por 14 a 16 h, después del tiempo de incubación las células se cosecharon por centrifugación a 18,000g a partir de 2 a 4 mL del caldo de cultivo en tubos de 1.5 mL, el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en 100 μL de Solución de Lisis Alcalina I fría, posteriormente se adicionaron 200 μL de Solución de Lisis Alcalina II, se mezclan por inversión del tubo 5 veces y se incuba por 5 min a temperatura ambiente, finalmente se agregaron 150 μL de la Solución de Lisis Alcalina III y nuevamente se mezcló invirtiendo el tubo varias veces hasta homogenizar. El lisado celular se centrifugó a 18,000g por 5 minutos a 4°C en una microcentrífuga y el sobrenadante se recolectó en un tubo de 1.5 mL nuevo. Los ácidos nucleícos se precipitaron adicionando al sobrenadante dos volúmenes de etanol a temperatura ambiente y mezclando por inversión. La precipitación de los ácidos nucleícos se realizó centrifugando a 18,000g por 10 min. Se removió el sobrenadante por decantación y se adicionó 1 mL de etanol al 70% en agua. El tubo se invirtió varias veces para después centrifugar a 18,000g por 2 min. El sobrenadante fue descartado y se dejó secar el tubo por 10 min en posición invertida. Finalmente los ácidos nucleícos se resuspendieron en 50 μL de Agua libre de Nucleasa.

5.3.6 Construcción del vector transformante.

Se empleó el genoma del cloroplasto de Phaseolus vulgaris (NP) para seleccionar una secuencia

homóloga que sirviera como sitio de inserción de genes exógenos en cuatro variedades de Phaseoulos vulgaris (NP). En la secuencia homóloga se insertó un sitio de clonación múltiple que sirvió para incorporar el gen de resistencia a espectinomicina aadA y el gen de flourescencia GFP.


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5.3.7 Digestión de ADN con enzimas de restricción.

Las enzimas de restricción empleadas fueron con Eco32I (EcoRV), SmaI, BssHII (PauI), Xba1, HindIII, NotI y XhoI mismas que se usaron bajo las condiciones de reacción sugeridas por los fabricantes (Fermentas y Biolabs). Los volúmenes de reacción fueron de 20 μL pero siempre manteniendo la relación de concentraciones sugerida por los fabricantes. La cantidad de enzima empleada varió dependiendo del volumen de reacción, pero en su mayoría fue de 0.5 a 1 μl de enzima (1-5 U/μL).

5.3.8 Ligación de fragmentos de ADN

La ligación de insertos en el interior de los vectores empleados se realizó con la enzima T4 DNA Ligasa de Fermentas. Los volúmenes de trabajo fueron de 20 μL y se siguieron las condiciones de reacción sugeridas por el fabricante. El buffer de reacción 10X, apropiado para esta enzima, contenía (66 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP). La relación molar entre el inserto y el vector varió de 1:1 a 4:1 M. Los tubos de reacción fueron incubados de 14 a 16 h. a 4°C.

5.3.9 Análisis cualitativo de bandas de ADN a partir de geles de agarosa. Los fragmentos y plámidos de ADN obtenidos al realizar reacciones de amplificación por PCR, reacciones de restricción y reacciones de ligación se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se documentaron en un fotodocumentador Gel Logic 440 marca Kodak. Para el caso de fragmentos de ADN menores a 500pb la concentración de agarosa fue de 1 a 1.5% (w/v), mientras que para cadenas de ADN mayores se empleó una concentración de 0.7% (w/v). Los geles se corrieron en una solución TBE a 90 V de forma horizontal. El tamaño de los fragmentos se estimó por comparación con un estándar de peso molecular de 100 a 10000pb o de 100 a 20000pb.

5.3.10 Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa.

Los fragmentos de ADN que requirieron ser y purificados de fragmentos de distinto tamaño se sometieron a electroforesis en geles de agarosa de bajo punto de fusión marca Nalgene a concentraciones de 0.7 a 1.0% (w/v) y se purificaron con el kit illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification de GE Healthcare, siguiendo las indicaciones sugeridas por el fabricante. Básicamente se cortó con un bisturí estéril la banda del gel que correspondió al fragmento de ADN de interés, misma que se pesó y se disolvió con el buffer de captura Type 3 a 60°C por 15 a 20 min. La solución se adicionó a una columna GFX Microspin y se incubó por 1 min a temperatura ambiente para después centrifugarse a 16000g por 30 s. Este paso se repitió hasta agotar la solución. El filtrado se descartó y la columna fue lavada con 500 μL del buffer Type 1. La columna se centrifugó nuevamente a 16000g por 30 s. Finalmente el ADN se eluyó en 20 a 40 μL del buffer de elución o agua MilliQ estéril centrifugando a 16000g por 1min.


20

5.4 Protocolo para la regeneración in vitro de Phaseolus vulgaris de acuerdo a Malik

et al., 1991.

5.4.1 Material vegetal

Se utilizaron hojas de tres variedades de frijol, Negro PlusFRI-064-2109993 (NP), Pinto Saltillo

1424-FRI-026-120901/C (PS) y Azufrado Higuera Higuera FRI-001-220995 (AH). Proporcionadas

por El Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP).

5.4.2 Limpieza y sanitización de semillas

Las semillas maduras de Phaseolus vulgaris se colocaron en una solución de H2SO4 durante

1min, posteriormente se le agrego una solución de de extran al 2% (v/v) por 20 min, a las

semillas se les colocó en una solución de etanol al 70% (v/v) y finalmente se ponen en una

solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 20 min. En cada paso las semillas fueron

enjuagadas con agua destilada estéril.

5.4.3 Germinación de semillas

Cinco semillas fueron colocadas en cajas magenta de 300mL (transparent plastic culture boxes;

Magenta Corporation, Chicago, Ill., USA) que contenían 45mL de medio MS suplementado con

5 mM de 6-BAP, para su germinación. Estos cultivos se mantuvieron en obscuridad durante 2

semanas a una temperatura de 25°C.

Las plántulas fueron usadas para la obtención de explantes.

5.4.4 Inducción de callos

Para inducción de callos se utilizó medio de cultivo MS- BAP a diferentes concentraciones de 1

a 20 μM (1, 5, 10, 15 y 20 μM). Los primeros pares de hojas fueron utilizados como explantes

(2-4 cm de largo), cada hoja fue cortada en tres segmentos de 0.5-1 cm denominados

superior, medio y basal (con peciolo) y fueron colocados seis explantes por caja petri. Los

recambios se realizaron cada 2 semanas hasta la aparición de brotes, los cuales fueron

preparados de los callos y transferidos a MS sin reguladores de crecimiento para favorecer su

elongación y enraizamiento.


21

5.5 Protocolo para la regeneración in vitro de Phaseolus vulgaris de acuerdo a

Quintero et al., 2010

5.5.1 Material vegetal

Se utilizaron ejes embrionarios de tres variedades de frijol, Negro Plus FRI-064-2109993 (NP),

Pinto Saltillo 1424-FRI-026-120901/C (PS) y Azufrado Higuera Higuera FRI-001-220995 (AH).

Proporcionadas por INIFAP

5.5.2 Limpieza y sanitización de semillas

Las semillas maduras de Phaseolus vulgaris se colocaron en una solución de H2SO4 durante 1

min, posteriormente se le agregó una solución de extran al 2% (v/v) por 20 min, a las semillas

se les colocó en una solución de etanol al 70% (v/v) y finalmente se ponen en una solución de

hipoclorito de sodio al 1% durante 20 min. En cada paso las semillas fueron enjuagadas con

agua destilada estéril.

5.5.3 inducción y Multiplicaciòn de yemas y brotes

Los ejes embriones se cultivaron 10 días en IMM. Después, se removieron los meristemos

apicales y radiculares y se cultivaron en el mismo medio. Los explantes se transfirieron a IMM

fresco cada dos semanas hasta la diferenciación de las yemas.

5.5.4 Elongación y enraizamiento (ERM)

. Los grupos de yemas con brotes diferenciados fueron transferidos a ERM (misma composición

que el IMM sin reguladores de crecimiento) para su completo desarrollo, elongación y

enraizamiento. Las condiciones de crecimiento fueron las mismas que en la etapa previa.


22

6. Resultados y discusión 6.1 Estrategia de construcción

La estrategia general para la construcción del vector de modificación genética de cloroplastos de frijol (NP, INIFAP), denominado aquí pMV1 consistió en los siguientes pasos. 1) elegir una región del genoma del cloroplasto del frijol (Guo et al., 2007); 2) amplificación de esta región por PCR; 3) inserción de esta región en un vector general de clonación en el cual el sitio múltiple de clonación ha sido eliminado; 4) Inserción de un sitio múltiple de clonación en algún sitio único dentro de la región intergénica; 5) Inserción de un cassette de expresión de algún gen reportero en el sitio múltiple de clonación (Figura 3).

Figura 3. Estrategia de construcción para la generación del vector de transformación pMV1 a) Plásmido pBsKSII y región homóloga atpB-rbcL b) El MCS de pBsKSII se retira del vector con PauI y se inserta en este sitio la región homologa atpB-rbcL c) Entre la región atpB y rbcL se interta el MCS que se encuentra en el esqueleto de pBSKII d) Los genes de interés se insertan en el MCS del nuevo vector


23

6.2 Descripción de la región homologa seleccionada atpB- rbcL El genoma del cloroplasto contiene un total de 127 genes de los cuales 108 son únicos y 19 son duplicados en la región de copia invertida (Guo et al., 2007); Después de analizar varias opciones se encontró que la región intergénica atpB-rbcL contiene un sitio único de restricción para XbaI en la posición 2008/2012 que no se encuentra dentro del terminador del gen atpB, lo cual es importante ya que este servirá para la inserción de un sitio múltiple de clonación en el cual se insertará posteriormente un cassette de expresión para un gen de selección o reportero. La inserción de cassettes de expresión dentro de la región del terminador interfiere con la correcta expresión de los transgenes, lo cual pudiera verse reflejado en niveles de expresión alterados (Maliga, 2002). Así, el genoma del cloroplasto de frijol tiene un tamaño de 150,285 bp de longitud y consta de un par de regiones invertidas de copia idénticas (IR) de 26,426 bp, que están separadas por una región de copia larga (LSC) de 79,824 bp y una región de copia pequeña (SSC) de 17,610 bp (Guo et al., 2007); en virtud de que el sitio de inserción carece de propiedades especiales y puede derivar de cualquier parte del genoma plastidial (Maliga, 2003) se decidió usar la región, atpB-rbcL, que tiene un tamaño de 3,060 pares de bases, de los cuales 1130 corresponden al gen atpB que se encuentra ubicado en la posición 10293-11789; 770 a la región intergénica entre atpB y rbcL, y 1160 corresponden a parte del gen rbcL que se encuentra ubicado en la posición 8093-9423. Hay un sitio único de restricción para la enzima XbaI en la posición 2008/2012 (Figura 4).

La región atpB-rbcL fue analizada con el programa NEBcutter V2.0 de NEW ENGLAND BioLabs con el fin de identificar sitios de restricción únicos en los que fuera posible insertar el Sitio de Clonación Múltiple (MCS) del plásmido pBsKSII para construir un vector. Como resultado de la búsqueda se encontró el sitio de restricción XbaI en la posición 2008/2012 dentro de la región intergénica entre atpB y rbcL.

Figura 4. Secuencia atpB-rbcL


24

6.3 Extracción de ADN de frijol y amplificación de la región atpB-rbcL Para amplificar la región atpB-rbcL, se extrajo el ADN genómico total de plántulas de 1 mes de edad de la variedad Negro Plus como se describe en la sección 7. Para verificar la integridad del ADN extraído, este se analizó por electroforesis en gel agarosa. Como se observa en la Figura 5 el DNA extraído corre en el gel como una sola banda y sin presencia de RNA. Se observa un barrido, lo cual pudiera ser el resultado de una alta concentración del ADN.

Para la amplificación de la región atpB-rbcL se diseñaron los iniciadores JAB 158 5’ gtatGCGCGCaaccggcagaacacctggtagag-3’ sentido y JAB 159 5’ gtatGCGCGCgtctcataatgttcttcaccaac-3’ antisentido con sitios de restricción encriptados PauI, los cuales se encuentran también flanqueando el sitio de clonación múltiple del plásmido pBsKSII, permitiendo que el producto de PCR pueda ser insertado en los sitos del vector. La amplificación del fragmento atpB-rbcL con la DNA polimerasa KOD se llevó a cabo como se describe en la sección 5.3.2. El producto de PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como se observa en la figura 6, se obtuvo un fragmento de aproximadamente 3000 pb, el cual corresponde a la región atpB-rbcL. El producto de PCR fue purificado del gel de agarosa como se describe en la sección 5.3.2. Una vez purificado se analizo por electroforesis en gel de agarosa para determinar la concentración (fotografía no mostrada). Para cortar tanto el fragmento atpB-rbcL como el vector pBSKII con PauI se realizó una reacción de restricción como se describe en la sección 5.3.10. Después de esto se purificaron, tanto el fragmento como el vector y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa para determinar la concentración (Figura 6a y 6b). El vector fue desfosforilado con la enzima Shrimp alkaline phosphatese como se describe en la sección 5.3.7.

10kb

Figura 5. ADN plastidial extraído de Phaseolus vulgaris variedad Negro Plus


25

Por otra parte, es retirado el MCS de pBSKII y atpB-rbcL se inserta en los sitios de restricción en este plásmido quedando reconstituidos los sitos Paul en los extremos del fragmento. Se realiza selección aleatoria de las clonas para comprobar la inserción del fragmento en el vector pBSKII encontrándose 5 plásmidos con el tamaño esperado (6,000 pb). Como la extracción es realizada por medio de lisis alcalina y no se ven claramente los plásmidos, se realiza extracción de los mismos utilizando el Kit QIAprep® Spin Miniprep Kit de QIAGEN

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

20 21 22 23 24 25

6,000

3,000

3,000

6,000

(7a

(7b

1 2 3 4 5 6 7 8 9

21 23 6 7 9 10 13 19 1

6,000

3,000

(6c

(6b (6a

3,000 3,000

3,000

Figura 6. a) amplificación del fragmento atpB-rbcL por PCR. C) Los flancos del fragmento atpB-rbcL son

conrtados con la enzima PauI d) A pBSKII se le retira el MCS y posteriormente es desfosforilado

Figura 7 a) Incorporación de la secuencia homóloga atpB-rbcL en el plásmido pBsKSII. Los plásmidos 6,

7, 10 ,19 y 23 presentan tamaño esperado cercano a las 6 kb. b) Extracción de las muestras posiblemente

tranformadas (muestras 6, 7, 10, 19 y 23) y 3 muestras aleatorias (21, 9 y 13) para comprobar el tamaño

de las bandas utilizando el Kit QIAprep® Spin Miniprep Kit de QIAGEN


26

De manera preliminar se comprobó la presencia de las secuencias homólogas mediante restricciones realizadas con las enzimas PauI y EcoRV en los plásmidos 2, 3,4, 6 y 8 de la figura 7b. El peso de los plásmidos es cercana a 6.0 kb, de los cuales 2750 corresponden al esqueleto del plásmido pBsKSII y 3,000 pb pertenecen a la región atpB-rbcL y tomando en cuenta que EcoRV corta en la posición 1026 de la región atpB-rbcL; se espera que utilizando, estas dos enzimas se obtengan tres fragmentos; es decir, con PauI se separa la región atpB-rbcL de pBSKII y con EcoRV se corta en un extremo atpB-rbcL. Estos tres fragmentos de los plásmidos solo se observan en las bandas 4 y 8 de la figura 8 que corresponden a los plásmidos mostrados las bandas 2 y 4 de la figura 7b

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1,000

3,000 6,000

Figura 8. Restricción realizada con PauI y EcoRV a plásmidos que contienen las región atpB-rbcL (plasmidos 2, 3, 4, 6 y 8 de la figura 8b). Las bandas cercanas a 3 kb corresponden al esqueleto de pBsKSII, mientras que las cercanas a 2.0 kb y 1 Kb corresponden a la región atpB- rbcL que fue partida por EcorV


27

6.4 Construcción del plásmido pMV1-aadA

El plásmido pMV1 puede ser utilizado para insertar en su sitio de clonación múltiple cualquier gen de interés. En este trabajo se empleó el gen aminoglucosido adeniltranferasa (aadA) que confiere resistencia a los antibióticos espectinomicina y/o estreptomicina (Svab et al., 1990, 1993), mismo que está bajo el control del promotor constitutivo del operón 16 S rRNA (Prrn), el cual es un promotor fuerte con un sitio de unión a ribosomas sintético diseñado a partir del gen rbcL, y del terminador TpsbA (Staub y Maliga, 1994) del gen psbA (proteína D1 del fotosistema II del cloroplasto). Tanto el promotor como el terminador tienen su origen en el genoma plastidial de tabaco. El gen aadA es insertado en el sitio XhoI de pMV1 (Figura 11). Previamente el gen aadA se extrajo del plásmido pzsJH1 obtenido anteriormente por el grupo de trabajo, mediante amplificación con la DNA polimerasa KOD como se describe en la sección 5.3.2 utilizando los iniciadores JAB 200 sentido y JAB 201 antisentido. El producto de PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como se observa en la figura 9, se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1600 pb, el cual corresponde al gen aadA. El producto de PCR fue purificado del gel de agarosa como se describe en la sección 5.3.5. Una vez purificado se analizo por electroforesis en gel de agarosa para determinar la concentración. El sitio de restricción XhoI de pMV1 y los extremos se obtienen de la amplificación con DNA polimerasa KOD no son compatibles. De tal forma que antes de realizar la ligación de estas cadenas de ADN, los extremos cohesivos que forma XhoI se trataron con la enzima T4 DNA polimerasa que complementa la cadena sencilla en el extremo 5’ y escinde en el extremo 3’, con el fin de formar extremos romos que pudieran unirse mediante una ligación con la enzima T4 DNA Ligasa (Figura 9).

Se comprueba la inserción del gen aadA en pMV1 por secuenciación y por su funcionalidad al crecer células en espectinomicina; al purificar el plásmido que se observa en el gel de purificación es del tamaño esperado (Figura 10a). Además se realizan restricciones con las enzimas PstI, XbaI, SmaI y SacI. El peso del plásmido pMV1-aadA es cercano a 7.5 kb y las enzimas utilizadas lo cortan en dos fragmento de los siguiente tamaños: PstI en fragmentos de 4700 y 2800pb, XbaI en fragmentos de 6500 y 1017pb, SmaI en fragmentos de 5500 y 2000pb y SacI en fragmentos de 5000 pb y 2500pb como se muestra en la figura 10b

1,500

1500

6,000

1500

1 2

Figura 9. Carril 1) Restricciòn de pMV1 con XhoI, tratado con la enzima T4 DNA polimerasa;

Carril 2) amplificación del gen aadA,


28

6,000

1500

1,000

1500

2,500

1500

3,000

1500

5,000

1500

(10a

(10b

1 2

1 2 1 2 3 4

Figura 10 a) Plásmidos pMV1(1) y Plásmido pMV1-aadA (2) b) Restricción realizada con PstI, XbaI,

SmaI y SacI para comprobar la inserción de gen aadA en pMV1.

Figura 11. Plásmido pMV1-aadA obtenido al insertar el gen de resistencia a espectinomicina en pMV1. El gen que confiere la resitencia a espectinomicina se inserto en el sitio XhoI ubicado en el sitio multiple de clonación del plásmido pMV1


29

6.5 Construcción del plásmido pMV1-aadA-GFP

En el plásmido pMV1-aadA construido en la sección 6.4 se inserto el gen de la proteína verde flourescente (GFP). El GFP de la medusa Arqueroa victotia, contiene un flouroforo el cual emite luz verde. La fluorescencia GFP ha permitido usarlo como reportero (Chalfie et al., 1994) y como una etiqueta de la proteína (Wang et al., 1994). Debido a que el flouroforo del GFP es producido autocatalíticamente desde una región de la pequeña cadena polipeptídica y puede ser captada en imágenes in vivo. La GFP es ampliamente utilizada como reportero en plantas (Blackman et al.,1998; Hasseloff et al.,1995; Köler et al., 1997). mismo que está bajo el control del promotor constitutivo del operón 16 S rRNA (Prrn), el cual es un promotor fuerte con un sitio de unión a ribosomas sintético diseñado a partir del gen rbcL, y del terminador TrrnB (Hibberd et al., 1998) del gen psbA. El gen GFP fue insertado entre los sitios NotI y HindIII del plásmido pMV1-aadA (Figura 13). Previamente, utilizando las mismas enzimas, se extrajo del plásmido pNtcC1 obtenido anteriormente por el grupo de trabajo, posteriormente se realiza ligación del plásmido pMV1-aadA con el gen GFP. Se comprueba la inserción del GFP por secuenciación y por la capacidad de las células de emitir fluorescencia. Además se realizan restricciones utilizando las enzimas NotI y HindIII los plásmidos pMV1-aadA- GFP y pMV1-aadA encontrando un fragmento del tamaño esperado (1633pb) únicamente en el plásmido pMV1-aadA- GFP, que corresponde al GFP insertado.

Figura 12. Restricción realizada con NotI y HindIII a los plásmidos pMV1-aadA-GFP (1) y pMV1-aadA (2)para comprobar la inserción de GFP

1 2

6,000

1500

1.500

1500


30

Se comprueba la funcionalidad del plásmido introduciéndolo en cloroplastos por medio de bombardeo de partículas de tungsteno de 0.7 μm recubiertas con el plásmido pMV1-aadA- GFP. Se monitoreo el gen GFP en 24, 48 y 72 horas después del bombardeo, usando el microscopio confocal de barrido laser LSM710 (Figuras 14, 15 y 16 ). Las longitudes de onda de excitación se establecieron entre 488 y 568 nm. En las figuras 14, 15 y 16 se observa que el GFP se puede detectar desde las primeras 24 horas y conforme pasa el tiempo (48 y 72 h), la expresión del GFP se detecta con mayor intensidad (Figura 15 y 16); esto indica, que el bombardeo de microproyectiles puede ser usado para entregar construcciones de gfp a los cloroplastos y los cloroplastos pueden expresar GFP. Bajo las condiciones utilizadas se pudo detectar la expresión de GFP en todas las hojas que fueron bombardeadas. Bombardeando hojas de frijol con el plásmido pMV1-aadA-GFP se muestra que el promotor bacterial Prrn puede ser usado para expresión de gfp en cloroplasto (Hibberd et al., 1998)

Figura 14. Imagen del GFP en cloroplastos tomadas con microscopio confocal de barrido laser (12 horas después del bombardeo)

Figura 13. Plásmido pMV1-aadA-GFP obtenido al insertar el gen GFP en pMV1-aadA El gen GFP se inserto en los sitios NotII y HidIII ubicado en el sitio múltiple de clonación del plásmido pMV1-aadA


31

Figura 15. Imagen del GFP en cloroplastos tomadas con microscopio confocal de barrido laser (48 horas después del bombardeo)

Figura 16. Imagen del GFP en cloroplastos tomadas con microscopio confocal laser (72 horas después del bombardeo)


32

7. Regeneración de tejidos vegetales de acuerdo con Malik et al., 1991 7.1 Germinación

La germinación de las semillas de P. vulgaris (variedades PS, NP y AH) se germinaron de acuerdo a apartado 5.4.1-5.4.3. Los porcentajes de germinación obtenidos para las 3 variedades empleadas se reportan en el Cuadro 1. Cuadro zzz. Porcentaje de germinación de las semillas de P. vulgaris

Variedad de frijol

Total de semillas Semillas germinadas

Porcentaje de germinación (%)

Tiempo de germinación (días)

NP 200 136 68 3-5 PS 200 120 60 3-5 AH 200 No hay

germinación 0 No hay

germinaciòn 3 repeticiones por variedad

Con la variedad AH no hay germinación debido a que con una concentración menor a 1.25% v/v de hipoclorito de sodio se contaminan y con una mayor las semillas se mueren y ya no germinan. Los frijoles de las variedades NP y PS germinan en un periodo de 3-5 días y las plántulas alcanzan un tamaño de 10 cm en 10 días (Figura 17 A, B Y C).

A B C

Figure 17. Germinación de P. vulgaris a 10 días de ser puesto en medio de germinación.: A) Frijol NP, B) Frijol PS C) frijol AH.


33

A B C

E D

7.2 Formación de callos

Las hojas de las variedades NP y PS se cortan en tres segmentos (superior, medio y basal, este último lleva una pequeña parte de peciolo) y se colocaron en posición axial en medio de inducción de callos a diferentes concentraciones de BAP (MSA, MSB, MSC, MSD Y MSE) ver Cuadro 1. En los explantes crecidos en MSA se observa la aparición de raíz en la parte superior del peciolo después de 2 semanas de cultivo (Figura 18 A). Con los medios MSB, MSC, y MSD (Figuras18 B, C y D) se observa incremento de tamaño y cambio de coloración (verde intenso). La inducción de callos se observó en el peciolo con el medio MSE (Figura 18 E).

Se observó muerte celular de los explantes con los medios de inducción de callos MSA, MSB, MSC Y MSD. a un mes de cultivo; con el medio MSE se observa proliferación celular e incremento en el tamaño del callo; los explantes cultivados en los medios MSA a MSD fueron transferidos a MSE. Este cambio, resulta positivo para los explantes ya que se detiene su muerte y se induce formación de callos en el peciolo para NP 44.6% y para PS 43.75% y no hay formación de callos en las hojas.

Figura 18. Inducción y cultivo de callos: A) Crecimiento de raíces en parte del peciolo en medio con una concentración de1 μM B), C) y D) Incremento de tamaño y intensidad de color en explantes sembrados en medio de inducción de callos con una concentración de 5, 10 y 15 μM de BAP. E) Comienzan aparecer callos después de dos semanas de poner los explantes en medio con BAP a 20 μM


34

Después de dos meses y medio se presentan brotes en el 7% de los callos de frijol NP y 9% de frijol PS. Estos brotes son removimos de los callos y pasados a medio sin BAP. Estos brotes no aumentan su tamaño y se van oxidando.

Y después de un mes de transferir los brotes a medio sin BAP todos los tejidos mueren.

A B

A B

Figure 19. A) Formación de callos en peciolo de frijol de la variedad NP B) Formación de callos en peciolo de frijol de la variedad PS

Figure 20. A) Brotes en el 7% de los callos formados en peciolo en el frijol variedad NP después de dos meses y medio pasados a medio sin BAP B) ) Brotes en el 9% de los callos formados en peciolo en el frijol variedad PS después de dos meses y medio pasados a medio sin BAP


35

De acuerdo a lo reportado por Malik et al., 1991, únicamente con la concentración 10μM de BAP se observa crecimiento de los explantes en las partes superior y media con poca formación de callos y en la parte basal se desarrolla callo alrededor del peciolo. Sin embargo, en la experimentación realizada por nuestro grupo, no ocurre así ya que solo se forma callo a una concentración de 20 μM de BAP (MSE) únicamente en el área basal (peciolo). En cuanto a la formación de brotes se obtiene un resultado muy similar al que Malik et al., 1991 reporta que se obtiene un 8% de formación de brotes y nuestro caso se obtiene 7% con frijol NP y 9% con frijol NP. Además, Maik el at., 1991 reporta que al pasar los brotes a medio sin regularos de crecimiento estos forman plantas que pueden ser pasadas a suelo después de 10-12 semanas, en nuestro caso los brotes mueren después de 4 semanas.


36

A

’

B

1cm

8. Regeneración de tejidos vegetales de acuerdo con Quintero et al., 2010

8.1 Formación de grupos de yemas

El cultivaron ejes embrionarios de las tres variedades de Phaseolus vulgaris (NP, PS y AH) en medio IMM de acuerdo al apartado 5.5.1-5.5.3. Sólo hay desarrollo de dichos ejes con la variedad NP (Figura 21 A). En cambio con de los ejes embrionarios de las variedades PS y AH, no hay desarrollo debido a que se presenta necrosis en los tejidos después de 10 días (Figura 21 A y B).

Para el caso de los ejes embrionarios de la variedad NP estos crecen sanos y después de 10 días de cultivo se les remueve el meristemo apical y radicular y continúa su desarrollo en el mismo medio (Figura 22).

7.1 Los eje embrionarios de la variedad NP después de 15 días de cultivo indujeron grupos de yemas organogénicas (1.5 mm de ancho x 1mm de altura) en un 40%. Dichos yemas de color verde intenso y también presentan oxidación en el tejido.

E

A B C

Figura 21. A) Ejes embrionarios recién cultivados B) y C) Ejes embrionarios de Phaseolus vulgaris variedades PS y AH , presentan necrosis después de 10 días

Figure 22. A) Ejes embrionarios cultivados por 10 días en medio IMM. B) Meristemos apicales y radiculares son removidos después e 10 días en medio IMM


37

8.2 Diferenciación de brotes La diferenciación de brotes inicio a después 45 días de aparición de yemas, mostrando de 2-6 brotes por grupo de yemas (Figura 24 A) y formando hojas diferenciadas 4mm de ancho. Sin embargo todos los ejes embrionarios sufren oxidación (Figura 24 B). De acuerdo a lo reportado por Quintero et al., 2010 utilizando estas mismas condiciones y con cuatro variedades d frijol se obtuvo de 21-26 brotes por grupo de yemas en 25 días y formando hojas diferenciadas de 6 mm de ancho y los ejes embrionario permanecen sanos de color verde fuerte. Por lo que, podemos decir que la oxidación en los ejes embrionarios es la causa de la reducción del crecimiento de los brotes.

1.5mm

1.0m

m

B A

Figura 23. Ejes embrionarios con grupos de yemas a los 15 días después de la escisión de meristemos apical y radicular

Figure 24. A) Primeros brotes diferenciados a los 45 días de cultivo B) Oxidación del tejido en ejes embrionarios


38

8.3 Desarrollo de la planta de P. vulgaris Después de 45 días se remueven los brotes de los ejes embrionarios y se pasan a cajas magenta en medio ERM (Figura 25 A). Los brotes obtenidos presentan crecimiento muy lento y en algunos casos comienzan a formar raíz después de 2 meses (Figura 25 B). Sin embargo, después de 3 meses los tejidos empiezan a presentar necrosis y no se logra desarrollar ninguna plánta.

El protocolo aquí descrito no muestra buena respuesta organogénica, a pesar de haber seguido el protocolo de acuerdo a Quintero et al., 2010 en donde obtienen resultados excelentes resultados (90-100% de formación de grupos de yemas, diferenciación de brotes y eficiencia en el desarrollo de las plantas del 83-100%); aplicando este protocolo a cuatro cultivares de frijol.

9. Conclusiones

Se diseñó y construyó un vector específico para la modificación genética del

cloroplasto de frijol que además podría ser empleado como vector de extensión. Se insertó el cassette de expresión del gen de resistencia a espectinomicina aadA en el

vector construido. Se insertó el cassette de expresión del gen de flouresecencia GFP en el vector

construido. Se evaluó de manera la inserción un cassette de expresión para la proteína verde

fluorescente y se monitoreó la acumulación de esta por microscopia confocal. Se avanzo en el desarrolló un protocolo de regeneración de tejidos para frijol.

10. Perspectivas Es necesario continuar con los trabajos de regeneración, ya que no se logra obtener plastas completas y aunado a esto comprobar que el gen de resistencia, junto con otros genes de interés, se están intertanto en el cloroplastos, sería necesario regenerar la planta completa y sobre esta realizar una caracterización molecular.

C A B

Figure 25. A) Brotes 1 mes después de haber sido transferidos a medio ERM. B) Los brotes comienzan a formar raíz después de 2 meses C) Los brotes comienzan presentar necrosis 3 meses después.


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11. Referencias Alarcón, F., Bolivar, R., De la Fuente, J. Kumate, A., Martínez, A., Pérez, R., Rudomín, P., Sarukhán, J., y Soberón G. Fronteras de la Biologia en los inicios del Siglo XXI. Importancia de un Proyecto Genómico de Frijol (Phaseolus vulgaris) para México. Colegio Nacional. México. Pp 52-54. Arellano, J., Fuentes, S., Castillo, P. y Hernández, G. (2008) Regeneration of different cultivars of common bean (Phaseolus vulgaris L.) via indirect organogenesis. Plant Cell Tiss Organ Cult 1: 11-18 Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Seidman, J., Smith, J. and Struhl K. (2003) “Current protocols in molecular biology” JW&S, Inc. Blackman, L., BoevinkP., Santa Cruz, S., Palukaitis. P. and Oparka, K. (1998) The movement protein of cucumber mosaic virus traffics into sieve elements in minor veins of Nicotiana clevelandii. Plant Cell, 10: 525-537. Bresanni, T. (1983). Research needs to upgrate the nutritional quality of common bean (Phaseolus vulgaris). Qual . Pl Plant food Human Nutr. 32:101-110. Bhojwani, S. y Razdan, M. (1986). Plant tissue culture: theory and practice. (3rd ed.) (Bhojwani,S.S. y Razdan,M.K. eds.) Elsevier science Publishers B.V., Amsterdam, The Netherlands. pp.: 488. Bock, R. (2001). Transgenic Plastids in basic Research and Plant Biotechnology. JMB , 425-438. Broetjes, C., y Keen, A. (1980). Adventitious shoots: do they develop from one cell. Euphytica 29: 73-87. Chalfie, M., Tu, Y. Euskirchen, G., Ward, W. and Prasher, D. (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263: 802-805. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). (1992). Catálogo de germoplasma de frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Ed. Por Hidalgo, R.H., Toro, O. Cali, Colombia, CIAT.pp.: 450 CIAT. (2008). Improved beans for the developing world. Annual Report . 302. Collado. R., García, L., Angenon, G., Torres, D., Romero C., Bermúdez, I,. Veitía, N., y Ramírez, R. (2008). Organogénesis indirecta en Phaseolus vulgaris L. cv. CIAP 724. Biotecnología Vegetal Vol. 8, No. 2: 81 - 86, Darbani, B., Eimanifar, A., Stewart, C. N., & Camargo, W. N. (2006). Methods to producemarker-free transgenic plants. Biotechnol , 83-90. Díaz, M.L., Zappacosta, D.C., Franzone, P.M and Ríos, R.D. (2004). Transformación genética. In: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Ed. por Echenique, V., Rubinstein, C. y Mroginski, L. Buenos Aires, Argentina, INTA. p. 109-123 Eissa, E., Bisztray., Velich I. (2002) Plant regeneration from seedling of common bean (Phaseolus vulgaris L.). Proceedings of the 7th Hungarian Congress on Plant Physiology. Acta Biologica Szegediensis 46 (3-4): 27 - 28. García, L., Collado R., Bermúdez, I., Veitía N., Torres, D. and Romero, C. (2008). Regeneración de plantas vía organogénesis directa en Phaseolus vulgaris L. Biotecnología Vegetal Vol. 8, No. 2: 109 – 114.


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Diseño y construcción de vectores para la …tesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/19729/1/Margarita...vii RESUMEN El frijol común (Phaseolusvulgaris) es un cultivo económicamente